Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie interakcji między różnymi cząsteczkami jest kluczowym aspektem zrozumienia patogenezy choroby i badań przesiewowych pod kątem celów leków. Umbelliferon, aktywny składnik tybetańskiej medycyny Vicatia thibetica, wykazuje działanie immunomodulujące o nieznanym mechanizmie. Białko CD40 jest kluczowym celem w odpowiedzi immunologicznej. Dlatego w badaniu tym wykorzystano zasadę technologii różnicowej fluorescencji skaningowej do analizy interakcji między białkiem CD40 a umbelliferonem przy użyciu fluorescencyjnych markerów enzymatycznych. Wstępnie eksperymentalnie zweryfikowano stabilność białka fluorescencyjnego barwnika pomarańczowego i określono optymalny stosunek rozcieńczenia 1:500. Następnie zaobserwowano, że wartość topnienia (Tm) białka CD40 miała tendencję do zmniejszania się wraz ze wzrostem stężenia. Co ciekawe, stwierdzono, że interakcja między białkiem CD40 a baldaszkowronem zwiększa stabilność termiczną białka CD40. Niniejsze badanie stanowi pierwszą próbę wykrycia potencjału wiązania związków i białek małocząsteczkowych za pomocą mikropłytek fluorescencyjnych i barwników fluorescencyjnych. Technika ta charakteryzuje się wysoką czułością i dokładnością, obiecując postępy w dziedzinie stabilności białek, struktury białek i interakcji białko-ligand, ułatwiając w ten sposób dalsze badania i eksplorację.
Wprowadzenie
Vicatia thibetica H. Boissieu, roślina z rodziny baldaszkowatych, jest powszechnie stosowana w medycynie tybetańskiej i stanowi jeden z podstawowych składników pięciu podstawowych składników (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. i Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.)1. Głównie dystrybuowany w południowo-zachodnich Chinach, takich jak północno-zachodni Yunnan, zachodni Syczuan, Tybet i inne obszary, jego suszony korzeń służy jako lokalny substytut arcydzięgla1. Korzeń, znany ze swojego zapachu, jest często wykorzystywany jako przyprawa do gulaszu, a liście, określane jako seler tybetański, przyczyniają się do wyśmienitych potraw. Tak więc Vicatia thibetica ma znaczenie nie tylko jako wyjątkowa roślina lecznicza, ale także jako źródło pożywienia w Tybecie.
Zarówno krajowe jak i międzynarodowe badania wskazują, że Vicatia thibetica posiada właściwości uzupełniające krew i orzeźwiające qi (moc lub energię), korzystne dla regulacji menstruacji. Stosuje się go w celu zwalczania objawów nieregularnego miesiączkowania spowodowanego kołataniem serca i niedoborem krwi, wykazując działanie farmakologiczne, takie jak antyoksydacyjna regulacja odporności organizmu2. Ekstrakt alkoholowy z Vicatia thibetica wykazał zdolność do przywracania masy ciała i indeksu narządów u myszy z obniżoną odpornością indukowaną cyklofosfamidem. Dodatkowo zwiększa aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy i zmniejsza zawartość dialdehydu malonowego, co sugeruje poprawę zdolności przeciwutleniających i równoważący wpływ na peroksydację lipidów2,3. Jednocześnie zwiększa liczbę krwinek i hemoglobiny, co nie tylko obiektywnie odzwierciedla funkcję krwiotwórczą organizmu, ale także odgrywa kluczową rolę w układzie odpornościowym2,3.
Umbelliferone, charakteryzujący się igiełkowymi kryształami i gorzkim smakiem, ma małą masę cząsteczkową, jest lotny i może być destylowany parą wodną. Łatwo sublimuje, ma niską rozpuszczalność w wodzie i wysoką rozpuszczalność w materii organicznej. Jako jeden z głównych składników chemicznych Vicatia thibetica, umbelliferon wykazuje działanie immunomodulujące na odporność komórkową, odporność humoralną i odporność nieswoistą w mysich modelach immunosupresji indukowanej hydrokortyzonem4,5.
Cząsteczka CD40 na powierzchni komórki, należąca do nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu, jest szeroko wyrażana w komórkach odpornościowych6. Jego homologiczny ligand, CD154, znany również jako CD40L, jest białkiem transbłonowym typu II ulegającym ekspresji przez aktywowane limfocyty T. Aktywacja CD40 ma zdolność do zwiększania ekspresji cząsteczek kostymulujących na powierzchni komórek dendrytycznych (DC) i monocytów. Proces ten promuje funkcję prezentacji antygenu cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) i dodatkowo aktywuje limfocyty T CD8 +7.
Makrofagi odgrywają kluczową rolę w tworzeniu i regulacji mikrośrodowiska guza, a aktywacja CD40 może przyspieszyć przebudowę mikrośrodowiska guza przez makrofagi8. Aktywacja sygnału CD40 znacząco wpływa na proliferację i aktywację limfocytów B. Limfocyty B, po aktywacji przez CD40, mogą funkcjonować jako skuteczne komórki prezentujące antygen. Prezentują antygeny, generują aktywność efektorowych limfocytów T, a tym samym przyczyniają się do działania przeciwnowotworowego9. Co więcej, aktywacja CD40 w komórkach nowotworowych może indukować apoptozę i hamować wzrost guza10. CD40 przede wszystkim przekazuje sygnały, kontrolując aktywność niereceptorowych kinaz białkowych tyrozyny, w tym Lyn, Fyn, Syk i innych. Dodatkowo ma zdolność stymulowania białek Bcl-xL, Cdk4 i Cdk6, aktywacji czynników transkrypcyjnych Rel/NF-kB oraz fosforylacji CG-2 i PI3K10.
Metoda DSF (Differential Scanning Fluorescence) jest szeroko stosowana do oceny wpływu różnych warunków środowiskowych, takich jak skład bufora, temperatura i ligandy małocząsteczkowe, na stabilność termiczną struktur białkowych. Powszechnie stosowanym barwnikiem do DSF jest pomarańczowy, wrażliwy na środowisko, hydrofobowy barwnik. W normalnych warunkach struktura białka jest pofałdowana, ukrywając wewnętrznie swój hydrofobowy segment. Wraz ze wzrostem temperatury hydrofobowy obszar białka staje się bardziej odsłonięty, co powoduje stopniowy rozpad naturalnej struktury białka. Barwnik selektywnie wiąże się z tą odsłoniętą częścią białka, wzmacniając jego fluorescencję. Wartości Tm są następnie obliczane poprzez monitorowanie zmian w detekcji sygnału fluorescencji11. Do pewnego stopnia zmiany wartości Tm mogą mierzyć zmiany w stabilności białek spowodowane mutacjami, zmianami w lub wiązaniem ligandów. Ponadto może wskazywać na zmiany strukturalne podczas procesu fałdowania białek12. Takie podejście oferuje precyzyjne dane, szeroki zakres temperatur, wysoką czułość i minimalną utratę próbki białka13.
W tym badaniu, oznaczanie fluorescencji zostało przeprowadzone przy użyciu fluorescencyjnego czytnika mikropłytek zamiast aparatu do fluorescencji ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Modyfikacja ta umożliwia wykrywanie DSF w laboratoriach pozbawionych fluorescencyjnego ilościowego przyrządu do PCR, dzięki czemu metoda jest mniej złożona i zmniejsza liczbę kroków wymaganych do konfiguracji urządzenia, upraszczając w ten sposób proces eksperymentalny. Takie podejście ma jednak pewne wady. Podczas gdy złożoność jest zmniejszona, procedura staje się bardziej uciążliwa. Konieczne jest ręczne wykrywanie fluorescencji w różnych temperaturach, a automatyczne i ciągłe zbieranie fluorescencji z systemu nie jest możliwe. W związku z tym w badaniu wykorzystano technikę DSF do zbadania interakcji między białkiem CD40 a baldaszkowronem, dostarczając nowych informacji na temat mechanizmów molekularnych medycyny tybetańskiej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Roztwór złożony, roztwór białka i barwnik zostały wprowadzone do roztworu PBS. Następnie próbki poddano stopniowemu podgrzewaniu za pomocą cyfrowej kąpieli grzewczej z wytrząsaniem na sucho, a stabilność termiczną białek oceniono poprzez pomiar zmiany intensywności fluorescencji w złożonym układzie. Szczegółowe kroki są opisane poniżej, a Rysunek 1 ilustruje przegląd protokołu.
1. Przygotowanie roztworu
- Przygotować 1 mM roztwór umbelliferonu, dodając 0,1 mg baldaszkowu do 616,75 μl roztworu DMSO (patrz tabela materiałów).
- Przygotować roztwór białka CD40 o stężeniu 200 μg/ml, dodając 0,1 mg CD40 do 500 μl roztworuddH 2O (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj 500-krotny roztwór pomarańczowego barwnika, dodając 1 μl 5000x pomarańczowego barwnika do 9 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz Tabela Materiałów).
UWAGA: Powyższe czynności należy wykonać na lodzie, a ponieważ pipeta ma minimalny zakres 0,1 μl, należy najpierw rozcieńczyć pomarańczowy barwnik białkowy 10-krotnie, aby ułatwić późniejsze użycie.
2. Testowanie wydajności barwnika
- Dodaj 500-krotny pomarańczowy barwnik do roztworu PBS i rozcieńcz go, aby uzyskać proporcje barwnika: PBS 1:500, 1:1000, 1:2000 i 1:4000,
UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie DMSO nie przekracza 2% (v/v). - Włącz czytnik mikropłytek fluorescencyjnych i podgrzewaj go przez 10 minut.
- Otwórz kolejno komputer i oprogramowanie do akwizycji danych (patrz tabela materiałów).
- Kliknij Instrument, wybierz odpowiedni model mikropłytki fluorescencyjnej i wybierz OK w oprogramowaniu do akwizycji danych.
UWAGA: Poczekaj, aż mikropłytka fluorescencyjna zakończy wstępne nagrzewanie i wyświetl temperaturę na panelu przed otwarciem oprogramowania do akwizycji danych, aby zapewnić pomyślne połączenie między przyrządem a oprogramowaniem. - Kliknij Ustawienia akwizycji i wybierz Fluorescencja w oprogramowaniu do akwizycji danych.
- Edytuj program w interfejsie Długości fal: Lm1 = 470 nm, 570 nm, a następnie wybierz OK.
UWAGA: Pomarańczowy barwnik może być wzbudzany światłem UV o długości fali 300 nm lub światłem widzialnym o długości fali 470 nm, a emisję można mierzyć przy długości fali 570 nm. - Dodaj różne stężenia barwnika pomarańczowego (1:500, 1:1000, 1:2000 i 1:4000) i PBS do 96-dołkowych płytek w ilości 100 μl/basenik.
UWAGA: Rozpuść roztwór w DMSO przed dodaniem go do PBS i dokładnie zwiruj go przy 2000 x g podczas procesu przygotowania, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie ze względu na tendencję barwnika do wytrącania się. - Umieść 96-dołkową płytkę w fazie wykrywania urządzenia, kliknij przycisk Odczyt w oprogramowaniu do akwizycji danych i zmierz fluorescencję każdego stężenia barwnika 13 razy w temperaturze pokojowej, za każdym razem w odstępie 2 minut.
- Kliknij przycisk Eksportuj po każdym oznaczeniu, wybierz Eksportuj do XML XLS TXT, wybierz Wszystkie płyty, następnie wybierz Płyta w formacie wyjściowym, a na koniec kliknij OK, aby zapisać dane w folderze w formacie "XLS" do dalszej analizy.
UWAGA: Te kroki pomagają określić wpływ ciągłego pomiaru na autofluorescencję pomarańczowego barwnika w temperaturze pokojowej i określić optymalne stężenie barwienia. - Włącz cyfrowe ogrzewanie wytrząsające suchą kąpiel, ustaw temperaturę grzania na 35 °C, a czas nagrzewania na 2 min.
- Przygotuj optymalny stosunek rozcieńczenia barwnika w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieść go w suchej łaźni z cyfrowym ogrzewaniem i wytrząsaniem na 2 minuty.
- Dodać roztwór PBS i roztwór barwiący, podgrzany w temperaturze 35 °C, do płytki 96-dołkowej w objętości 100 μl na studzienkę.
- Umieść 96-dołkową płytkę w fazie wykrywania urządzenia i kliknij przycisk Odczyt w oprogramowaniu do akwizycji danych.
- Ustaw temperaturę grzania na 40 °C, a czas nagrzewania na 2 min.
- Odpipetować roztwór barwnika z 96-dołkowej płytki z powrotem do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i podgrzewać go w urządzeniu przez 2 minuty.
- Powtórzyć czynności opisane w krokach 2.12-2.15 i 2.9 w celu zbadania absorbancji roztworu barwnika w temperaturze 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C i 95 °C, odpowiednio.
UWAGA: Kroki te pomagają określić stabilność autofluorescencji pomarańczowego barwnika pod ciągłym ogrzewaniem w gradiencie od 35 °C do 95 °C. Bardzo ważne jest, aby pracować szybko, aby uniknąć gwałtownych spadków temperatury lub dodania niewłaściwego płynu, co może prowadzić do błędów eksperymentalnych.
3. Wykrywanie temperatury topnienia (Tm) białka
- Połącz białko CD40 i barwnik pomarańczowy z roztworem PBS, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml i 1:500.
- Powtórzyć czynności opisane w krokach 2.2-2.6 i 2.10-2.16 w celu oceny absorbancji roztworu białka CD40 w temperaturach 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, i 95 °C.
- Powtórz krok 2.9, aby zapisać i przeanalizować dane, a następnie obliczyć wartość Tm za pomocą oprogramowania do analizy danych (patrz tabela materiałów).
- Dodaj białko CD40, baldaszkowit i barwnik pomarańczowy do roztworu PBS, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μM i 1:500.
UWAGA: Energiczne wirowanie podczas przygotowywania roztworu jest niezbędne, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie barwnika, białka CD40 i baldaszkowiloronu w PBS. - Powtórzyć czynności opisane w krokach 3.2-3.3 w celu zmierzenia absorbancji roztworu kompleksów CD40-umbelliferon w temperaturach 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C i 95 °C, odpowiednio.
UWAGA: Kroki te przeprowadzono w celu określenia wartości Tm białka CD40 i kompleksów CD40-umbelliferon, mając na celu określenie optymalnego stężenia wiązania białka CD40 z umbelliferonem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomarańczowy barwnik wykazywał konsekwentnie stabilną ekscytację fluorescencyjną przy Ex = 470 nm i Em = 570 nm, zarówno w temperaturze pokojowej, jak i w temperaturach podwyższonych. Wyznaczono optymalny stopień rozcieńczenia wynoszący 1:500 (Rycina 2A,B). Wyznaczenie wartości Tm okazało się trudne, gdy stężenie białka CD40 było niższe niż 15 µg/mL (Rycina 3A,B). Jednakże przy stężeniu 15 µg/mL można było wykryć stabilną warto...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
DSF, znany również jako test przesunięcia termicznego lub test fluorescencji termicznej, jest techniką stosowaną do wykrywania procesu denaturacji termicznej białek w próbkach poprzez monitorowanie zmian sygnału fluorescencji badanej próbki lub barwnika podczas powolnego, zaprogramowanego wzrostu temperatury. Początkowo opracowana przez Pantoliano14, DSF służy jako metoda o wysokiej przepustowości. Główna procedura polega na podniesieniu temperatury na sterowanej komputerowo podgrzewanej płycie, w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Wyrażamy naszą szczerą wdzięczność za wsparcie finansowe otrzymane od Projektu Budowy Konotacji 14. Planu Pięcioletniego Uniwersytetu Medycyny Tybetańskiej (2022ZYYGH12), Otwartych Przedmiotów Kluczowego Laboratorium Medycyny Tybetańskiej i Edukacji Podstawowej Ministerstwa Edukacji na Uniwersytecie Medycyny Tybetańskiej (ZYYJC-22-04), Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Ningxia (2023BEG02012), oraz projekt promocji badań Xinglin Scholar Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (XKTD2022013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Białko CD40 | MedChemExpress | HY-P75408 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek FlexStation 3 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | Oprogramowanie FlexStation 3 | |
| OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami ( 1x) | Gibco | 8120485 | |
| SoftMax Pro 7.1 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | SoftMax Pro 7.1 | |
| SSYPRO pomarańczowy barwnik | Sigma | S5942 | |
| Umbelliferone | Shanghai Yuanye Biotechnology Co. | Zobacz materiał B21854 |
Bibliografia
- Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).
- Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide. Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).
- Lu, H., et al. Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice. J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).
- Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui. Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).
- Lu, Z., Zhang, L. Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice. Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).
- Vonderheide, R. H. CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).
- Grewal, I. S., Flavell, R. A. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).
- Long, K. B., et al. IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma. Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).
- He, Y., et al. The roles of regulatory B cells in cancer. J Immunol Res. 2014, 215471(2014).
- Eliopoulos, A. G., et al. CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily. Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
- Rosa, N., et al. Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry. J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).
- Hellman, L. M., et al. Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes. J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
- Gorny, H., et al. Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules. J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).
- Freire, E. Thermal denaturation methods in the study of protein folding. Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).
- Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites. Heliyon. 9 (11), 21238(2023).
- Zhou, C., Yu, M., Li, W. Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein. Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
- Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases. Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).
- Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Sharma, R., et al. Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD. Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).
- Grädler, U., et al. Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding. J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).
- Xu, Y., et al. Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein. Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
