Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Objętość mikroskopii elektronowej (Objętość EM) stała się potężnym narzędziem do wizualizacji struktury 3D komórek i tkanek z dokładnością nanometrów. W obrębie siatkówki różne typy neuronów tworzą połączenia synaptyczne w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie splotowatej. Podczas gdy konwencjonalne techniki EM dostarczyły cennych informacji na temat organelli subkomórkowych siatkówki, ich ograniczenie polega na dostarczaniu danych obrazowych 2D, które mogą utrudniać dokładne pomiary. Na przykład ilościowe określenie wielkości trzech odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, kluczowych dla transmisji synaptycznej, jest wyzwaniem w 2D. Volume EM oferuje rozwiązanie, dostarczając dane 3D o dużej skali i wysokiej rozdzielczości. Warto zauważyć, że przygotowanie próbki jest krytycznym krokiem w tomie EM, znacząco wpływającym na klarowność i kontrast obrazu. W tym kontekście przedstawiamy protokół przygotowania próbki do rekonstrukcji 3D zakończeń aksonów fotoreceptorów w siatkówce. Protokół ten obejmuje trzy kluczowe kroki: rozwarstwienie i stabilizację siatkówki, procesy osadzania próbki oraz wybór obszaru zainteresowania.
Wprowadzenie
Siatkówka jest gęsto wypełniona przeplatającymi się aksonami neuronalnymi i dendrytami, które tworzą między nimi synapsy1. Mikroskopia jest niezbędnym narzędziem do badania anatomii siatkówki, ponieważ ma drobne, skomplikowane i małe struktury. Chociaż mikroskopia elektronowa (EM) zapewnia niezrównaną moc badania ultrastruktury organelli subkomórkowych i dokładnej lokalizacji określonych białek na poziomie nanometrów2, tworzy obrazy ograniczone do płaszczyzny dwuwymiarowej (2D), co prowadzi do potencjalnej utraty kluczowych informacji.
Rozwój nowych technik mikroskopii elektronowej objętościowej o wysokiej rozdzielczości (Volume EM) wspiera dostarczanie bardziej wszechstronnych i wielkoskalowych trójwymiarowych (3D) informacji strukturalnych. Niektóre metody 3D EM zostały ostatnio sprawdzone przez innych3,4,5. 3D EM pozwala na rekonstrukcję kształtu neuronów i szczegółów połączeń, umożliwiając precyzyjną analizę ilościową interesujących struktur. Pokazuje to, że dane uzyskane przez tom EM są bardziej systematyczne, kompletne i dokładne.
Fotoreceptory siatkówki, stanowiące początkowe neurony w sygnalizacji wzrokowej6,7, ustanawiają synapsy z dendrytami dwubiegunowych i poziomych komórek drugiego rzędu w terminalu fotoreceptora, aby ułatwić sygnały pobudzające8,9. Te zakończenia, określane jako szypułki stożkowe i sferuli pręcikowe, obejmują trzy kluczowe elementy: mitochondria, wstążki synaptyczne i pęcherzyki synaptyczne. Podczas gdy poprzednie badania koncentrowały się głównie na ogólnej strukturze synaps wstęgowych, zauważalny był brak badań nad subtelną strukturą głównych składników, w tym mitochondriów, wstążek, pul pęcherzyków i ich organizacji przestrzennej w terminalach10,11,12,13. Precyzyjna i systematyczna analiza każdego składnika, wraz ze zrozumieniem ich wzajemnych powiązań w obrębie końcówek fotoreceptorów, jest niezbędna do rozwikłania organizacji przestrzennej i kompleksowego uchwycenia funkcji przetwarzania wzrokowego. W fotoreceptorach mitochondria są obecne głównie w segmencie wewnętrznym, ciele komórki i końcu. Skupiliśmy się tutaj na mitochondriach w końcowych fotoreceptorach. Skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM), rodzaj objętości EM szczycący się wysoką rozdzielczością (rozdzielczość x, y i z < 5 nm) i stosunkowo dużym strumieniem objętościowym4,14, jest potężnym narzędziem do dokładnej wizualizacji struktury 3D końcówek fotoreceptorów.
Zarówno FIB-SEM, jak i Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM) są oparte na SEM objętościowym do uzyskiwania obrazu tkanek poprzez skanowanie powierzchni próbki. Ultrastrukturalne cechy powierzchni próbki ujawniają się poprzez kontrast utworzony przez intensywność elektronów wtórnych lub wstecznie rozproszonych (BSE), gdy wiązka elektronów skanuje próbkę15. Zasadniczo, wykrycie BSE lub elektronów wtórnych z powierzchni przekroju poprzecznego próbki tkanki zatopionej w żywicy w SEM pozwala na uzyskanie obrazów osadzonej próbki16,17. Gdy BSE lub elektrony wtórne są mniej generowane, można uzyskać informacje tylko o powierzchni próbki. Uzyskanie spójnego kontrastu i wysokiej jakości obrazów seryjnych wymaga wystarczającego osadzania metali ciężkich w próbce. W związku z tym określone protokoły przygotowania próbek mają kluczowe znaczenie dla późniejszej segmentacji, rekonstrukcji 3D i analizy w przypadku wykorzystania SEM do obrazowania seryjnego. Metoda osmowo-tiokarbohydrazydowo-osmowa (OTO) jest typowym schematem przygotowania próbki do mikroskopii elektronowej 3D próbek biologicznych, zachowując strukturę błon zawierających lipidy i utrzymując dobry kontrast18,19.
Tutaj opracowaliśmy metodę OTO do przygotowania próbek siatkówki do użycia objętości EM. Proces ten koncentruje się w szczególności na wypreparowaniu siatkówki, określeniu optymalnego czasu utrwalenia tkanki siatkówki oraz wyszczególnieniu konkretnych procedur i środków ostrożności w przygotowaniu próbek 3D. Dodatkowo, segmentacja i rekonstrukcja 3D struktury docelowej są integralnymi krokami w tej rozszerzonej aplikacji. Siatkówka, będąca małą i trudną strukturą do pozyskiwania materiałów, wymaga szybkich i precyzyjnych operacji dla EM, z ustalonymi czasami i świeżymi odczynnikami przygotowanymi do natychmiastowego użycia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokoły opieki nad zwierzętami i ich użytkowania zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou i były zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO). Wszystkie myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym cyklu ciemności i zaopatrywano je w standardową dietę karmową.
1. Sekcja i fiksacja siatkówki
- Znieczulić myszy (C57BL/6J, samiec, 8 tygodni, 20-25 g) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanolu (0,25 mg/g masy ciała). Potwierdź głębokość znieczulenia, nie cofając tylnej łapy po uszczypnięciu palca u nogi lub nie odruchując mrugania. Następnie zwichnij kręg szyjny jeszcze pod narkozą, aby poddać zwierzę eutanazji.
UWAGA: Tribromoetanol został wybrany ze względu na jego dobrze udokumentowaną skuteczność w wywoływaniu szybkiego i niezawodnego znieczulenia u małych modeli zwierzęcych, szczególnie w przypadku zabiegów krótkoterminowych. Chociaż preferowane są środki znieczulające klasy farmaceutycznej, tribromoetanol oferuje szczególne zalety w niektórych protokołach, co czyni go odpowiednią alternatywą, jeśli jest odpowiednio przygotowany i podany. Podjęto wszelkie środki ostrożności, aby zapewnić jego bezpieczne i skuteczne stosowanie. Badanie to jest zgodne z względami etycznymi, zapewniając odpowiednie przygotowanie, podawanie i monitorowanie w celu ograniczenia potencjalnego ryzyka związanego z jego stosowaniem. - Usuń oczy zakrzywionymi nożyczkami i zanurz je w mieszanym roztworze zawierającym 2% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w buforze fosforanowym (PB, 0,1 M, pH 7,4).
- Usuń przedni odcinek i ciało szkliste z oczu za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym.
- Oderwij twardówkę dwoma kleszkami, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana od muszli ocznej.
- Szybko pokrój siatkówkę na paski o grubości 100 - 200 μm za pomocą brzytwy i przenieś paski siatkówki za pomocą pipety Pasteura do nowej probówki do mikrowirówki (EP) zawierającej 2% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w buforze fosforanowym (PB, 0,1 M, pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze. Po zakończeniu umieścić probówki w temperaturze 4 °C na 24 godziny.
2. Przykładowy proces osadzania
- Po przemyciu 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,4) 5 razy przez 15 minut każdy, inkubować paski siatkówki z roztworem zawierającym 1,5% żelazocyjanku potasu i 1% OsO4 (w PB, pH 7,4) w 0,1 M kakodylanu sodu z 4 mM CaCl2 przez 1,5 h w ciemności na lodzie.
UWAGA: Ciemna inkubacja i brak fosforanów mogą zapobiec wytrącaniu się osadów i artefaktom w próbce. - Przemyj paski siatkówki 3 razy w ddH2O przez 10 minut każdy, a następnie potraktuj 1% tiokarbohydrazydem w ddH2O przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Po przepłukaniu w ddH2O 3 razy przez 15 minut każdy, inkubować paski siatkówki w 2% OsO4 (w PB, PH 7,4) przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Po przemyciu w ddH2O 3 razy przez 15 minut każdy, zanurzyć paski siatkówki w 1% wodnym octanie uranylu w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc.
- Następnego dnia, po umyciu w ddH2O 3 razy po 15 minut, potraktuj paski siatkówki 0,66% azotanem ołowiu w kwasie L-asparaginowym (0,03 M, pH 5,5) przez 40 minut w temperaturze 65 °C.
- Po przemyciu w ddH2O 3 razy przez 15 minut każdy, odwodnić paski siatkówki rosnącym stężeniem etanolu 30%, 50%, 70%, 90% i 100% przez 20 minut w każdym roztworze.
- Paski siatkówki należy traktować mieszanym roztworem zawierającym równy etanol i aceton przez 20 minut, a następnie płukać acetonem 2 razy po 20 minut.
- Naciekać paski siatkówki w acetonie/żywicy zmieszanym w stosunku 7:3 w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc, a następnie acetonem/żywicą w proporcji 3:7 w ciemności przez 24 godziny w temperaturze
UWAGA: Dokładny skład żywicy jest następujący: Epon812 10,06 ml, DDSA 4 mL, MNA 5,94 ml i DMP-30 0,2 ml. - Następnego dnia należy wymienić rurki i infiltrować paski siatkówki czystą żywicą przez 24 godziny w temperaturze 45 °C. Następnego dnia ponownie wymienić żywicę i zatopić paski siatkówki na 48 godzin w temperaturze 60 °C.
UWAGA: Celem zwiększenia temperatury jest poprawa penetracji.
3. Wybór obszaru zainteresowań
- Pokrój bloki żywicy na odcinki o grubości 1 μm, wybarwij skrawki 1% błękitu toluidynowego i obserwuj ogólną strukturę siatkówki pod mikroskopią świetlną, aby wybrać szorstkie obszary zainteresowania.
- Pokryj bloki żywicy platyną za pomocą napylarki, a następnie miel o grubości 70 nm za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów pod prądem 0,23 nA i napięciem przyspieszenia 30 kV.
- Wstępnie prześwietl sekcję za pomocą FIB-SEM z 2000-krotnym powiększeniem, aby zidentyfikować dokładne obszary zainteresowania.
- Zbieraj dane za pomocą FIB-SEM o prądzie wiązki 0,69 nA i napięciu przyspieszenia 2 kV. Pozostałe parametry są następujące: czas przebywania = 2 μs, rozmiar woksela = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1A przedstawia obraz zakończeń fotoreceptorów siatkówki przygotowanych tradycyjną metodą chemicznej podwójnej fiksacji, a Rycina 1B przedstawia obraz zakończeń fotoreceptorów siatkówki przygotowanych metodą OTO. W obu przypadkach próbki pobrano za pomocą FIB-SEM. Wyraźnie widać, że zastosowanie metody OTO pozwala na maksymalne zachowanie struktury błony komórkowej, a widoczne są nawet kontury pęcherzyków. Ponadto kontrast obrazów uzyskanych metodą OTO jes...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wdrożyliśmy protokół przygotowania próbki Volume EM firmy OTO do analizy końcowej struktury fotoreceptorów w tkance siatkówki. Skupiono się na szczegółowym omówieniu całej procedury, począwszy od odwarstwienia i unieruchomienia siatkówki, a skończywszy na przedstawieniu wyników rekonstrukcji 3D zakończeń aksonów fotoreceptorów.
Charakterystyczną cechą tkanki siatkówki, w przeciwieństwie do tkanki mózgowej, jest brak różnic regionalnych. Siatkówka, składająca się z trzech warstw ciał komórek ne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Mikroskopia elektronowa | acetonu | 10000 | |
| Amira 6.8 | Thermo Fisher Scientific | ||
| CaCl2 | Sigma | C-2661 | |
| Forma do zatapiania | Beijing Zhongjingkeyi Technology | GP10590 | |
| Epon żywica | Mikroskopia elektronowa Science | 14900 | |
| Etanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Aldehyd glutarowy | Mikroskopia elektronowa Science | 16020 | |
| Helios NanoLab 600i dwuwiązkowy SEM | FEI | ||
| Kwas L-asparaginowy | Sigma | 56-84-8 | |
| Azotan ołowiu | Sigma | 10099-74-8 | |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | Składnik buforu fosforanowego |
| NaH2PO4. H2O | Sigma | 71507 | Składnik buforu fosforanowego |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Paraformaldehydowa | mikroskopia elektronowa Science | 157-8 | |
| Żelazocyjanek potasu | Sigma | 14459-95-1 | |
| Kakodylan sodu | Sigma | 6131-99-3 | |
| Napylarka | Leica | ACE200 | |
| Tiokarbohydrazyd | Sigma | 2231-57-4 | |
| Octan uranylu | TED PELLA | CA96049 |
Bibliografia
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
- Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
- Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
- Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
- Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
- Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
- Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
- Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
- Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944(2011).
- Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024(2016).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916(2017).
- Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
- Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).
- Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
- Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
- Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
- Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
- Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98(2018).
- Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
