Modele płuc na chipie przewyższają tradycyjne hodowle 2D, naśladując granicę powietrze-ciecz i perfuzję komórek śródbłonka, symulując przepływ krwi i wymianę składników odżywczych, co jest kluczowe dla badań nad fizjologią płuc. Zwiększa to znaczenie badań nad płucami, oferując dynamiczne, fizjologicznie dokładne środowisko, które pomaga w lepszym zrozumieniu i leczeniu infekcji dróg oddechowych.
Artykuł metodologiczny
Immunokompetentny model pęcherzyka płucnego na chipie do badania odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej pęcherzyków płucnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzamy zaawansowany immunokompetentny model płuca na chipie, zaprojektowany do replikowania struktury i funkcji ludzkiego pęcherzyka płucnego. Ten innowacyjny model wykorzystuje biochip perfundowany mikroprzepływowo, który obsługuje interfejs powietrze-ciecz, naśladując środowisko w ludzkich pęcherzykach płucnych. Inżynieria tkankowa służy do integracji kluczowych komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, makrofagów i komórek nabłonkowych, w celu stworzenia reprezentatywnego modelu tkankowego zębodołu. Model ułatwia dogłębne badania odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej na różne patogeny, w tym wirusy, bakterie i grzyby, pogłębiając w ten sposób naszą wiedzę na temat odporności płuc. Głównym celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat ustanowienia tego modelu pęcherzyka na chipie jako solidnej platformy in vitro do badań nad infekcjami, umożliwiającej naukowcom dokładną obserwację i analizę złożonych interakcji między patogenami a układem odpornościowym gospodarza w środowisku płucnym. Osiąga się to dzięki zastosowaniu technik opartych na mikroprzepływach do symulacji kluczowych warunków fizjologicznych ludzkich pęcherzyków płucnych, w tym przepływu krwi i biomechanicznej stymulacji komórek śródbłonka, przy jednoczesnym utrzymaniu granicy faz powietrze-ciecz, która ma kluczowe znaczenie dla realistycznej ekspozycji komórek nabłonka na działanie powietrza. System modelowy jest kompatybilny z szeregiem standardowych testów, takich jak barwienie immunofluorescencyjne, profilowanie cytokin i analiza jednostek tworzących kolonie (CFU)/płytki nazębnej, co pozwala na kompleksowy wgląd w dynamikę immunologiczną podczas infekcji. Pęcherzyk płucny na chipie składa się z podstawowych typów komórek, w tym ludzkich dystalnych komórek nabłonka płuc (H441) i ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) oddzielonych porowatymi błonami politereftalanu etylenu (PET), z pierwotnymi makrofagami pochodzącymi z monocytów strategicznie rozmieszczonymi między warstwą nabłonka i śródbłonka. Model tkankowy zwiększa zdolność do analizowania i niuansów czynników zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne płuc in vitro. Jako cenne narzędzie, powinno ono przyczynić się do postępu w badaniach nad płucami, zapewniając dokładniejszy i bardziej dynamiczny model in vitro do badania patogenezy infekcji dróg oddechowych i testowania potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Wprowadzenie
Płuco ludzkie odgrywa niezwykłą rolę w oddychaniu i obronie immunologicznej, ze złożonymi interakcjami między odpowiedziami immunologicznymi błony śluzowej pęcherzyków płucnych1. Zdolność pęcherzyków płucnych do wytworzenia skutecznej odpowiedzi immunologicznej ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania infekcjom płuc i zapewnienia zdrowia płuc. Ponieważ płuca są stale narażone na szeroki zakres potencjalnych zagrożeń, w tym bakterie, wirusy, grzyby, alergie i cząstki stałe, zrozumienie złożoności odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej pęcherzyków płucnych ma kluczowe znaczenie dla odkrycia mechanizmów stojących za infekcjami dróg oddechowych, zaburzeniami zapalnymi i leczeniem chorób płuc1.
Aby badać procesy związane z infekcją i stanem zapalnym dróg oddechowych in vitro, potrzebne są modele, które mogłyby wiernie naśladować środowisko pęcherzykowe i reakcje immunologiczne. Hodowle komórkowe 2D i moduły zwierzęce są używane od dziesięcioleci jako niezbędne narzędzia do badań biomedycznych nad odpowiedzią immunologiczną płuc. Często jednak mają one ograniczenia w swoim potencjale translacyjnym w sytuacjach ludzkich. Modele lung-on-chip mogą przyczynić się do wypełnienia luki między tradycyjnymi modelami in vitro i in vivo oraz zapewnić nowatorskie podejście do badania odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla człowieka2,3. Modele płuc na chipie mogą naśladować granicę faz powietrze-ciecz, która jest wymagana, aby komórki płuc mogły odtworzyć warunki fizjologiczne dróg oddechowych i opracować dokładniejszy i bardziej wytrzymały model tkanki. Ta technika hodowli umożliwia precyzyjne badanie różnicowania, funkcjonowania i reakcji komórek na leki lub bodźce związane z chorobą in vitro2.
W tym badaniu prezentujemy model oparty na mikroprzepływach ludzkiego pęcherzyka płucnego jako skuteczne narzędzie do podsumowania ludzkiego środowiska pęcherzykowego poprzez zastosowanie perfuzji do naśladowania przepływu krwi i biomechanicznej stymulacji komórek śródbłonka oraz włączenie interfejsu powietrze-ciecz z komórkami nabłonka wystawionymi na fazę powietrzną4. Opracowaliśmy mikroprzepływowy, perfundowany pęcherzyk płucny na chipie, który naśladuje strukturę fizyczną i interakcje biologiczne ludzkiego zębodołu, ze szczególnym uwzględnieniem granicy faz powietrze-ciecz. Interfejs ten odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu komórek nabłonka oddechowego, co jest niezbędne do dokładnego modelowania środowiska płucnego. W modelu wykorzystano ludzkie dystalne komórki nabłonka płuc (H441) i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), oddzielone porowatymi błonami politereftalanu etylenu (PET), z pierwotnymi makrofagami pochodzącymi z monocytów umieszczonymi między warstwami komórkowymi. Ta konfiguracja odtwarza skomplikowany układ komórkowy zębodołu i ma kluczowe znaczenie dla dokładnej symulacji granicy faz powietrze-ciecz, która jest istotnym czynnikiem w fizjologicznej funkcji tkanki płucnej.
Uzasadnienie rozwoju modelu rozciąga się na integrację zarówno krążących, jak i rezydujących w tkankach komórek odpornościowych. Podejście to ma na celu dokładne naśladowanie odpowiedzi zapalnej gospodarza na infekcje dróg oddechowych u ludzi, zapewniając dynamiczne środowisko do badania interakcji patogen-gospodarz. Obecność makrofagów pozwala na badanie natychmiastowych odpowiedzi immunologicznych i ich interakcji z patogenami, odzwierciedlając pierwszą linię obrony przed infekcjami dróg oddechowych. Co więcej, konstrukcja platformy biochip ułatwia wygodną i precyzyjną manipulację sygnałami zarówno biofizycznymi, jak i biochemicznymi, co ma kluczowe znaczenie dla odtworzenia funkcji zębodołu in vitro. Ta elastyczność ma zasadnicze znaczenie w analizowaniu czynników przyczyniających się do zakażeń u ludzi, umożliwiając naukowcom dostosowanie warunków do różnych stanów chorobowych lub przetestowanie potencjalnych interwencji terapeutycznych. Kompatybilność platformy z wieloma technologiami odczytu, w tym zaawansowaną mikroskopią, analizami mikrobiologicznymi i biochemiczną analizą ścieków, zwiększa jej użyteczność. Możliwości te pozwalają na kompleksową ocenę odpowiedzi tkanek na infekcje, w tym ocenę zachowania komórek, proliferacji patogenów i skuteczności odpowiedzi immunologicznej.
Przedstawiamy szczegółowy protokół i techniki do stworzenia i wykorzystania modelu ludzkiego zębodołu na chipie, koncentrującego się na replikacji interfejsu powietrze-ciecz i integracji komórek odpornościowych do badania ludzkich infekcji in vitro.
Protokół
Komórki HUVEC są izolowane z pępowiny i używane do przejścia 4. Pierwotne monocyty są izolowane od zdrowych dawców z krwi pełnej. Badanie zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Jenie, Jena, Niemcy (3939-12/13). Zgodnie z Deklaracją Helsińską, wszystkie osoby oddające komórki do badania wyraziły świadomą zgodę.
1. Dzień 1: Przygotowanie biochipa
- Biochipy są dostępne w różnych rozmiarach i modelach. Do eksperymentów w tym miejscu użyj modelu BC002. Umieść biochip na szklanej szalce Petriego, napełnij naczynie i przepłucz wszystkie ubytki sterylnym 70% etanolem (EthOH). Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukać ubytki 2x sterylnym ddH2O. Usunąć ddH2O.
- Pokryj błonę biochipa obu jam sterylnym roztworem kolagenu dożylnego (0,5 mg/ml w 0,5 mM kwasu octowego; użyj stężenia 1:100 w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco zawierającym magnez i wapń PBS (+/+)) poprzez delikatne przepłukanie roztworu kolagenu dożylnego przez obie wnęki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z niebieskimi końcówkami. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
UWAGA: Używanie pipety o pojemności 1 000 μl z końcówkami z niebieskim filtrem (P1000) jest zalecane w całym protokole. Średnica otworu końcówki filtra całkowicie zakrywa otwór portów łączących kanały, co pozwala uniknąć wprowadzania się pęcherzyków powietrza do chipa. - Po 30 minutach inkubacji przepłukać dolną i górną komorę 2x sterylnym PBS (+/+), aby wypłukać pozostały kolagen i kwas octowy.
- Przygotować pożywkę EC, dodając 1:100 (v/v) penicyliny/streptomycyny (10 000 j./ml). Napełnij górną komorę każdej komory 250 μl pożywki EC, a dolną komorę 150 μl pożywki EC.
- Zebrać HUVEC z zlewającej się kolby T25: Przemyć 5 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco bez magnezu i wapnia PBS (-/-), dodać 1 ml 0,25% trypsyny + 1 mM EDTA w PBS (-/-) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać aktywność trypsyny, dodając 5 ml PBS (+/+) + 5% FCS i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EC.
- Użyj seryjnego rozcieńczenia 1:10 podczas zliczania komórek. Dodać 10 μl zawieszonych osadów komórkowych do 90 μl pożywki komórkowej. Ostrożnie połączyć próbki. Użyj probówki do mikrowirówki z 10 μl niebieskiej plamy trypanowej. Rozcieńczyć roztwór komórek błękitem trypanowym (1:1) za pomocą szkiełek do liczenia komórek. Policz komórki ręcznie za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek. Określ liczbę komórek i dostosuj stężenie do 0,4 x 106 komórek na 200 μl.
- Zastąp pożywkę z komórek śródbłonka w górnej komorze biochipa 200 μl pożywki EC zawierającej zawieszone HUVEC. Delikatnie pipetować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w kanałach lub komorach. Umieścić szklaną szalkę Petriego z biochipami w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
2. Dzień 2: Sprawdzanie warstwy komórkowej
- W dniu 2 sprawdź wzrokowo zbieg warstwy komórek HUVEC w górnej komorze. Przeprowadzić wymianę pożywki w górnej komorze na 300 μl pożywki EC. Delikatnie pipetować, aby uniknąć oderwania się komórek od błony. Wykonuj wymianę mediów codziennie po 24h. Umieścić szklaną szalkę Petriego z biochipami z powrotem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
3. Dzień 3: Przygotowanie dolnej komory
- Sprawdź wzrokowo zbieganie się warstwy komórek śródbłonka. W tym momencie określ obecność zlewającej się warstwy i morfologii przypominającej bruk (Rysunek 1). Przeprowadzić wymianę pożywki w górnej komorze na 300 μl pożywki EC.
- Następnie należy przygotować dolną komorę do wysiewu komórek tworzących warstwę nabłonkową. Delikatnie przepłukać dolną komorę 150 μl pożywki RPMI (dodać 1:100 (v/v) penicyliny/streptomycyny (10 000 U/ml), 5% płodowej surowicy krowiej, 1 μM deksametazonu).
- W przypadku dolnej komory wysiewaj 0,5 x 106 komórek H441 zawieszonych w 200 μl pożywki RPMI (RPMI) na wnękę.
- Pobieranie komórek H441
- Umyj komórki 5 ml PBS (-/-) raz. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny + 1 mM EDTA w PBS (-/-).
- Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Czas inkubacji różni się w zależności od zbiegu warstwy. W ciągu 5-7 minut komórki powinny całkowicie się oderwać.
- Zatrzymaj aktywność trypsyny za pomocą 10 ml PBS (+/+) + 5% FBS, zbierz komórki i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty.
- Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI i policzyć.
- Wysiewaj 0,5 x 106 komórek na komorę, delikatnie pipetując roztwór komórek do dolnej komory. Zamknij wszystkie porty i odwróć biochip do góry nogami, aby komórki mogły przyczepić się do membrany PET. Trzymaj biochip do góry nogami i inkubuj przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
4. Dni 4 - Dzień7: Utrzymanie komórek i pobieranie monocytów
- Wykonaj codzienną wymianę pożywki w górnej i dolnej komorze. W przypadku górnej komory przeprowadzić wymianę pożywki z 300 μl pożywki EC.
- Użyj 200 μl RPMI+ (pożywka RPMI plus 1:100 (v/v) penicylina/streptomycyna (10 000 U/ml), 10 ng/mL GM-CSF, 10% autologicznej surowicy ludzkiej, 1 μM deksametazonu) dla dolnej komory. W dniu 7 przepłucz dolną komorę RPMI+, aby przygotować jamę do wysiewu monocytów.
- Nasiona 0,1 x 106 monocytów zawieszonych w 200 μL RPMI+ w dolnej komorze.
- Zbieranie monocytów
- Przemyć komórki 1 ml PBS (-/-) i inkubować przez 7 minut w temperaturze 37 °C we wstępnie podgrzanym PBS (-/-) zawierającym 4 mg/ml lidokainy + 5 mM EDTA w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zebrać komórki i odwirować przy 350 x g przez 7 minut, ponownie zawiesić komórki w 1 ml RPMI+ i policzyć. Umieść porty biochipa skierowane w dół, tak aby komórki przyczepiły się do membrany.
5. Dzień 8: Perfuzja biochipów
- W tym momencie upewnij się, że biochipy są gotowe do podłączenia do przepływu i perfuzji. Przed rozpoczęciem perfuzji należy przygotować pusty inkubator i umieścić w nim pompę perystaltyczną.
- Perfuzja biochipów
- Przed podłączeniem wysterylizowanej rurki do biochipa należy przepłukać rurkę 200 μl PBS (+/+), a następnie 200 μl pożywki EC. Rurka ma średnicę wewnętrzną 0,5 mm i składa się z dłuższych (20 cm) i krótszych (12 cm) boków przedzielonych dwoma perystaltycznymi korkami pompy. Odłóż rurki na bok i przygotuj zbiorniki na podłoże.
- Przeprowadzić wymianę pożywki w górnej i dolnej komorze, przepłukując je odpowiednią świeżo przygotowaną pożywką do hodowli komórkowych.
- Włóż zbiornik po stronie wylotowej biochipa i podłącz zbiornik z rurką do wlotu biochipa (Rysunek 2). Podłącz rurkę do zbiornika i biochipa tak, aby między zbiornikiem a biochipem znajdowała się okrągła perfuzja medium.
- Gdy wszystko zostanie podłączone do portów, napełnij zbiornik 500 μl pożywki EC. Połącz biochip z rurką na perfuzji o natężeniu przepływu 21 μL/min (Rysunek 2). Obserwuj uważnie przez pierwsze 15 minut perfuzji pod kątem wprowadzenia pęcherzyków. Codziennie wykonuj wymianę pożywki w obu komorach.
6. Dzień 9 - Dzień 11: Ustanowienie interfejsu powietrze-ciecz
- Zatrzymaj perfuzję, opróżnij zbiorniki i ponownie napełnij świeżo przygotowaną pożywką pod sterylną szafką bezpieczeństwa. Odpipetować 500 μl pożywki EC do zbiorników i delikatnie przepłukać dolną komorę 200 μl RPMI+. Ponownie rozpocząć perfuzję z szybkością perfuzji 21 μl/min.
- Interfejs powietrza i cieczy (ALI)
- Ustal ALI od 12 dnia do końca eksperymentu (dzień 14). Podczas hodowli ALI należy wystawić komórki nabłonka na działanie powietrza.
- Aby ustalić hodowlę ALI, przygotuj nowe podłoże naczyniowe EC (dodać 1:100 (v/v) penicyliny/streptomycyny (10 000 U/ml), 10 ng/ml GM-CSF, 20% autologicznej surowicy ludzkiej, 1 μM deksametazonu), aby utrzymać wszystkie typy komórek w chipie. W tym momencie podłoże zawiera wyższe stężenie AS (20%).
- Otwórz zatyczki w dolnej komorze pod sterylną szafką bezpieczeństwa i ostrożnie wchłoń pożywkę, aż pojawi się pęcherzyk powietrza, jak pokazano na Rysunek 3. Upewnij się, że cała ciecz z kanału i komory została usunięta i ostrożnie zamknij porty.
- Napełnić zbiorniki pożywką EC (-/-) i kontynuować hodowlę perfuzyjną z natężeniem przepływu 21 μl/min. Wymieniać pożywkę tylko w górnej komorze do 14 dnia i utrzymywać komórki nabłonka w dolnej komorze tylko z powietrzem.
7. Dzień 14: Pobieranie i analiza tkanek
- Odłącz biochip od przepływu. Odłącz rurkę i sprawdź pod mikroskopem zbieżność komórek. Ze względu na powietrze w dolnej komorze warstwy komórek mogą wydawać się rozmyte i trudne do wizualizacji. W tym momencie model jest gotowy do dalszych eksperymentów.
- Utrwalanie i barwienie tkanki w biochipie
- Przemyć ubytki PBS (+/+) w celu usunięcia pożywki do hodowli komórkowych. Odpipetować 300 μl 4% paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w PBS (-/-) do górnej komory i 200 μl w dolnej komorze i inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
UWAGA: Podczas pracy z chemikaliami utrwalającymi, takimi jak PFA, należy używać okapu wyciągowego. Zbieraj i utylizuj odpady w odpowiedni sposób. - Umyj komory 3x PBS (+/+). Po utrwaleniu przechowuj biochipy w temperaturze 4 °C lub użyj ich bezpośrednio do barwienia immunofluorescencyjnego komórek.
- Do permeabilizacji odpipetować 300 μl 0,25% Triton X-100 w PBS (+/+). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Po inkubacji przemyć obie komory PBS (+/+) i odpipetować 300 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (+/+) w obu komorach. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- W międzyczasie przygotuj panel przeciwciał do barwienia immunofluorescencyjnego. Aby przygotować panel przeciwciał do barwienia immunofluorescencyjnego, ustawiono probówkę z wystarczającą ilością 3% BSA w celu rozcieńczenia przeciwciał. Użyć 50 μl rozcieńczeń przeciwciał dla każdej membrany. Stosować stosunek rozcieńczenia 1:100 dla paneli przeciwciał pierwszorzędowych i 1:200 dla paneli przeciwciał drugorzędowych. Dodatkowo, dla panelu przeciwciał wtórnych, należy przygotować DAPI w stosunku rozcieńczenia 1:2,000. Odpowiednie przeciwciała znajdują się w (Tabeli 1).
- Aby uzyskać bezpośredni dostęp do komórek w biochipie, należy usunąć folię łączącą. Aby otworzyć komory mikroprzepływowe, należy wykonać dokładne nacięcie na zewnątrz wnęki i usunąć folię łączącą. Wytnij membranę, usuwając krawędzie przyklejone do biochipa za pomocą skalpela.
UWAGA: Na tym etapie pracuj precyzyjnie i dokładnie, aby uniknąć uszkodzenia membrany i obrażeń spowodowanych ostrością skalpela. - Po odłączeniu membrany od biochipa należy podzielić membranę na dwie części. Zbierz kawałki membrany pęsetą i umieść je na mikroskopijnym szkiełku w celu barwienia.
- Odpipetować 50 μl roztworu przeciwciała na kawałek membrany. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
- Po inkubacji umieścić membranę w 500 μl PBS (-/-) na płytce 24-dołkowej i przemyć membranę 3x przez 5 minut każdy w PBS (+/+). Po umyciu odpipetować 50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
- Umyj membranę PBS (+/+) 3x po 5 minut. W międzyczasie przygotuj i oznacz mikroskopijne szkiełka do eksperymentu. Umieść kroplę medium montażowego na szkiełku i umieść odpowiednią membranę. Powtórz ten krok dla wszystkich membran. Na koniec umieść jeszcze jedną kroplę medium montażowego na wierzchu membrany i użyj szkła nakrywkowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przemyć ubytki PBS (+/+) w celu usunięcia pożywki do hodowli komórkowych. Odpipetować 300 μl 4% paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w PBS (-/-) do górnej komory i 200 μl w dolnej komorze i inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
Wyniki
Badanie zmian morfologicznych oraz ekspresji białek markerowych można przeprowadzić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Po 14 dniach kokultury analizuje się strony naczyniową i nabłonkową pod kątem ekspresji odpowiednich markerów komórkowych. Metoda ta jest użyteczna w badaniu oddziaływań i integralności komponentów naczyniowych i nabłonkowych, co jest niezbędne w modelowaniu chorób jako funkcjonalny odczyt biologiczny związany z infekcją. Barwienie immunofluorescencyjne można uzupełnić analizą ilościową, oceną morfologiczną oraz testami funkcjonalnymi, w tym oznaczaniem uwalniania cytokin, analizą odcieków pod kątem markerów śmierci komórkowej, takich jak uwalnianie LDH, oraz zmianami w morfometrii komórek5. Po stronie naczyniowej można badać integralność i morfologię białek połączeń międzykomórkowych komórek śródbłonka, takich jak VE-cadherin, aby ocenić stopień konfluencji i formowanie bariery śródbłonkowej6 (Rycina 4A). Po perfuzji warstwa komórek śródbłonka powinna być konfluentna z wyraźnie ustrukturyzowaną ekspresją VE-cadherin na granicach komórek śródbłonka. Dolna część membrany może zostać poddana immunostainingowi w kierunku markerów nabłonkowych, takich jak E-cadherin i białko surfaktantu A (SP-A)7. Ekspresja SP-A, kluczowego składnika surfaktantu płucnego będącego złożoną mieszaniną lipidów i białek, zmniejsza napięcie powierzchniowe na granicy powietrze-ciecz w nabłonku, co zapobiega in vivo zapadaniu się pęcherzyków płucnych podczas wydechu oraz pozwala na utrzymanie prawidłowej funkcji płuc i wymiany gazowej6,8. W naszym modelu komórki nabłonka wykazują ekspresję SP-A po zastosowaniu leczenia ALI, co można zwizualizować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (Rycina 4B). Konfluencję i integralność warstwy komórek nabłonkowych można potwierdzić barwieniem immunofluorescencyjnym na E-cadherin, ważny marker połączeń nabłonkowych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych (Rycina 4C). Obecność makrofagów można potwierdzić barwieniem immunofluorescencyjnym na białko markerowe makrofagów CD686 (Rycina 4C). W celu zbadania infekcji wirusowych, bakteryjnych lub grzybiczych, szczegółowe informacje na temat modeli infekcji można znaleźć w pracach Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 oraz Hoang et al.9.
Rysunek 1: Reprezentatywny obraz konfluentnej warstwy komórek HUVECs w biochipie w 3. dniu. Obraz przedstawia mikroskopię w polu jasnym przy 10-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Układ do modelu pęcherzyka płucnego na chipie (alveolus-on-chip) oraz indukcji ALI. (A) Reprezentatywne zdjęcie układu perfuzyjnego dla modelu pęcherzyka płucnego na chipie oraz (B) reprezentatywne zdjęcie indukcji ALI w komorze poprzez odessanie medium i doprowadzenie powietrza do komórek. Powstanie pęcherzyka powietrza wewnątrz komory wskazuje, że komórki są eksponowane na powietrze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Schematyczny przegląd układu pęcherzyka płucnego na chipie (alveolus-on-chip). Szczegółowy protokół 14-dniowej hodowli przedstawia istotne etapy wysiewania i namnażania komórek wewnątrz biochipa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 4: Barwienie immunofluorescencyjne warstw komórek śródbłonka i nabłonka. (A) Komórki śródbłonka HUVEC wykazujące ekspresję VE-cadherin (pomarańczowy), (B-C) komórki nabłonka H441 wykazujące ekspresję (B) SP-A (czerwony) oraz (C) E-cadherin (pomarańczowy), a także ekspresję SP-A (czerwony) i CD68 (zielony) po stronie nabłonka. DAPI (niebieski) barwi DNA i wskazuje jądra komórkowe. Pasek skali reprezentuje 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Jama | Komórki |
| Górna komora | śródbłonne (0,4 x 106) |
| Dolna komora | Nabłonkowy (0,5x106H441+ 1x105 monocyty) |
Tabela 1: Przegląd wysiewu komórek w biochipie.
Dyskusja
Model pęcherzyka płucnego na chipie reprezentuje wielowarstwowy model tkankowy ludzkiego zębodołu, integrujący podstawowe typy komórek dolnych dróg oddechowych, w tym komórki nabłonka płuc, komórki śródbłonka i makrofagi, hodowane w układzie organotypowym w ALI ze średnią perfuzją wyściółki śródbłonka. Komórki o różnych warstwach wyrażają specyficzne białka markerów komórkowych, takie jak E-kadheryna, zależna od wapnia cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka płuc, która ma kluczowe znaczenie w tworzeniu międzykomórkowych barier nabłonkowych 5,10. E-kadheryna tworzy fizyczny element bariery i kontroluje odpowiedź immunologiczną na szkodliwe patogeny i substancje w środowisku10,11. Komórki nabłonkowe H441 dodatkowo eksprymują białko powierzchniowo czynne A, które ma również kluczowe znaczenie w pierwszej linii obrony gospodarza przed infekcją poprzez pośredniczenie w aktywności immunomodulującej i przeciwbakteryjnej8. Integracja komórek odpornościowych w modelu pęcherzyka płucnego zwiększa jego złożoność komórkową, a tym samym lepiej replikuje odpowiedź immunologiczną na czynniki zapalne, tj. podczas infekcji. W tym kontekście model wykorzystano do zbadania koinfekcji wirusem grypy A i ludzkim patogenem oportunistycznym Staphylococcus aureus (S. aureus)5. W badaniu ujawniono mechanizm koinfekcji w zapaleniu płuc, w którym wirusowe zakażenie komórek nabłonka wywołuje znaczną reakcję zapalną, która powoduje znaczne uszkodzenie komórek śródbłonka, prowadząc do utraty funkcji bariery. W innym badaniu model wykorzystano do wykazania, że zakażenie S. aureus obniża zewnątrzkomórkowy poziom białka powierzchniowo czynnego-A (SP-A), kluczowego składnika obrony immunologicznej w płucach, prawdopodobnie z powodu proteaz bakteryjnych6. Chociaż ekspresja SP-A nie jest bezpośrednio dotknięta ani przez S. aureus, ani wirus grypy A, jest ona znacznie obniżona przez TNF-α, cytokinę silnie wytwarzaną w odpowiedzi na infekcje bakteryjne, zwłaszcza w obecności makrofagów. Wyniki te sugerują, że mono- i nadinfekcje bakteryjne mogą obniżać poziom SP-A w płucach, potencjalnie pogarszając wynik bakteryjnego zapalenia płuc6. Co więcej, model pęcherzyka płucnego został wykorzystany do zbadania zakażenia grzybiczego pęcherzyka płucnego Aspergillus fumigatus oraz skuteczności leków przeciwgrzybiczych poprzez wykorzystanie mikroskopii o wysokiej rozdzielczości i analizy obrazu opartej na algorytmie w połączeniu z molekularnymi testami biologicznymi, w tym barwieniem immunofluorescencyjnym i profilowaniem cytokin7. Modelowanie inwazyjnej aspergilozy płucnej w pęcherzyku zębodołowym na chipie ujawniło kluczowe funkcje ludzkich makrofagów, które mogą częściowo hamować wzrost grzyba. Makrofagi odgrywały kluczową rolę w uwalnianiu cytokin i chemokin prozapalnych, które korelowały ze zwiększoną liczbą inwazyjnych strzępek grzybów. Ponadto badanie potwierdziło, że fungistatyczny lek kaspofungina skutecznie ogranicza wzrost grzybów i indukuje zmiany morfologiczne w strukturze grzyba, co jest zgodne z wynikami innych badań. Badania te potwierdzają potencjał platformy modelowej w zakresie identyfikacji komórkowych celów infekcji i testowania leków w klinicznie istotnych stężeniach.
Istnieje kilka aspektów, które należy wziąć pod uwagę podczas tworzenia pęcherzyka na chipie. Precyzyjne wysiewanie komórek ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia równomiernego rozmieszczenia komórek i tworzenia warstw. Upewnij się, że komórki są rozsiane w odpowiedniej gęstości, aby osiągnąć konfluencję bez przerastania się nawzajem, co może zagrozić integralności i funkcjonalności warstw komórek. Podczas procesu zakładania ALI ostrożnie usuń pożywkę od strony wierzchołkowej i zamknij porty, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Utrzymanie optymalnych warunków kohodowli, takich jak temperatura, poziom CO2 i skład pożywki, ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i interakcji zarówno komórek śródbłonka, jak i nabłonka. Zawsze wykonuj zmiany podłoża ostrożnie, aby nie naruszyć warstw komórek lub nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Delikatnie pipetuj i upewnij się, że cały używany sprzęt jest sterylny, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, pipetuj powoli i przechylaj chip podczas wymiany medium, aby umożliwić wydostanie się pęcherzyków. Pracuj w czystym, sterylnym i kontrolowanym środowisku, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Należy wziąć pod uwagę złożoność i precyzję wymaganą do ustanowienia i obsługi modelu 3D na potrzeby kolejnych eksperymentów z modelem. Jeśli warstwy komórek nie tworzą się prawidłowo, rozważ optymalizację gęstości komórek i partii komórek, ponieważ mogą wystąpić różnice we wzroście komórek w zależności od dawcy i partii.
Chociaż model oferuje znaczne ulepszenia w stosunku do istniejących metod, należy również pamiętać, że należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Jednym z takich ograniczeń jest złożoność i koszty związane z eksploatacją urządzenia mikroprzepływowego. Uruchamianie modeli narządów na chipie wymaga specjalistycznego sprzętu i specjalistycznej wiedzy z zakresu mikrofluidyki, aby przyjąć model zębodołu na chipie. Ponadto, chociaż model ten może z powodzeniem odtworzyć wiele kluczowych cech środowiska pęcherzykowego, nie może w pełni odtworzyć wszystkich interakcji komórkowych i sił mechanicznych występujących in vivo. Na przykład model nie posiada kompleksowego układu odpornościowego ani pełnego zakresu typów komórek w ludzkich płucach, co może mieć wpływ na dokładność badań interakcji patogen-gospodarz.
Pomimo tych ograniczeń, model płuca na chipie oferuje postęp w porównaniu z tradycyjnymi hodowlami komórkowymi 2D, takimi jak systemy Transwell. Łącząc granicę faz powietrze-ciecz, komórki śródbłonka i nabłonka oraz składniki immunologiczne w wielowarstwowej tkance w dynamicznym, perfundowanym środowisku, model ten stanowi bardziej fizjologicznie istotne podejście do badania fizjologii płuc, chorób i reakcji na leczenie in vitro. Ma to kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat infekcji dróg oddechowych u ludzi i opracowania skuteczniejszych terapii. Zdolność modelu do precyzyjnego manipulowania sygnałami biofizycznymi i biochemicznymi stanowi ważną cechę dla analizy mechanizmów progresji choroby i działania leków. Wykorzystanie ludzkiego materiału komórkowego może jeszcze bardziej zmniejszyć różnice międzygatunkowe obserwowane w eksperymentach na zwierzętach. Integracja wielu analiz biomarkerów dodatkowo zwiększa głębię i zakres danych możliwych do uzyskania z jednego eksperymentu, co przyczynia się do obniżenia kosztów eksperymentów in vitro. Uznając swoje ograniczenia, model płuca na chipie stanowi znaczący krok naprzód w badaniach nad chorobami układu oddechowego, oferując dokładniejszą, bardziej etyczną i wydajną alternatywę dla tradycyjnych metod.
Oświadczenia
K.R. jest dyrektorem generalnym Dynamic42 GmbH i posiada udziały w spółce. A.S.M. jest doradcą naukowym Dynamic 42 GmbH i posiada udziały w spółce. Wszyscy pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
H.K. i A.S.M. potwierdzają finansowanie z Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, finansowane przez linię finansowania Strategic Networking of the Leibniz Association. M.A. i A.S.M. byli wspierani przez projekt IGF IMPROVE finansowany przez Federalne Ministerstwo Gospodarki i Energii na podstawie uchwały niemieckiego Bundestagu. A.S.M potwierdza ponadto wsparcie finansowe ze strony Klastra Doskonałości Balance of the Microverse w ramach niemieckiej strategii doskonałości - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały eksploatacyjne | |||
| Szkiełka do komory do liczenia komórek (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, 24 dołki, sterylne | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, 6-dołkowe, sterylne | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Szkiełka nakrywkowe (24x40mm; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Chusteczki Eco | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Wacik z gazy | Noba | PZN 2417767 | |
| Rękawice Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Płytki wielodołkowe 24-dołkowe, sterylne | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Pipety Pasteura (szkło) 150mm | Pipety Assistent | 40567001 | |
| Pasteur (szkło) 230mm | Rurki | ||
| (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Skalpele | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Pipety serologiczne 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Pipety serologiczne 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Pipety serologiczne 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Pipety serologiczne 50mL | Greiner Pipety serologiczne Bio-One | 768 160-TRI | |
| 5 ml | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 kolba | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Końcówki sterylne 10µ L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Końcówki sterylne 1250&mikro; L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Końcówki sterylne 300&mikro; L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Końcówki niesterylne 10µ L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Końcówki niesterylne 1000&mikro; L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Końcówki niesterylne 200&mikro; L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Pęseta (prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Etanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Podłoże do montażu fluorescencyjnego | Dako | S3023 | |
| Metanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Hodowla komórkowa | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| Roztwór EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka | Promocell | C-22020 | |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka Mieszanka suplementów | Promocell | C-39225 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Ludzka rekombinowana GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Trypane niebieskie zabarwienie 0,4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsyna | Gibco | 15090-046 | |
| Przeciwciała pierwotne | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (koza) | BD | 610252 | |
| CD68 (królik) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Kadheryna (koza) | R& D | AF748 | |
| SP-A (mysz) | Abcam | ab51891 | |
| Przeciwciała wtórne | |||
| AF488 (osł przeciw myszy) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (osioł przeciw myszy) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (osioł anty królik) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluidic | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Męski zamek Luer Lock (mały) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Męskie mini wtyki luer, rząd czterech, PP, zielony | Chipshop Microfluidic | 09-0558-0336-11 | |
| Męskie mini wtyki luer, rząd czterech, PP, nieprzezroczyste | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | |
| Męskie mini wtyki luer, rząd czterech, PP, czerwone | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 | |
| Zatyczki | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Zbiornik 4,5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Rurka | dynamiczna 42 | ST001 | |
| Sprzęt | |||
| Autoklaw | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Wirówka | Eppendorf | 5424 | |
| Inkubator CO2 | Heracell | 150i | |
| Countess Automatyczny licznik komórek | Invitrogen | C10227 | |
| Przepływomierz | BD | FACS Canto II | |
| Zamrażarka (-20 ° C) | Zamrażarka Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 ° C) | Lodówka Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Liebherr | LCexv 4010 | ||
| Mikroskop Heraeus Multifuge | Thermo | Scientific X3R | |
| Wytrząsarka orbitalna | |||
| Pompa perystaltyczna | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipety 10 i mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipety 100µ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipety 1000µ L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipety 2,5 i mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipety 20µ L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipety 200µ L | Eppendorf Research plus | ||
| Sartorius | 6101 | ||
| Skala | Sartorius | TE1245 | |
| Sterylna ławka | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Kąpiel wodna | Julabo | SW-20C | |
| Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego | |||
| Apotome.2 | Zeiss Urządzenie oświetleniowe | ||
| Mikroskop Zeiss | HXP 120 C | ||
| Zeiss | Axio Observer 5 | ||
| Sekcja optyczna | Zasilacz Zeiss | ApoTome | |
| Mikroskop | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN Niebieska edycja | Zeiss |
Bibliografia
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Przedruki i uprawnienia
