Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Objętość mikroskopii elektronowej (Objętość EM) stała się potężnym narzędziem do wizualizacji struktury 3D komórek i tkanek z dokładnością nanometrów. W obrębie siatkówki różne typy neuronów tworzą połączenia synaptyczne w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie splotowatej. Podczas gdy konwencjonalne techniki EM dostarczyły cennych informacji na temat organelli subkomórkowych siatkówki, ich ograniczenie polega na dostarczaniu danych obrazowych 2D, które mogą utrudniać dokładne pomiary. Na przykład ilościowe określenie wielkości trzech odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, kluczowych dla transmisji synaptycznej, jest wyzwaniem w 2D. Volume EM oferuje rozwiązanie, dostarczając dane 3D o dużej skali i wysokiej rozdzielczości. Warto zauważyć, że przygotowanie próbki jest krytycznym krokiem w tomie EM, znacząco wpływającym na klarowność i kontrast obrazu. W tym kontekście przedstawiamy protokół przygotowania próbki do rekonstrukcji 3D zakończeń aksonów fotoreceptorów w siatkówce. Protokół ten obejmuje trzy kluczowe kroki: rozwarstwienie i stabilizację siatkówki, procesy osadzania próbki oraz wybór obszaru zainteresowania.
Wprowadzenie
Siatkówka jest gęsto wypełniona przeplatającymi się aksonami neuronalnymi i dendrytami, które tworzą między nimi synapsy1. Mikroskopia jest niezbędnym narzędziem do badania anatomii siatkówki, ponieważ ma drobne, skomplikowane i małe struktury. Chociaż mikroskopia elektronowa (EM) zapewnia niezrównaną moc badania ultrastruktury organelli subkomórkowych i dokładnej lokalizacji określonych białek na poziomie nanometrów2, tworzy obrazy ograniczone do płaszczyzny dwuwymiarowej (2D), co prowadzi do potencjalnej utraty kluczowych informacji.
Rozwój nowych technik mikroskopii elektronowej objętościow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokoły opieki nad zwierzętami i ich użytkowania zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou i były zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO). Wszystkie myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym cyklu ciemności i zaopatrywano je w standardową dietę karmową.
1. Sekcja i fiksacja siatkówki
- Znieczulić myszy (C57BL/6J, samiec, 8 tygodni, 20-25 g) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanolu (0,25 mg/g masy ciała). Potwierdź głębokość znieczulenia, nie cofając tylnej łapy po uszczypnięciu palca u nogi lub....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1A przedstawia obraz zakończeń fotoreceptorów siatkówki przygotowanych tradycyjną metodą chemicznej podwójnej fiksacji, a Rycina 1B przedstawia obraz zakończeń fotoreceptorów siatkówki przygotowanych metodą OTO. W obu przypadkach próbki pobrano za pomocą FIB-SEM. Wyraźnie widać, że zastosowanie metody OTO pozwala na maksymalne zachowanie struktury błony komórkowej, a widoczne są nawet kontury pęcherzyków. Ponadto kontrast obrazów uzyskanych metodą OTO jes.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wdrożyliśmy protokół przygotowania próbki Volume EM firmy OTO do analizy końcowej struktury fotoreceptorów w tkance siatkówki. Skupiono się na szczegółowym omówieniu całej procedury, począwszy od odwarstwienia i unieruchomienia siatkówki, a skończywszy na przedstawieniu wyników rekonstrukcji 3D zakończeń aksonów fotoreceptorów.
Charakterystyczną cechą tkanki siatkówki, w przeciwieństwie do tkanki mózgowej, jest brak różnic regionalnych. Siatkówka, składająca się z trzech warstw ciał komórek ne.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Mikroskopia elektronowa | acetonu | 10000 | |
| Amira 6.8 | Thermo Fisher Scientific | ||
| CaCl2 | Sigma | C-2661 | |
| Forma do zatapiania | Beijing Zhongjingkeyi Technology | GP10590 | |
| Epon żywica | Mikroskopia elektronowa Science | 14900 | |
| Etanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Aldehyd glutarowy | Mikroskopia elektronowa Science | 16020 | |
| Helios NanoLab 600i dwuwiązkowy SEM | FEI | ||
| Kwas L-asparaginowy | Sigma | 56-84-8 | |
| Azotan ołowiu | Sigma | 10099-74-8 | |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | Składnik buforu fosforanowego |
| NaH2PO4. H2O | Sigma | 71507 | Składnik buforu fosforanowego |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Paraformaldehydowa | mikroskopia elektronowa Science | 157-8 | |
| Żelazocyjanek potasu | Sigma | 14459-95-1 | |
| Kakodylan sodu | Sigma | 6131-99-3 | |
| Napylarka | Leica | ACE200 | |
| Tiokarbohydrazyd | Sigma | 2231-57-4 | |
| Octan uranylu | TED PELLA | CA96049 |
Bibliografia
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
- Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
- Varsano, N., Wolf, S....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
