Artykuł metodologiczny

Technika chirurgicznej implantacji kości w modelach cukrzycy i osteoporozy kości piszczelowej szczura

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66591

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona, 2Department of Oral Surgery, Davallmed Clinic. Porto, 3Biomaterials, Biomechanics and Tissue Engineering Group, Department of Materials Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Barcelona Research Centre in Multiscale Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 5Department of Periodontology, Davallmed Clinic. Porto, 6Department of Odontostomatology, University of Barcelona, 7Oral Health and Masticatory System Research Group at the Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 8Preclinical imaging platform, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 9Preclinical Therapeutics Core, Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 10Animal facility, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 11UCSF Gnotobiotics Core Facility, University of California, San Francisco, 12Human Anatomy and Embryology Unit, Experimental Pathology and Therapeutics Department, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona

W tym artykule

Podsumowanie

Umieszczenie implantów w modelu szczurzym jest niezbędną procedurą eksperymentalną dla badań klinicznych. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół chirurgiczny do wszczepiania implantów tytanowych do kości piszczelowej modeli szczurzych z cukrzycą i osteoporozą.

Streszczenie

Szczur od dawna służy jako cenny model zwierzęcy w implantologii stomatologii i ortopedii, szczególnie w badaniu interakcji między biomateriałami a tkanką kostną. Kość piszczelowa szczura jest często wybierana ze względu na łatwy dostęp chirurgiczny przez cienkie warstwy tkanek (skóra i mięśnie) oraz spłaszczony kształt przyśrodkowej powierzchni, ułatwiający chirurgiczne wprowadzenie wkładek doszpikowych. Ponadto model ten umożliwia indukcję określonych chorób, naśladując różne stany kliniczne w celu oceny reakcji biologicznych na różne warunki implantu, takie jak geometria, tekstura powierzchni lub wskazówki biologiczne. Jednak pomimo solidnej struktury kory mózgowej, niektóre urządzenia dokostnialne mogą wymagać dostosowania konstrukcji i rozmiaru w celu pomyślnej implantacji. Dlatego ustanowienie ustandaryzowanych metod chirurgicznych do manipulowania zarówno miękkimi, jak i twardymi tkankami w obszarze implantacji jest niezbędne do zapewnienia prawidłowego umieszczenia implantu lub urządzenia śrubowego, szczególnie w dziedzinach takich jak stomatologia implantologiczna i ortopedia. W badaniu tym wzięło udział osiemdziesiąt szczurów Sprague Dawley podzielonych na dwie grupy w zależności od ich chorób: grupa 1 z osteoporozą i grupa 2 z cukrzycą typu 2. Implantacje wykonywano po 4 i 12 tygodniach, przy czym ten sam chirurg stosował spójną technikę chirurgiczną. Zaobserwowano pozytywną odpowiedź biologiczną, wskazującą na pełną osteointegrację wszystkich wszczepionych implantów. Wyniki te potwierdzają powodzenie protokołu chirurgicznego, który może zostać powtórzony w innych badaniach i służyć jako punkt odniesienia dla społeczności zajmującej się biomateriałami. Warto zauważyć, że wartości osteointegracji pozostały stabilne zarówno po 4 tygodniach, jak i 12 tygodniach dla obu modeli choroby, co świadczy o trwałej integracji implantu w czasie i kładzie nacisk na ustanowienie ścisłego połączenia kostnego już po 4 tygodniach.

Wprowadzenie

Częstym wyborem szczurów jako obiektów doświadczalnych jest fakt, że są one łatwe do wyhodowania i stosunkowo tanie w porównaniu do większych modeli zwierzęcych. Pojawienie się nowych procedur, takich jak wiarygodne odtwarzanie zaburzenia, np. osteoporozy lub cukrzycy, sprawia, że model ten jest szczególnie przydatny do analizy potencjalnego zastosowania leczenia i/lub wpływu choroby na biologiczną odpowiedź na leki i urządzenia lub procedury chirurgiczne1,2.

Przyrost masy kostnej szczura występuje głównie w ciągu pierwszych 6 miesięcy życia, chociaż niektórzy badacze uważają, że długa kość rośnie stale przez co najmniej rok wraz z postępującym wzrostem długości1. Wraz z wiekiem następuje przejście od modelowania do przebudowy, które nie występuje we wszystkich przypadkach jednakowo w całej kości2. Samice szczurów Sprague Dawley rosną wolniej niż samce szczurów i osiągają niższą wagę niż samce szczurów1. Ciągłe wydłużanie kości i zróżnicowana dynamika przebudowy kości u szczurów to czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy rozwiązywaniu problemów zdrowotnych u ludzi; Jednak do tej pory nie udało się znaleźć żadnych badań eksperymentalnych, które wskazywałyby na trwający całe życie rozwój kości szczurów lub niezdolność gatunku do przebudowy Bone1. Jeśli eksperyment rozpocznie się około 10 miesiąca życia, margines co najmniej 1 mm od płytki wzrostowej kości piszczelowej powinien pozostać nienaruszony ze względu na ten podłużny wzrost kości, co należy wziąć pod uwagę w badaniach nad implantami dentystycznymi2. Hormony są również kluczowym parametrem w badaniach nad kośćmi, ponieważ w wieku 8 miesięcy stwierdzono, że samce szczurów mają o 22% większą szerokość kości i o 33% większą wytrzymałość na łamanie niż samice w klasie tibia3.

Niezawodne odwzorowanie zaburzenia jest więc bardzo ważne w ortopedii i implantologii stomatologicznej, ponieważ osteointegracja ortopedycznej lub implantu dentystycznego jest złożonym procesem, który zależy od wielu czynników wpływających na odpowiedź systemową na implantację urządzenia do kości. Wiadomo, że zaburzenia ogólnoustrojowe, takie jak osteoporoza i cukrzyca, wpływają na wskaźnik sukcesu w ortopedii i stomatologii implantologicznej, więc wiarygodne odtworzenie tych zaburzeń w modelach szczurzych można zastosować do zbadania sposobów przezwyciężenia tych ograniczeń.

piszczel szczura, ze względu na łatwy dostęp chirurgiczny, umiarkowaną objętość kości i płaski kształt na przyśrodkowej płytce, sprawia, że nadaje się do eksperymentów chirurgicznej implantacji kości4,5, i był używany w licznych badaniach naukowych badających wpływ powierzchni implantu na osteointegrację4,5,6. Coraz więcej badań ocenia wpływ powłok i substancji dodawanych do powierzchni implantu na osteointegrację zarówno u zdrowych zwierząt7, jak i u zwierząt zagrożonych chorobą dotkniętych cukrzycą lub osteoporozą8,9,10,11,12,13,14.

Liczba implantów umieszczonych w piszczelach jednego szczura jest ograniczona i może się różnić w zależności od rodzaju badania. W zależności od liczby implantów lub warunków badania, wymiary urządzeń muszą być dostosowane, aby zminimalizować uraz chirurgiczny. W badaniach z jednym implantem można umieścić implant o rozmiarach zbliżonych do ludzkiego (2,0 mm średnicy i 4 do 5 mm długości) i uzyskać zakotwiczenie dwukorowe6,7,15,16. Wymiary implantów w protokołach wieloimplantowych powinny przyjmować odpowiedni rozmiar implantu (1,5 mm średnicy i 2,5 mm długości)4,17.

Niniejsze badanie ma na celu opisanie standardowego protokołu chirurgicznego umieszczania tytanowego implantu na kości piszczelowej dwóch modeli szczurów: modelu szczurzego osteoporozy i modelu szczurzego z cukrzycą. Ponadto badanie to pozwala na przetestowanie protokołu chirurgicznego w celu oceny różnych rodzajów biofunkcjonalizacji powierzchni implantu i jej wpływu na osteointegrację.

Próba 80 szczurów została podzielona na dwie grupy. W grupie 1 wybrano 40 samic Sprague Dawley poddanych owariektomii i 5 zwierząt pozorowanych, o średniej masie ciała 484 g i średnim wieku 12 tygodni. Na podstawie zaleceń dostawcy (patrz Tabela materiałów), trzy miesiące po kastracji rozpoczęto eksperyment. Ten okres oczekiwania zapewnił zanik hormonów płciowych. Osteoporoza została potwierdzona w czasie operacji na podstawie analizy kości za pomocą mikrotomografii komputerowej (mikro-CT), która wykazała średnio 20% utratę masy kostnej w porównaniu z grupą pozorowaną. Grupa 2 składała się z 40 genetycznie zmodyfikowanych szczurów Sprague Dawley z cukrzycą typu II (Bio Breeding Diabetes Resistant) z BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant). Średnia waga wynosiła 730 g, a średni wiek wynosił 12 tygodni. Przed operacją stan cukrzycowy został potwierdzony trzema kolejnymi dniami pomiarów glikemii z wynikami wyższymi niż 200 mg/dl. Glukozę mierzono glukometrem w ciągu 6 godzin postu, a kroplę krwi pobierano przez nakłucie ogona.

Zastosowano

Zastosowano tytanowe implanty klasy 3 o długości 2 mm i średnicy 1,8 mm. Wszystkie implanty zostały wysterylizowane w warunkach czystych, poprzez ultradźwiękowe czyszczenie w cykloheksanie (3 razy przez 2 min), acetonie (raz przez 1 min), wodzie dejonizowanej (3 razy przez 2 min), etanolu (3 razy przez 2 min) i acetonie (3 razy przez 2 min) przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej (230 VAC, 50/60 Hz, 360 W). Następnie próbki osuszono gazowym azotem, a wiązkę azotu o ciśnieniu 0,5 bara nałożono bezpośrednio na próbki. Przed implantacją implanty najpierw namoczono w wodzie dejonizowanej, a następnie zanurzono w 70% etanolu (v/v) na 10 minut. Następnie implanty przeniesiono do sterylnych probówek mikrowirówkowych i przechowywano w sterylnych warunkach aż do operacji.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (dyrektywa 2010/63/UE), zaimplementowanymi w prawie hiszpańskim (dekret królewski 53/2013) i przepisami Generalitat de Catalunya (dekret 214/97). Zatwierdzenie etyczne dla wszystkich procedur i obchodzenia się z zwierzętami zostało uzyskane od Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach Vall D'Hebron Institut de Recerca (numer rejestracyjny 72/18 CEEA). Do modelu osteoporotycznego wykorzystano samice szczurów Sprague Dawley o średniej wadze 484 g i średnim wieku 12 tygodni. Jeśli chodzi o model cukrzycowy, wykorzystano genetycznie zmodyfikowane samice szczurów BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) o średniej wadze 730 g i średnim wieku 12 tygodni. Wszystkie zwierzęta pochodziły od komercyjnego dostawcy. Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu wykorzystanego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Anestezjologia/farmakologia i przygotowanie zwierząt

  1. Przedoperacyjne znieczulenie należy podawać za pomocą buprenorfiny w dawce 0,05 mg/kg mc. i meloksykamu w dawce 2 mg/kg mc. we wstrzyknięciach podskórnych 10-15 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
  2. Znieczulenie śródoperacyjne należy wykonać wziewnym izofluranem: rozpocząć od 5% na świeżym powietrzu podczas indukcji i utrzymać na poziomie 3%. Wywołać znieczulenie w komorze szczura i utrzymać dopływ izofluranu z adaptacją stożka nosa podczas operacji.

2. Przygotowanie do zabiegu

  1. Zmierz temperaturę ciała znieczulonego zwierzęcia za pomocą sondy doodbytniczej i użyj elektronicznie sterowanej poduszki grzewczej w celu wsparcia termicznego przez cały zabieg chirurgiczny. Przed rozpoczęciem zabiegu należy nałożyć maść do oczu, aby uniknąć suchości rogówki.
    UWAGA: W razie potrzeby maść należy ponownie nałożyć po sprawdzeniu suchości oczu.
  2. Przytnij włosy golarką elektryczną i nałóż krem do depilacji, aby wyeliminować pozostałą sierść.
  3. Uzyskaj aseptyczne pole chirurgiczne, czyszcząc skórę kolana we wzorze jodu i 70% (v/v) etanolu za pomocą sterylnych wacików, zaczynając od wewnątrz i przesuwając się na zewnątrz linii nacięcia bez cofania. Wykonaj co najmniej trzy kolejne rotacje czyszczenia (jod-etanol-jod).
  4. Odizoluj pole operacyjne, umieszczając sterylną zasłonę chirurgiczną z okienkami nad zwierzęciem, odsłaniając nogę przez centralny otwór (Rysunek 1).

3. Chirurgia

  1. Narażenie chirurgiczne
    1. Wykonaj nacięcie skóry o pełnej grubości o długości około 1 cm pionowo wzdłuż proksymalnej granicy przednio-przyśrodkowej powierzchni kości piszczelowej, w okolicy przynasady, aby odsłonić kość (Ryc. 2).
    2. Ustabilizuj nogę i przyciągnij skórę do leżącej pod nią kości podczas wykonywania nacięcia, upewniając się, że czyste nacięcie pozostaje we właściwym miejscu. Zarządzaj, czyszcząc spodziewane lekkie krwawienie kompresem nasączonym roztworem soli fizjologicznej (Rysunek 2).
      UWAGA: Skóra szczura jest cienka i obwisła lub luźna. Stabilizacja skóry jest kluczowa i wymagana.
    3. Całkowicie odłącz tkankę od kości za pomocą małych wind okostnej (Ryc. 3).
    4. Odsłaniaj kość do momentu zidentyfikowania przyczepu mięśnia piszczelowego czaszkowego, gracilis i mięśnia brzuchatego łydki bocznej głowy w tylnej granicy przyśrodkowej części kości piszczelowej, jako włóknistej białej tkanki mocno przylegającej do kości (Ryc. 3).
      UWAGA: Ważne jest, aby zidentyfikować tę grupę przyczepów mięśniowych, aby umożliwić umieszczenie implantu w obszarze kości o podobnych cechach i bodźcach w całej próbce, niezależnie od wielkości szczura.
  2. Proces wiercenia
    1. Rozpocznij proces wiercenia we właściwym obszarze między bliższym grzebieniem piszczelowym a tylną granicą przyśrodkowej powierzchni kości piszczelowej, przylegającej do przyczepu mięśnia piszczelowego czaszkowego, gracilis i bocznego mięśnia głowy brzuchatego łydki, unikając urazów mięśni.1
      UWAGA: Prawidłowa lokalizacja powinna znajdować się w odległości 5 mm ± 2 mm od płaskowyżu piszczelowego.
    2. Wiercić z maksymalną prędkością 150 obr./min (obr./min) pod nawadnianiem roztworem soli w temperaturze bliskiej 20 °C za pomocą elektrycznego silnika chirurgicznego z kątnicą redukcyjną 20:1.
      UWAGA: Wymagane były tylko dwa ćwiczenia.
    3. Zacznij od wiertła pilotującego lancą (Rysunek 4) na głębokości 2,4 mm pod nawadnianiem roztworem soli fizjologicznej.
      UWAGA: Każde wiertło miało maksymalnie 10 zastosowań.
    4. Jako drugie wiertło użyj (Rysunek 4) wiertła o konstrukcji skrętnej na głębokości 2,4 mm i średnicy 1,6 mm pod roztworem soli.
      UWAGA: Każde wiertło miało maksymalnie 10 zastosowań.
  3. Wszczepienie implantu
    1. Włóż implant za pomocą elementu pośredniego (Rysunek 5) przymocowanego do kątownika redukcyjnego 20:1.
    2. Przed wszczepieniem implantu należy go oczyścić z wszelkich pozostałości chemicznego środka sterylizującego, obracając go w kątnicy z jednoczesnym nawadnianiem solą fizjologiczną przez 10 sekund (Rysunek 5).
    3. Umieść tytanowy implant (2 mm wzdłuż i 1,8 mm średnicy) za pomocą elementu pośredniego z prędkością 20 obr./min, monitorując wartość momentu obrotowego w czasie rzeczywistym, rejestrując maksymalny moment wkłuwania.
      UWAGA: Spodziewana jest początkowa trudność we wprowadzeniu implantu ze względu na różnicę między końcowym wiertłem a implantem, a także cylindryczny profil implantu; Jednak ta początkowa trudność szybko się normalizuje, gdy tylko implant przeniknie do początkowej kości korowej.
    4. Zakończ wprowadzanie implantu, zanim całkowicie przejdzie przez kość korową, w której jest wprowadzany, czyli płaską przyśrodkową powierzchnię kości piszczelowej.
      UWAGA: W końcowym momencie wszczepienia implantu ważne jest, aby pozostawić implant nieco poza kością korową lub na poziomie kości korowej, w której jest wprowadzany, czyli płaskiej przyśrodkowej powierzchni kości piszczelowej, aby zapewnić pierwotną stabilność (Ryc. 6).
  4. Zamykanie ran
    1. Zszyj granice tkanki mięśniowej prostymi szwami wewnętrznymi za pomocą syntetycznego szwu resorbowalnego 4/0 monofilamentowego (glikonian) (Rysunek 7).
    2. Wykonaj zamknięcie skóry za pomocą szwu śródskórnego za pomocą syntetycznego szwu resorbowalnego 4/0 monofilamentowego (glikonian) (Rysunek 7).

4. Badanie mikrotomografią komputerową

  1. Po zakończeniu zabiegu, nadal w znieczuleniu ogólnym, należy wykonać badanie mikrotomografią komputerową w celu potwierdzenia prawidłowego wszczepienia implantu.
  2. Usuń szczura z łóżka chirurgicznego i umieść go na łóżku do skanowania. Zlokalizuj operowaną nogę za pomocą trybu skanowania na żywo mikrotomografii komputerowej i wyśrodkuj pole widzenia na implancie.
    UWAGA: Zalecane parametry akwizycji to pole widzenia 5 mm, rozdzielczość przestrzenna 0,0001 mm3, 50 kV, 200 μA oraz czas akwizycji 3 min.
  3. Po uzyskaniu skanu potwierdź prawidłową odległość między bliższym aspektem implantu a powierzchnią płaskowyżu piszczelowego, zgodnie z krokiem 5.2.1.
    UWAGA: Ta wartość będzie pomocna dla standaryzacji techniki (Rysunek 8).

5. Opieka pooperacyjna

  1. Po pobraniu obrazowania należy umieścić szczura z powrotem w klatce i monitorować aż do pełnego wyzdrowienia.
    UWAGA: Zajmuje to około 5-10 minut, w zależności od modelu zwierzęcia. Oczekuje się, że szczury z cukrzycą pozostaną dłużej znieczulone i będą miały dłuższy czas rekonwalescencji ze względu na zmiany metaboliczne związane z cukrzycą.
  2. Buprenorfinę (0,1 mg/kg) podaje się co 6-8 godzin, a meloksykam (5 mg/kg) co 24 godziny, podskórnie, do 72 godzin.
  3. Czas usuwania szwów
    1. Codziennie badaj ranę chirurgiczną pod kątem infekcji, integralności szwów lub innych problemów i usuń resztki szwów, jeśli to konieczne, 15 dni po operacji.

6. Eutanazja

  1. Poddaj zwierzęta eutanazji za pomocą komory CO2, zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH), ze wskaźnikiem wypełnienia CO2 wynoszącym 30%-70% objętości komory / min po czasie implantacji (4 tygodnie lub 12 tygodni).

7. Analiza pooperacyjna

  1. W przypadku obu modeli (osteoporoza i cukrzyca) po eutanazji należy usunąć kość piszczelową przez rozczłonkowanie w celu dalszej analizy.
    UWAGA: Jeśli chodzi o analizę mikro-CT, dane pozwoliły na obliczenie kontaktu kości z implantem (BIC). Akwizycję tomografii komputerowej przeprowadzono przy użyciu wcześniej opisanych parametrów, a analizę BIC wykonano poprzez podzielenie obszaru kostnego (mm2) przez obszar implantu (mm2) obliczony w obszarze korowym, adaptując protokół opisany już w literaturze18. Reprezentatywne obrazy są pokazane dla każdego modelu, osteoporozy (Rysunek 9) i cukrzycy (Rysunek 10).

Wyniki

Faza chirurgiczna
Należy zaznaczyć, że oba modele zwierzęce wykorzystane w niniejszym badaniu wykazują pewne ograniczenia wynikające z indukowanych chorób. Ograniczenia te w zakresie manipulacji tkankami twardymi i miękkimi objawiają się podczas procedury chirurgicznej.

W modelu cukrzycowym szczur jest większy, co utrudnia stabilizację kończyn podczas procedur chirurgicznych. Zwiększa to czas trwania operacji, a w konsekwencji czas znieczulenia, co wydłuża okres rekonwalescencji i wymaga zatem większej czujności w okresie pooperacyjnym.

W przypadku modelu osteoporotycznego wymagania były zupełnie inne, koncentrując się bardziej na etapie manipulacji kostnej. W tym przypadku można zaobserwować silniejsze krwawienie podczas procedury wiercenia. Ponadto proces osadzania implantu staje się trudniejszy. Mogą wystąpić pewne powikłania, takie jak niewielkie pęknięcia w kości, co zmienia przebieg wprowadzania implantu i czyni go bardziej niestabilnym ze względu na brak oporu kostnego na bocznych ściankach implantu. Ograniczenie to wymaga większego nacisku manualnego i stabilizacji podczas osadzania, co utrudnia kontrolę do momentu uzyskania prawidłowego położenia implantu.

W odniesieniu do maksymalnego momentu obrotowego wprowadzenia implantu, dla obu jednostek chorobowych zaobserwowano stosunkowo różne wartości (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, maksymalny średni moment obrotowy wprowadzenia zaobserwowany w modelu osteoporozy był wyższy niż w modelu cukrzycy. W świetle tych wyników interesujące jest zrozumienie wpływu cukrzycy na gęstość kości oraz odporność kości na wprowadzenie implantu, ponieważ stan ten wydaje się mieć bardziej znaczący wpływ na właściwości mechaniczne kości w porównaniu z osteoporozą.

Analiza pooperacyjna
Prawidłowe umiejscowienie implantów tytanowych po 4 i 12 tygodniach od implantacji przeanalizowano za pomocą obrazowania mikro-CT. Reprezentatywne obrazy przedstawiono dla szczurów z osteoporozą (Rycina 9) oraz z cukrzycą (Rycina 10). Ogólnie implanty zostały prawidłowo osadzone w korowej i beleczkowej części kości piszczelowych, wykazując ścisły i ciągły kontakt z częścią korową, bez żadnych oznak stanu zapalnego czy reakcji niepożądanych, co potwierdziło skuteczność protokołu chirurgicznego dla obu modeli patologii.

Łącznie analiza obrazów pozwoliła również na obliczenie stosunku powierzchni kości (mm2)2) w stosunku do powierzchni implantu (mm2), określane jako V(BIC), w obszarze kory, oraz porównując efektywność procedury chirurgicznej w czasie i pomiędzy modelami. Jak pokazano w Rysunek 11Wartości V(BIC) pozostały stałe dla modelu osteoporotycznego w 4. i 12. tygodniu, co wskazuje na stabilną integrację implantu w czasie i podkreśla, że ścisłe połączenie z kością jest zapewnione już w 4. tygodniu. Warto odnotować, że uzyskano bardzo podobne wartości dla modelu cukrzycowego, co wykazuje adekwatność protokołu badania dla obu modeli patologii.

Układ do sekcji zwierząt; instrumenty chirurgiczne ustawione do procedury; edukacyjny eksperyment biologiczny.
Rysunek 1: Pole operacyjne. Pole operacyjne ukazujące prawidłowe ułożenie szczura i odsłonięcie obszaru interwencji, dopasowanie stożkowego adaptora do dróg oddechowych w celu utrzymania anestezji podczas procedury, a także instrumenty niezbędne do zabiegu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Procedura chirurgiczna przedstawiająca technikę nacięcia na obrzękniętej tkance.
Rycina 2: Nacięcie chirurgiczne. Prawidłowa stabilizacja łapy szczura oraz jednoczesne unieruchomienie cienkiej, ruchomej skóry w celu wykonania prawidłowego nacięcia. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat techniki chirurgicznej przedstawiający procedurę nacięcia tkanki zwierzęcej w badaniu weterynaryjnym.
Rycina 3: Odsłonięcie kości i identyfikacja przyczepów mięśniowych. Po lewej stronie: całkowite oddzielenie tkanek z wynikającym odsłonięciem kości. Aby zachować i uniknąć uszkodzenia przyczepów mięśnia tibialis cranialis, mięśnia gracilis oraz bocznej głowy mięśnia gastrocnemius, ważne jest prawidłowe zidentyfikowanie włóknistej białej tkanki ściśle przylegającej do kości, widocznej na rycinie po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura chirurgiczna na modelu zwierzęcym; etapy nacięcia i wiercenia; ustawienie badawcze, weterynaryjne i eksperymentalne.
Rycina 4: Kolejność wiercenia. Sekwencja procesu wiercenia rozpoczyna się od wiertła pilotującego po lewej stronie, a następnie od wiertła skręcanego po prawej stronie. Aby zapewnić stabilną i bezpieczną procedurę wiercenia, ważne jest utrzymanie stabilizacji zarówno kończyny, jak i tkanek miękkich podczas wiercenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza techniki wiertła stomatologicznego, precyzyjny instrument, zestaw kliniczny, interakcja z gazą, badanie stomatologiczne.
Rysunek 5: Przygotowanie do osadzenia implantu. Implant jest mocowany do elementu pośredniego, który zostaje poddany procesowi czyszczenia roztworem soli fizjologicznej podczas obrotu implantu z prędkością 20 rpm. Element pośredni ten umożliwia wprowadzenie implantu do kości za pomocą urządzenia elektronicznego. Urządzenie to zapewnia kontrolę prędkości wprowadzania implantu i rejestruje moment obrotowy w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Seria procedur chirurgicznych, wszczepienie implantu, technika medyczna, zbliżenie, operacja krok po kroku.
Rysunek 6: Umieszczenie implantu tytanowego. Wszczepienie implantu do kości wymaga jego umieszczenia na płaskiej powierzchni przyśrodkowej kości, z dala od proksymalnej krawędzi powierzchni przednio-przyśrodkowej kości. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Procedura chirurgiczna na modelu mysim; układ eksperymentalny do badania tkanek i analizy procesu gojenia.
Rycina 7: Zamknięcie rany. Kroki zamykania rany przedstawiono w dwóch różnych płaszczyznach. Po lewej: pierwsza, głębsza płaszczyzna jest zamykana prostymi szwami w celu zbliżenia brzegów tkanki mięśniowej. Po prawej: druga, bardziej powierzchowna płaszczyzna jest zamykana szwem wewnątrzskórnym w celu zbliżenia skóry przy jednoczesnym zapobieganiu zewnętrznemu położeniu węzła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment obrazowania CT kości szczura w skanerze rentgenowskim, pokazujący analizę przekroju poprzecznego kości.
Rycina 8: Skan mikro-CT umiejscowienia implantu po zabiegu chirurgicznym. Rycina ilustruje ułożenie szczura w skanerze mikro-CT, a obrazy pozycji implantu są podzielone na trzy sekcje, odpowiadające odpowiednio widokom w osiach x, y i z. Implant jest wskazany czerwoną strzałką w różnych widokach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie skanów CT, analiza umieszczenia implantu stomatologicznego, widoki osiowe i przekrojowe, badanie radiologiczne.
Rysunek 9: Skan micro-CT implantu umieszczonego w kości piszczelowej szczura z osteoporozą. Reprezentatywne obrazy micro-CT po operacji z implantami tytanowymi umieszczonymi w kościach piszczelowych szczurów z osteoporozą po (A) 4 tygodniach i (B) 12 tygodniach implantacji. Każdy obraz jest podzielony na trzy sekcje, odpowiadające odpowiednio widokom w osiach x, y i z. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie skanów CT; interfejs implant-kość; implanty w kształcie litery U i O; analiza integralności strukturalnej.
Rysunek 10: Skan mikro-CT implantu umieszczonego w kości piszczelowej szczura z cukrzycą. Reprezentatywne pooperacyjne obrazy mikro-CT implantów tytanowych umieszczonych w kościach piszczelowych szczurów z osteoporozą po (A) 4 tygodniach i (B) 12 tygodniach implantacji. Każdy obraz jest podzielony na trzy sekcje, odpowiadające odpowiednio widokom w osiach x, y i z. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy stosunku kości do implantu; VBIC=pole powierzchni kości/pole powierzchni implantu; porównanie Osteo vs Diab w 4. i 12. tygodniu.
Rysunek 11: Analiza kontaktu kości z implantem (BIC). Wartości V(BIC) obliczone jako pole powierzchni kości (mm2) *100/ pole powierzchni implantu (mm2) na podstawie obrazów mikro-CT dla modeli z osteoporozą (Osteo) i cukrzycą (Diab) po 4 tygodniach (4 w) i 12 tygodniach (12 w) od implantacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Maksymalny moment obrotowy wkręcania implantu [N·cm]
ModelPrawa nogaLewa noga
Osteoporoza6.11 ± 0.966.49 ± 1.34
Cukrzyca4.79 ± 1.704.90 ± 1.76

Tabela 1: Maksymalny moment obrotowy podczas wkręcania. Różnice w wartościach maksymalnego momentu obrotowego uzyskane podczas wkręcania implantów u szczurów z cukrzycą oraz szczurów z osteoporozą. Szczury z cukrzycą wykazują niższe wartości maksymalnego momentu obrotowego niż szczury z osteoporozą.

Dyskusja

Chociaż szczur jest szeroko stosowanym modelem do badania osteointegracji, ważne jest, aby zdefiniować i opisać powtarzalną technikę chirurgiczną do odpowiedniego umieszczania implantów. Taka technika może służyć jako przewodnik dla społeczności naukowej. Co więcej, fakt, że niektóre choroby, takie jak osteoporoza i cukrzyca, zmieniają metabolizm kości, implikuje większe wymagania dotyczące prawidłowego projektowania zabiegów chirurgicznych. Szczur wypada korzystnie w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, ponieważ prezentuje główne cechy zarówno osteoporozy (spontaniczne i mało dotkliwe złamania), jak i cukrzycy oraz otyłości wywołanej dietą, nie wymagając kosztownych specjalistycznych urządzeń i długich, kosztownych eksperymentów oraz kontrolii konserwacji pooperacyjnej. Mały rozmiar szczura, wysoka płodność i krótka żywotność ułatwiają przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę, efektywnych czasowo, przy jednoczesnym spełnieniu trzech wymagań R eksperymentów na zwierzętach (wymiana, redukcja i udoskonalenie)20.

Pomimo znacznej ilości literatury naukowej w tej dziedzinie, istnieje tylko kilka artykułów naukowych opisujących szczegółowe techniki chirurgiczne. Jednak zdecydowana większość pomija kluczowe informacje chirurgiczne, uniemożliwiając w ten sposób odtworzenie opisanych technik.

W tym protokole chirurgicznym należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych etapów podczas całej procedury chirurgicznej, takich jak lokalizacja nacięcia, dokładne miejsce wiercenia i umieszczenia implantu, technika wiercenia, dokładne wymiary implantu i końcowe wiertło używane do wprowadzenia implantu.

W literaturze dokładna lokalizacja nacięcia jest często nieprecyzyjna, brakuje podstaw naukowych do jego umiejscowienia. Nacięcie powinno być wykonane w innym miejscu niż miejsce wszczepienia implantu. Ważne jest, aby unikać umieszczania nacięcia i następującego po nim szwu bezpośrednio nad wszczepionym obszarem, aby zachować integralność okostnej oderwanej powyżej implantu. Nacięcie i początkowe oderwanie płata o pełnej grubości może zakłócić dopływ krwi i uszkodzić okostną, potencjalnie prowadząc do zaburzenia aktywności komórek okostnej podczas tworzenia nowej kości, jak zaobserwowano w innych badaniach21. Podejście to ma na celu optymalizację tworzenia kości wokół implantu i zminimalizowanie urazów, złego gojenia, zwłóknienia lub ryzyka kolonizacji bakteryjnej w obszarze szwu. W tej metodzie nacięcie jest szczegółowe i wykonane w bliższym grzebieniu piszczelowym, upewniając się, że nie znajduje się bezpośrednio nad miejscem wszczepienia implantu.

Podczas określania obszaru do wszczepienia implantu kluczowe znaczenie ma zapewnienie jednolitej gęstości kości w całej próbce. Zazwyczaj pomiary odnoszą się do płaskowyżu piszczelowego. Biorąc pod uwagę podłużne różnice w wielkości wśród szczurów, konieczne jest odniesienie anatomiczne, aby konsekwentnie umieszczać implanty w tym samym obszarze. W tej metodzie obszar przylegający do przyczepu kości piszczelowej czaszki, gracilisa i bocznych mięśni głowy brzuchatego łydki służy jako wiarygodne odniesienie anatomiczne. Oczekuje się, że ten obszar, charakteryzujący się przyczepami mięśniowymi, będzie wykazywał jednorodną gęstość kości w całej próbce.

Omawiając metodę wiercenia, ważne jest, aby podać dokładne informacje na temat rodzaju/wymiarów wiertła, prędkości wiercenia (zwykle mierzonej w obr./min) oraz temperatury roztworu soli. Czynniki te są niezbędne w zapobieganiu rozległemu obszarowi martwiczemu i późniejszemu tworzeniu się tkanki włóknistej22,23, jak podkreślono w kilku badaniach skoncentrowanych na reakcjach nekrotycznych wywołanych wierceniem. Jednak niektóre artykuły przekraczają te biologiczne limity24 w swoich metodach wiercenia, podczas gdy inne całkowicie pomijają tę kluczową informację 4,25,26,27,28. Badanie to podkreśla skrupulatne środki ostrożności podejmowane podczas zabiegów wiercenia w celu zmniejszenia urazów chirurgicznych i martwicy tkanek. Zdecydowaliśmy się na bezpieczną procedurę wiercenia z prędkością ograniczoną do 150 obr./min, czyli poziomem uważanym za bezpieczny pod względem temperatury kości nawet bez roztworu soli fizjologicznej. Takie podejście jest skuteczne pod względem prędkości wiercenia i pozwala na dobrą kontrolę wiercenia podczas zabiegu 29,30. Dodatkowo utrzymywaliśmy nawadnianie i chłodzenie roztworem soli w temperaturze około 20 °C, aby jeszcze bardziej złagodzić potencjalne efekty termiczne.

Kolejną istotną informacją, która jest często pomijana, jest rozmiar zastosowanego implantu. Pominięcie to uniemożliwia interpretację zależności pomiędzy wielkością końcowego wiertła a wielkością implantu. Rozbieżność ta ma kluczowe znaczenie w ocenie stabilności implantu, co w deficycie może prowadzić do niestabilności, natomiast w nadmiarze może powodować nadmierne ciśnienie i reakcję niedokrwienno-martwiczą.

Ważne jest, aby pamiętać, że aby osiągnąć pierwotną stabilność, powinna istnieć niewielka różnica w średnicy między ostatnim wiertłem a implantem, przy czym implant ma nieco większą średnicę. Ten krytyczny parametr chirurgiczny dla osiągnięcia pierwotnej stabilności nie zawsze jest spójny w literaturze, ponieważ niektóre metodologie obejmują końcowe wiertło o większej średnicy niż implant umieszczony4. Biorąc pod uwagę, że obszar ten charakteryzuje się przyczepami mięśniowymi, oczekuje się jednorodnej i solidnej gęstości kości w całej próbce. Ta cecha pomaga uniknąć podstawowego ograniczenia zgłaszanego w przypadku interwencji piszczelowych szczurów, a mianowicie podłużnego wzrostu kości piszczelowej w czasie31. Dodatkowo metoda ta pozwala na kontrolę temperatury, eliminując jedną z przyczyn powikłań i późniejszej zachorowalności23. Jednak, podobnie jak inne badania, to badanie również napotyka na ograniczenie dotyczące konieczności dostosowania urządzenia ze względu na różnice w rozmiarze piszczeli 4,17.

Kolejną kwestią związaną z liczbą wykorzystanych zwierząt jest znaczenie wyboru odpowiedniej wielkości próby. Ma to kluczowe znaczenie dla maksymalizacji wpływu wyników badań przy jednoczesnej minimalizacji wykorzystania zwierząt. Taka strategia nie tylko poprawia efektywność i wiarygodność badań, ale także kładzie nacisk na względy etyczne w badaniach naukowych. Należy nadal dążyć do optymalizacji tej wydajności.

Podsumowując, niniejsza metoda dostarcza szczegółowego opisu wszystkich zabiegów chirurgicznych i pozwala na obserwację różnych wyzwań chirurgicznych w obu chorobach. Co więcej, protokół ten wyróżnia się jako ważna metoda, ponieważ wszystkie próbki mające bezpośredni kontakt z kością osiągnęły stabilne wartości V(BIC). Różni się jednak od większości badań eksperymentalnych w literaturze tym, że przedstawia szczegółową i uzasadnioną technikę, co pozwala na dokładne odtworzenie. W związku z tym może być stosowany do badania wpływu różnych powierzchni implantów na różne choroby, w tym te wpływające na gęstość kości.

Oświadczenia

Niniejszym oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów w związku z tym artykułem naukowym.

Podziękowania

Autorzy dziękują Hiszpańskiej Państwowej Agencji Badawczej za wsparcie finansowe poprzez projekty PID2020-114019RBI00 i PID2021-125150OB-I00.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 22 G + A2: C30TerumoNN-2238R
4/0 monofilamentowy syntetyczny resorbowalny szewBraun ( MonoSyn)
5 mL, strzykawki 10 mlBraun4617100V-02 4606051V
Kleszcze AdsonAntã oNr ref. medyczny: A586
BBDR (biohodowla odporna na cukrzycę) Sprague Dawley RatsJanvier Labs
BetadineMylan
BuprecareAnimalcare (Wielka Brytania)
Castroviejo Suwmiarka 0-40 mm 15 cm kątowaUL AMIN Industries
Castroviejo Uchwyt igłyAntã o Nr medyczny: AM1702
Nożyczki do chirurgii dentystycznej zakrzywione i prosteAntã o Golarka elektrycznaMedical AMA603 / AMA600
Oster Pro 3000i34264482227
Ekstra drobne kleszcze GraefeFSTNr ref.: 11150-10
GazikiCOVIDIEN441001
GlukometrMenarini (Włochy)
Wiertło helikoidalne / WIERTARKA OSTEO-PIN & Oslash; 1,6 mmsoadcoRef. OS-8001
Implanty / ŚRUBA OSTEO-PIN & Oslash; 1,8 x 2,0 mmsoadcoRef. OS-3
IsofloLe Vet Pharma (Holandia)
Wiertło pilotujące lanca / Wiertło lancetowate (DS)soadcoRef. 10 02 01 T
Rękawice lateksowe - Rękawice chirurgiczne sterylneHartmannRef: 9426495
Lucas Curette SurgicalCurette Antã o Nr ref. medyczny: AMA940-3
MetacamBoehringer Ingelheim (Niemcy)
Mikro kleszcze prostenopaNr ref.: AB 542/12
Mikrotomografia komputerowa ( Quantum Fx microCT )Perkin Elmer (USA)
Osteoporotyczny Sprague Dawley samice SzczuryJanvier Labs Winda
okostna -  Linienie 2-4mrówkowe i tyldowe; o Nr medyczny: A1564
Fizjologiczne rozwiązanie do nawadnianiaHygitechNr ref.: 10238
Ostrze skalpela ze stali węglowej 15CRazor MedNr ref.: 02846
Sterylne waciki z gazyAlledentalNr ref.: 270712
Sterylny system nawadnianiaHygitechNr ref.: HY1-110001D
Sterylne ręczniki (1 sztuka na zwierzę)Dinarex4410
Rękojeść chirurgiczna przeciwkątniczaW& HRef: WS-75 LED G
Rękojeść chirurgiczna przeciwkątniczaW& HSN 08877
Rękojeść chirurgiczna kątnicaW& HSN 01309
Chirurgiczny silnik elektrycznyWH Implantmed Typ: SI-1023  Nr ref.: 30288000
Rękojeść do skalpela chirurgicznegoAsaDentalNr ref.: 0350-3
Zaciski do ręcznikówXelpov chirurgiczneAF-773-11
Urządzenie ultradźwiękoweJ.P. Selecta, Abrera, Hiszpania

Bibliografia

  1. Turner, R. T., et al. Animal models for osteoporosis. Rev Endocr Metab Disord. 2 (1), 117-127 (2001).
  2. Jee, W. S., Yao, W. Overview: Animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (3), 193-207 (2001).
  3. Kim, B. T., et al. The structural and hormonal basis of sex differences in peak appendicular bone strength in rats. J Bone Miner Res. 18 (1), 150-155 (2003).
  4. Alenezi, A., Galli, S., Atefyekta, S., Andersson, M., Wennerberg, A. Osseointegration effects of local release of strontium ranelate from implant surfaces in rats. J Mater Sci Mater Med. 30 (10), 116(2019).
  5. Blanc-Sylvestre, N., Bouchard, P., Chaussain, C., Bardet, C. Pre-clinical models in implant dentistry: Past, present, future. Biomedicines. 9 (11), 1538(2021).
  6. Schliephake, H., et al. Functionalization of titanium implants using a modular system for binding and release of VEGF enhances bone-implant contact in a rodent model. J Clin Periodontol. 42 (3), 302-310 (2015).
  7. Mafra, C. E. S., et al. Effect of different doses of synthetic parathyroid hormone (1-34) on bone around implants: A preclinical rat model. Braz Dent J. 30 (1), 43-46 (2019).
  8. Rybaczek, T., Tangl, S., Dobsak, T., Gruber, R., Kuchler, U. The effect of parathyroid hormone on osseointegration in insulin-treated diabetic rats. Implant Dent. 24 (4), 392-396 (2015).
  9. Zou, G. K., et al. Effects of local delivery of bfgf from plga microspheres on osseointegration around implants in diabetic rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 114 (3), 284-289 (2012).
  10. Zhang, J., et al. Effect of nerve growth factor on osseointegration of titanium implants in type 2 diabetic rats. Int J Oral Maxillofac Implants. 31 (5), 1189-1194 (2016).
  11. Kuchler, U., et al. Intermittent parathyroid hormone fails to stimulate osseointegration in diabetic rats. Clin Oral Implants Res. 22 (5), 518-523 (2011).
  12. Hashiguchi, C., Kawamoto, S., Kasai, T., Nishi, Y., Nagaoka, E. Influence of an antidiabetic drug on biomechanical and histological parameters around implants in type 2 diabetic rats. Implant Dent. 23 (3), 264-269 (2014).
  13. Han, Y., et al. Sustained topical delivery of insulin from fibrin gel loaded with poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres improves the biomechanical retention of titanium implants in type 1 diabetic rats. J Oral Maxillofac Surg. 70 (10), 2299-2308 (2012).
  14. De Molon, R. S., et al. Impact of diabetes mellitus and metabolic control on bone healing around osseointegrated implants: Removal torque and histomorphometric analysis in rats. Clin Oral Implants Res. 24 (7), 831-837 (2013).
  15. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of c57bl/6j and c57bl/6n mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  16. Cirano, F. R., et al. Effect of curcumin on bone tissue in the diabetic rat: Repair of peri-implant and critical-sized defects. Int J Oral Maxillofac Surg. 47 (11), 1495-1503 (2018).
  17. De Oliveira, M. A., et al. The effects of zoledronic acid and dexamethasone on osseointegration of endosseous implants: Histological and histomorphometrical evaluation in rats. Clin Oral Implants Res. 26 (4), e17-e21 (2015).
  18. Vandeweghe, S., Coelho, P. G., Vanhove, C., Wennerberg, A., Jimbo, R. Utilizing micro-computed tomography to evaluate bone structure surrounding dental implants: A comparison with histomorphometry. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 101 (7), 1259-1266 (2013).
  19. Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 140-162 (2018).
  20. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: Innovation, implementation, ethics and society. Front Vet Sci. 10, 1185706(2023).
  21. Melcher, A. H. Role of the periosteum in repair of wounds of the parietal bone of the rat. Arch Oral Biol. 14 (9), 1101-1109 (1969).
  22. Barrak, I., et al. Heat generation during guided and freehand implant site preparation at drilling speeds of 1500 and 2000 rpm at different temperatures: An in vitro study. Oral Health Prev Dent. 17 (4), 309-316 (2019).
  23. Kniha, K., et al. Effect of thermal osteonecrosis around implants in the rat tibia: Numerical and histomorphometric results in context of implant removal. Sci Rep. 12 (1), 22227(2022).
  24. Da Silva, J. P., et al. Apoptosis in bone defect of diabetic rats treated with low intensity laser: Radiological and immunohistochemical approach. International Journal of Morphology. 35, 178-183 (2017).
  25. Zeller-Plumhoff, B., et al. Analysis of the bone ultrastructure around biodegradable Mg-χGd implants using small angle X-ray scattering and X-ray diffraction. Acta Biomater. 101, 637-645 (2020).
  26. Bruns, S., et al. On the material dependency of peri-implant morphology and stability in healing bone. Bioact Mater. 28, 155-166 (2023).
  27. De Morais, J. A., et al. Effect of diabetes mellitus and insulin therapy on bone density around osseointegrated dental implants: A digital subtraction radiography study in rats. Clin Oral Implants Res. 20 (8), 796-801 (2009).
  28. Aydemir Celep, N., Kara, H., Erbas, E., Dogan, E. Radioprotective role of amifostine on osteointegration of titanium implants in the tibia of rats. J Vet Sci. 24 (3), 35(2023).
  29. Delgado-Ruiz, R. A., et al. Slow drilling speeds for single-drill implant bed preparation. Experimental in vitro study. Clin Oral Investig. 22 (1), 349-359 (2018).
  30. Abdel Motagly, M., El Khadem, A., Abdel Rassoul, M. Assessment of low-speed drilling without irrigation, versus convencionaldrilling with irrigation regarding heat generation and peri-implant marginal bone loss (randomised clinical trial). Alex Dent J. 46 (2), 33-38 (2021).
  31. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model ko ci piszczelowej szczuratechnika chirurgicznamodel cukrzycymodel osteoporozyosseointegracjaimplantologia stomatologicznaimplant tytanowyko korowamanipulacja tkankami mi kkimi

Powiązane artykuły