Method Article

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

DOI:

10.3791/66617

⸱

May 10th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bio-Architecture and Bio-Interactions (IBABI), Shenzhen Medical Academy of Research and Translation, 2Yau Mathematical Sciences Center, 3Key Laboratory of Protein Science (Tsinghua University), Ministry of Education, 4School of Life Science, Tsinghua University, 5Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology, 6Beijing Frontier Research Center for Biological Structure, 7Department of Mathematical Sciences, Tsinghua University, 8Yanqi Lake Beijing Institute of Mathematical Sciences and Applications, 9State Key Laboratory of Membrane Biology, School of Life Science

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaawansowana metoda selekcji cząstek dla cryo-EM, a mianowicie CryoSieve, poprawia rozdzielczość mapy gęstości, usuwając większość cząstek z końcowych stosów, co zostało zademonstrowane poprzez jej zastosowanie na rzeczywistym zestawie danych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, postęp w technologii i metodologii w dziedzinie kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM) analizy pojedynczych cząstek (SPA) znacznie poprawił naszą zdolność do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek biologicznych. Postęp ten zapoczątkował nową erę wglądu molekularnego, zastępując krystalografię rentgenowską jako dominującą metodę i dostarczając odpowiedzi na odwieczne pytania w biologii. Ponieważ cryo-EM nie zależy od krystalizacji, która jest istotnym ograniczeniem krystalografii rentgenowskiej, wychwytuje cząstki o różnej jakości. W związku z tym selekcja cząstek ma kluczowe znaczenie, ponieważ jakość wybranych cząstek ma bezpośredni wpływ na rozdzielczość zrekonstruowanej mapy gęstości. Innowacyjne, iteracyjne podejście do selekcji cząstek, nazwane CryoSieve, znacznie poprawia jakość zrekonstruowanych map gęstości poprzez skuteczne zmniejszenie liczby cząstek w końcowym stosie. Dowody eksperymentalne pokazują, że metoda ta może wyeliminować większość cząstek w końcowych stosach, co skutkuje znaczną poprawą jakości map gęstości. W tym artykule przedstawiono szczegółowy przepływ pracy tego podejścia i przedstawiono jego zastosowanie w rzeczywistym zestawie danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) analiza pojedynczych cząstek (SPA) stała się dominującą metodą wyznaczania trójwymiarowych map gęstości makrocząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości. Dzięki serii innowacji technologicznych1,2,3,4,5,6, o nazwie resolution revolution7, cryo-EM ma zdolność określania struktur makrocząsteczek biologicznych z rozdzielczością do atomową w niespotykanym dotąd tempie. To przełomowe odkrycie wyznacza początek nowej ery w badaniach molekularnych, wyprzedzając krystalografię rentgenowską jako dominującą technikę i odpowiadając na odwieczne pytania biologiczne.

Cryo-EM SPA różni się od krystalografii rentgenowskiej, ponieważ nie wymaga krystalizacji makrocząsteczek biologicznych. Zamiast tego roztwór zawierający docelowe makrocząsteczki biologiczne jest szybko zamrażany w szklistym lodzie. Następnie jest obrazowany za pomocą wiązki elektronów w celu wytworzenia serii mikrofotografii, z pominięciem potrzeby krystalizacji8. Następnie algorytmy wybierania cząstek są wykorzystywane do wyodrębniania pojedynczych surowych cząstek z tych mikrofotografii4,9,10,11,12. Ponieważ cryo-EM nie zależy od krystalizacji, naturalne jest, że wyekstrahowane cząstki są w przeważającej mierze uszkodzone lub znajdują się w niepożądanych stanach konformacyjnych, co wymaga wielu rund selekcji cząstek w celu uzyskania mapy gęstości o wysokiej rozdzielczości. W przetwarzaniu obrazów cryo-EM SPA selekcja cząstek ma zatem kluczowe znaczenie dla uzyskania map gęstości o wysokiej rozdzielczości13.

W cryo-EM SPA, standardowe metody selekcji cząstek obejmują dwuwymiarową (2D) i trójwymiarową (3D) klasyfikację14. Klasyfikacja 2D kategoryzuje cząstki do predefiniowanej liczby grup, uzyskując średni obraz i szacunkową rozdzielczość 2D dla każdej klasy. Badacze mogą następnie wizualnie sprawdzić te klasy, usuwając cząstki z grup o niższej rozdzielczości, aby wykorzystać pozostałe w rekonstrukcjach mających na celu osiągnięcie wyższej rozdzielczości. rezolucja. Po ustaleniu pozycji cząstek za pomocą algorytmów udoskonalania, naukowcy przystąpią do klasyfikacji 3D, grupując cząstki w wiele klas. Umożliwia to wizualną kontrolę zrekonstruowanej mapy gęstości dla każdej klasy, co pozwala na wykluczenie niepożądanych cząstek, takich jak te pochodzące z niepożądanych konformacji. Po wielu rundach klasyfikacji uzyskuje się końcowy stos składający się ze stosunkowo wysokiej jakości cząstek. Te końcowe stosy odgrywają zasadniczą rolę w tworzeniu map gęstości o rozdzielczości atomowej lub prawie atomowej.

Zhu i jej koledzy wykazali, że na tych końcowych stosach można przeprowadzić dalszą selekcję cząstek15. CryoSieve15, innowacyjna iteracyjna metoda selekcji cząstek, może być zastosowana w celu poprawy jakości końcowej mapy gęstości poprzez znaczne zmniejszenie liczby cząstek. Podczas gdy inne kryteria sortowania cząstek i oprogramowanie, takie jak metoda znormalizowanej korelacji krzyżowej (NCC)16, podejście do spójności wykresu kątowego (AGC)17 i klasyfikacja bez wyrównania5, są obecnie używane w tej dziedzinie, wykazano, że ta metoda przewyższa te algorytmy pod względem skuteczności.

W tym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy przewodnik po całym procesie. Jako studium przypadku zastosowaliśmy tę nową metodę do zestawu danych trimera hemaglutyniny grypy (wpis EMPIAR: 10097)18, który zawiera 130 000 cząstek w końcowym stosie. Nasza procedura z powodzeniem odrzuciła około 73,8% cząstek z końcowego stosu tego zestawu danych, poprawiając rozdzielczość zrekonstruowanej mapy gęstości z 4,11 A do 3,62 A. Oprócz trimera hemaglutyniny grypy, wyniki z wielu zestawów danych przedstawiono we wcześniejszej publikacji15, prezentując różne rozdzielczości i masy cząsteczkowe biomolekuł.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instalacja

  1. Sprawdzanie i konfigurowanie środowiska akceleracji GPU
    1. Otwórz terminal i wprowadź polecenie: nvidia-smi. Upewnij się, że polecenie pomyślnie wyświetla wszystkie informacje o kartach GPU, a wersja CUDA jest wyższa niż 10.2. Wykonaj polecenie: conda -V, aby sprawdzić, czy Conda jest zainstalowana (Rysunek uzupełniający 1).
  2. Konfigurowanie środowiska wirtualnego
    1. Wprowadź następujące polecenie, aby skonfigurować środowisko wirtualne, zastępując CRYOSIEVE_ENV żądaną nazwą środowiska: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge. Poczekaj kilka minut, aż środowisko zostanie pomyślnie skonfigurowane (Rysunek uzupełniający 2).
      UWAGA: Użytkownicy mogą w razie potrzeby modyfikować nazwę środowiska. Podane polecenie jest specyficzne dla CUDA 10.2. Jeśli wymagana jest inna wersja CUDA, dostosuj numer wersji dla cudatoolkit.
  3. Zainstaluj CryoSieve
    1. Aktywuj środowisko, wykonując polecenie: conda activate CRYOSIEVE_ENV. Zainstaluj oprogramowanie, uruchamiając: install cryosieve lub conda install -c mxhulab cryosieve (Rysunek uzupełniający 3). Wprowadź cryosieve -h i upewnij się, że informacje pomocy są poprawnie wyświetlane (Rysunek uzupełniający 4).

2. Przesiewanie cząstek

  1. Pobieranie danych
    1. Pobierz zestaw danych końcowego stosu EMPIAR-10097 z EMPIAR (patrz tabela materiałów). Pobierz plik gwiazdy, plik maski (mask.mrc) i początkowy model (dla kroku ponownego oszacowania; initial.mrc) z Github (zobacz Tabelę materiałów). Umieść wszystkie te pliki w folderze razem (Rysunek uzupełniający 5).
      UWAGA: Repozytorium w https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos korzysta z Git Large File Storage (Git LFS). Zainstalowanie usługi Git LFS jest niezbędne do klonowania całego repozytorium. Alternatywnie uzyskaj dostęp do pliku za pośrednictwem linku GitHub i kliknij przycisk Pobierz plik raw, aby pobrać pojedynczy plik.
  2. Proces przesiewania cząstek
    1. Otwórz terminal i użyj polecenia: cd FILEPATH, aby przejść do folderu, w którym znajduje się zestaw danych. Aktywuj środowisko Conda przez: conda activate CRYOSIEVE_ENV.
    2. Wprowadź następujące polecenie, aby rozpocząć nasz eksperyment z przesiewaniem cząstek: cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance (Rysunek uzupełniający 5). Podczas wykonywania terminal wyświetli dzienniki wyjściowe dla każdej iteracji.
      UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące każdej opcji można znaleźć w pliku uzupełniającym 1. Czas przetwarzania i minimalne wymagania dotyczące wykonania są szczegółowo opisane w pliku uzupełniającym 2. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star został udoskonalony przez CryoSPARC z T40_HA_130K-Equalized_run-data.star (pobranego z EMPIAR) w celu złagodzenia skutków spowodowanych postępem w technikach szacowania orientacji.

3. Znalezienie optymalnej iteracji

  1. Sprawdź rozdzielczości
    1. Użyj polecenia: grep "+ FINAL RESOLUTION:" output/_postprocess*.txt, aby wydrukować wyniki rozdzielczości dla 10 iteracji przesiewania (Rysunek 1). Ponieważ stos cząstek przefiltrowany w 7. iteracji ma najwyższą rozdzielczość z najmniejszą liczbą cząstek, prawdopodobnie zapewni optymalny wynik.
      UWAGA: Aby uniknąć niezamierzonego transferu informacji z cząstek odrzuconych do zatrzymanych15 i aby upewnić się, że stos cząstek po 7. iteracji jest rzeczywiście optymalny, użytkownicy są zobowiązani do wykonania kroku ponownej estymacji dla pobliskich iteracji. W tym protokole weryfikacji poddawane są iteracje 4, 5, 6, 7 i 8.
  2. Import przesianych cząstek
    1. Otwórz interfejs sieciowy CryoSPARC i wykonaj następujące kroki: Wejdź do przestrzeni roboczej i kliknij przycisk Builder w prawym górnym rogu panelu. W panelu wybierz i kliknij opcję Importuj stos cząstek. W sekcji Parameters (Parametry) panelu Particle Stack Import (Import stosu cząstek) określ metaścieżkę Particle (Cząstka) jako plik _iter{n}.star znajdujący się w folderze wyjściowym ukończonych wyników oraz ścieżkę danych cząstek do folderu, w którym przechowywany jest plik mrcs. Kliknij przycisk Kolejka zadań, a następnie kliknij przycisk Kolejka, aby rozpocząć proces. W ten sam sposób należy zaimportować pozostałe iteracje, które wymagają ponownego oszacowania (rysunek uzupełniający 6A).
  3. Importowanie początkowego modelu
    1. Kliknij przycisk Kreator w prawym górnym rogu panelu. W panelu wybierz i kliknij opcję Importuj woluminy 3D.
    2. Określ ścieżkę danych woluminu jako plik initial.mrc. Kliknij przycisk Queue Job (Zadanie kolejki), a następnie kliknij przycisk Queue (kolejka), aby zainicjować proces (Rysunek uzupełniający 6B).
      UWAGA: Model początkowy można również wygenerować poprzez rekonstrukcję ab initio (plik uzupełniający 3).
  4. Jednorodne zagęszczenie (zadanie kompilacji)
    1. Kliknij przycisk Kreator w prawym górnym rogu panelu. W panelu wybierz i kliknij opcję Jednorodne zagęszczenie.
      UWAGA: Stosowane jest również niejednolite uściślenie.
  5. Jednorodne rozdrobnienie (cząstki importowane)
    1. W panelu głównym po lewej stronie otwórz zadanie importowania stosu cząstek z 5. iteracji (lub żądanej iteracji). Przeciągnij moduł zaimportowanych cząstek z prawej strony panelu głównego i upuść go w sekcji Stosy cząstek w kreatorze po prawej stronie. Zamknij zadanie Importuj stos cząstek, klikając czerwony znak X w prawym górnym rogu panelu głównego.
    2. Otwórz zadanie importowania woluminów 3D. Przeciągnij moduł zaimportowanych woluminów z prawej strony panelu głównego i upuść go w sekcji Wolumin początkowy w Konstruktorze po prawej stronie.
  6. Jednorodne zagęszczenie (modyfikacja parametrów)
    1. W polu Parametry znajdź opcję Symetria i ustaw ją na C3. Znajdź opcję Wymuś ponowne wykonanie podziału GS i wyłącz ją. Kliknij przycisk Kolejka zadań, a następnie kliknij przycisk Kolejka, aby zainicjować jednorodne uściślenie. Wykonaj jednorodne zagęszczenie dla pozostałych iteracji przy użyciu tej samej metody (rysunek uzupełniający 6C-D).
      UWAGA: Opcja podziału GS Force re-do ma kluczowe znaczenie. Wyłączenie tej opcji gwarantuje, że CryoSPARC zachowa złoty standard podziału określony przez plik gwiazdy, unikając nadmiernego dopasowania. Szczegółowe uzasadnienie wyłączenia Force Re-do GS Split można znaleźć w pliku uzupełniającym 4.
  7. Poczekaj, aż wszystkie zadania zakończą działanie, aby uzyskać wyniki. Na podstawie wyników potwierdza się, że stos cząstek przefiltrowany w 6. iteracji jest faktycznie optymalnym wynikiem.
    UWAGA: To normalne, że uzyskane wyniki mają niewielkie losowe odchylenia od wyników podanych w tym protokole. Odchylenia te nie mają wpływu na ogólny wniosek.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole wykorzystaliśmy zestaw danych trimera hemaglutyniny grypy (wpis EMPIAR: 10097) jako demonstrację skuteczności tego procesu. Ze względu na preferowaną orientację próbki, akwizycja danych wymagała pochylenia pod kątem 40°. Białko wykazuje symetrię C3 i masę cząsteczkową 150 kDa.

Zaimplementowaliśmy opisany wcześniej protokół do przetwarzania końcowego stosu cząstek. Stopniowo usuwał 20% cząstek w każdej iteracji, co dało współczynnik retencji 80,0%, 64,0%, 51,2% i tak dalej. Jak pokazano na Rysunek 1 i Rysunek 2, rozdzielczość zatrzymanych cząstek początkowo się poprawiła, ale ostatecznie spadła. Spośród iteracji, szóstaiteracja została zidentyfikowana jako najbardziej optymalny podzbiór, zawierający najmniejszą liczbę cząstek, a jednocześnie osiągający najwyższą rozdzielczość. Nasz algorytm z powodzeniem zidentyfikował podzbiór cząstek stanowiących zaledwie 26,2% oryginalnego stosu, co zaowocowało poprawą rozdzielczości z 4,19 A do 3,62 A (ponownie oszacowanej przez CryoSPARC), pokazanej na Rysunek 2. Ponadto mapy gęstości przed i po użyciu CryoSieve zostały porównane w Rysunek 3. Pokazano również krzywą korelacji powłoki Fouriera (FSC) typu model-mapa oraz krzywa FSC z półmapami zrekonstruowanych map gęstości przed i po zastosowaniu metody (Rysunek 3A-B). Porównano również uzyskane mapy gęstości surowej i mapy gęstości ostrej, z zastosowaniem równoważnego poziomu konturu (Rysunek 3C)". Porównano boczne łańcuchy ostrych map gęstości, co wykazało ulepszenie zrekonstruowanych map gęstości. Szacowany współczynnik B Rosenthala-Hendersona został również przyjęty dla kryteriów jakości cząstek19. Po usunięciu większości cząstek w końcowym stosie, współczynnik B Rosenthala-Hendersona wzrósł z 226,9 A2 do 146,2 A2 (Rysunek 3D). Do porównania wykorzystano również rozdzielczość lokalną, lokalny czynnik B20 oraz ResLog21, co wskazuje, że CryoSieve rzeczywiście poprawia zarówno jakość map gęstości, jak i cząstek (Rysunek 4)".

figure-results-1
Rysunek 1: Rozdzielczości każdej iteracji. Zgłoszone rozwiązania są wyróżnione czerwonymi polami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Rozdzielczości każdej iteracji. Rozdzielczości zidentyfikowane przez jednorodne zadania uściślania są wyróżnione czerwonymi polami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mapy gęstości. (A) Porównanie krzywej FSC model-mapa zrekonstruowanych map gęstości przed i po użyciu CryoSieve. Oś y reprezentuje FSC, podczas gdy oś x reprezentuje rozdzielczość. Czerwona przerywana linia oznacza próg 0,5 dla FSC. Pionowa linia przerywana ilustruje rozdzielczość map gęstości uzyskanych przy progu 0,5. (B) Półmapy krzywej FSC uzyskano ze zrekonstruowanych map gęstości przed i po zastosowaniu CryoSieve za pomocą CryoSPARC. Oś y reprezentuje FSC, podczas gdy oś x reprezentuje rozdzielczość. (C) Mapy gęstości surowej i mapy gęstości ostrości zostały pokazane zarówno dla cząstek zatrzymanych przez CryoSieve, jak i dla całego zestawu cząstek w końcowych stosach. Równoważny poziom konturu wynoszący 0,65 zastosowano dla map gęstości surowej. Równoważny poziom konturu wynoszący 0,84 został zastosowany dla ostrych map gęstości. Ostre mapy gęstości uzyskano bezpośrednio za pomocą CryoSPARC. Ostre mapy gęstości zostały poddane automatycznej obróbce końcowej, najpierw ważone FSC (na podstawie FSC dostarczonych przez CryoSPARC). Następnie współczynnik B został wyostrzony za pomocą automatycznie określonych współczynników B (232,0 A2 dla wszystkich cząstek w końcowym stosie i 160,8 A2 dla CryoSieve). Porównano łańcuchy boczne na ostrych mapach gęstości, uwzględniając modele atomowe jako odniesienie. Czerwone strzałki podświetlają ulepszone regiony. (D) Szacowany współczynnik B Rosenthala-Hendersona został pokazany zarówno dla cząstek zatrzymanych przez CryoSieve, jak i dla całego zestawu cząstek w końcowych stosach. Oś y reprezentuje liczbę użytych cząstek, a oś x reprezentuje odwrotność kwadratu rozdzielczości. Poruszając się od góry do dołu, każdy punkt reprezentuje połowę cząstek poprzedniego. Postanowienia zostały określone w drodze doprecyzowania. Współczynniki B zostały wyznaczone przy użyciu aproksymacji najmniejszych kwadratów mierzonych punktów, jak pokazano za pomocą krzywych dopasowania. Szacowane współczynniki B Rosenthala i Hendersona są wskazane w legendach: kolor pomarańczowy reprezentuje cząstki zatrzymane przez CryoSieve, podczas gdy niebieski oznacza wszystkie cząstki w końcowym stosie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie różnych wskaźników map gęstości. (A) Porównanie map rozdzielczości lokalnej przed i po użyciu CryoSieve uzyskanych przez CryoSPARC. Rozdzielczość lokalna waha się od 7 A (czerwony) do 3,5 A (niebieski). (B) Porównanie map gęstości przed i po użyciu CryoSieve, pokolorowanych lokalną mapą współczynnika B uzyskaną przez LocBFactor przy użyciu zakresu rozdzielczości [20-3,5] A. (C), Porównanie wykresów ResLog przed i po użyciu CryoSieve uzyskanych przez CryoSPARC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Używanie poleceń nvidia-smi i conda -V w celu sprawdzenia wymagań wstępnych. Jeśli wymagania wstępne są spełnione, wpisanie polecenia nvidia-smi spowoduje wyświetlenie wersji sterownika procesora graficznego, wersji CUDA i stanu kart GPU. Podobnie, wpisanie polecenia conda -V powinno poprawnie wyświetlić zainstalowaną wersję Conda. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Proces tworzenia nowych środowisk akceleracji GPU. Na ekranie zostaną wyświetlone dane wyjściowe wygenerowane przez polecenie użyte do utworzenia środowiska Conda. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Instalacja CryoSieve w środowisku akceleracji GPU. Po aktywacji nowo utworzonego środowiska Conda, na ekranie wyświetlane są dane wyjściowe wynikające z wykonania polecenia instalacji CryoSieve za pomocą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Informacje pomocy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Uruchomiony proces. Po uruchomieniu CryoSieve za pomocą wiersza poleceń, na ekranie wyświetlane są informacje dotyczące uruchomionego procesu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Konfiguracja zadań CryoSPARC. (A) Importuj stos cząstek. (B) Importowanie woluminów 3D. (C-D) Jednorodne uszlachetnienie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Opcje CryoSieve. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Czas przetwarzania i minimalne wymagania do uruchomienia Cryosieve. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Generowanie początkowego modelu przez CryoSPARC. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Uzasadnienie wyłączenia wymuszania ponownego podziału GS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Opcje cryosieve-csrefine. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Opcje cryosieve-csrhbfactor. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-EM jest kluczową techniką wyjaśniania struktur cząsteczek biologicznych. W tym procesie, po zebraniu danych za pomocą mikroskopii, niezbędna jest ekstrakcja cząstek z mikrofotografii, a następnie ich wieloetapowa klasyfikacja w celu skompilowania końcowego stosu. Częstym wyzwaniem jest przewaga uszkodzonych lub niepożądanie uformowanych cząstek, co podkreśla potrzebę wielokrotnej selekcji cząstek w celu uzyskania map gęstości o wysokiej rozdzielczości. To sprawia, że selekcja cząstek jest kluczowym krokiem w cryo-EM SPA w celu uzyskania wysokiej jakości map gęstości. Istniejące techniki selekcji cząstek obejmują statystyczny algorytm walidacji bez pochylenia22, podejście oparte na wskaźniku z23 oraz metodę szacowania dokładności kątowej24.

CryoSieve jawi się jako cenne narzędzie w tym kontekście, biegłe w eliminowaniu znacznej liczby obcych cząstek z końcowego stosu. Redukcja ta nie tylko zwiększa wydajność obliczeniową rekonstrukcji, ale także usprawnia proces. Oferuje kompleksowy pakiet do selekcji cząstek, w którym zakres odrzucania cząstek i wynikająca z tego poprawa rozdzielczości w dużej mierze zależą od początkowej jakości danych i metodologii zastosowanych w przetwarzaniu danych.

W tym manuskrypcie przedstawiliśmy kompletny przebieg przesiewania cząstek przy użyciu rzeczywistego zestawu danych trymerów hemaglutyniny grypy (wpis EMPIAR: 10097). Omówione i omówione tutaj kroki można podsumować jako przesiewanie cząstek i ponowną ocenę pozy. Ostateczna zrekonstruowana w 3D objętość osiągnęła rozdzielczość 3,62 A, a łańcuchy boczne w alfa-helisach były wyraźniejsze w objętości poddanej obróbce końcowej w porównaniu z opublikowaną mapą gęstości.

CryoSieve to metoda typu open source, która jest dostępna na GitHub (https://github.com/mxhulab/cryosieve). Szczegółowy samouczek można również znaleźć na jego stronie głównej. Użytkownicy mogą go zainstalować i używać, postępując zgodnie z samouczkiem. Dodatkowo dostępne są dwa moduły: cryosieve-csrefine i cryosieve-csrhbfactor. Moduł cryosieve-csrefine został specjalnie zaprojektowany, aby zautomatyzować sekwencyjne wykonywanie różnych operacji w CryoSPARC (plik uzupełniający 5). Operacje te obejmują importowanie stosów cząstek i przeprowadzanie zadań ab initio, jednorodnego lub niejednorodnego uszlachetniania. Z drugiej strony, moduł cryosieve-csrhbfactor został zaprojektowany w celu zautomatyzowania oznaczania czynnika B Rosenthala-Hendersona poprzez wykorzystanie możliwości cryosieve-csrefine (plik uzupełniający 6).

Obecnie zastosowanie tej metody ogranicza się do pojedynczych scenariuszy konformacji. W związku z tym, w przypadkach, gdy cząstki reprezentują wiele konformacji, ich możliwości są ograniczone. Zaleca się, aby użytkownicy początkowo zaangażowali się w klasyfikację 3D w celu posegregowania cząstek o różnych konformacjach przed zastosowaniem jej do wyrafinowanej selekcji cząstek. Co więcej, chociaż metoda ta wykazuje biegłość w odfiltrowywaniu ponad 50% cząstek z końcowego stosu, pochodzenie tych wyrzuconych cząstek i przyczyny ich znikomego wkładu w jakość rekonstrukcji pozostają niejasne. Ta luka w zrozumieniu wymaga dodatkowych badań, aby kompleksowo zająć się tym ograniczeniem i potencjalnie je naprawić.

Istnieją trzy możliwe metody sortowania cząstek lub przesiewania cząstek. Po pierwsze, cisTEM4 może raportować wynik dla każdego obrazu pojedynczej cząstki po udoskonaleniu 3D. Użytkownicy mogą sortować cząstki za pomocą wyniku cisTEM, aby odrzucić cząstki. Podejście oparte na spójności wykresu kątowego (AGC)17 jest również metodą odrzucania nieprawidłowo ustawionych cząstek. Co więcej, klasyfikacja niewspółosiowości5 jest tradycyjnym sposobem odrzucania cząstek przy użyciu klasyfikacji 3D. Porównaliśmy jakość cząstek zatrzymanych tymi metodami z CryoSieve i stwierdziliśmy, że zatrzymane cząstki CryoSieve są wyższej jakości15. Przedstawiona tutaj metoda znacznie przewyższa metody alternatywne i pozwala osiągnąć najmniejszą liczbę cząstek przy tej samej rozdzielczości.

Jak wykazano w wyniku, większość cząstek w końcowym stosie cryo-EM nie przyczynia się do rekonstrukcji mapy gęstości. Innymi słowy, spośród wszystkich cząstek zebranych podczas akwizycji obrazu, tylko kilka wybranych, a mianowicie najdrobniejszy podzbiór, faktycznie przyczynia się do ostatecznej rekonstrukcji. W związku z tym stosunek tego końcowego podzbioru do całkowitej liczby zebranych cząstek może służyć jako ilościowy miernik do oceny jakości próbki. Im wyższy ten stosunek, tym lepsza jakość próbki. Pomimo postępu technicznego, który sprawił, że cryo-EM stał się bardziej dostępny dla biologów strukturalnych, przygotowanie próbek pozostaje głównym wąskim gardłem w przepływie pracy. Naukowcy i inżynierowie koncentrują swoje wysiłki na tym wyzwaniu25. W analizie pojedynczych cząstek (SPA) przygotowanie próbki składa się z dwóch kluczowych etapów: optymalizacji próbki i przygotowania siatki. Pierwsza z nich polega na oczyszczeniu próbki przy zachowaniu jej optymalnego stanu biochemicznego. To ostatnie wiąże się z przygotowaniem próbki do analizy pod mikroskopem, w tym obróbką chemiczną lub plazmową siatki, osadzaniem próbki i witryfikacją. Zaproponowano wiele technik w celu rozwiązania problemu niestabilności makromolekularnej, ale skuteczność jednego podejścia w stosunku do drugiego zależy od charakterystyki próbki25,26. Obecnie na wyniki przygotowania siatki duży wpływ ma wiedza i doświadczenie użytkownika, co może sprawić, że proces ten będzie czasochłonny i wymagający 27,28. Liczne zmienne napotkane podczas przygotowywania próbki i siatki stanowią wyzwanie w ustaleniu związków przyczynowo-skutkowych, ponieważ naukowcy mogą ocenić próbkę tylko na poziomie molekularnym za pomocą mikroskopu. W rezultacie, nadal brakuje statystyk ilościowych pochodzących z porównań różnych protokołów przygotowania próbek i siatek, a systematyczne podejście jest niezbędne do zbadania trendów i zrozumienia podstawowych mechanizmów zachowania próbki29.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Shenzhen Academy of Research and Translation (do M.H.), Advanced Innovation Center for Structural Biology (do M.H.), Beijing Frontier Research Center for Biological Structure (do M.H.), National Key R&D Program of China (No.2021YFA1001300) (do C.B.), National Natural Science Foundation of China (No.12271291) (do C.B.), oraz Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 12071244) (do Z.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc. Toronto, KanadaCryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) to najnowocześniejsze oprogramowanie HPC do kompleksowego przetwarzania danych z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) z pojedynczych cząstek. CryoSPARC jest przydatny do rozwiązywania struktur krio-EM białek błonowych, wirusów, kompleksów, elastycznych cząsteczek, małych cząstek, danych dotyczących płytek fazowych i danych dotyczących barwienia ujemnego.
EMPIAR-10097 Zestaw danychhttps://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcsTen zestaw danych zawiera dane krio-EM z pojedynczych cząstek trymera hemaglutyniny grypy, charakteryzujące się wysoce preferowaną orientacją, zebrane przy użyciu strategii zbierania pod kątem 40 stopni.
initial.mrchttps://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
mask.mrchttps://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
RELION4.0-beta-2RELION (REgularyzowany LIKkelihood OptimisatioN) to oprogramowanie typu open source do przetwarzania danych z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), w szczególności do udoskonalania makromolekularnych Struktur. Wykorzystując podejście bayesowskie, doskonale radzi sobie z oddzielaniem sygnału od szumu, umożliwiając określenie struktury w wysokiej rozdzielczości. RELION obsługuje analizę pojedynczych cząstek, tomografię i uśrednianie subtomogramowe i stał się szeroko stosowany w biologii strukturalnej ze względu na swoją skuteczność i przyjazny dla użytkownika interfejs.
T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.starhttps://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097Plik metadanych dla końcowego stosu cząstek z EMPIAR-10097

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bai, X. C., Fernandez, I. S., Mcmullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-em particles. elife. 2, 00461(2013).
  2. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-em. Nat Meth. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. Cis tem, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, e35383(2018).
  5. Scheres, S. H. Relion: Implementation of a bayesian approach to cryo-em structure determination. J Str Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  6. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. Cryosparc: Algorithms for rapid unsupervised cryo-em structure determination. Nat Meth. 14 (3), 290-296 (2017).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quart Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
  9. Wagner, T., et al. Sphire-cryolo is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Comm Biol. 2 (1), 218(2019).
  10. Bepler, T., et al. Positive-unlabeled convolutional neural networks for particle picking in cryo-electron micrographs. Nat Meth. 16 (11), 1153-1160 (2019).
  11. Wang, F., et al. Deeppicker: A deep learning approach for fully automated particle picking in cryo-em. J Str Biol. 195 (3), 325-336 (2016).
  12. Heimowitz, A., Andén, J., Singer, A. Apple picker: Automatic particle picking, a low-effort cryo-em framework. J Str Biol. 204 (2), 215-227 (2018).
  13. Glaeser, R. M. How good can single-particle cryo-em become? What remains before it approaches its physical limits. Ann Rev Biophys. 48, 45-61 (2019).
  14. Diiorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion. J Vis Exp. (179), e63387(2022).
  15. Zhu, J., et al. A minority of final stacks yields superior amplitude in single-particle cryo-em. Nat Comm. 14 (1), 7822(2023).
  16. Zhou, Y., Moscovich, A., Bendory, T., Bartesaghi, A. Unsupervised particle sorting for high-resolution single-particle cryo-em. Inv Probl. 36 (4), 044002(2020).
  17. Méndez, J., Garduno, E., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. Identification of incorrectly oriented particles in cryo-em single particle analysis. J Str Biol. 213 (3), 107771(2021).
  18. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Meth. 14 (8), 793-796 (2017).
  19. Rosenthal, P. B., Henderson, R. Optimal determination of particle orientation, absolute hand, and contrast loss in single-particle electron cryomicroscopy. J Mol Biol. 333 (4), 721-745 (2003).
  20. Kaur, S., et al. Local computational methods to improve the interpretability and analysis of cryo-em maps. Nat Comm. 12 (1), 1240(2021).
  21. Stagg, S. M., Noble, A. J., Spilman, M., Chapman, M. S. Reslog plots as an empirical metric of the quality of cryo-em reconstructions. J Str Biol. 185 (3), 418-426 (2014).
  22. Vargas, J., Otón, J., Marabini, R., Carazo, J. M., Sorzano, C. Particle alignment reliability in single particle electron cryomicroscopy: A general approach. Sci Rep. 6 (1), 21626(2016).
  23. Vargas, J., et al. Particle quality assessment and sorting for automatic and semiautomatic particle-picking techniques. J Str Biol. 183 (3), 342-353 (2013).
  24. Vargas, J., Melero, R., Gomez-Blanco, J., Carazo, J. -M., Sorzano, C. O. S. Quantitative analysis of 3d alignment quality: Its impact on soft-validation, particle pruning and homogeneity analysis. Sci Rep. 7 (1), 6307(2017).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard'sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Sec D: Str Biol. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Glaeser, R. M. How good can cryo-em become. Nat Meth. 13 (1), 28-32 (2016).
  28. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  29. Weissenberger, G., Henderikx, R. J., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Meth. 18 (5), 463-471 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Electron MicroscopySingle Particle AnalysisDensity Map EnhancementParticle SelectionCryoSieve MethodHigh Resolution StructureParticle Stack FilteringHomogenous RefinementLocal ResolutionRosenthal Henderson B Factor

Related Articles