Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66595

⸱

8 marca 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Streszczenie

Systemy ekspresji bezkomórkowej (CFE) są potężnymi narzędziami w biologii syntetycznej, które umożliwiają biomimikrę funkcji komórkowych, takich jak biodetekcja i regeneracja energii w komórkach syntetycznych. Rekonstrukcja szerokiego zakresu procesów komórkowych wymaga jednak pomyślnego odtworzenia białek błonowych w błonie komórek syntetycznych. Podczas gdy ekspresja rozpuszczalnych białek jest zwykle skuteczna w powszechnych systemach CFE, rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych komórek syntetycznych okazała się wyzwaniem. W tym artykule przedstawiono metodę rekonstytucji modelowego białka błonowego, bakteryjnego receptora glutaminianu (GluR0), w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) jako modelowych komórkach syntetycznych opartych na enkapsulacji i inkubacji reakcji CFE wewnątrz komórek syntetycznych. Wykorzystując tę platformę, wykazano wpływ zastąpienia N-końcowego peptydu sygnałowego GluR0 peptydem sygnałowym proteorodopsyny na udaną kotranslacyjną translokację GluR0 do błon hybrydowych GUV. Metoda ta zapewnia solidną procedurę, która pozwoli na bezkomórkową odtworzenie różnych białek błonowych w komórkach syntetycznych.

Wprowadzenie

Biologia syntetyczna oddolna zyskała coraz większe zainteresowanie w ciągu ostatniej dekady jako rozwijająca się dziedzina z licznymi potencjalnymi zastosowaniami w bioinżynierii, dostarczaniu leków i medycynie regeneracyjnej1,2. Rozwój komórek syntetycznych jako kamienia węgielnego oddolnej biologii syntetycznej, w szczególności, przyciągnął szerokie grono społeczności naukowych ze względu na obiecujące zastosowania komórek syntetycznych, a także ich właściwości fizyczne i biochemiczne podobne do komórek, które ułatwiają badania biofizyczne in vitro3,4,5,6. Komórki syntetyczne są często konstruowane w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych wielkości komórki (GUV), w których odtwarzane są różne procesy biologiczne. Rekonstytucja cytoszkieletu komórkowego7,8, regeneracja energii zależnej od światła9, komunikacja komórkowa10,11, oraz biosensing12 to przykłady prób rekonstrukcji zachowań podobnych do komórkowych w komórkach syntetycznych.

Podczas gdy niektóre procesy komórkowe opierają się na rozpuszczalnych białkach, wiele cech naturalnych komórek, takich jak wykrywanie i komunikacja, często wykorzystuje białka błonowe, w tym kanały jonowe, receptory i transportery. Głównym wyzwaniem w rozwoju komórek syntetycznych jest odtworzenie białek błonowych. Chociaż tradycyjne metody rekonstytucji białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych opierają się na oczyszczaniu za pośrednictwem detergentów, takie metody są pracochłonne, nieskuteczne w przypadku białek, które są toksyczne dla gospodarza ekspresji lub często nie nadają się do rekonstytucji białek błonowych w GUVs13.

Alternatywną metodą ekspresji białek są systemy ekspresji bezkomórkowej (CFE). Systemy CFE są potężnym narzędziem w biologii syntetycznej, które umożliwia ekspresję in vitro różnych białek przy użyciu lizatu komórkowego lub oczyszczonej maszynerii transkrypcyjno-translacyjnej14. Systemy CFE mogą być również zamknięte w GUV, co pozwala na podział na przedziały reakcji syntezy białek, które można zaprogramować do różnych zastosowań, takich jak tworzenie syntetycznych komórek zbierających światło9 lub biosensory mechanowrażliwe15,16. Analogicznie do metod ekspresji białek rekombinowanych, ekspresja białek błonowych jest wyzwaniem w systemach CFE17. Agregacja, nieprawidłowe fałdowanie i brak modyfikacji potranslacyjnej w systemach CFE są głównymi wąskimi gardłami, które utrudniają pomyślną syntezę białek błonowych przy użyciu systemów CFE. Trudność w oddolnej rekonstytucji białek błonowych przy użyciu systemów CFE wynika częściowo z braku złożonego szlaku biogenezy białek błonowych, który opiera się na peptydach sygnałowych, cząstkach rozpoznających sygnał, translokonach i cząsteczkach opiekuńczych. Jednak ostatnio wiele badań sugerowało, że obecność błoniastych struktur, takich jak mikrosomy lub liposomy, podczas translacji sprzyja skutecznej ekspresji białek błonowych18,19,20,21. Ponadto Eaglesfield i in. oraz Steinküher i wsp. odkryli, że włączenie specyficznych domen hydrofobowych znanych jako peptydy sygnałowe do N-końca białka błonowego może znacznie poprawić jego ekspresję22,23. Podsumowując, badania te sugerują, że wyzwanie związane z rekonstytucją białek błonowych w komórkach syntetycznych można pokonać, jeśli translacja białka zachodzi w obecności błony GUV i jeśli wykorzystany zostanie odpowiedni N-końcowy peptyd sygnałowy.

Tutaj przedstawiono protokół enkapsulacji syntezy białek za pomocą reakcji CFE z rekombinowanymi elementami (PURE) do rekonstytucji białek błonowych w GUV. Bakteryjny receptor glutaminianu < klasa sup = "xref">24 (GluR0) jest wybierany jako modelowe białko błonowe i badany jest wpływ jego N-końcowego peptydu sygnałowego na rekonstytucję błony. Wpływ peptydu sygnałowego proteorodopsyny, który, jak wykazano w celu poprawy skuteczności rekonstytucji białek błonowych przez Eaglesfield i wsp.22, jest badany poprzez konstruowanie zmutowanego wariantu GluR0 oznaczonego jako PRSP-GluR0 oraz porównanie jego ekspresji i lokalizacji błony z GluR0 typu dzikiego (określanego dalej jako WT-GluR0), który zawiera jego natywny peptyd sygnałowy. Protokół ten jest oparty na metodzie odwróconej emulsji25 z modyfikacjami, które sprawiają, że jest on niezawodny dla enkapsulacji CFE. W przedstawionej metodzie reakcje CFE są najpierw emulgowane przy użyciu roztworu lipid w oleju, który generuje kropelki o wielkości mikronów, które zawierają układ CFE i są stabilizowane przez monowarstwę lipidową. Kropelki emulsji są następnie nakładane warstwami na powierzchnię styku olej-woda, która jest nasycona kolejną monowarstwą lipidową. Kropelki emulsji są następnie zmuszane do przemieszczania się przez granicę faz olej-woda za pomocą siły odśrodkowej. W wyniku tego procesu kropelki uzyskują kolejną monowarstwę, tworząc w ten sposób dwuwarstwowy pęcherzyk lipidowy. GUV zawierające reakcję CFE są następnie inkubowane, podczas której białko błonowe ulega ekspresji i jest włączane do błony GUV. Chociaż protokół ten jest określony dla bezkomórkowej ekspresji GluR0, może być używany do bezkomórkowej syntezy innych białek błonowych lub różnych zastosowań w komórkach syntetycznych, takich jak rekonstytucja cytoszkieletu lub badania fuzji błonowej26.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyte do tego badania znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Masowe reakcje CFE w obecności małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV)

  1. Przygotowanie do SUV-a
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w dygestorii zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa dotyczącymi pracy z chloroformem.
    1. Przygotować 5 mM 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholiny (POPC) SUV w szklanej fiolce, przenosząc 76 μl 25 mg/ml roztworu podstawowego POPC rozpuszczonego w chloroformie.
    2. Delikatnie obracając szklaną fiolkę, wdmuchnąć delikatny strumień argonu do fiolki, aby utworzyć warstwę wysuszonych lipidów na dnie. Następnie przenieść szklaną fiolkę do eksykatora z luźno zakręconą nakrętką w celu odparowania nadmiaru chloroformu.
    3. Przechowywać szklaną fiolkę w eksykatorze przez 1 godzinę. Następnie dodaj 0,5 ml ultraczystej wody dejonizowanej, aby rozpuścić film lipidowy i wirować przez około 2 minuty.
    4. Skonfiguruj mini-aparat do wytłaczania, mocząc dwa wsporniki filtra w wodzie dejonizowanej i umieszczając je na każdym z wewnętrznych wsporników membrany. Następnie namocz filtr poliwęglanowy o długości fali 100 nm i umieść go między dwoma wewnętrznymi wspornikami membrany połączonymi zewnętrzną obudową ekstrudera i nakrętką ustalającą. Umieść tę konfigurację w stojaku ekstrudera.
    5. Przepłucz dwie gazoszczelne strzykawki o pojemności 1 ml 3 razy ultraczystą wodą dejonizowaną.
    6. Załaduj próbkę mieszanki lipidowo-wodnej do jednej z gazoszczelnych strzykawek o pojemności 1 ml i umieść ją na jednym końcu mini ekstrudera za pomocą zacisków ramienia wahadłowego, aby utrzymać strzykawkę na miejscu. Włóż drugą strzykawkę do drugiego końca mini-ekstrudera i upewnij się, że jest całkowicie wciśnięta.
      UWAGA: Podczas ładowania strzykawki mieszanką lipidów i wody, upewnij się, że w strzykawce nie ma powietrza przed przepuszczeniem jej przez mini-ekstruder.
    7. Delikatnie przepuścić mieszaninę lipidowo-wodną z oryginalnej strzykawki do pustej strzykawki przez mini-ekstruder. Powtórz ten krok 11 razy, aby utworzyć SUV-y. Przenieś SUV-y do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Roztwór SUV można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  2. Zespół reakcyjny CFE
    1. Przygotować reakcję CFE, postępując zgodnie z protokołem ekspresji bezkomórkowej dostarczonym przez producenta z niewielkimi modyfikacjami szczegółowo opisanymi poniżej.
    2. Wymieszać 10 μL roztworu 1 (zawierającego aminokwasy, NTP, tRNA i substraty dla enzymów oraz niezbędny bufor), 1 μL roztworu 2 (białka w 20% glicerolu), 2 μL roztworu 3 (rybosom (20 μM)), odpowiednią ilość DNA kodującego dla rozpuszczalnego sfGFP-sfCherry(1-10)27 (zwanego dalej rozpuszczalnym sfGFP), WT-GluR0-sfGFP lub PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 par zasad), 1 μl mysiego inhibitora RNAzy i 4 μl 5 mM roztworu SUV dla białek błonowych lub 4 μl wody dla białek rozpuszczalnych.
    3. Doprowadzić końcową objętość reakcji do 20 μl, dodając ultraczystą wodę dejonizowaną.
      UWAGA: Podczas montażu systemu CFE wszystkie elementy muszą być trzymane na lodzie. Wszystkie materiały są wrażliwe na temperaturę i mogą ulec degradacji, jeśli osiągną temperaturę pokojową.
  3. Inkubacja i monitorowanie reakcji CFE
    1. Przenieś roztwór CFE na 96-dołkową stożkową płytkę dolną w kształcie litery V. Aby zapobiec parowaniu w trakcie reakcji, przykryj płytkę folią uszczelniającą.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w czytniku płytek przez 4-5 godzin, monitorując reakcję CFE, mierząc sygnał GFP o wzmocnieniu 100 przy długościach fal wzbudzenia/emisji 488 nm/528 nm co 2 minuty.

2. Reakcje CFE zamknięte w GUV

  1. Przygotowanie zewnętrznego roztworu buforowego GUV
    1. W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wymieszać 1,5 μl 1 M spermidyny, 37,5 μl 100 mM ATP, 25 μl 100 mM GTP, 12,5 μl 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M fosforanu kreatyny, 18 μL 1 M octanu magnezu, 93,33 μl 3 M glutaminianu potasu, 50 μl 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μl 332 mM kwasu folinowego, 100 μL 2 M glukozy i 50 μl z roztworu podstawowego 6 mM mieszaniny każdego z 20 aminokwasów (przygotowanych zgodnie z protokołem opisanym przez Sun et al.28).
    2. Doprowadzić ostateczną objętość roztworu do 1 ml, dodając ultra oczyszczoną wodę dejonizowaną.
      UWAGA: Wszystkie elementy muszą być trzymane na lodzie. Dodaj mieszaninę aminokwasów na końcu, aby uniknąć wyczerpania aminokwasów28. Roztwór można podzielić na porcje w 330 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Przygotowanie mieszaniny lipidów w oleju
    UWAGA: ten krok należy wykonać w dygestoriach zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa dotyczącymi pracy z chloroformem.
    1. W dygestorium wymieszać 17,3 μl roztworu podstawowego POPC o stężeniu 25 mg/ml i 1,08 μl kopolimeru poli(butadienu)-b-poli(tlenku etylenu) (PEO-b-PBD) o stężeniu 50 mg/ml w szklanej fiolce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Końcowy roztwór lipidów w oleju zawiera 0,5 mM lipidów z odpowiednio 95% i 5% POPC i PEO-b-PBD. PEO-b-PBD zastosowano w celu zwiększenia stabilności błony podczas ekspresji białka, ale utrzymywano go na niskim poziomie molowym, aby zmniejszyć tendencję kopolimeru do agregacji w micele oddzielone od cząsteczek lipidów29,30.
    2. Ostrożnie wdmuchnąć delikatny strumień argonu do szklanej fiolki, obracając fiolkę w celu odparowania chloroformu.
    3. Odpipetować pipetą 1,2 ml lekkiego oleju mineralnego do szklanej fiolki o pojemności 15 ml zawierającej osuszone lipidy.
    4. Wymieszaj lipidy i olej, wirując z maksymalną prędkością przez 10-20 sekund. Rozpuszczona mieszanina kopolimerów lipidowych będzie wyglądać na mętną.
    5. Aby upewnić się, że wszystkie możliwe agregaty lipidowe w oleju są całkowicie rozpuszczone i rozproszone w oleju, umieść szklaną fiolkę w piecu w temperaturze około 50 °C na 20 minut, a następnie wiruj przez dodatkowe 10-20 s z maksymalną prędkością.
  3. Montaż i enkapsulacja reakcji CFE (Rysunek 1 podsumowuje następujące kroki).
    1. Przygotować 300 μl roztworu zewnętrznego GUV w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, mieszając 270 μl zewnętrznego roztworu buforowego CFE przygotowanego w kroku 2.1, 15 μl 5 M NaCl i 15 μl 4,5 M KCl.
      UWAGA: Na tym etapie dodać 0,45 μl 1 M 1,4-ditiotreitolu (DTT) do roztworu zewnętrznego GUV. Celem dodania NaCl i KCl jest dostosowanie osmolalności roztworu zewnętrznego w celu dopasowania go do wewnętrznego roztworu CFE. Dokładna objętość NaCl i KCl zależy od pożądanej regulacji osmolalności. Można dodać NaCl lub KCl lub oba, aby dostosować osmolalność.
    2. Delikatnie odpipetować 300 μl mieszaniny lipidów w oleju na wierzchu zewnętrznego roztworu GUV.
      UWAGA: Podczas dodawania mieszanki lipidów i oleju ważne jest, aby olej nie mieszał się z wodnym roztworem zewnętrznym. Po dodaniu powinna być widoczna granica między mieszaniną lipidów w oleju a zewnętrznym roztworem GUV.
    3. Inkubować granicę faz olej-woda w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby umożliwić utworzenie monowarstwy lipidowej i ustabilizowanie się na granicy faz.
    4. W międzyczasie postępuj zgodnie z sekcją 1.2.1, aby złożyć reakcję CFE zawierającą plazmidowe DNA kodujące warianty białka błonowego lub rozpuszczalny GFP. Zastąp 4 μl 5 mM roztworu SUV lub wody 4 μl 1 M sacharozy. Ta reakcja będzie wewnętrznym rozwiązaniem GUV.
      UWAGA: Do pomiaru osmolalności roztworów wewnętrznych i zewnętrznych użyto osmometru. Osmolalność roztworu zewnętrznego została następnie odpowiednio dostosowana przez dodanie NaCl lub wody. Osmolalność reakcji CFE wynosi zwykle około 1600 mOsm/kg. Dodanie sacharozy do reakcji zwiększa wewnętrzną gęstość roztworu, umożliwiając w ten sposób pęcherzykom przemieszczanie się przez granicę faz olej-woda podczas etapu wirowania. Alternatywą dla sacharozy jest roztwór gradientu gęstości Opti-Prep.
    5. Dodać 600 μl mieszaniny lipidów i oleju do probówki mikrowirówki zawierającej reakcję CFE i energicznie pipetować w górę iw dół przez ~1 min, aby emulgować reakcję w roztworze lipid-in-oil i utworzyć monowarstwę lipidową wokół komórek syntetycznych.
      UWAGA: Końcowy roztwór nie powinien mieć żadnych pęcherzyków i powinien wyglądać na nieprzezroczysty.
    6. Delikatnie odpipetować wewnętrzną emulsję roztworu na wierzchu warstwy oleju w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, w której ustawiono interfejs olej-woda.
      UWAGA: Uważaj, aby nie przeszkadzać ani nie destabilizować interfejsu.
    7. Wirować przez 10 minut przy 2.000 x g w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Prędkość wirowania została zoptymalizowana dla tego protokołu. Adir et al.31 podali inną prędkość wirowania.
    8. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń nadmiar oleju i roztwór zewnętrzny z probówki mikrowirówki za pomocą pipetora. Usunąć roztwór zewnętrzny, aż pozostała objętość wyniesie około 100 μl.
      UWAGA: Na dnie probówki mikrowirówki zwykle widoczne są osady GUV. Jednak brak widocznego granulatu nie musi oznaczać braku plonu GUV. Zamiast używać pipetora, nadmiar oleju z wierzchu roztworu zewnętrznego można usunąć przez aspirację. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że roztwór lipidów w oleju został całkowicie usunięty. Zanieczyszczenie olejem w roztworze GUV może powodować niską jakość obrazów.
    9. Zawiesić granulat GUV w pozostałych 100 μl roztworu, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie przenieść roztwór GUV na czystą, 96-dołkową, przezroczystą płaską płytkę denną w celu inkubacji.

3. Inkubacja i obrazowanie reakcji CFE w kapsułkach

  1. Przykryj płytkę folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-6 godzin. Można użyć czytnika płytek i postępować zgodnie z krokiem 1.3.2, aby przygotować czytnik płytek do etapu inkubacji.
  2. Po zakończeniu inkubacji umieść 96-dołkową płytkę na stoliku do obrazowania mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę EMCCD (lub kamerę sCMOS), laser sterowany DAQ-MX (lub zintegrowany system sumowania laserowego) i konfokalny dysk wirujący CSU-X1 (lub konfokalny skaning laserowy). Skoncentruj się na dowolnym ROI zawierającym GUV i rejestruj obrazy o długości fali wzbudzenia 488 nm za pomocą obiektywu Plan-Apochromat 60 x/1,4 NA.
  3. Zapisz obrazy GUV w formacie .tiff.
  4. Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (np. ImageJ lub Fidżi). Otwórz panel ustawień Jasność/Kontrast. Dostosuj jasność i kontrast do odpowiednich ustawień, które sprawią, że białka fluorescencyjne będą widoczne.
  5. Jeśli celem jest porównanie intensywności sygnału różnych białek ulegających ekspresji, najpierw ułóż poszczególne obrazy GUV zawierające różne białka, korzystając z panelu Obrazy do stosu znajdującego się w podmenu Obraz > Stosy. Następnie dostosuj jasność i kontrast wszystkich obrazów za pomocą panelu Jasność/Kontrast.

Wyniki

Przed enkapsulacją reakcji CFE, dwa warianty GluR0-sfGFP zawierające natywne i proteorhodopsinowe peptydy sygnałowe (sekwencje peptydów sygnałowych przedstawiono w Supplementary Table 1) oraz rozpuszczalne sfGFP wyprodukowano indywidualnie w reakcjach objętościowych, a ich ekspresję monitorowano poprzez wykrywanie sygnału sfGFP za pomocą czytnika płytek (Figure 2A). Białka błonowe eksponowano w obecności lub przy braku 100 nm SUVs. Dodatkowo, wykorzystując krzywą kalibracyjną korelującą sygnał sfGFP z jego stężeniem (Supplementary Figure 1), oszacowano stężenia syntetyzowanych białek (Supplementary Table 2). Wyraźnie widać, że rozpuszczalne sfGFP wykazywało najwyższą ekspresję spośród trzech białek, co sugeruje, że ekspresja białek błonowych obciąża system CFE, spowalniając tym samym reakcję i obniżając jej wydajność. Ponadto średnio reakcje wykazujące ekspresję białek błonowych w obecności SUVs wykazywały wyższy sygnał sfGFP w porównaniu do reakcji bez SUVs. Obserwacja ta jest zgodna z wynikami Steinkühera i wsp., którzy wykazali, że ekspresja białek błonowych zmniejsza zdolność systemów CFE do produkcji białek23. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę pomyślną demonstrację ekspresji białek w objętościowej reakcji CFE, można założyć, że enkapsulowane CFE będzie również syntetyzować białka wewnątrz GUVs.

Następnie poszczególne reakcje CFE zamknięto w GUV za pomocą metody emulsji odwróconej, aby wyexpronować warianty GluR0, mianowicie WT-GluR0, PRSP-GluR0 oraz rozpuszczalne sfGFP. Podczas gdy WT-GluR0, zawierający natywny peptyd sygnałowy GluR0, wykazał doskonałą ekspresję i lokalizację błonową (Rysunek 2B, panel lewy), jego odpowiednik, PRSP-GluR0, posiadający N-końcowy peptyd sygnałowy proteorodopsyny, nie wykazał tak silnej lokalizacji błonowej. Stwierdzono, że PRSP-GluR0 jest bardziej podatny na agregację i tworzenie punktowych skupień (Rysunek 2B, panel środkowy). Zgodnie z oczekiwaniami, rozpuszczalne sfGFP zostało wyexpronowane w GUV i pozostało w ich lumenie (Rysunek 2B, panel prawy; obrazy grup GUV znajdują się w Rysunku uzupełniającym 2).

Tworzenie pęcherzyków z diblockowego kopolimeru; schemat montażu PEO-PBD z wykorzystaniem etapów wirowania.
Rysunek 1: Kroki eksperymentalne emulsji odwróconej. (1) Etapy od 2.3.1 do 2.3.3 protokołu są zwizualizowane, aby zademonstrować tworzenie się monowarstwy lipidowej na granicy fazy mieszaniny lipidowo-olejowej i zewnętrznego roztworu buforowego. (2) Przedstawiono wizualizację kroku 2.3.5 protokołu, obrazującą tworzenie się monowarstwy lipidowej wokół emulsyficowanych kropel kapsułkujących wewnętrzny roztwór CFE. (3) Krok 2.3.6 protokołu pokazuje dodanie monowarstwowych GUV do probówki do mikrowirówki z monowarstwą lipidową na granicy fazy mieszaniny lipidowo-olejowej i zewnętrznego roztworu buforowego. (4) Przedstawiono krok 2.3.7, w którym wirowanie prowadzi do powstania osadu GUV w roztworze zewnętrznym. (5) Pokazano krok 2.3.8, wskazujący proces usuwania nadmiaru mieszaniny lipidów w oleju oraz roztworu zewnętrznego. (6) Na koniec przedstawiono krok 2.3.9, w którym osad GUV zostaje resuspendowany w roztworze zewnętrznym, a GUV są gotowe do inkubacji, a następnie do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywe wzrostu fluorescencji i obrazy mikroskopowe; ekspresja białek w różnych warunkach.
Rysunek 2: Ekspresja białek w reakcjach CFE w objętości całkowitej oraz w GUV zawierających reakcje CFE. (A) Odczyty fluorescencji poszczególnych reakcji CFE w objętości całkowitej z ekspresją WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP oraz rozpuszczalnego sfGFP. Wykres dla rozpuszczalnego sfGFP przedstawia sygnał z reakcji o objętości 2,5 µL (standardowa objętość reakcji wynosi 20 µL), aby uniknąć przesycenia pomiarów czytnika płytek. Dane przedstawiono jako średnia ± S.D, n = 3. (B) Lewo: Reprezentatywny obraz konfokalny GUV zawierającej reakcję CFE z ekspresją WT-GluR0-sfGFP. Środek: Reprezentatywny obraz konfokalny GUV zawierających reakcję CFE z ekspresją PRSP-GluR0-sfGFP. Prawo: Reprezentatywny obraz konfokalny GUV zawierającej reakcję CFE z ekspresją rozpuszczalnego sfGFP. Paski skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Krzywa kalibracyjna sygnału sfGFP oraz odpowiadająca jej analiza regresji liniowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywny obraz konfokalny grup GUVs wykazujących ekspresję (od lewej) WT-GluR0-sfGFP, (środek) PRSP-GluR0-sfGFP oraz (od prawej) rozpuszczalnego sfGFP. Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencja aminokwasowa peptydów sygnałowych typu dzikiego i proteorodopsyny. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Stężenie zsyntetyzowanych białek w reakcjach CFE w skali masowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Praktycznie każdy proces komórkowy, który zależy od przenoszenia cząsteczek lub informacji przez błonę komórkową, taki jak sygnalizacja komórkowa lub pobudzenie komórki, wymaga białek błonowych. W związku z tym rekonstytucja białek błonowych stała się głównym wąskim gardłem w realizacji różnych projektów komórek syntetycznych do różnych zastosowań. Tradycyjna rekonstytucja białek błonowych w błonach biologicznych za pośrednictwem detergentów wymaga metod generowania GUV, takich jak delikatne pęcznienie lub elektroformacja. Metody pęcznienia zwykle wytwarzają pęcherzyki o małych rozmiarach, a wydajność elektroformacji znacznie spada, gdy skomplikowane roztwory, co często ma miejsce w przypadku generowania komórek syntetycznych, są zamknięte w kapsułkach32. Dodatkowo detergenty rozpuszczają białko błonowe, a ich usunięcie podczas procesu rekonstytucji może powodować nieprawidłowe fałdowanie białek33,34. Z drugiej strony, przedstawione tutaj podejście opiera się na kotranslacyjnym włączaniu białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej, która bardziej przypomina naturalny szlak biogenezy białek w komórkach22.

Z technicznego punktu widzenia przedstawiony protokół jest korzystny w porównaniu z innymi popularnymi metodami enkapsulacji, takimi jak elektroformacja i ciągła enkapsulacja 7,8,35,36 (cDICE), co ułatwia wdrożenie, ponieważ jedynym sprzętem laboratoryjnym wymaganym do generowania GUV jest wirówka. W przeciwieństwie do elektroformacji, metoda emulsji odwróconej pozwala na enkapsulację różnych kombinacji cząsteczek o różnych stężeniach. Dodatkowo, w porównaniu z oryginalną techniką emulsji odwróconej25, podejście to pozwala na uzyskanie bardziej stabilnych GUV, które nadają się do enkapsulacji lizatów CFE lub systemów PURE. Wyższa stabilność GUV wynika z obecności kopolimeru diblokowego w składzie membrany GUV37, a także długiej inkubacji granicy faz olej-woda, która pozwala na nasycenie granicy faz cząsteczkami lipidów. Wreszcie, w przeciwieństwie do podejść mikroprzepływowych, przedstawiony tutaj protokół nie wymaga małych kanałów i rurek. W związku z tym reakcja CFE może być zamknięta w kapsułki zaraz po jej zmontowaniu, a krótszy czas montażu GUV ze względu na brak przepływu i możliwe zatkanie zapobiega przedwczesnemu rozpoczęciu reakcji CFE. Chociaż demonstracja ekspresji białek błonowych w tym protokole jest wyłączna dla reakcji PUREfrex, można rozszerzyć tę metodę o syntezę białek przy użyciu różnych dostępnych systemów CFE, takich jak bakteryjne systemy CFE oparte na lizacie lub ssaki.

Przedstawione tutaj podejście ma ograniczenia, które wynikają z zależnego od ropy naftowej charakteru procesu powstawania GUV i zamiaru uzyskania stabilnych GUV. Podejście to jest zazwyczaj dłuższe w porównaniu z innymi metodami, takimi jak cDICE lub mikrofluidyka, ze względu na długi czas inkubacji granicy faz olej-woda, który jest wymagany do stabilizacji granicy faz i wysokiej wydajności GUV. Ponadto skład lipidowy ogranicza się przede wszystkim do POPC z małymi dawkami innych lipidów lub kopolimerów blokowych, podczas gdy inne metody, takie jak elektroformacja, są bardziej odpowiednie do włączania lipidów o różnych właściwościach fizycznych i chemicznych. Chociaż skład membrany GUV w tej metodzie jest mieszaniną POPC i PBD-PEO w celu maksymalizacji wydajności CFE, można przetestować możliwe różnice w składzie membrany GUV. Jednak dalsza optymalizacja parametrów może być wymagana w przypadku innych białek błonowych. Ponieważ emulgacja kropelek zachodzi poprzez ręczne pipetowanie, GUV generowane tą metodą są polidyspersyjne i mają dość niejednorodną wielkość. Co więcej, fakt, że lipidy rozpuszczają się w fazie organicznej, może czasami powodować tworzenie się warstwy oleju między dwoma płatkami membrany GUV lub zanieczyszczać komorę obrazowania olejem, co może być szkodliwe dla jakości obrazu. Możliwym obejściem problemu pozostałości oleju jest zastąpienie oleju mineralnego lotnym rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak eter dietylowy, jak wykazano w Tsumoto i wsp.38, polegając na odparowywaniu rozpuszczalnika wraz z wirowaniem podczas tworzenia GUV.

Chociaż w tej pracy nie ma demonstracji funkcji kanału, zainspirowanej wcześniejszymi testami używanymi do sondowania zrekonstruowanej mechano- lub światłoczułej funkcjonalności kanału, przedstawiono test oparty na mikroskopii fluorescencyjnej. Zgłasza się, że otwarcie kanału GluR0 zwiększa przewodność membranową dla jonów K+ 24. Ponieważ reakcje CFE zawierają już wysokie stężenie K+, typowe wskaźniki potasu nie będą odpowiednie do oceny funkcjonalności kanału. Ponieważ jednak napływ potasu zmienia potencjał błonowy, wrażliwe wskaźniki potencjału błonowego, takie jak DiBAC4(3)22 lub BeRST 139 , mogą zgłaszać aktywność GluR0 w obecności glutaminianu.

Udana rekonstytucja białek błonowych w komórkach syntetycznych otwiera liczne możliwości tworzenia komórek syntetycznych o niespotykanych dotąd zdolnościach, które bardziej naśladują komórki naturalne. Obecnie główną wadą ogniw syntetycznych jest ich niezdolność do reprodukcji i recyklingu energii. Jednak dzięki schematom odzyskiwania energii zależnym od światła i chemikaliów, które w dużym stopniu opierają się na białkach błonowych, można wyobrazić sobie długotrwałekomórki syntetyczne. Wykorzystanie systemów CFE pozwala na odtworzenie wielu białek błonowych, które mogą wspólnie wykonywać określone zadania. Na przykład, odtworzenie kanału jonowego bramkowanego ligandem, podobnego do opisanego tutaj GluR0, wraz z różnymi kanałami jonowymi bramkowanymi napięciem, może prowadzić do budowy pobudliwej, podobnej do neuronu komórki syntetycznej.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

APL dziękuje za wsparcie od National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 i R21-AR080363) oraz Army Research Office (80523-BB)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr poliwęglanowy 100 nmSTERLITECH1270193
96 Well Clear Płyta dolnaThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M Hybrydowy czytnik wielomodowyAgilent11-120-533
Fosforan kreatynyMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 Skaner konfokalnyYokogawaCSU-X1 
Średni gradient gęstości (Optiprep)Millipore SigmaD1556Opcjonalnie do przełączania z sacharozą w roztworze wewnętrznym
Filtr obsługujeAvanti610014
Fisherbrand (1,5 ml)Fisher Scientific05-408-129 
Kwas folinowy sól wapniowa hydratMillipore SigmaF7878
GlukozaMilipore Sigma158968
HEPESKamera Millipore SigmaH3375
iXon X3 AndorDU-897E-CS0 
Kwas L-glutaminowy sól potasowa monohydratMillipore SigmaG1501
Lekki olej mineralnyMillipore SigmaM5904
Octan magnezu tetrahydrat Millipore SigmaM5661
(w tym uchwyt na strzykawkę i stojak na ekstruder)Avanti610020
Olympus IX81 OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Mikroskop olejowy Obiektyw Olympus1-U2B933 
PEO-b-PBDŹródło polimeruP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plazmidowe DNADomoweN/A
pET28b-sfGFP-sfWiśniowe (1-10) plazmidowe DNADomoweN/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plazmidowe DNADomowyN/A
POPC w chloroformie Avanti850457C
Chlorek potasuMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
Zestaw roztworów rybonukleotydówNew England BioLabsN0450
Inhibitor RNazy, mysiNew England BioLabsM0314S
RTS Próbnik aminokwasówBiotechrabbitBR1401801
Chlorek soduMillipore SigmaS9888
SpermidynaMillipore SigmaS2626
SacharozaMillipore SigmaS0389
VAPRO Oscylometr ciśnienia pary Model 5600ELITechGroupVAPRO 5600
mikroprobówki Zestaw mini-ekstrudera Mikroskop odwrócony lipid

Bibliografia

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912(2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605(2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917(2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429(2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104(2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332(2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstytucja bia ek b onowychsyntetyczne kom rkigigantyczne p cherzyki jednowarstwoweodwr cona emulsja kropelkowadwuwarstwa lipidowamikroskopia konfokalnaenkapsulacja bia eksynteza kana w jonowych

Powiązane artykuły