Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Podsumowanie

Ten protokół opisuje solidną metodę tworzenia biofilmu błonki. Metoda jest skalowalna do różnych objętości hodowli, co pozwala na łatwe zastosowanie do różnych celów eksperymentalnych. Konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę potencjału biofilmotwórczego kilku gatunków prątków.

Streszczenie

Wiele bakterii rozwija się w skomplikowanych naturalnych społecznościach, wykazując kluczowe cechy wielokomórkowości, takie jak komunikacja, współpraca i rywalizacja. Najczęstszym przejawem zachowania wielokomórkowego bakterii jest tworzenie biofilmów, często związanych z chorobotwórczością. Biofilmy stanowią schronienie dla środków przeciwdrobnoustrojowych, sprzyjając powstawaniu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Konwencjonalna praktyka hodowli bakterii w płynnych kulturach bakterii w kolbach wstrząsowych nie odzwierciedla ich prawidłowego fizjologicznego wzrostu w naturze, co w konsekwencji ogranicza nasze zrozumienie ich skomplikowanej dynamiki. Warto zauważyć, że profile metaboliczne i transkrypcyjne bakterii znajdujących się w biofilmach są bardzo podobne do profili naturalnie rosnących komórek. Ten paralelizm podkreśla znaczenie biofilmów jako idealnego modelu dla badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł koncentruje się na wykorzystaniu Mycobacterium smegmatis jako organizmu modelowego w celu zilustrowania techniki hodowli biofilmów błonki. Podejście to można dostosować do różnych objętości kultur, co ułatwia jego wdrożenie do różnych celów eksperymentalnych, takich jak badania nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Co więcej, konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę zdolności do tworzenia biofilmu różnych gatunków prątków z niewielkimi korektami.

Wprowadzenie

Bakterie są w stanie przetrwać jako jednokomórkowe jednostki; jednak w najbardziej fizjologicznie istotnych warunkach, organizują się w mimetyki społecznościowe. Biofilm jest powszechnie uznaną organizacją społeczną bakterii utworzoną przez zagregowane komórki zamknięte w samodzielnie wyprodukowanej matrycy¹. Takie złożenie posiada sygnatury wczesnej wielokomórkowości i zapewnia wyższą odporność na stres dla systemów bakteryjnych. Biofilmy są często tolerancyjne na środki przeciwdrobnoustrojowe i szacuje się, że są odpowiedzialne za prawie 80% infekcji mikrobiologicznych^2,3.

Hodowle bakterii z kolby wstrząsowej i na płytkach tradycyjnie stosują się do hodowli bakterii. Ich ogromną akceptowalność i sukces można przypisać łatwości obsługi, odtwarzalności i skalowalności. Jednak brak kontekstu fizjologicznego ogranicza potencjał translacyjny wiedzy generowanej za pomocą takich systemów⁴. Dlatego biofilmy stają się atrakcyjnym systemem modelowym do badania patofizjologii bakterii. Biofilmy zapewniają dynamiczny system modelowy, ściśle odzwierciedlający warunki naturalne, umożliwiając naukowcom odtworzenie aspektów fizjologicznych, takich jak gradienty składników odżywczych i niejednorodność przestrzenna^5,6.

Styl życia związany z biofilmem jest szczególnie istotny w badaniach nad prątkami, ponieważ prątki, w tym osławiona Mycobacterium tuberculosis, są biegłymi w tworzeniu biofilmu⁷. Ich zdolność do rozwoju w biofilmach przyczynia się do ich trwałości w tkankach gospodarza podczas infekcji. Stanowi ogromne wyzwanie w leczeniu chorób prątków, biorąc pod uwagę nieodłączną oporność na antybiotyki związaną ze stylem życia biofilmu⁸. Biofilmy stanowią również idealny system modelowy do badania metabolizmu prątków, ponieważ pozwalają na badanie unikalnych adaptacji metabolicznych i strategii wykorzystania składników odżywczych stosowanych przez prątki w złożonych zbiorowiskach mikroorganizmów⁹.

Chociaż biofilm jest coraz częściej akceptowany jako lepszy system modelowy do badań nad prątkami¹⁰, istnieje potrzeba spójnych i powtarzalnych standardowych procedur operacyjnych, zwłaszcza do rysowania podobieństw między badaniami prowadzonymi w różnych laboratoriach. Opisana tutaj metoda opisuje procedury tworzenia biofilmu u gatunku prątków, M. smegmatis. M. smegmatis jest bardziej dostępnym modelem do badania biofilmów prątków, ze względu na jego niepatogenność i szybszą kinetykę tworzenia biofilmu. Metodę można modyfikować w celu dostosowania do zastosowań, takich jak badania przesiewowe przeciwko prątkom, ekstrakcja metabolitów i badania omiczne.

Protokół

Szczegóły dotyczące wszystkich odczynników i sprzętu użytego do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mediów Sautona

1. Przygotować 50 ml 2,5% roztworu diwodorofosforanu potasu, ostrożnie ważąc 1,25 g diwodorofosforanu potasu i rozpuszczając go w 50 ml wody dejonizowanej.
2. Przygotuj 50 ml 2,5% roztworu siarczanu magnezu, ważąc 2,56 g siarczanu magnezu i rozpuszczając go w 50 ml wody dejonizowanej.
3. Przygotuj 10 ml 5% roztworu cytrynianu żelazowo-amonowego, ważąc 0,5 g cytrynianu żelazowo-amonowego i rozpuszczając go w 10 ml wody dejonizowanej. Przechowuj go w bursztynowej tubie.
4. Przygotuj 100 ml 20% roztworu glukozy, ważąc 20 g glukozy i rozpuszczając ją w 100 ml wody dejonizowanej. Sterylizować filtrem za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml i filtra strzykawkowego PVDF 0,2 μM w probówce.
5. Przygotuj 10 ml sterylnego 1% roztworu siarczanu, ostrożnie ważąc 0,1 g siarczanu i rozpuszczając go w 10 ml wody dejonizowanej. Sterylizować filtrem za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego PVDF 0,2 μM w okapie laminarnym.
6. Wymieszać przygotowane składniki w 750 ml wody dejonizowanej, jak opisano w Tabeli 1. Zmierz pH roztworu i dostosuj je do 7. Uzupełnić objętość do 900 ml wodą dejonizowaną.
7. Autoklawować pożywkę w temperaturze 15 PSI i 121 °C przez 15-20 minut. Niech ostygnie. Następnie dodaj 100 μl sterylizowanego filtrem 1% siarczanu. Dodaj 100 ml wysterylizowanej przez filtr 20% glukozy i dobrze ją rozpuść.

2. Przygotowanie filtracyjno-sterylizowanego 5% Tween-80

1. Rozpuść 0,5 ml Tween-80 w 9,5 ml wody dejonizowanej.
2. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego PVDF 0,2 μM w okapie laminarnym.

3. Przygotowanie kultury podstawowej

1. W kapturze laminarnym użyj pipety serologicznej, aby dozować 2 ml autoklawowanego podłoża LB do dwóch sterylnych probówek o pojemności 14 ml.
2. Dodaj 20 μl sterylizowanego filtrem 5% Tween-80 do probówek za pomocą mikropipety.
3. Inokulować M. smegmatis w jednej z probówek, dodając jej krio-wywar za pomocą pętli inokulacyjnej. Druga probówka służy jako kontrola pożywki.
4. Inkubować probówki przez 48 godzin w inkubatorze z wytrząsarką przy 300 obr./min i temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Rurka kontrolna pożywki nie powinna wykazywać żadnego wzrostu.

4. Przygotowanie kultury wtórnej

1. W kapturze laminarnym użyj pipety serologicznej, aby dozować 2 ml autoklawowanego podłoża LB do dwóch sterylnych probówek o pojemności 14 ml.
2. Dodaj 20 μl sterylizowanego filtrem 5% Tween-80 do probówek za pomocą mikropipety.
3. Dodać 20 μl kultury pierwotnej do jednej z probówek za pomocą mikropipety. Zachowaj drugą probówkę jako kontrolkę nośnika.
4. Inkubować kultury w inkubatorze z wytrząsarką z prędkością 300 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż osiągną OD₆₀₀ 0,6 do 0,8,
   UWAGA: Zwykle potrzeba od 12 do 14 godzin, aby osiągnąć OD₆₀₀ od 0,6 do 0,8. Można również stosować inne gęstości komórek, ale zdefiniowana wartość OD₆₀₀ pomaga w badaniach porównawczych.

5. Zakładanie biofilmu

1. W kapturze laminarnym dozować 6 ml pożywki Saautona uzupełnionej o 2% glukozy do każdej studzienki 6-dołkowej płytki za pomocą pipety serologicznej.
2. Zaszczepić odpowiednie studzienki 120 μl (tj. 2%) wtórnego inokulum za pomocą mikropipety. Trzymaj jeden niezaszczepiony dobrze jako kontrolę pożywki.
3. Wymieszać podłoże i kulturę, pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Przykryj pokrywkę i ostrożnie uszczelnij płytkę folią parafinową.
4. Inkubować płytkę w spokoju w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C przez 7 dni.

6. Ustawianie biofilmów do obserwacji specyficznych dla danego etapu

UWAGA: Ogólna konfiguracja biofilmu jest taka sama, jak opisana w kroku 5. Aby zebrać lub zobrazować biofilm w różnych momentach w czasie, sugeruje się, aby ten sam biofilm był ustawiony w wielu zestawach na oddzielnych płytkach.

1. Aby obserwować biofilmy między dniem 3 a 6, należy przygotować cztery płytki w identycznych warunkach i używać jednej płytki dziennie do obrazowania.
   UWAGA: Warstwa biofilmu zaczyna pojawiać się na granicy faz powietrze-medium począwszy od trzeciego dnia montażu płytki.

7. Szacowanie rozwoju biofilmu

1. Oszacowanie wizualne
   1. Zobrazuj płytki za pomocą systemu dokumentacji żelowej z oświetleniem światłem epi-white (Rysunek 1).
      UWAGA: Obrazowanie daje ogólne jakościowe i ilościowe oszacowanie powstałego biofilmu. Jako alternatywę można użyć dowolnej dobrej jakości aparatu.
2. Oszacowanie suchej masy
   1. Wykonaj pomiar suchej masy, aby uzyskać bardziej precyzyjną ocenę ilościową.
   2. Aby zmierzyć suchą masę, zacznij od zważenia bibuły.
      UWAGA: Zamiast bibuły można również użyć bibuły filtracyjnej.
   3. Pobrać biofilm z płytki 6-dołkowej i przenieść go na papier za pomocą szpatułki.
   4. Ostrożnie zbierz większość biofilmu z hodowli, uważając, aby nie przenieść nadmiernych ilości pożywki na papier.
   5. Umieść biofilm na bibułce.
   6. Umieścić go w inkubatorze w temperaturze 50 °C na 0,5-1 godziny, aż do całkowitego wyschnięcia biofilmu.
   7. Zmierz łączną masę papieru i biofilmu.
      UWAGA: Sucha masa biofilmu=(Waga biofilmu +papier)-(Waga papieru)

8. Test tolerancji antybiotyków w biofilmach

1. Oszacuj MIC90 ryfampicyny w hodowli planktonowej M. smegmatis zgodnie z protokołem opisanym przez Iritha Wieganda i wsp., używając media^{11 Sautona}. Dodaj antybiotyk, gdy kultury osiągną OD₆₀₀ 0,2.
2. Ustawić płytki do wzrostu biofilmu zgodnie z opisem w kroku 5 protokołu.
3. W czwartym dniu inkubacji dodać ryfampicynę do kultur o stężeniu MIC90 (64 μg/ml) z boków studzienki za pomocą mikropipety umieszczonej w kapturze laminarnym.
   UWAGA: Rób to ostrożnie, nie naruszając zbytnio biofilmu. Pozostaw jedną ze studzienek z biofilmem nieleczoną.
4. Powoli obracaj płytki, aby wymieszać antybiotyki.
5. Przykryj boki płytek folią parafinową i trzymaj je w inkubatorze do dalszego wzrostu.
6. Po 24 godzinach wyjąć płytki z okapu laminarnego i dodać Tween-80 do końcowego stężenia 0,2% we wszystkich studzienkach zawierających biofilm.
7. Ponownie przykryj płytki folią parafinową i utrzymuj je w temperaturze 4 °C i 100 obr./min przez 12 godzin.
8. Wyjąć płytki z okapu laminarnego i homogenizować składniki za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml.
9. Umyj składniki pożywką Sautona, korzystając z protokołu opisanego w Anand et al.¹².
10. Na koniec ponownie zawieś komórki w 6 ml pożywki Saautona i rozcieńcz do końcowych stężeń ^10-4, ^10-5, ^10-6 i ^10-7.
11. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB za pomocą autoklawowanych kulek szklanych.
12. Uszczelnić wszystkie płytki folią parafinową i przechowywać je w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
13. Po 3 dniach inkubacji policz kolonie na każdej płytce. Weź pod uwagę tylko płytki z liczbą kolonii między 30 a 300.
14. Oblicz jtk/ml i względny spadek jtk/ml, korzystając z podanych wzorów¹³.
    UWAGA: CFU/ml = (liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia) / (objętość podana (w ml))
    Względny spadek jtk/ml = ((jtk/ml u nieleczonych - jtk/ml u leczonych)) / ((jtk/ml u nieleczonych)) / ((jtk/ml u nieleczonych)) × 100

Wyniki

Błony biofilmu stają się widoczne gołym okiem od trzeciego dnia. Chociaż biofilm rośnie na pożywce Sautona bez 2% glukozy, po jej dodaniu zaobserwowano poprawę siatkowania. Uzyskano 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) suchej masy biofilmu z każdej studni płytki 24-dołkowej zawierającej 1,5 mL pożywki Sautona (uzupełnionej o 2% glukozy), hodowanej przez cztery dni. Na Rysunku 2 rozwój biofilmu był widoczny od 3. do 6. dnia. W 3. dniu zaczyna tworzyć się błona z lekkim siatkowaniem, a do 5. dnia jest o...

Dyskusja

Wielokomórkowy tryb życia drobnoustrojów został opisany prawie sto lat temu; Badania kliniczne są jednak nadal nieliczne, głównie ze względu na brak solidnych metod¹⁴ . Metody opisane w pracach z zakresu biologii biofilmu są często trudne do zaadaptowania. Oczekuje się, że szczegółowa metodologia, wspomagana demonstracjami krytycznych kroków, poprawi odtwarzalność protokołów.

Opisana w tym artykule metoda wytwarzania biofilmu jest skalowalna, wymaga proporcjonalnego zwi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 &mikro; Filtr strzykawkowy M PVDF	Axiva	SFNY04 R
1 ml końcówki	Genetix	GXM-611000 C
10 i mikro; L końcówki	Genetix	GXM-6110 C
200 µ Końcówki L	Genetix	GXM-61200C
6-dołkowe płytki polipropylenowe	Tarsons	980010
Rurki bursztynowe	Autoklaw Tarsons	546051
Szafa	biologicznego Hospharma
A II	MSET
Bibuła	Dowolny odpowiedni sprzedawca
Wirówka	Eppendorf
	251275		z kwasem cytrynowym
	Bio-Rad	2239955
Cytrynian amonu żelazowego	Sigma	F5879
System dokumentacji żelu	Bio-Rad
Koraliki szklane	Sigma	G8772
Glukoza	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Pętle inokulacyjne	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Siarczan magnezu	Sigma	M2643
Mikropipety	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH-metr	Labman Scientific Instruments
Czytnik płytek	Tecan
Probówki polipropylenowe	Genaxy	GEN-14100-PS
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	P5379
Ryfampicyna	MedchemExpress	HY-B0272
Pipeta serologiczna	SPL Nauki przyrodnicze	95210
Inkubator z wytrząsarką
Inkubator statyczny	CARON
Sterylna strzykawka 10 ml	Becton Dickinson	309642
Sterylna strzykawka 50 ml	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Waga wagowa	Sartorius
Siarczan	Sigma	Z0251

bezpieczeństwa Kuwety Spektrofotometr szpatułkowy Eppendorf Thermo Scientific