Artykuł metodologiczny

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

DOI:

10.3791/66613

⸱

24 maja 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne techniki izolowania szpiku kostnego od dorosłych myszy są dobrze znane. Jednak izolowanie szpiku kostnego od nowonarodzonych myszy jest trudne i czasochłonne, ale w przypadku niektórych modeli jest to translacyjne i konieczne. Protokół ten opisuje skuteczną i prostą metodę przygotowania komórek szpiku kostnego od 7-9-dniowych szczeniąt. Komórki te można następnie dalej izolować lub różnicować w określone typy komórek. Makrofagi są kluczowymi komórkami odpornościowymi, które odgrywają główną rolę w stanach zapalnych i infekcjach. Podczas rozwoju makrofagi noworodków w znacznym stopniu przyczyniają się do przebudowy tkanek. Co więcej, fenotyp i funkcje makrofagów noworodków różnią się od ich dorosłych odpowiedników. Protokół ten przedstawia również różnicowanie makrofagów noworodków od izolowanych komórek szpiku kostnego w obecności pożywki kondycjonowanej L929. Markery powierzchniowe dla zróżnicowanych makrofagów noworodków oceniano za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Aby wykazać funkcjonalność, przetestowano również wydajność fagocytarną przy użyciu wrażliwej na pH bakterii Escherichia coli sprzężonej z barwnikiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szpik kostny obejmuje zarówno populacje hematopoetycznych, jak i mezenchymalnych komórek macierzystych, które są samoodnawialne i mogą być zróżnicowane w różne linie komórkowe. Hematopoetyczne komórki macierzyste w szpiku kostnym dają początek liniom szpikowym i limfoidalnym1. Mezenchymalne komórki macierzyste wytwarzają osteoblasty (kość), adipocyty (tłuszcz) lub chondrocyty (chrząstki)2. Komórki te mają wiele zastosowań w dziedzinie biologii komórki i inżynierii tkankowej, w tym terapii genowej3,4. Komórki progenitorowe obecne w szpiku kostnym różnicują się w określone typy komórek w obecności czynników wzrostu specyficznych dla linii. Erytropoetyna wspomaga proliferację erytroidalnych komórek progenitorowych, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) stymuluje wzrost kolonii neutrofili, a trombopoetyna reguluje produkcję płytek krwi jako kilka przykładów czynników wzrostu specyficznych dla linii5. Antygen powierzchniowy oznaczony FACS i sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) są dobrze znanymi metodami izolacji i oczyszczania określonych typów komórek pochodzących ze szpiku kostnego6.

Chociaż badania nad noworodkami się naprzód w kierunku znalezienia przyczyn zgonów noworodków i rozwiązania problemów związanych z powikłaniami podczas przedwczesnych porodów, bezpośredni rozwój terapii pozostaje niezaspokojoną potrzebą medyczną. Smith i Davis stwierdzili: "Pacjenci pediatryczni pozostają sierotami terapeutycznymi"7. Istnieje kilka wyzwań, takich jak małe próbki, trwające całe życie skutki wyniku oraz kwestie etyczne związane z uzyskiwaniem zgody w badaniach klinicznych noworodków8. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na modele badań in vivo i in vitro specyficzne dla noworodków, aby uzyskać znaczenie translacyjne. Ze względu na podobieństwa między poziomami anatomicznymi i tkankowymi, krótkimi okresami ciąży i wielkością miotów, gryzonie są najlepiej zbadanym systemem modelowym ssaków.

Tutaj opisujemy szczegółową, wysoce wykonalną i powtarzalną procedurę izolacji szpiku kostnego od 7-9-dniowych szczeniąt myszy i ich zdolności do różnicowania się w makrofagi. Jednak różnorodność linii komórkowych można uzyskać za pomocą odrębnych sygnałów różnicowania. Wykazujemy również obecność markerów powierzchniowych komórek i obecność aktywności fagocytarnej in vitro oczekiwanej dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Zachodniej Wirginii i zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Przewodnika po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych wydanego przez Krajową Radę ds. Badań. Do badań wykorzystano młode myszy C57BL/6J. Szczegółowe informacje na temat wszystkich używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotuj 3 ml pożywki hodowlanej MEM uzupełnionej 10% FBS, 2 mM glutaminy, 25 mM HEPES i penicyliny (100 U/ml)/streptomycyny (100 μg/ml) w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i trzymaj na lodzie.
  2. Jeśli jest to konieczne do przechowywania komórek progenitorowych szpiku kostnego w ciekłym azocie, należy przygotować pożywkę do zamrażania zawierającą 10% DMEM, 80% FBS i 10% DMSO.
  3. Aby uzyskać kompletny DMEM, przygotuj DMEM uzupełniony 10% FBS, 2 mM glutaminy, 25 mM HEPES i penicyliną (100 U/ml)/streptomycyną (100 μg/ml).
  4. W celu różnicowania makrofagów przygotuj DMEM uzupełniony 10% FBS, 2 mM glutaminy, penicyliny (100 U / mL) / streptomycyny (100 μg / ml) i 10% supernatantu z komórek L929 < sup class="xref">9,10,11.

2. Przygotowanie supernatantu komórkowego L929

  1. Rozmrozić komórki L929 przechowywane w ciekłym azocie i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml kompletnego DMEM. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki DMEM i zasiać je w kolbie do hodowli tkankowej T25 o gęstości 2×105 komórek. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, używając 0,4% błękitu trypanowego. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do osiągnięcia 70% zlewności.
  3. Aby odłączyć komórki, najpierw umyj je 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odessać PBS i zastąpić go 2,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5 minut i dodać 5 ml kompletnego DMEM.
  5. Zebrać komórki i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 15 ml kompletnej pożywki DMEM i przenieść go do kolby T75.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do momentu, gdy komórki osiągną 90% zlewności, a następnie zebrać pożywkę i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować pożywkę zawierającą M-CSF przez filtr 0,45 μm i zamrozić w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach o pojemności 5 ml.

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego ostrożnie oddziel 7-9-dniowe młode myszy C57BL/6J (miot 6 młodych) od matki i umieść je w osobnej klatce.
  2. Namocz wacik w 2 ml izofluranu klasy weterynaryjnej w słoiku dzwonowym lub innej komorze przechowawczej.
  3. Umieść szczeniaka w komorze i zamknij pokrywę. Monitoruj noworodka przez około 90 sekund, aby upewnić się, że staje się nieruchomy i nieprzytomny.
  4. Szybko usuń szczeniaka i odetnij mu głowę ostrymi nożyczkami (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami), zanim szczeniak odzyska przytomność.
    UWAGA: Noworodki nie oddychają wystarczająco głęboko, aby można je było poddać eutanazji za pomocą samego izofluranu.
  5. Upewnij się, że zamknęłeś pokrywę pojemnika po wyjęciu każdego szczeniaka. Ten sam wacik może być używany dla 5-7 szczeniąt.

4. Izolacja szpiku kostnego noworodka

  1. Wysterylizuj ciało noworodka 70% etanolem.
  2. "Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych z cienką końcówką wykonaj nacięcie między
    brzuch i tylne nogi. Usuń skórę, ciągnąc w kierunku stopy tylnych kończyn.
  3. Zeskrob tkankę łączną i mięśnie przyczepione do kości za pomocą kleszczy o ostrych krawędziach.
  4. Przeciąć kość piszczelową i udową, jak pokazano na rysunku 1, nożyczkami, aby odłączyć i usunąć. Za pomocą kleszczy umieść te kości w rurce z mediami na lodzie. Powtórz ten proces dla każdego szczeniaka.
  5. Przenieś kości za pomocą kleszczy do sitka o średnicy 40 μm z probówką do pobierania pokarmów. Zmiażdżyć kości i uwolnić szpik, dociskając tłok strzykawki o pojemności 3 ml do sitka.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie w 0,2% NaCl, hipotonicznym roztworze do lizy erytrocytów. Natychmiast dodaj równą objętość 1,6% NaCl, aby doprowadzić roztwór do izotoniku.
  8. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć roztwór do lizy.
  9. Zawiesić w kompletnym DMEM do natychmiastowego użycia lub pożywce do zamrażania do przechowywania i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: W niniejszym badaniu metoda ta dała 6,55 (± 1,44) × 106 komórek szpiku kostnego / szczenię (Rysunek 1E).
  10. Przechowywać ogniwa w temperaturze -80 °C w pożywce do zamrażania lub natychmiast zużyć w sposób opisany poniżej.
    UWAGA: Ze względu na wiek kości są na tyle przezroczyste i wyraźne, że można przez nie uwidocznić szpik. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas ciągnięcia kości, ponieważ lekki nacisk na nie może wystarczyć do uwolnienia szpiku. Szpik w kościach noworodków ma postać cieczy, a nie nienaruszonej nici znajdującej się w kościach dorosłych. Trudno jest pobrać szpik, jeśli wydostanie się on podczas pobierania kości.

5. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego noworodków

  1. Nasiona 2 × 107 komórek szpiku kostnego na kolbę T75 w 10 ml kompletnego DMEM, który zawiera 10% supernatantu z komórek L929 (2,5 ml) jako źródło M-CSF. Inkubować szalki hodowlane w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5 dni. Dodać 2 ml pożywki kondycjonowanej L929 w 3. dniu różnicowania.
  2. Codziennie obserwuj komórki pod mikroskopem za pomocą odwróconego mikroskopu i systemu obrazowania z 20-krotnym powiększeniem. Po różnicowaniu makrofagi powinny wydawać się przylegające, wydłużone i niejednorodne (Rysunek 2).
  3. Aby zebrać makrofagi do dalszych testów, należy odessać pożywkę różnicującą.
  4. Umyj komórki 5 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki i białka surowicy, które będą przeszkadzać w odklejaniu. Zassać PBS.
  5. Zbierz komórki, dodając 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby. Umieścić kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 na 5 minut i dodać 5 ml DMEM.
  6. Odłączyć komórki pipetować i odwirowywać przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Oddzielić osad komórkowy w 1 ml kompletnego DMEM, a następnie policzyć i sprawdzić żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego. BMDM izolowane tą metodą to 7,05 (± 2,52) ×105 komórek/szczenię (Rysunek 1E).
    UWAGA: Obserwuj obecność komórek w kształcie wrzeciona, które zaczynają pojawiać się w drugim dniu różnicowania (Rysunek 1B, czerwone strzałki). Jeśli kolor pożywki zmieni kolor na żółty, wskazując na to, że została zużyta, dodaj więcej pożywki kondycjonowanej L929 w 4 dniu różnicowania; Nie zaleca się całkowitej wymiany nośników.

6. Znakowanie immunologiczne i analiza cytometryczna przepływowa

  1. Blokować znakowanie przeciwciałami nieswoistymi BMDM (2x105/znacznik) poprzez traktowanie 10 μl/107 komórek odczynnika blokującego FcR zgodnie z zaleceniami producenta w objętości 100 μl/znacznik buforu cytometrii przepływowej (PBS uzupełniony 2 mM EDTA i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej). Przechowywać na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: Ogniwa mogą być blokowane luzem lub w pojedynczych studzienkach lub probówkach. We wszystkich kolejnych krokach wskazują się ilości i objętości na pojedynczą etykietę markera komórkowego przy końcowej objętości 100 μl.
  2. Przemyć komórki, dodając 200 μl buforu do cytometrii przepływowej i odwirować przy 525 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant i umieścić komórki na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U o gęstości 5 × 105 komórek na basenik. Wybarwiaj komórki, dodając barwnik zliczający żywe/martwe komórki FVS780-Live/Dead rozcieńczony 3,000-krotnie i 0,625 μl BV786-CD11b, PE-F4/80 i AlexaFluor488-CD206 w 100 μl buforu cytometrii przepływowej pojedynczo lub w połączeniu12,13,14,15. Inkubować komórki przez 45 minut na lodzie pokrytym folią.
  4. Dodać 100 μl buforu do cytometrii przepływowej i przepłukać komórki, odwirowując przy 525 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać supernatant i delikatnie wymieszać osad komórkowy. Dodać 100 μl 0,4% paraformaldehydu do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć komórki, dodając 100 μl buforu cytometrii przepływowej i osadu przez odwirowanie przy 525 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl buforu cytometrii przepływowej i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego.

7. Test in vitro oceniający skuteczność fagocytarną makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego noworodków

  1. Zawiesić BMDM w kompletnym DMEM bez czerwieni fenolowej lub antybiotyków i wysiać je w gęstości 2 × 105/ćwiartkę w poczwórnej szalce o średnicy 35 mm w objętości 500 μl.
  2. Aby przygotować inokulum bakteryjne przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 25 lub innym pożądanym MOI, należy usunąć wstępnie obliczony zapas Escherichia coli O1:K1:H7 przechowywany w temperaturze -80 °C.
  3. Porcję żądanej objętości bakterii umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Umyj bakterie, dodając PBS do całkowitej objętości 1 ml. Osadzać bakterie przez odwirowanie w ilości 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania.
  4. Zawiesić osad bakteryjny w 50 μl PBS i dodać zielony barwnik fluorescencyjny wrażliwy na pH do końcowego stężenia 500 μM. Jest to barwnik wrażliwy na pH, który nie ma sygnału fluorescencyjnego przy neutralnym pH i jasno fluoryzuje w kwaśnym środowisku, takim jak zakwaszone fagosomy, podczas procesu fagocytozy.
  5. Inkubuj komórki bakteryjne przez 20 minut w ciemności w celu koniugacji barwnika.
  6. Przemyć bakterie czterokrotnie 1 ml PBS przez odwirowanie w temperaturze 1000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Zawiesić bakterie w 500 μl kompletnego DMEM bez czerwieni fenolowej i dodać do kultur BMDM.
  8. Inkubować BMDM w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 przez 4 godziny, a następnie dodać 200 ng przepuszczalnego dla komórek czerwonego barwnika fluorescencyjnego, który barwi lizosomy.
    UWAGA: Bakterie fagocytarne można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metody opisanej w tym badaniu, można z powodzeniem wyizolować od 25 do 37 milionów komórek szpiku kostnego z miotu pięciu szczeniąt myszy C57BL/6. Metoda ta została zwalidowana dla miotów o wielkości od 5 do 7 młodych. Minimalny wiek do izolacji w naszych eksperymentach to 7 dni. W zależności od wielkości miotu i liczby komórek wymaganych do eksperymentu mniejszej niż milion, naukowcy mogą wypróbować ten protokół dla myszy w wieku poniżej 7 dni. W obecności supernatantu komórek L929 jako źródła M-CSF, komórki szpiku kostnego różnicowały się w makrofagi w ciągu 5 dni (Ryc. 2). Tworzenie się komórek w kształcie wrzeciona zaobserwowano w drugim dniu różnicowania (Ryc. 2B), prawie połowa komórek wykazywała kształt wrzeciona w trzecim dniu (Rycina 2C), a większość komórek przylegała i tworzyła wydłużone kształty wrzeciona w piątym dniu różnicowania (Rycina 2D). Wydajność makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) przy użyciu tej metody wynosiła 2,5-5 milionów komórek od 5 młodych w wieku 7 dni.

Aby fenotypowo scharakteryzować zróżnicowane BMDM, komórki z 5-dniowych hodowli zostały immunoznakowane pod kątem CD11b, CD206 i F4/80. Schematy rozproszenia przedniego/bocznego i bramkowania z pojedynczym znacznikiem można zobaczyć na rysunku uzupełniającym 1. Wyniki analizy cytometrii przepływowej wykazały, że 76,4% BMDM jest dodatnich zarówno dla CD11b, jak i F4/80 (Figura 3A). Populacja F480-CD11b+ jest zgodna z przybliżoną liczbą komórek dodatnich dla CD206 (Figura 3B). Ten ostatni jest ogólnie uważany za marker zgodny z makrofagami podobnymi do M2 i chociaż obfitość znakowania CD206 może być nawet dwukrotnie większa, wyższy odsetek znakowania F4 / 80 jest zgodny ze zdolnością M-CSF do promowania różnicowania do fenotypu podobnego do M116,17(Rysunek 3).

Dalej ocenialiśmy zdolność zróżnicowanych noworodków BMDM do fagocytozy bakterii i transportu ich do zakwaszonych przedziałów jako miary funkcjonalnej. Bakterie znakowane barwnikiem wrażliwym na pH powinny fluoryzować na zielono tylko wtedy, gdy są fagocytozowane i transportowane do zakwaszonych komór. Liczne zielone bakterie fluorescencyjne fagocytozy wewnątrz BMDM zostały wykryte po infekcji (Rysunek 4A). Zielona fluorescencja dodatkowo lokalizuje się z czerwoną fluorescencją wskazującą na zakwaszone lizosomy (Rysunek 4B, C). Fagocytozę i pojawienie się zielonych, wrażliwych na pH, barwnikowo-dodatnich BMDM noworodków zaobserwowano również przez cały 4-godzinny okres infekcji (Rysunek 4D i dodatkowe wideo). Wyświetlana tutaj aktywność funkcjonalna jest zgodna z aktywnością makrofagów zapalnych podobnych do M1.

figure-results-1
Rysunek 1: Izolacja szpiku kostnego 7-dniowych szczeniąt myszy C57BL/6J. (A) Kości kończyn tylnych 7-dniowych szczeniąt w naczyniu o średnicy 100 mm. (B) Tylna kończyna 7-dniowego szczeniaka po usunięciu skóry i tkanki podskórnej; Czarne przerywane linie wskazują miejsce do wycięcia w celu ekstrakcji szpiku kostnego. (C) Tylna kończyna noworodka przetwarzała kości ze szpikiem przed zmiażdżeniem. (D) Noworodkowa kończyna tylna przetwarzała kości po zmiażdżeniu za pomocą tłoka strzykawki w sitku. (E) Średnia liczba ± błąd standardowy szpiku kostnego (BM) i komórek makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego uzyskanych z trzech niezależnych doświadczeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Różnicowanie BMDM od 7-dniowych komórek szpiku kostnego noworodków. Komórki szpiku kostnego w dniu 1 (A), dniu 2 (B), dniu 3 (C) i dniu 5 różnicowania (D). Czerwone strzałki na panelu B wskazują wrzecionowate przylegające komórki w 2 dniu różnicowania. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wykrywanie mysich markerów makrofagów za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej. Zróżnicowane makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego noworodków wykazujące ekspresję antygenów powierzchniowych F4/80 i CD11b (A) lub CD206 i CD11b (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Fagocytoza E. coli znakowanej barwnikiem wrażliwym na pH przez noworodkowe BMDM. (A) Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego wykazujące fagocytozowaną, wrażliwą na pH E. coli znakowaną barwnikiem (zieloną) po 4 godzinach od infekcji. (B) BMDM oznaczone barwnikiem dla zakwaszonych lizosomów (kolor czerwony). (C) Scalony obraz paneli (A) i (B). Paski skali: 20 μm. (D) Nałożenie zielonych bakterii fluorescencyjnych na makrofagi pokazane w kontraście fazowym. Powiększenie w (D) jest takie samo jak w (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo. 4-godzinny film przedstawiający obrazowanie żywych komórek bakterii zielonego fluorescencyjnego przez BMDM noworodków, jak na rysunku 4, panel A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek uzupełniający 1: Analiza cytometrii przepływowej BMDM. (A) BMDM zostały najpierw bramkowane na FSC i SSC w celu usunięcia zanieczyszczeń i dubletów. Pokazano pojedyncze barwienie F4/80 (B), CD11b (C) i CD206 (D). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania z udziałem noworodków na modelach myszy mogą wiązać się z wieloma wyzwaniami. Noworodki mają rozwijający się układ odpornościowy, który jest wyjątkowy w porównaniu z dorosłymi8. W związku z tym nie należy zakładać, że dane wygenerowane z modeli dorosłych zwierząt mają zastosowanie do noworodków, a kilka opublikowanych prac dobrze wyraziło tę ideę18,19. Dlatego modele specyficzne dla noworodków i źródła komórek są niezbędne do badania zawiłości odpowiedzi immunologicznej we wczesnym okresie życia. Jednak ze względu na wielkość, wrażliwość i delikatną naturę nowonarodzonych myszy ilość próbek biologicznych może być ograniczona, a proces pobierania może być czasochłonny. Protokół ten ustanawia prostą i efektywną czasowo procedurę ekstrakcji szpiku kostnego od nowonarodzonych myszy.

Kości dorosłych myszy są wystarczająco duże, aby wprowadzić igłę i łatwo wypłukać szpik. I odwrotnie, dostęp do szpiku kostnego noworodka za pomocą igły jest trudny ze względu na jego rozmiar i kruchość. W niektórych badaniach stosowano trawienie enzymatyczne z kolagenazą typu II i dyspazą20. Tutaj, ze względu na miękką i drobną naturę kości noworodka, przyjęliśmy metodę kruszenia w celu uwolnienia szpiku kostnego. Po oczyszczeniu, w zależności od interesującego zastosowania badawczego, komórki te mogą być różnicowane w określone typy komórek.

Noworodki wykazują odrębne populacje makrofagów fenotypowych21. Badanie to wyjaśniło różnicowanie BMDM od komórek szpiku kostnego szczeniąt w wieku 7-9 dni bez użycia enzymów. Kluczowe kroki związane z metodologią obejmują ogólną delikatność nowonarodzonych szczeniąt myszy, pobieranie małych kości w sposób, który nie pozwala na uwolnienie szpiku kostnego oraz zlokalizowanie odpowiedniego miejsca w kości piszczelowej i kości udowej do wykonania cięć nożycowych. Zaobserwowaliśmy, że BMDM noworodków są bardziej wrażliwe niż BMDM dorosłych w hodowli, a dłuższy czas izolacji szpiku kostnego od noworodków uniemożliwiał ich zdolność różnicowania. W związku z tym nie zaleca się ekstrakcji z więcej niż 7 szczeniąt na raz. Ponadto dodanie pożywek różnicujących BMDM w drugim dniu różnicowania również skutkowało słabymi wynikami, takimi jak słabe różnicowanie i niższa żywotność.

W protokole tym wykorzystano supernatant komórek L929 jako źródło M-CSF do różnicowania komórek szpiku kostnego w makrofagi. Komórki L929 to mysie fibroblasty, o których wiadomo, że wytwarzają duże ilości M-CSF10. Oczekuje się, że makrofagi będą narażone na działanie innych substancji wydzielanych w supernatancie L929, wraz z M-CSF. Komercyjnie oczyszczony M-CSF może być również stosowany do różnicowania makrofagów; jednak nie porównaliśmy go bezpośrednio z użyciem supernatantu hodowli L929. Należy również zauważyć, że L de Brito Monteiro i in. zaobserwowali odrębne profile metaboliczne między makrofagami generowanymi przy użyciu L929 i komercyjnego M-CSF22.

Metoda ta pozwoliła na zaoszczędzenie czasu i oszczędność czasu bez użycia jakichkolwiek enzymów trawiennych. Technika ta pozwoliła na wiarygodną izolację szpiku kostnego noworodka, co doprowadziło do wyraźnego różnicowania noworodków BMDM. Izolowane BMDM noworodków mogą być dalej wykorzystywane do badania dynamiki makrofagów noworodków podczas różnych infekcji i regulacji stanu zapalnego przez te komórki. Ograniczenia metody obejmują krzywą uczenia się początkowego ustalania i adaptacji do procesu ciągnięcia małych kości, która ostatecznie poprawia się wraz z doświadczeniem i minimalizuje czas trwania procesu przy zwiększonej żywotności komórek. Wielkość miotu młodych jest dodatkowym czynnikiem wpływającym na liczbę makrofagów, które można różnicować w zależności od potrzeb eksperymentalnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tym artykułem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health [R01 AI163333] do CMR. Doceniamy dodatkowe wsparcie finansowe udzielone Ośrodkowi Cytometrii Przepływowej i Pojedynczej Komórki Uniwersytetu Zachodniej Wirginii w postaci następujących grantów: grant WV CTSI GM104942, grant Tumor Microenvironment CoBRE GM121322 oraz grant NIH OD016165.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40 i mikro; m sitkoGreiner542040Hodowla komórkowa
96-dołkowa okrągła (U) płyta dolnaThermo Scientific12-565-65Hodowla komórkowa
Anty-mysie CD11b-BV786BD Biosciences740861analiza FACS
Anty-mysia CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709analiza FACS
Anty-mysz F4/80-PEBD Biosciences565410Analiza FACS
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCAutomatyczny licznik komórek
DMEMHycloneSH30022.01Hodowla komórkowa
DMSOVWRWN182Hodowla
komórkowa DPBS, 1xCorning21-031-CVHodowla komórkowa
Escherichia coli O1:K1:H7ZakażenieATCC11775
EVOS FL Invitrogen12-563-649 
FBSAvantor 76419-584Hodowla komórkowa
FluoroBright BMDMThermo fisher A1896701 NaukowePożywki hodowlane bez barwników
GlutaminaCytivaSH30034.01Hodowla komórkowa
HEPESCytivaSH30237.01Hodowla komórkowa
L-929ATCCRóżnicowanie
LSRFortessaBecton DickinsonPrzepływocytometr
Lysotracker czerwony DND 99InvitrogenL7528Barwnik fluorescencyjny
MEMCorning15-010-CVHodowla komórkowa
Penicylina /streptomycyna HyclonSV30010Hodowla komórkowa
pHrodo zielony ester STP InvitrogenP35369Barwnik fluorescencyjny
Kolba T75Cell star658170Hodowla komórkowa
Trypsin-EDTAGibco25300120Hodowla
komórkowa Zeiss 710 ZeissP20GM103434konfokalny
System obrazowania komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
  2. Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
  3. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  4. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  5. Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
  6. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
  7. Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
  8. Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
  9. Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).
  10. Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).
  11. Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566(2023).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
  14. Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
  15. Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654(2012).
  16. Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792(2019).
  17. Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931(2022).
  18. Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077(2018).
  19. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  20. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).
  21. Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
  22. de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neonatal Bone MarrowBone Marrow IsolationBone Marrow Derived MacrophagesMacrophage DifferentiationFlow CytometryPhagocytosis AssayL929 Conditioned MediumHypotonic SolutionEscherichia Coli InfectionCell Counter

Powiązane artykuły