Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.
Artykuł metodologiczny
Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zaawansowany model jelita na chipie, odtwarzający nabłonkowe 3D organotypowe struktury podobne do kosmków i krypt. Model immunokompetentny obejmuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), komórki nabłonka jelitowego Caco-2, makrofagi rezydujące w tkankach i komórki dendrytyczne, które samoorganizują się w tkance, odzwierciedlając cechy błony śluzowej jelit człowieka. Unikalnym aspektem tej platformy jest jej zdolność do integracji krążących ludzkich pierwotnych komórek odpornościowych, co zwiększa znaczenie fizjologiczne. Model ma na celu zbadanie odpowiedzi jelitowego układu odpornościowego na kolonizację i infekcję bakteryjną i grzybiczą. Ze względu na powiększony rozmiar wnęki, model oferuje różnorodne odczyty funkcjonalne, takie jak testy przenikania, uwalnianie cytokin i infiltracja komórek odpornościowych, i jest kompatybilny z pomiarem immunofluorescencji struktur 3D utworzonych przez warstwę komórek nabłonka. Niniejszym dostarcza kompleksowych informacji na temat różnicowania i funkcji komórek. Platforma intestine-on-chip wykazała swój potencjał w wyjaśnianiu złożonych interakcji między substytutami żywej mikrobioty a ludzką tkanką gospodarza w ramach mikrofizjologicznej perfundowanej platformy biochipowej.
Wprowadzenie
Systemy Organ-on-Chip (OoC) reprezentują nową technikę hodowli komórek 3D, która jest w stanie wypełnić lukę między konwencjonalną hodowlą komórkową 2D a modelami zwierzęcymi. Platformy OoC zazwyczaj składają się z jednego lub więcej przedziałów zawierających komórki specyficzne dla tkanek hodowane na szerokiej gamie rusztowań, takich jak membrany lub hydrożele1. Modele są w stanie naśladować jedną lub więcej zdefiniowanych funkcji organotypowych. Pompy umożliwiają ciągłą mikroprzepływową perfuzję pożywki do hodowli komórkowych w celu usunięcia produktów przemiany materii komórkowej, zaopatrzenia w składniki odżywcze i czynniki wzrostu w celu poprawy różnicowania komórkowego oraz odtworzenia niezbędnych warunków in vivo. Dzięki integracji komórek odpornościowych, systemy OoC mogą naśladować ludzką odpowiedź immunologiczną in vitro2. Do tej pory zaprezentowano szeroką gamę narządów i jednostek funkcjonalnych1. Systemy te obejmują modele układu naczyniowego3, lung4, liver2,5 oraz intestine6, które mogą być ułatwione do testowania leków5,7 i badań nad infekcjami6,8.
Prezentujemy tutaj model ludzkiego jelita na chipie, integrujący ludzkie komórki nabłonkowe, tworzący organotypową topografię 3D struktur podobnych do kosmków i krypt w połączeniu z wyściółką śródbłonka i makrofagami rezydującymi w tkankach. Model jest hodowany w mikroprzepływowo perfundowanym biochipie w formacie szkiełka mikroskopowego. Każdy biochip składa się z dwóch oddzielnych wnęk mikroprzepływowych. Każda wnęka jest podzielona porowatą membraną z politereftalanu etylenu (PET) na górną i dolną komorę. Sama błona służy również jako rusztowanie dla komórek do wzrostu z każdej strony. Pory błony umożliwiają przesłuchy komórkowe i migrację komórek między warstwami komórek. Dostęp do każdej komory można uzyskać za pomocą dwóch żeńskich portów wielkości luer lock. Opcjonalnie dodatkowy port o rozmiarach mini-luer lock może zapewnić dostęp do górnej lub dolnej komory (Rysunek 1).
Platforma OoC oferuje wiele odczytów, które można uzyskać z jednego eksperymentu. Intestine-on-chip jest dostosowany do łączenia perfundowanej hodowli komórek 3D, analizy ścieków i mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny ekspresji markerów komórkowych, tempa metabolizowania, odpowiedzi immunologicznej, kolonizacji i infekcji drobnoustrojów oraz funkcji bariery3,6,8. Model obejmuje rezydujące w tkance komórki odpornościowe i bezpośredni kontakt żywych mikroorganizmów z tkanką gospodarza, co jest zaletą w porównaniu z innymi opublikowanymi modelami9. Co więcej, komórki nabłonkowe samoorganizują się w trójwymiarowe struktury, które zapewniają fizjologicznie istotny interfejs dla kolonizacji żywym mikrobiotą6.
Protokół
Protokół ten wymaga dostępu do ~20 mL świeżej krwi od zdrowych dawców na jeden biochip w celu izolacji pierwotnych ludzkich monocytów. Wszyscy dawcy wyrazili pisemną, świadomą zgodę na udział w badaniu, które zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Jenie (numer zezwolenia 2018-1052-BO). Szczegółowe informacje na temat materiałów znajdują się w Tabeli materiałów. Szczegółowe informacje dotyczące składu wszystkich roztworów i pożywek znajdują się w Tabeli 1.
1. Ogólne uwagi dotyczące obsługi biochipów
- Ostrożnie oddziel pasek zbiorniczków i odczep pokrywki za pomocą podgrzanego noża, aby uzyskać pojedyncze zbiorniczki i pokrywki. Poszerz otwór w pokrywce tak, aby rurka silikonowa pasowała ściśle.
- Rurka silikonowa ma średnicę wewnętrzną 0.5 mm, jest asymetryczna i podzielona na stronę dłuższą (20 cm) oraz krótszą (12 cm) przez dwa stopery pompy perystaltycznej. Złóż dwie rurki każdej symetrii na jeden biochip poprzez przymocowanie rurki do męskiego złącza luer lock oraz pokrywki po przeciwnej stronie rurki. Złóż również cztery zbiorniczki na jeden biochip.
UWAGA: Przygotuj rurki i zbiorniczki z wyprzedzeniem i wysterylizuj je w autoklawie przed użyciem. Ponieważ rurki silikonowe mają ograniczoną żywotność, wymieniaj je po 3-5 eksperymentach. W przypadku określonych celów badawczych, takich jak testowanie leków, zaleca się przygotowanie nowych rurek do każdego eksperymentu. Wiele etapów niniejszego protokołu przebiega równolegle; zapoznaj się z rysunkiem poglądowym, który wyróżnia poszczególne kroki wykonywane w jednym dniu, jak pokazano na Rysunku 2.
Rysunek 1: Schematyczny model jelita na chipie (intestine-on-chip). (A) Biochip przedstawiony w przekroju poprzecznym. (B) Widoczne wymiary całego biochipu oraz płaskiej, wyjmowanej membrany PET. Całkowita objętość górnej komory, wliczając porty o rozmiarze luer lock, wynosi 290 µL, a dolnej komory odpowiednio 270 µL. (C) Schematyczna budowa biochipu jelitowego; widoczny jest trójwymiarowy rozrost nabłonka przypominający struktury kosmków i krypt, zawierający zróżnicowane komórki odpornościowe oraz warstwę śluzu. Druga strona membrany PET jest pokryta monowarstwą endotelialną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schematyczny przegląd harmonogramu budowy modelu i układu eksperymentalnego. Ten rysunek przedstawia schematyczny przegląd zaprezentowanego protokołu. Kluczowe procedury, takie jak wysiew komórek i stymulacja nabłonka LPS, są zaznaczone strzałkami. Skróty: HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej; LPS = lipopolisacharyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
2. Sterylizacja biochipu
- Sterylną szklaną szalkę Petri o średnicy 15 cm należy napełnić 70% niedenaturowanym etanolem. Wewnątrz należy umieścić biochip w taki sposób, aby wszystkie jego porty były całkowicie zakryte roztworem etanolu.
- Przez wszystkie komory chipa należy dwukrotnie na każdy port przepuścić 1 mL 70% etanolu. Inkubować przez 45-60 min w temperaturze pokojowej (RT).
UWAGA: Należy upewnić się, że wewnątrz biochipu nie pozostały pęcherzyki powietrza. Od tego momentu do układu biochipu nie może dostać się powietrze, a wnęki powinny pozostać wypełnione cieczą. - Etanol z szalki Petri należy usunąć i zastąpić sterylną wodą dwukrotnie destylowaną (ddH2O) tak, aby wszystkie porty były całkowicie zakryte. Ponownie, dwukrotnie na każdy port, należy przepuścić 1 mL ddH2O przez wnękę biochipu. Należy odświeżyć ddH2O w szalce Petri i powtórzyć procedurę.
- Należy usunąć całą ciecz z szalki Petri. Od tej pory w pełni wysterylizowane biochipy należy przechowywać w zamkniętej szalce Petri w każdym przypadku, gdy znajdują się one poza środowiskiem sterylnym. Do szalki Petri należy dodać niewielki zbiornik (np. zakrętkę od probówki 50 mL) zawierający 2-5 mL ddH2O, aby ograniczyć parowanie cieczy z wnętrza biochipu.
UWAGA: Biochipy można wysterylizować z wyprzedzeniem do 3 dni, pod warunkiem przechowywania ich w środowisku sterylnym do momentu użycia. Pozwala to na większą elastyczność w planowaniu pracy w ciągu jednego dnia.
3. Pozyskiwanie i wysiew komórek HUVEC
UWAGA: Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) zostały wyizolowane z pępowin zgodnie z wcześniej opisaną metodą10.
- Przed wysianiem komórek HUVEC, pokryj membranę ludzkim kolagenem IV. W tym celu przygotuj 1:100 rozcieńczenie roztworu zapasowego kolagenu (Tabela 1) w fosforanie soli buforowanych Dulbecco zawierającym magnez i wapń (PBS +/+). Dodaj 350 µL rozcieńczonego roztworu zapasowego do odpowiedniej komory. Inkubuj przez 5 min w RT.
UWAGA: Podczas pracy z biochipem w komorze sterylnej zalecamy umieszczenie pod nim sterylnej chusteczki w celu zbierania nadmiaru pożywki. - Przepłucz wszystkie komory dwukrotnie 350 µL PBS +/+, aby wypłukać pozostały kolagen i kwas octowy. Następnie dodaj 350 µL pożywki do wzrostu komórek endotelialnych (EC-medium) do każdej komory.
UWAGA: Na tym etapie biochipy są gotowe do wysiewu komórek i mogą być przechowywane w 37 °C do momentu użycia. - Używaj komórek HUVEC w pasażach 1-3 przy konfluencji komórek na poziomie 80-90%. Hoduj HUVEC w pożywce EC-medium zawierającej zdefiniowaną mieszankę suplementów dostarczoną przez producenta. Reprezentatywny obraz w polu jasnym hodowli komórek HUVEC przedstawiono na Rysunku 3A.
UWAGA: W zależności od dawcy, komórki HUVEC w wyższych pasażach mogą zacząć ulegać dedyferencjacji i nie będą w stanie wiarygodnie utworzyć gęstej i konfluentnej monowarstwy wewnątrz biochipu. Stosowanie antybiotyków, tj. 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny, jest opcjonalne, ale zalecane jako dodatek do pożywki EC-medium w celu zapobiegania kontaminacji mikrobiologicznej. - Usuń pożywkę z hodowli komórkowej z kolby T25 i delikatnie przemyj komórki 3-5 mL fosforanu soli buforowanych Dulbecco bez magnezu i wapnia (PBS -/-). Usuń PBS -/- i dodaj 1 mL odczynnika do dysocjacji trypsyną (Tabela 1). Inkubuj przez 5 min w 37 °C, aż komórki oddzielą się od kolby hodowlanej.
- Przenieś oddzielone komórki do probówki, używając 9 mL 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS -/-. Centryfuguj przy 350 × g przez 5 min w RT. Usuń nadsącz, resuspenduj w 1 mL pożywki EC-medium i określ liczbę komórek. Dostosuj stężenie komórek do poziomu 0,4 × 106 komórek na 150 µL (wysiew do dolnej komory) lub na 250 µL (wysiew do górnej komory).
- Dodaj odpowiednią objętość komórek do komory. W przypadku wysiewu do dolnej komory, zamknij wszystkie porty i natychmiast odwróć biochip do góry dnem, aby komórki opadły na membranę PET. Inkubuj biochipy w inkubatorze z nawilżaniem w 37 °C i 5% CO2.
- Po 24 h przeprowadź wymianę pożywki w komorze zawierającej HUVEC na 350 µL pożywki EC-medium. Pożywki w przeciwległej komorze nie trzeba wymieniać.
4. Pobieranie ludzkiej surowicy i izolacja monocytów pochodzących z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)
UWAGA: Komórki PBMC zostały wyizolowane zgodnie z opisem w pracy Mosig et al.11.
- Pobrać krew żylną od zdrowych dawców. Na każdy biochip należy pozyskać minimum 10 mL krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających krzemionkę w celu uzyskania surowicy. Po pełnej koagulacji odwirować probówki z krwią przy 2 500 × g przez 10 min w RT. Zebrać surowicę, podzielić na alykwoły i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Pozyskać minimum 10 mL krwi pełnej od tego samego dawcy do probówek do pobierania krwi zawierających EDTA w celu izolacji PBMC. Delikatnie wymieszać niekoagulowaną krew w stosunku 1:1 z izobuforem (Tabela 1) poprzez odwracanie probówki, a następnie powoli nanieść 35 mL tej mieszaniny na 15 mL medium do gradientu gęstości o gęstości 1,077 g/mL w probówce 50 mL.
- Odwirować przy 800 × g przez 20 min bez hamowania w RT. Ostrożnie pobrać powstałą warstwę komórek odpornościowych, znajdującą się nad medium do gradientu gęstości, i przenieść ją do nowej probówki 50 mL. Dopełnić do 50 mL zimnym izobuforem i wyprać komórki poprzez delikatne odwracanie.
- Odwirować przy 200 × g przez 8 min bez hamowania w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz i resuspendować w 10 mL izobufora na każdy gradient gęstości. Opcjonalnie: połączyć PBMC jednego dawcy, jeśli kilka gradientów jest prowadzonych równolegle.
- Odwirować przy 150 × g przez 8 min w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz i resuspendować osad w 10 mL izobufora na gradient gęstości. Powtórzyć krok wirowania 4.4. Na koniec odlać nadsącz i resuspendować komórki w 2 mL medium do różnicowania monocytów (Tabela 1).
UWAGA: Dodatek M-CSF i GM-CSF wymusza różnicowanie izolowanych monocytów w kierunku makrofagów pochodzenia monocytarnego oraz dendrytycznych komórek pochodzenia monocytarnego (w połączeniu z lipopolisacharydem [LPS], który jest dodawany na późniejszym etapie tego protokołu). Stosowanie antybiotyków, tj. 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny, jest opcjonalne, ale zalecane jako dodatek do medium w celu zapobiegania kontaminacji mikrobiologicznej. - Określić liczbę komórek i wysiać ~10 × 106 komórek na dołek płytki 6-dołkowej w 2 mL medium do różnicowania monocytów (Tabela 1). Inkubować w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przez 1 h, aby umożliwić przyleganie monocytów do plastiku płytki 6-dołkowej.
- Ostrożnie odlać nadsącz i wyprać 2x podgrzanym do odpowiedniej temperatury 2 mL medium do komórek hematopoetycznych, aby usunąć nieprzylegające komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 h w medium do różnicowania monocytów.
- Aby zebrać monocyty, ostrożnie odlać nadsącz i wyprać raz 2 mL podgrzanym PBS -/-. Przykład obrazu w jasnym polu hodowli monocytów na tym etapie przedstawia Rysunek 3B. Następnie inkubować komórki przez 7 min w 1 mL podgrzanego odczynnika do odrywania monocytów (Tabela 1) w temperaturze 37 °C, aby wymusić odłączenie monocytów od plastiku płytki 6-dołkowej.
- Przenieść odłączone monocyty do probówki o niskim wiązaniu (low-binding). Opcjonalnie: aby uzyskać wyższą wydajność komórek, ostrożnie wyprać płytkę 6-dołkową kilka razy za pomocą PBS -/-.
- Odwirować przy 300 × g przez 8 min w RT. Odlać nadsącz i resuspendować w medium kondycjonowanym przez EC (Tabela 1). Określić liczbę komórek i dostosować stężenie komórek do 0,1 × 106 komórek na 150 µL (wysiew do dolnej komory) lub na 250 µL (wysiew do górnej komory).
UWAGA: Na wszystkich etapach izolacji komórek odpornościowych należy postępować delikatnie i ograniczyć siły ścinające, aby zapobiec aktywacji komórek odpornościowych. Podczas opracowywania tej izolacji należy sprawdzić czystość monocytów pochodzących z PBMC (np. za pomocą cytometrii przepływowej). Ponad 95% wszystkich komórek powinno być dodatnich w kierunku typowych markerów monocytarnych, takich jak CD14.
5. Wysiew monocytów
- Przeprowadź wymianę medium w komorze zawierającej HUVEC, używając 350 µL podgrzanego medium warunkowanego przez EC.
- Do tej samej komory dodaj 150 µL (komora dolna) lub 250 µL (komora górna) przygotowanej zawiesiny monocytów (patrz krok 4.10). W przypadku wysiewania do komory dolnej, zamknij wszystkie porty i natychmiast odwróć biochip do góry dnem, aby komórki opadły na warstwę HUVEC. Inkubuj biochip w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
- Co 24 h przeprowadzaj wymianę medium w komorze zawierającej HUVEC + monocyty, używając 350 µL medium warunkowanego przez EC.
6. Zbiór i wysiew C2BBe1
UWAGA: Komórki Caco-2 wykazujące ekspresję rąbka szczoteczkowego 1 (C2BBe1)12 są wykorzystywane do 35. pasażu i pobierane z kolb o 80-90% konfluencji. Reprezentacyjny obraz w polu jasnym hodowli C2BBe1 przedstawiono na Ryc. 3C.
- Hodować komórki C2BBe1 w pożywce C2 (Tabela 1).
UWAGA: Stosowanie antybiotyków, np. 20 µg/mL gentamycyny, jest opcjonalne, ale zalecane jako dodatek do pożywki C2 w celu zapobiegania kontaminacji mikrobiologicznej. - Usunąć pożywkę z hodowli komórkowej z kolby T25 i delikatnie przemyć komórki 3-5 mL PBS -/-. Usunąć PBS -/- i dodać 1 mL odczynnika do dysocjacji trypsyną (Tabela 1). Inkubować przez 5 min w 37 °C, aż komórki oddzielą się od ścianek kolby.
- Przenieść oddzielone komórki do probówki, używając 9 mL 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS -/-. Wirować przy 350 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć nadsącz, resuspender w 1 mL pożywki C2 i określić liczbę komórek. Dostosować stężenie komórek do 0,5 × 106 komórek na 150 µL (wysiew do dolnej komory) lub na 250 µL (wysiew do górnej komory).
- Przed wysiewem komórek C2BBe1 delikatnie przemyć odpowiednią komorę 350 µL pożywki C2.
- Dodać 150 µL (dolna komora) lub 250 µL (górna komora) przygotowanej zawiesiny C2BBe1 (patrz krok 6.3) do odpowiedniej komory. W przypadku wysiewu do dolnej komory, zamknąć wszystkie porty i natychmiast odwrócić biochip do góry dnem, aby komórki opadły na membranę PET. Inkubować biochipy w wilgotnej inkubatorze w 37 °C i 5% CO2.
Rycina 3: Morfologia komórek HUVECs, monocytów i C2BBe1 przed wysianiem w biochipie. Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne obrazy w polu jasnym dla różnych źródeł komórek wykorzystanych w protokole. Obrazy wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu w polu jasnym przy powiększeniu 10x. Wszystkie typy komórek: (A) HUVECs, (B) monocyty oraz (C) C2BBe1 były hodowane w 2D w monowarstwie, zgodnie z opisem w odpowiednich sekcjach protokołu. Paski skali = 200 µm. Skróty: HUVECs = ludzkie komórki endotelialne żyły pępowinowej; PBMCs = mononuklearne komórki krwi obwodowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
7. Podłączenie do pompy perystaltycznej i perfuzja obiegowa
- Przygotować pusty inkubator, dodając do niego pompę perystaltyczną. Wszystkie powierzchnie inkubatora i pompy należy dokładnie oczyścić środkiem dezynfekującym, aby zapewnić środowisko quasi-sterylne.
UWAGA: Pompy perystaltyczne mogą generować dużo ciepła podczas pracy. W dobrze izolowanych inkubatorach lub słabo klimatyzowanych laboratoriach liczba użytecznych pomp na inkubator może być ograniczona, ponieważ inkubatory mają tendencję do przegrzewania się. Dwie pompy perystaltyczne na inkubator powinny być wystarczające. - Przed podłączeniem wysterylizowanych rurek do biochipu, przepłukać każdą rurkę 700 µL PBS +/+, a następnie 500 µL pożywki C2 lub pożywki kondycjonowanej EC. Przygotować jedną rurkę każdego rodzaju symetrii dla każdej pożywki (patrz krok 1.2). Rurkę o krótkiej odległości od złącza luer lock do stopera pompy perystaltycznej należy przeznaczyć dla lewej wnęki, a rurkę o drugiej symetrii dla prawej wnęki.
- Wyjąć biochip z inkubatora i przeprowadzić wymianę pożywki, używając 350 µL dla każdej komory. Usunąć wszystkie zatyczki i wypełnić wszystkie porty aż do pełna.
- Zaczynając od lewej wnęki, podłączyć pierwszą rurkę do prawego portu górnej komory, wkładając adapter luer lock do portu biochipu. Następnie podłączyć drugą rurkę do lewego portu dolnej komory. Powtórzyć tę procedurę dla prawej wnęki mikrofluidycznej.
- Wziąć zbiornik i dodać małą kroplę pożywki do hodowli komórek na dno zbiornika. Następnie wstawić zbiornik po przeciwnej stronie pierwszej rurki i powtórzyć czynność dla drugiej komory. Gdy wszystkie porty zostaną podłączone do rurek lub zbiorników, napełnić zbiorniki 3,5 mL pożywki do hodowli komórek.
- Wolny koniec rurki, do której przymocowana jest pokrywka, położyć na wierzchu zbiornika, aby zamknąć układ mikrofluidyczny każdej komory. W tym stanie przetransportować biochip do pompy perystaltycznej.
UWAGA: W zależności od odległości do inkubatora i otoczenia laboratoryjnego, do przenoszenia chipów do inkubatora można użyć wcześniej oczyszczonego i autoklawowanego pudełka. - Użyć stoperów pompy perystaltycznej, aby podłączyć rurki do pompy. Podłączyć każdą rurkę do pompy perystaltycznej w taki sposób, aby pożywka przepływała ze zbiornika do wnęki, następnie do rurki i przez pompę z powrotem do zbiornika (Rycina 4). Zbiornik służy jako pułapka na pęcherzyki powietrza w obiegu perfuzyjnym i zapobiega uwięzieniu powietrza w układzie. Perfundować każdą komorę z szybkością przepływu 50 µL/min, co skutkuje naprężeniem ścinającym na poziomie 0,013 dyn/cm2 w górnej komorze i 0,006 dyn/cm2 w dolnej komorze8.
UWAGA: Jeśli pożywka w dolnych i górnych wnękach jest przemieszczana w przeciwnych kierunkach, można uzyskać większy trójwymiarowy rozrost tkanki jelitowej13. Dlatego zbiorniki górnych i dolnych wnęk są rozmieszczone po przeciwnych stronach (Rycina 4). Perfuzja cyrkulacyjna zmniejsza ilość potrzebnej pożywki do hodowli komórek, ale potencjalnie może prowadzić do wzbogacenia w cytokiny i metabolity. W razie potrzeby możliwa jest również perfuzja liniowa biochipu. - Perfundować biochip przez 72 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
Rysunek 4: Biochip podłączony do pompy perystaltycznej. Przedstawiono przykład biochipu podłączonego do pompy perystaltycznej. Komórki nabłonkowe C2BBe1 są hodowane w dolnej komorze (czerwone medium C2 znajduje się w zbiornikach z przodu), natomiast komórki HUVEC są hodowane w górnej komorze (żółtawe medium EC-conditioned-medium znajduje się w zbiornikach z tyłu). Różne pożywki do hodowli komórkowej nie mieszają się dzięki funkcji barierowej wyhodowanej tkanki. Biochip jest podłączony do pompy perystaltycznej w taki sposób, że pożywka przepływa ze zbiornika do wnęki. Stąd pożywka przepływa z powrotem do zbiornika przez rurki za pomocą pompy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
8. Kondycjonowanie bariery nabłonkowej LPS
- Po 72 h preperfuzji zatrzymać pompę perystaltyczną i zdjąć pokrywkę połączoną z rurką każdego zbiornika. Położyć ją na sterylnej chusteczce obok pompy.
- Usunąć całe medium i napełnić zbiorniki 2 mL świeżo przygotowanego medium. Do strony nabłonkowej zawierającej komórki C2BBe1 dodać do medium LPS w stężeniu 100 ng/mL.
UWAGA: LPS zwiększa funkcję barierową tkanki, stymuluje migrację makrofagów pochodzenia monocytarnego do tkanki nabłonkowej oraz umożliwia różnicowanie komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego. - Ponownie połączyć rurki i pokrywki ze zbiornikiem i kontynuować perfuzję okrężną przy szybkości przepływu 50 µL/min przez kolejne 24 h.
UWAGA: Od tego momentu model na chipie może być wykorzystywany w eksperymentach – testach związków lub badaniach nad infekcjami. Zaleca się wymianę 2 mL medium w każdym zbiorniku co 24 h.
9. Dostęp do tkanki dla różnych metod odczytu
- Pobierać nadsączniki z pożywki hodowlanej z rezerwuarów przez cały czas trwania perfuzji. Otworzyć rezerwuar i pobrać pożądaną objętość (patrz kroki 8.1-8.3). Wykorzystać te nadsączniki do detekcji metabolitów, cytokin lub innych cząsteczek.
- Aby uzyskać dostęp do tkanki, użyć skalpela, aby wykonać precyzyjne cięcie wzdłuż zewnętrznej krawędzi górnej komory i usunąć folię wiążącą, otwierając jamę mikrofluidyczną. Tkanka modelu biochipu jelitowego jest teraz dostępna. Ostrożnie wyciąć wzdłuż zewnętrznej krawędzi komory mikrofluidycznej, aby oddzielić membranę od biochipu. Zebrać membranę zawierającą tkankę za pomocą pęsety.
UWAGA: Należy zwrócić uwagę na ułożenie palców podczas tego kroku i pracować ostrożnie, aby zapobiec wypadkom. Zaleca się stosowanie rękawic odpornych na przecięcia. - Alternatywnie można zebrać komórki z oddzielnych warstw wewnątrz biochipu, używając roztworów enzymatycznych, np. trypsyny, lub poddać komórki lizie z użyciem buforów zawierających Triton X-100.
10. Ocena przepuszczalności poprzez dyfuzję FITC-dekstranu
UWAGA: Funkcję barierową tkanki można przeanalizować za pomocą testu przepuszczalności dla FITC-dekstranu po odłączeniu pompy perystaltycznej. Ocena przepuszczalności FITC-dekstranu została dostosowana na podstawie pracy Deinhardt-Emmer et al.4.
- Przygotować roztwór zapasowy dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC-dextran) (masa cząsteczkowa 3-5 kDa, Tabela 1).
- Opróżnić zbiorniki i odłączyć chip z układu perfuzji.
- Przeprowadzić wymianę medium w komorze górnej i dolnej na medium bez czerwieni fenolowej.
UWAGA: Ten krok nie jest konieczny, jeśli podczas eksperymentu stosowano już medium bez czerwieni fenolowej. - Do komory zawierającej komórki C2BBe1 dodać 350 µL roztworu FITC-dextran o stężeniu 1 mg/mL.
- Zamknąć porty i inkubować chip przez 60 min w temperaturze 37 °C stroną nabłonkową skierowaną do góry.
- Po czasie inkubacji osobno zebrać medium hodowlane z obu komór chipa i przechowywać w temperaturze 4 °C, w ciemności, do momentu pomiaru.
- Do pomiaru przygotować krzywą wzorcową w medium C2 oraz w medium warunkowanym przez EC bez czerwieni fenolowej w zakresie od 1 000 µg/mL do 0 µg/mL FITC-dextran, wykonując 11 kolejnych rozcieńczeń seryjnych 1:2.
- Przenieść 200 µL każdej próbki do czarnej płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 495 nm i długości fali emisji 517 nm.
- Na podstawie krzywej wzorcowej obliczyć stężenie FITC-dextran w próbkach, a następnie wyznaczyć współczynnik przepuszczalności.
11. Barwienie immunofluorescencyjne
UWAGA: Żywa tkanka może być badana mikroskopowo. W celu łatwiejszej manipulacji zaleca się odłączenie biochipu od pompy perystaltycznej i zastosowanie obiektywów o dużej odległości roboczej w mikroskopie odwróconym. Jako analizę końcową można przeprowadzić fiksację tkanki wewnątrz biochipu w celu wykonania takich procedur jak barwienie immunofluorescencyjne.
- Zatrzymaj pompę perystaltyczną i otwórz zbiorniki wszystkich komór. Opróżnij zbiorniki i odłącz rurki oraz zbiorniki z biochipu.
- Przemyj komory mikrofluidyczne 500 µL zimnego PBS +/+ (dwukrotnie na każdą komorę). Dodaj 500 µL lodowatego metanolu do wszystkich komór i inkubuj przez 15 min w temperaturze -20 °C. Następnie przemyj komorę mikrofluidyczną 500 µL PBS +/+ (dwukrotnie na każdą komorę).
UWAGA: Odpowiednie są również inne metody fiksacji, takie jak fiksacja 4% paraformaldehydem lub utrwalaczem Carnoy'a. Po fiksacji chipy można przechowywać w temperaturze 4 °C lub przystąpić bezpośrednio do barwienia immunofluorescencyjnego. OSTROŻNIE: Odczynniki do fiksacji, takie jak metanol lub paraformaldehyd, są toksyczne. Wykonuj odpowiednie czynności pod wyciągiem i utylizuj odpady zgodnie z przeznaczeniem. - Otwórz chip zgodnie z opisem w kroku 9.2, aby uzyskać dostęp do tkanki. Potnij membranę PET zawierającą tkankę na maksymalnie trzy części, aby barwić je równolegle za pomocą różnych paneli immunologicznych.
- Przenieś każdy fragment membrany do oddzielnej płytki 24-dołkowej zawierającej roztwór blokujący i permeabilizujący (Tabela 1), używając pęsety precyzyjnej. Upewnij się, że badana warstwa komórek jest zawsze skierowana do góry przez cały proces barwienia. Inkubuj fragmenty membrany przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
UWAGA: Najlepsze wyniki barwienia uzyskuje się, dopasowując surowicę do przeciwciała wtórnego. Na przykład, jeśli przeciwciała wtórne pochodzą z gatunku kozy, zalecamy użycie normalnej surowicy koziej. - Przenieś fragmenty membrany na czyste szkiełko przedmiotowe wewnątrz komory wilgotnościowej. Przygotuj panel przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze do barwienia (Tabela 1) i dodaj 50 µL do każdego fragmentu membrany. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Optymalne stężenie przeciwciał i skuteczność barwienia mogą się różnić w zależności od producenta i klonu. Zalecamy wcześniejsze przetestowanie paneli barwiących w 2D kulturze komórkowej. - Po inkubacji przenieś próbki do płytki 24-dołkowej i delikatnie przemyj membrany 3 x 5 min roztworem do mycia (Tabela 1).
- Ponownie przenieś fragmenty membrany na czyste szkiełko przedmiotowe wewnątrz komory wilgotnościowej. Przygotuj panel przeciwciał wtórnych w roztworze do barwienia (Tabela 1) i dodaj 50 µL do każdego fragmentu membrany. Jeśli jest wymagane, dodaj barwnik przeciwjądrowy, taki jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub Hoechst. Inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
UWAGA: Podczas pracy z fluoroforami chroń próbki przed światłem, aby zapobiec fotobleakcingowi i zwiększyć jakość obrazu. - Po inkubacji przenieś próbki do płytki 24-dołkowej i delikatnie przemyj membrany 2 x 5 min roztworem do mycia (Tabela 1). Następnie przemyj raz PBS +/+ przez 5 min.
- Zamocuj fragmenty membrany na czystym szkiełku przedmiotowym, używając medium montażowego do fluorescencji i szkiełka nakrywkowego. Przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania mikroskopowego.
Wyniki
Te reprezentatywne wyniki przedstawiają wyraźne warstwy tkanki w modelu jelita na chipie. Zostały one zabarwione immunofluorescencyjnie zgodnie z opisem w sekcji 11 protokołu. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego jako stosy z (z-stacks), a następnie przetworzono do projekcji ortogonalnej. Szczegóły dotyczące konfiguracji mikroskopowej i oprogramowania znajdują się w Tabeli Materiałów. Rysunek 5 przedstawia warstwę naczyniową, tworzącą barierę endotelialną monowarstwę składającą się z HUVECs i makrofagów. Zabarwiono reprezentatywne markery komórkowe, takie jak VE-Cadherin i czynnik von Willebranda dla komórek endotelialnych oraz CD68 dla makrofagów. Trójwymiarowa warstwa nabłonkowa składająca się z komórek C2BBe1 jest pokazana na Rysunku 6 i Rysunku 7. Integralność tkanki została potwierdzona poprzez zabarwienie E-Cadherin i ZO-1. Szczegółową analizę wszystkich oczekiwanych markerów tkankowych i polaryzacji tkanki można znaleźć w pracy Maurer et al.6. Rysunek 8 przedstawia przykładowy obraz wykazujący brak trójwymiarowego wzrostu struktur przypominających kosmki jelitowe. W porównaniu z typową trójwymiarową warstwą komórkową (Rysunek 6), liczba zabarwionych jąder jest znacznie mniejsza, a komórki występują jedynie w formie monowarstwy. Ten specyficzny fenotyp uzyskano poprzez dodanie do pożywki hodowlanej inhibitora deacetylazy histonowej, który hamuje proliferację komórek. Przepuszczalność bariery ocenia się za pomocą testu przenikania z użyciem FITC-dextran. Przepuszczalność wzrosła po zakażeniu oportunistycznym patogenem C. albicans, co pokazano na Rysunku 9A. Zakażenie prowadzi do zwiększonego uwalniania cytokin IL-1β, IL-6, IL-8 i IL-10 do nadsączu pożywki naczyniowej (Rysunek 9B)8.
Rysunek 5: Utrwalona strona naczyniowa układu intestine-on-chip. Reprezentatywny obraz immunofluorescencji bariery naczyniowej po pięciu dniach perfuzji. Tkankę utrwalono metanolem. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wykonano stos z-stack z przekrojami o grubości 1 µm; przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu. (A) DNA w jądrach komórkowych zabarwiono DAPI. (B) W pełni zróżnicowane makrofagi pochodzące z monocytów wykazują ekspresję CD68 i są rozproszone w całej tkance naczyniowej. (C) HUVECs tworzą konfluencyjną warstwę wykazującą integralność tkanki poprzez tworzenie połączeń przylegających, takich jak VE-Cadherin. Dodatkowo, (D) czynnik von Willebranda jest silnie eksponowany przez HUVECs. Na koniec, (E) wszystkie markery pokazano na obrazie nałożonym. Paski skali = 100 µm. Skróty: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 6: Utrwalona strona nabłonkowa układu jelita-na-chipie. Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny spolaryzowanej warstwy komórek nabłonkowych po 5 dniach perfuzji, wykazujący ekspresję białek połączeń E-Cadherin i ZO-1. Tkankę utrwalono metanolem. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wykonano stos obrazów z (z-stack) o grubości sekcji 1 µm. Przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu. (A) DNA w jądrach komórkowych zabarwiono DAPI. Szczelna bariera nabłonkowa powstaje w wyniku formowania się (B) połączeń przylegających, zabarwionych E-Cadherin, oraz (C) apikalnych połączeń ścisłych, zabarwionych ZO-1. Połączenia ścisłe i przylegające ko-lokalizują się w apikalnej błonie komórkowej, co widać na (D) obrazie nałożonym. Paski skali = 100 µm. Skrót: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Utrwalona strona nabłonkowa jelita na chipie z wypustkami przypominającymi kosmki. Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny trójwymiarowej warstwy komórek nabłonkowych po sześciu dniach perfuzji. Tkanka została utrwalona utrwalaczem Carnoya. Za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego wykonano stos obrazów z (z-stack) przekrojów o grubości 1 µm, a (A) przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu obrazów. DNA w jądrach komórkowych zabarwiono Hoechstem. Dodatkowo tkankę zabarwiono aglutyniną z kiełków pszenicy, lektyną, która barwi ludzką mucynę. (B) Trójwymiarowy wzrost struktur nabłonka przypominających kosmki i krypty można zaobserwować w przekrojach x i y stosu obrazów. Paski skali = 50 µm. Skrót: WGA = aglutynina z kiełków pszenicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8: Utrwalona strona nabłonkowa jelita-na-chipie bez wypustek przypominających kosmki. Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny warstwy komórek nabłonkowych traktowanych kwasem suberoylanilidohydroksamowym (SAHA), inhibitorem deacetylazy histonowej, zapobiegającym proliferacji komórek. Tkankę utrwalono metanolem. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wykonano stos z-stack z przekrojami o grubości 1 µm. Przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu z-stack. (A) DNA w jądrach komórkowych zabarwiono DAPI. Na obrazie (B) połączenia przylegające zabarwiono E-kadheryną, a na obrazie (C) połączenia ścisłe zabarwiono ZO-1. Połączenia ścisłe i przylegające ko-lokalizują, co widać na obrazie nałożonym (D). Paski skali = 100 µm. Skrót: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 9: Patogenozależna odpowiedź immunologiczna zintegrowanych wrodzonych komórek odpornościowych: Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Kaden et al.8. Model jelita na chipie niezinfekowany (-) lub zinfekowany (+) C. albicans SC5314 analizowano pod kątem (A) przepuszczalności z użyciem FITC-Dekstranu (3-5 kDa) oraz (B) sekrecji cytokin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Roztwór/pożywka | Skład | |
| Roztwór zapasowy kolagenu | 0.5 mg/mL kolagenu IV w 0.5 mM kwasie octowym | |
| Bufor izotoniczny | PBS -/-, 1 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej frakcji V, 2 mM EDTA | |
| Pożywka do różnicowania monocytów | Pożywka dla komórek krwiotwórczych + 10% ludzkiej surowicy autologicznej + 10 ng/mL rekombinowanego czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF) + 10 ng/mL rekombinowanego czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) | |
| Odczynnik do dysocjacji trypsyną | 0.25% trypsyny + 1 mM EDTA w PBS -/- | |
| Odczynnik do odrywania monocytów | 4 mg/mL lidokainy + 5 mM EDTA w PBS -/- | |
| Pożywka warunkowana przez komórki śródbłonka (EC) | Pożywka EC + 10% ludzkiej surowicy autologicznej + 10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF | |
| Pożywka C2 | DMEM z wysoką zawartością glukozy (4.5 g/L) + 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM + 1 mM pirogronianu sodu + 10 µg/mL ludzkiej holo-transferyny | |
| Roztwór zapasowy dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) | 1 mg/mL w podgrzanej pożywce C2 bez czerwieni fenolowej | |
| Roztwór blokujący i permeabilizujący | 3% normalnej surowicy osła (NDS) + 0.1% saponiny w PBS +/+ | |
| Roztwór barwiący | 0.3% normalnej surowicy osła (NDS) + 0.1% saponiny w PBS +/+ | |
| Roztwór do płukania | 0.1% saponiny w PBS +/+ | |
| Fiksatyw Carnoya | 60% etanolu, 30% chloroformu, 10% lodowatego kwasu octowego | |
Tabela 1: Wykaz i skład roztworów użytych w tym protokole. Skrót: PBS -/- = sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco bez magnezu i wapnia.
Dyskusja
Przedstawiony protokół szczegółowo opisuje niezbędne kroki do wygenerowania immunokompetentnego modelu jelita na chipie. Opisaliśmy konkretne techniki i możliwe metody odczytu, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, analiza cytokin i metabolitów, cytometria przepływowa, analiza białkowa i genetyczna oraz pomiar przepuszczalności.
Opisany model składa się z pierwotnych HUVEC, makrofagów pochodzących z monocytów i komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów współhodowanych z warstwą 3D komórek nabłonka jelitowego reprezentujących aspekty populacji wydzielających śluz, absorpcyjnych, enteroendokrynnych i podobnych do komórek Pabeth, jak opisano wcześniej 6,14. Podczas wykonywania kroków protokołu należy pamiętać o kilku krytycznych punktach. Na wszystkich etapach należy zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza w układzie mikroprzepływowym. Dlatego zawsze pipetuj odwrotnie (pobieraj objętość od drugiego oporu i dozuj tylko do pierwszego zatrzymania) podczas obchodzenia się z biochipem lub rurką. Aby zapobiec wysokiemu ciśnieniu lub siłom ścinającym działającym na komórki w biochipie, należy zawsze delikatnie pipetować i zamykać przeciwległą komorę podczas pipetowania w biochipie (np. podczas wymiany pożywki w górnej komorze należy zamknąć dolną komorę odpowiednimi zatyczkami). Biochip umożliwia wysiewanie komórek po dwóch stronach membrany PET. W związku z tym model można ustawić ze strukturami przypominającymi kosmki jelitowe pod membraną PET lub rosnącymi na błonie w górę. W zależności od zainteresowania badawczego, jedna lub druga orientacja komórek ma pewne korzyści w zakresie interakcji fizycznej, takie jak wspomaganie grawitacyjne przyłączania komórek krążących zawieszonych w ośrodku przepływowym.
Ze względu na przepływ ośrodka mikroprzepływowego, spolaryzowane komórki jelitowe tworzą trójwymiarową tkankę przypominającą struktury przypominające krypty i kosmki, które kształtują głęboką barierę tkankową wierzchołkową przez gęstą sieć połączeń ścisłych i połączeń adherenowych6. Dodatkowo, zintegrowane wrodzone komórki odpornościowe zwiększają funkcję bariery jelitowej i pozwalają na szczegółowe badanie odpowiedzi cytokin i komórek odpornościowych na różne bodźce, w tym odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla dawcy 3,6. Model ten stanowi fizjologicznie istotną platformę do badania komensalów mikrobiologicznych (np. Lactobacillus rhamnosus6) i patogenów (np. Candida albicans 6,8 ) ludzkiego jelita. Model wykorzystano do zbadania mechanizmów zmian składu mikrobiologicznego jelit i regulacji odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej6. W badaniu wykazaliśmy, jak odtworzyć fizjologiczną tolerancję immunologiczną światła jelita i wspierać homeostatyczną kolonizację przez żywe mikroorganizmy. Co więcej, wstępna kolonizacja luminalnej strony modelu probiotykiem Lactobacillus rhamnosus zmniejszyła inwazję tkankową Candida albicans i ograniczyła jej translokację do przedziału naczyniowego, podobnie jak w sytuacji in vivo. Badanie dowiodło potencjału modelu w zakresie badania interakcji mikrobiologicznych, odpowiedzi immunologicznych i mechanizmów patogenności jelita w fizjologicznie istotnych warunkach in vitro.
Mimo to ta platforma chipowa ma ograniczenia, a mianowicie wykorzystanie komórek jelitowych pochodzących z raka, które nie są w pełni zdolne do reprezentowania ludzkiego jelita, oraz wykorzystanie pierwotnych komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Warunki hodowli hipoksyjnej można ustalić, hodując model w inkubatorze do hipoksji w warunkach perfuzji, aby lepiej odzwierciedlić sytuację in vivo ludzkiego jelita.
W porównaniu z innymi platformami OoC, takimi jak model "gut-on-a-chip" opublikowany przez Kima i wsp.14,15, początkowa liczba komórek tworzących prezentowany model tkankowy jest około 10-krotnie wyższa. Umożliwia to na przykład jednoczesną analizę do trzech paneli barwienia immunofluorescencyjnego w ramach pojedynczego eksperymentu. Większa liczba komórek dodatkowo usprawnia analizy punktów końcowych, w tym cytometrię przepływową, analizę western blot i inne standardowe, gotowe testy, które wymagają supernatantów do hodowli komórkowych, takich jak profilowanie cytokin i pomiar dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Uzyskanie wielu odczytów z jednego eksperymentu zmniejsza ogólne koszty i czas eksperymentu. Gotowe rozwiązania sprzętowe od szerokiego spektrum producentów są dostępne dzięki ustandaryzowanej platformie biochipów, która obejmuje interfejsy przemysłowe i ślady (mikroskopijny format szkiełka chipa, porty w formacie luer lock i wyrównane na matrycy 96-dołkowej). Obejmuje to również wiele membran z różnych materiałów i o różnych rozmiarach porów. Wielkość porów może wpływać na wzrost komórek i integralność tkanek16, a także na migrację komórek.
Podsumowując, protokół ten przedstawia szczegółowy i adaptowalny model jelita na chipie, który replikuje kluczowe elementy środowiska jelitowego człowieka. Stanowi skalowalną i skuteczną platformę do prowadzenia szeroko zakrojonych badań nad mikrobiotą jelitową i tkanką jelitową gospodarza, ze szczególnym uwzględnieniem odpowiedzi immunologicznych gospodarza i patofizjologii jelit. W związku z tym model jest w stanie wypełnić lukę między tradycyjnymi modelami in vitro a biologią człowieka, co czyni go niezbędnym narzędziem do dogłębnych badań nad biologią jelit.
Oświadczenia
M.R. jest dyrektorem generalnym Dynamic42 GmbH i posiada udziały w spółce. A.S.M. jest doradcą naukowym Dynamic 42 GmbH i posiada udziały w spółce.
Podziękowania
Praca została wspierana finansowo przez Collaborative Research Center PolyTarget 1278 (numer projektu 316213987) dla V.D.W. i A.S.M. A.F. i A.S.M. dodatkowo dziękują za wsparcie finansowe Klastra Doskonałości "Balance of the Microverse" w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. Pragniemy podziękować Astrid Tannert i Laboratorium Biofotonicznemu i Obrazowaniu w Jenie (JBIL) za udostępnienie nam ich konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego ZEISS LSM980. Rysunek 1C i rysunek 2 zostały utworzone za pomocą Biorender.com.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 96-dołkowa, przezroczyste dno | Thermo Fisher | 10000631 | Materiały eksploatacyjne |
| Kwas octowy | Roth | 3738.4 | Chemikalia |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, osioł, anty-mysie IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Wtórne barwienie naczyń krwionośnych i barwienie nabłonka |
| przeciwciał Alexa Fluor 647 AffiniPure, osioł, anty-królik IgG (H+L) | Jackson Badania immunologiczne | 711-605-152 | Wtórne barwienie nabłonka przeciwciał |
| Alexa Fluor 647, osioł, anty-królicze IgG (H + L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Wtórne barwienie naczyń krwionośnych |
| przeciwciał Aparat Axiocam ERc5s | Zeiss | 426540-9901-000 | Wyposażenie techniczne |
| Basal Medium MV, bez czerwieni fenolowej | Promocell | C-22225 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe |
| Frakcja BSA V | Gibco | 15260-037 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| C2BBe1 (klon Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Źródło komórek nabłonkowych |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemikalia |
| Inkubator CO2 | Heracell | 150i | Wyposażenie techniczne |
| Kolagen IV z ludzkiego łożyska | Sigma-Aldrich | C5533 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Szkiełka nakrywkowe (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | Materiały eksploatacyjne |
| Cy3 AffiniPure, osioł, anty-kozi IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Wtórne barwienie naczyniowe przeciwciał |
| Cy3 AffiniPure, osioł, antyszczurzy IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Wtórne barwienie nabłonka przeciwciał |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy | Gibco | 41965-062 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez czerwieni fenolowej | Gibco | 31053028 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Roztwór EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka | Promocell | C-22020 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka mieszanka suplementów | Promocell | C-39225 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Etanol 96%, niedenaturowany | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemikalia |
| Surowica bydlęca | płodu invitrogen 10270106 | Hodowla komórkowa materiały eksploatacyjne | |
| Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemikalia |
| Fluorescencyjne medium montażowe | Dako | S3023 | Chemikalia |
| Gentamycyna (10 mg / ml) | Sigma Aldrich | G1272 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Suplement GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Barwienie nabłonka |
| Holotransferyna (5 mg / ml) Transferyna, Holo, Milipore z ludzkiego osocza | 616397 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych | |
| Ludzki rekombinowany GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Człowiek rekombinowany M-CSF | Peprotech | 300-25 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Urządzenie oświetleniowe | mikroskopu fluorescencyjnego | Zeiss | HXP 120 C |
| Laserowy mikroskop skaningowy | Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego | Zeiss | CLSM980 |
| Chlorowodorek lidokainy | Sigma-Aldrich | L5647 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Lipopolisacharyd (LPS) | Sigma | L2630 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Materiały eksploatacyjne |
| Rurki z niskim mocowaniem (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Materiały eksploatacyjne |
| Adapter Luer do górnej pokrywy (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe |
| Męskie mini wtyki luer, rząd czterech, PP, nieprzezroczyste | Chipshop mikroprzepływowy | 09-0556-0336-09 | Mikroprzepływowe materiały eksploatacyjne |
| MEM Roztwór aminokwasów endogennych | Gibco | 11140 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Metanol | Roth | 8388.2 | Mikroskop chemiczny |
| Zeiss | Axio Observer 5 | Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego | |
| Szkiełka mikroskopowe | Menzel | MZ-0002 | Materiały eksploatacyjne |
| Monoklonalne, mysie, anty-ludzkie przeciwciało CD68 ( KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Pierwotne przeciwciało Barwienie naczyniowe |
| Monoklonalne, szczurze, anty-ludzkie przeciwciało E-kadheryny (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Pierwotne barwienie nabłonka przeciwciał |
| Czytnik płytek Multiskan | Go Thermo Fisher | 51119300 | Wyposażenie techniczne |
| Normalna surowica osła | Biozol | LIN-END9010-10 | chemikalia |
| Przekrój optyczny | mikroskopu fluorescencyjnego | Zeiss | ApoTome |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / mL) | Gibco | 15140-122 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Zatyczki | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe |
| Poliklonalne, kozie, anty-ludzkie przeciwciało VE-Kadheryna | R& D Systems | AF938 | Pierwotne przeciwciało Barwienie naczyniowe |
| Poliklonalne, królik, anty-ludzkie Przeciwciało czynnika von Willebranda | Dako | A0082 | Pierwotne przeciwciało Barwienie naczyniowe |
| Poliklonalne, królik, przeciwciało anty-ludzkie ZO-1 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Pierwotne przeciwciało Barwienie nabłonka |
| Zasilacz | Mikroskop Zeiss | Eplax Vp232 | Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego |
| Mikroskop Primovert | Zeiss | 415510-1101-000 | Wyposażenie techniczne |
| Pompa perystaltyczna Reglo ICC | Ismatec | ISM4412 | Wyposażenie techniczne |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7,5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Materiały eksploatacyjne |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Materiały eksploatacyjne |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360-088 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Zbiornik 4,5 ml | ChipShop | 10000079 | Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe |
| Trypane niebieskie barwienie 0,4% | Invitrogen | T10282 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Trypsyna | Gibco | 11538876 | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych |
| Rurki | Dynamic 42 | ST001 | Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe |
| Pęseta (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Materiały eksploatacyjne |
| Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Barwienie nabłonka |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych, Pożywka z komórek krwiotwórczych |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterylne | Greiner Bio-One | 662 160 | Materiały eksploatacyjne |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterylne | Greiner Bio-One | 657 160 | Materiały eksploatacyjne |
| Zen Blue | Oprogramowanie Zeiss | Wersja 3.7 | Oprogramowanie mikroskopowe |
Bibliografia
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374(2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396(2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525(2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535(2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'. Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).
Przedruki i uprawnienia
