Artykuł metodologiczny

Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66607

⸱

12 lipca 2024

 , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje solidną metodę tworzenia biofilmu błonki. Metoda jest skalowalna do różnych objętości hodowli, co pozwala na łatwe zastosowanie do różnych celów eksperymentalnych. Konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę potencjału biofilmotwórczego kilku gatunków prątków.

Streszczenie

Wiele bakterii rozwija się w skomplikowanych naturalnych społecznościach, wykazując kluczowe cechy wielokomórkowości, takie jak komunikacja, współpraca i rywalizacja. Najczęstszym przejawem zachowania wielokomórkowego bakterii jest tworzenie biofilmów, często związanych z chorobotwórczością. Biofilmy stanowią schronienie dla środków przeciwdrobnoustrojowych, sprzyjając powstawaniu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Konwencjonalna praktyka hodowli bakterii w płynnych kulturach bakterii w kolbach wstrząsowych nie odzwierciedla ich prawidłowego fizjologicznego wzrostu w naturze, co w konsekwencji ogranicza nasze zrozumienie ich skomplikowanej dynamiki. Warto zauważyć, że profile metaboliczne i transkrypcyjne bakterii znajdujących się w biofilmach są bardzo podobne do profili naturalnie rosnących komórek. Ten paralelizm podkreśla znaczenie biofilmów jako idealnego modelu dla badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł koncentruje się na wykorzystaniu Mycobacterium smegmatis jako organizmu modelowego w celu zilustrowania techniki hodowli biofilmów błonki. Podejście to można dostosować do różnych objętości kultur, co ułatwia jego wdrożenie do różnych celów eksperymentalnych, takich jak badania nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Co więcej, konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę zdolności do tworzenia biofilmu różnych gatunków prątków z niewielkimi korektami.

Wprowadzenie

Bakterie są w stanie przetrwać jako jednokomórkowe jednostki; jednak w najbardziej fizjologicznie istotnych warunkach, organizują się w mimetyki społecznościowe. Biofilm jest powszechnie uznaną organizacją społeczną bakterii utworzoną przez zagregowane komórki zamknięte w samodzielnie wyprodukowanej matrycy1. Takie złożenie posiada sygnatury wczesnej wielokomórkowości i zapewnia wyższą odporność na stres dla systemów bakteryjnych. Biofilmy są często tolerancyjne na środki przeciwdrobnoustrojowe i szacuje się, że są odpowiedzialne za prawie 80% infekcji mikrobiologicznych2,3.

Hodowle bakterii z kolby wstrząsowej i na płytkach tradycyjnie stosują się do hodowli bakterii. Ich ogromną akceptowalność i sukces można przypisać łatwości obsługi, odtwarzalności i skalowalności. Jednak brak kontekstu fizjologicznego ogranicza potencjał translacyjny wiedzy generowanej za pomocą takich systemów4. Dlatego biofilmy stają się atrakcyjnym systemem modelowym do badania patofizjologii bakterii. Biofilmy zapewniają dynamiczny system modelowy, ściśle odzwierciedlający warunki naturalne, umożliwiając naukowcom odtworzenie aspektów fizjologicznych, takich jak gradienty składników odżywczych i niejednorodność przestrzenna5,6.

Styl życia związany z biofilmem jest szczególnie istotny w badaniach nad prątkami, ponieważ prątki, w tym osławiona Mycobacterium tuberculosis, są biegłymi w tworzeniu biofilmu7. Ich zdolność do rozwoju w biofilmach przyczynia się do ich trwałości w tkankach gospodarza podczas infekcji. Stanowi ogromne wyzwanie w leczeniu chorób prątków, biorąc pod uwagę nieodłączną oporność na antybiotyki związaną ze stylem życia biofilmu8. Biofilmy stanowią również idealny system modelowy do badania metabolizmu prątków, ponieważ pozwalają na badanie unikalnych adaptacji metabolicznych i strategii wykorzystania składników odżywczych stosowanych przez prątki w złożonych zbiorowiskach mikroorganizmów9.

Chociaż biofilm jest coraz częściej akceptowany jako lepszy system modelowy do badań nad prątkami10, istnieje potrzeba spójnych i powtarzalnych standardowych procedur operacyjnych, zwłaszcza do rysowania podobieństw między badaniami prowadzonymi w różnych laboratoriach. Opisana tutaj metoda opisuje procedury tworzenia biofilmu u gatunku prątków, M. smegmatis. M. smegmatis jest bardziej dostępnym modelem do badania biofilmów prątków, ze względu na jego niepatogenność i szybszą kinetykę tworzenia biofilmu. Metodę można modyfikować w celu dostosowania do zastosowań, takich jak badania przesiewowe przeciwko prątkom, ekstrakcja metabolitów i badania omiczne.

Protokół

Szczegóły dotyczące wszystkich odczynników i sprzętu użytego do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mediów Sautona

  1. Przygotować 50 ml 2,5% roztworu diwodorofosforanu potasu, ostrożnie ważąc 1,25 g diwodorofosforanu potasu i rozpuszczając go w 50 ml wody dejonizowanej.
  2. Przygotuj 50 ml 2,5% roztworu siarczanu magnezu, ważąc 2,56 g siarczanu magnezu i rozpuszczając go w 50 ml wody dejonizowanej.
  3. Przygotuj 10 ml 5% roztworu cytrynianu żelazowo-amonowego, ważąc 0,5 g cytrynianu żelazowo-amonowego i rozpuszczając go w 10 ml wody dejonizowanej. Przechowuj go w bursztynowej tubie.
  4. Przygotuj 100 ml 20% roztworu glukozy, ważąc 20 g glukozy i rozpuszczając ją w 100 ml wody dejonizowanej. Sterylizować filtrem za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml i filtra strzykawkowego PVDF 0,2 μM w probówce.
  5. Przygotuj 10 ml sterylnego 1% roztworu siarczanu, ostrożnie ważąc 0,1 g siarczanu i rozpuszczając go w 10 ml wody dejonizowanej. Sterylizować filtrem za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego PVDF 0,2 μM w okapie laminarnym.
  6. Wymieszać przygotowane składniki w 750 ml wody dejonizowanej, jak opisano w Tabeli 1. Zmierz pH roztworu i dostosuj je do 7. Uzupełnić objętość do 900 ml wodą dejonizowaną.
  7. Autoklawować pożywkę w temperaturze 15 PSI i 121 °C przez 15-20 minut. Niech ostygnie. Następnie dodaj 100 μl sterylizowanego filtrem 1% siarczanu. Dodaj 100 ml wysterylizowanej przez filtr 20% glukozy i dobrze ją rozpuść.

2. Przygotowanie filtracyjno-sterylizowanego 5% Tween-80

  1. Rozpuść 0,5 ml Tween-80 w 9,5 ml wody dejonizowanej.
  2. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego PVDF 0,2 μM w okapie laminarnym.

3. Przygotowanie kultury podstawowej

  1. W kapturze laminarnym użyj pipety serologicznej, aby dozować 2 ml autoklawowanego podłoża LB do dwóch sterylnych probówek o pojemności 14 ml.
  2. Dodaj 20 μl sterylizowanego filtrem 5% Tween-80 do probówek za pomocą mikropipety.
  3. Inokulować M. smegmatis w jednej z probówek, dodając jej krio-wywar za pomocą pętli inokulacyjnej. Druga probówka służy jako kontrola pożywki.
  4. Inkubować probówki przez 48 godzin w inkubatorze z wytrząsarką przy 300 obr./min i temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Rurka kontrolna pożywki nie powinna wykazywać żadnego wzrostu.

4. Przygotowanie kultury wtórnej

  1. W kapturze laminarnym użyj pipety serologicznej, aby dozować 2 ml autoklawowanego podłoża LB do dwóch sterylnych probówek o pojemności 14 ml.
  2. Dodaj 20 μl sterylizowanego filtrem 5% Tween-80 do probówek za pomocą mikropipety.
  3. Dodać 20 μl kultury pierwotnej do jednej z probówek za pomocą mikropipety. Zachowaj drugą probówkę jako kontrolkę nośnika.
  4. Inkubować kultury w inkubatorze z wytrząsarką z prędkością 300 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż osiągną OD600 0,6 do 0,8,
    UWAGA: Zwykle potrzeba od 12 do 14 godzin, aby osiągnąć OD600 od 0,6 do 0,8. Można również stosować inne gęstości komórek, ale zdefiniowana wartość OD600 pomaga w badaniach porównawczych.

5. Zakładanie biofilmu

  1. W kapturze laminarnym dozować 6 ml pożywki Saautona uzupełnionej o 2% glukozy do każdej studzienki 6-dołkowej płytki za pomocą pipety serologicznej.
  2. Zaszczepić odpowiednie studzienki 120 μl (tj. 2%) wtórnego inokulum za pomocą mikropipety. Trzymaj jeden niezaszczepiony dobrze jako kontrolę pożywki.
  3. Wymieszać podłoże i kulturę, pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Przykryj pokrywkę i ostrożnie uszczelnij płytkę folią parafinową.
  4. Inkubować płytkę w spokoju w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C przez 7 dni.

6. Ustawianie biofilmów do obserwacji specyficznych dla danego etapu

UWAGA: Ogólna konfiguracja biofilmu jest taka sama, jak opisana w kroku 5. Aby zebrać lub zobrazować biofilm w różnych momentach w czasie, sugeruje się, aby ten sam biofilm był ustawiony w wielu zestawach na oddzielnych płytkach.

  1. Aby obserwować biofilmy między dniem 3 a 6, należy przygotować cztery płytki w identycznych warunkach i używać jednej płytki dziennie do obrazowania.
    UWAGA: Warstwa biofilmu zaczyna pojawiać się na granicy faz powietrze-medium począwszy od trzeciego dnia montażu płytki.

7. Szacowanie rozwoju biofilmu

  1. Oszacowanie wizualne
    1. Zobrazuj płytki za pomocą systemu dokumentacji żelowej z oświetleniem światłem epi-white (Rysunek 1).
      UWAGA: Obrazowanie daje ogólne jakościowe i ilościowe oszacowanie powstałego biofilmu. Jako alternatywę można użyć dowolnej dobrej jakości aparatu.
  2. Oszacowanie suchej masy
    1. Wykonaj pomiar suchej masy, aby uzyskać bardziej precyzyjną ocenę ilościową.
    2. Aby zmierzyć suchą masę, zacznij od zważenia bibuły.
      UWAGA: Zamiast bibuły można również użyć bibuły filtracyjnej.
    3. Pobrać biofilm z płytki 6-dołkowej i przenieść go na papier za pomocą szpatułki.
    4. Ostrożnie zbierz większość biofilmu z hodowli, uważając, aby nie przenieść nadmiernych ilości pożywki na papier.
    5. Umieść biofilm na bibułce.
    6. Umieścić go w inkubatorze w temperaturze 50 °C na 0,5-1 godziny, aż do całkowitego wyschnięcia biofilmu.
    7. Zmierz łączną masę papieru i biofilmu.
      UWAGA: Sucha masa biofilmu=(Waga biofilmu +papier)-(Waga papieru)

8. Test tolerancji antybiotyków w biofilmach

  1. Oszacuj MIC90 ryfampicyny w hodowli planktonowej M. smegmatis zgodnie z protokołem opisanym przez Iritha Wieganda i wsp., używając media11 Sautona. Dodaj antybiotyk, gdy kultury osiągną OD600 0,2.
  2. Ustawić płytki do wzrostu biofilmu zgodnie z opisem w kroku 5 protokołu.
  3. W czwartym dniu inkubacji dodać ryfampicynę do kultur o stężeniu MIC90 (64 μg/ml) z boków studzienki za pomocą mikropipety umieszczonej w kapturze laminarnym.
    UWAGA: Rób to ostrożnie, nie naruszając zbytnio biofilmu. Pozostaw jedną ze studzienek z biofilmem nieleczoną.
  4. Powoli obracaj płytki, aby wymieszać antybiotyki.
  5. Przykryj boki płytek folią parafinową i trzymaj je w inkubatorze do dalszego wzrostu.
  6. Po 24 godzinach wyjąć płytki z okapu laminarnego i dodać Tween-80 do końcowego stężenia 0,2% we wszystkich studzienkach zawierających biofilm.
  7. Ponownie przykryj płytki folią parafinową i utrzymuj je w temperaturze 4 °C i 100 obr./min przez 12 godzin.
  8. Wyjąć płytki z okapu laminarnego i homogenizować składniki za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml.
  9. Umyj składniki pożywką Sautona, korzystając z protokołu opisanego w Anand et al.12.
  10. Na koniec ponownie zawieś komórki w 6 ml pożywki Saautona i rozcieńcz do końcowych stężeń 10-4, 10-5, 10-6 i 10-7.
  11. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB za pomocą autoklawowanych kulek szklanych.
  12. Uszczelnić wszystkie płytki folią parafinową i przechowywać je w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  13. Po 3 dniach inkubacji policz kolonie na każdej płytce. Weź pod uwagę tylko płytki z liczbą kolonii między 30 a 300.
  14. Oblicz jtk/ml i względny spadek jtk/ml, korzystając z podanych wzorów13.
    UWAGA: CFU/ml = (liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia) / (objętość podana (w ml))
    Względny spadek jtk/ml = ((jtk/ml u nieleczonych - jtk/ml u leczonych)) / ((jtk/ml u nieleczonych)) / ((jtk/ml u nieleczonych)) × 100

Wyniki

Błony biofilmu stają się widoczne gołym okiem od trzeciego dnia. Chociaż biofilm rośnie na pożywce Sautona bez 2% glukozy, po jej dodaniu zaobserwowano poprawę siatkowania. Uzyskano 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) suchej masy biofilmu z każdej studni płytki 24-dołkowej zawierającej 1,5 mL pożywki Sautona (uzupełnionej o 2% glukozy), hodowanej przez cztery dni. Na Rysunku 2 rozwój biofilmu był widoczny od 3. do 6. dnia. W 3. dniu zaczyna tworzyć się błona z lekkim siatkowaniem, a do 5. dnia jest ona w pełni dojrzała. Od 6. dnia biofilm zaczyna ulegać rozpadowi. MIC90 ryfampicyny (64 µg/mL) zredukowała liczbę CFU w biofilmie jedynie o 25% ± 12% (n = 3).

Analiza hodowli komórkowych na płytce wielodołkowej, obraz mikroskopowy przedstawiający wzorce wzrostu komórek.
Rysunek 1: Biofilmy M. smegmatis po 4 dniach inkubacji w pożywce Sautona. (1) Bez glukozy, zaszczepione 2% inokulum. (2) Bez glukozy, zaszczepione 4% inokulum. (3) Z 2% glukozą, zaszczepione 2% inokulum. (4) Z 2% glukozą, zaszczepione 4% inokulum. (5) i (6) to kontrole pożywek. Próbki znajdują się w standardowych płytkach 6-dołkowych. Zdjęcia wykonano bez powiększenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost hodowli komórkowych w ciągu 4 dni, obrazy mikroskopowe, eksperymentalny film poklatkowy, analiza biologiczna.
Rysunek 2: M. smegmatis morfologia biofilmu z 3rd dzień po inokulacji do 6. dniath dzień. Próbki znajdują się w standardowych płytkach 24-dołkowych. Zdjęcia wykonano bez powiększenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Lp.KomponentStężenie robocze (m/v)Stężenie roztworu zapasuObjętość/masa roztworu zapasowego
1Wodorofosforan potasu0.05%2.50%20 ml
2Siarczan magnezu0.05%2.50%20 ml
3Cytrynian amonu i żelaza(III)0.01%5%1 mL
4Glicerol6%100%60 ml
5L-asparagina0.40%NA4 g
6Kwas cytrynowy0.20%NA2 g

Tabela 1: Składniki do przygotowania pożywki Sautona.

Dyskusja

Wielokomórkowy tryb życia drobnoustrojów został opisany prawie sto lat temu; Badania kliniczne są jednak nadal nieliczne, głównie ze względu na brak solidnych metod14 . Metody opisane w pracach z zakresu biologii biofilmu są często trudne do zaadaptowania. Oczekuje się, że szczegółowa metodologia, wspomagana demonstracjami krytycznych kroków, poprawi odtwarzalność protokołów.

Opisana w tym artykule metoda wytwarzania biofilmu jest skalowalna, wymaga proporcjonalnego zwiększenia objętości podłoża i wielkości inokulum. Zastosowania takie jak ekstrakcja metabolitów wymagają większej objętości hodowli, podczas gdy testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe wymagają mniejszej biomasy12. Dodatkowo, rozmiar inokulum może być regulowany w celu dostosowania tempa tworzenia biofilmu. Ta elastyczność pozwala badaczom odpowiednio kontrolować czas trwania eksperymentów.

Warunki wzrostu i mikrośrodowisko odgrywają kluczową rolę w fizjologii biofilmu15. Warto zauważyć, że obecność glukozy nie jest obowiązkowa do tworzenia biofilmu; Niemniej jednak zaobserwowano, że włączenie 2% glukozy poprawia siateczkę i stabilność biofilmu. Innym interesującym spostrzeżeniem jest potencjał wzmocnienia biofilmu wynikający z umieszczenia szklanego szkiełka nakrywkowego na dnie studzienek hodowlanych. Dodanie Tween-80 zarówno w hodowlach pierwotnych, jak i wtórnych ma kluczowe znaczenie dla łagodzenia agregacji komórek.

Rozwój biofilmu obejmuje odrębne fazy wzrostu, takie jak przyczepianie, dojrzewanie i dyspersja. Podczas gdy opisany tutaj układ biofilmu jest zwykle inkubowany przez 7 dni, błonki stają się widoczne gołym okiem od 3dnia. Taki układ pozwala na badanie czasowej dynamiki rozwoju biofilmu. Chociaż w tym artykule opisano oszacowanie suchej masy w celu oceny biomasy biofilmu, konfiguracja jest również podatna na konwencjonalne barwienie fioletem krystalicznym lub oszacowanie oparte na mikroskopii12,16.

Wytwarzanie biofilmów przez prątki odgrywa znaczącą rolę w ich patogenności i nadaje zwiększoną oporność na leki 8,17. Zaobserwowaliśmy od siedmiu do ośmiu razy wyższą tolerancję na antybiotyki w hodowlach biofilmu w porównaniu z kulturami w kolbach wstrząsowych. Kilka grup wykorzystuje biofilmy jako system modelowy do badania fizjologii bakterii; Szersze przyjęcie tego trybu wzrostu przez społeczność badawczą zajmującą się prątkami może dostarczyć nowszych informacji na temat patofizjologii różnych gatunków patogennych w tym rodzaju.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez stypendium DBT-Ramalingaswami przyznane Amiteshowi Anandowi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; Filtr strzykawkowy M PVDFAxivaSFNY04 R
1 ml końcówkiGenetixGXM-611000 C
10 i mikro; L końcówkiGenetixGXM-6110 C
200 µ Końcówki LGenetixGXM-61200C
6-dołkowe płytki polipropylenoweTarsons980010
Rurki bursztynoweAutoklaw Tarsons546051
Szafabiologicznego Hospharma
A IIMSET
BibułaDowolny odpowiedni sprzedawca
WirówkaEppendorf
251275z kwasem cytrynowym
Bio-Rad2239955
Cytrynian amonu żelazowegoSigmaF5879
System dokumentacji żeluBio-Rad
Koraliki szklaneSigmaG8772
GlukozaSigma49139
GlycerolSigmaG5516
Pętle inokulacyjneGenaxyHS81121C
L-AspargineSigmaA0884
LB-agarHimediaM1151
LB-mediaHimediaM575
M. smegmatis mc2155 cryo-stockATCC700084
Siarczan magnezuSigmaM2643
MikropipetyGilson
ParafilmTarsons
Petri DishTarsons460020
pH-metrLabman Scientific Instruments
Czytnik płytekTecan
Probówki polipropylenoweGenaxyGEN-14100-PS
Fosforan potasu jednozasadowySigmaP5379
RyfampicynaMedchemExpressHY-B0272
Pipeta serologicznaSPL Nauki przyrodnicze95210
Inkubator z wytrząsarką
Inkubator statycznyCARON
Sterylna strzykawka 10 mlBecton Dickinson309642
Sterylna strzykawka 50 mlBecton Dickinson309653
Tween-80SigmaP1754
Waga wagowaSartorius
SiarczanSigmaZ0251
bezpieczeństwa Kuwety Spektrofotometr szpatułkowy Eppendorf Thermo Scientific

Bibliografia

  1. Davey, M. E., O'toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  3. Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).
  4. Hernández-Jiménez, E., et al. Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer. Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).
  5. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  6. Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).
  7. Keating, T., et al. Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation. Cell Surf. 7, 100065(2021).
  8. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).
  9. Dietrich, L. E. P., et al. Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state. J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).
  10. Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms. J Vis Exp. (60), e3820(2012).
  11. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  12. Anand, A., et al. Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches. Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).
  13. Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements (2019).
  14. Høiby, N. A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections. Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).
  15. Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482. bioRxiv. , (2023).
  16. O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. (47), e2437(2011).
  17. Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie biofilmuMycobacterium smegmatisbiofilm b onowywielokom rkowo bakteriiinkubacja statycznapo ywka Lysogeny Brothpo ywka Sautonakwantyfikacja biofilmu

Powiązane artykuły