Artykuł metodologiczny

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66620

⸱

8 marca 2024

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Streszczenie

Chociaż wiele obecnie stosowanych leków jest pochodzenia syntetycznego, produkty naturalne nadal stanowią bogate źródło nowej różnorodności chemicznej i bioaktywności, i mogą dostarczyć obiecujących wskazówek dla opornych lub nowo pojawiających się chorób. Wyzwanie jest jednak dwojakie: badacze muszą nie tylko znaleźć naturalne produkty i wyjaśnić ich strukturę, ale także określić, co jest warte wyizolowania i oznaczenia (oraz to, co jest już znane - proces znany jako dereplikacja). Wraz z pojawieniem się nowoczesnej aparatury analitycznej tempo odkrywania i dereplikacji produktów naturalnych przyspieszyło. Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS) stała się szczególnie cenną techniką identyfikacji i klasyfikacji struktur chemicznych. Alkaloidy tropanowe (TA) to związki pochodzenia roślinnego o dużym znaczeniu leczniczym i toksykologicznym. W tym badaniu opracowaliśmy przepływ pracy przesiewowy oparty na LC-MS/MS, wykorzystując wiele konfiguracji MS / MS dostępnych w spektrometrze mas z potrójnym kwadrupolem (QQQ) do opisywania i klasyfikowania struktur TA na podstawie ich odrębnych wzorców fragmentacji. Stosując kombinację zależnych od danych (DD) skanów jonów produktu, skanów jonów prekursorowych (PrIS) i skanów utraty neutralnej (NLS), zastosowaliśmy tę metodę do bogatych w TA ekstraktów psiankowatych Datura stramonium i Datura metel. Metoda ta jest szybka, czuła i została z powodzeniem zastosowana zarówno do wstępnej dereplikacji złożonych próbek zawierających TA, jak i do odkrycia nowego kandydata do izolacji, oczyszczania (i ewentualnego testu biologicznego).

Wprowadzenie

Chociaż w ostatnich dziesięcioleciach w pełni syntetyczne molekuły stały się coraz bardziej widoczne w odkrywaniu leków, prawie dwie trzecie wszystkich zatwierdzonych leków z ostatnich 39 lat to produkty naturalne lub inspirowane produktami naturalnymi,1,2 podkreślając nieustające znaczenie badań nad produktami naturalnymi. Alkaloidy, niektóre naturalne produkty zawierające azot, są szczególnie cenione ze względu na swoje właściwości lecznicze. Alkaloidy tropanowe (TA) zawierające [3.2.1.]-bicykliczny system zawierający azot, wytwarzany jest głównie przez rośliny z rodziny Solanaceae (psiankowate), Erythroxylaceae i Convolvulaceae. Przykłady obejmują atropinę, skopolaminę i kokainę; Wiele półsyntetycznych lub syntetycznych tropanów jest również stosowanych klinicznie3. TA i ich pochodne są stosowane w leczeniu wielu schorzeń3,4, a kilka z tych leków znajduje się na Liście Leków Podstawowych WHO 20235. Ze względu na ich silne działanie, TA są również używane rekreacyjnie (jako stymulanty lub delirianty) i mogą powodować zatrucie po spożyciu roślin (lub preparatów), które je zawierają6,7. Są one niepożądane w żywności dla ludzi i zwierząt8 i mogą zanieczyszczać herbaty, przyprawy, ziarna, miód i suplementy ziołowe9,10. Ze względu zarówno na ich potencjał leczniczy, jak i zdolność do zatruwania, metody analityczne, które mogą pomóc w odkryciu nowych TA (i identyfikacji znanych TA) są przydatne.

W tandemowej spektrometrii mas (MS/MS), "filtry masowe" (np. kwadrupole, lampy czasu przelotu) są sprzężone ze sobą fizycznie ("w przestrzeni"), lub instrument wykorzystuje dodatkowe etapy reakcji/separacji "w czasie". In-space MS/MS wykorzystuje różne tryby do selekcji i fragmentacji różnych jonów w różnych filtrach masowych (np. kwadrupolach instrumentu z potrójnym kwadrupolem lub QQQ). Te różne tryby mogą być wykorzystane do określenia, które konkretne fragmenty są wytwarzane przez dany jon (skanowanie jonów produktowych), które jony w próbce dają określone fragmenty (skanowanie jonów prekursorowych lub PrIS) lub ulegają ubytkom o charakterystycznej masie (skanowanie utraty obojętnej lub NLS) lub które konkretne związki posiadają które określone fragmenty (monitorowanie wielu reakcji). MS/MS dostarcza zatem fragmentów, które są przydatne do proponowania struktur dla nowych związków lub potwierdzania obecności istniejącego związku. MS/MS jest coraz częściej stosowany w dziedzinie odkrywania leków, chemii produktów naturalnych i metabolomiki11,12, i jest używany do profilowania gatunków zawierających alkaloidy (do charakterystyki fitochemicznej lub analizy chemotaksonomicznej) oraz do wykrywania i ilościowego określania określonych alkaloidów w żywności lub roślinach leczniczych10,13,14,15,16.

Pomimo wielu dostępnych technik spektrometrii mas, istnieją wyzwania związane z poszukiwaniem nowych alkaloidów. Oprócz znalezienia organizmu kandydującego do badań przesiewowych, pełne strukturalne potwierdzenie alkaloidu jest żmudnym procesem, który może obejmować wiele różnych technik analitycznych. Dodatkowo naukowcy mogli wyizolować związek, który jest już znany, marnując pracę, czas i zasoby. Jest to szczególnie trudne w przypadku TA, gdzie zgłaszane są setki, jeśli nie tysiące TA, z których wiele jest izomerycznych względem siebie. Proces "identyfikowania znanych i odróżniania ich od nieznanych" jest znany jako dereplikacja. Bazy danych czasów retencji (r.t.s) i fragmentów masowych różnych TA i innych związków są publikowane, aby pomóc w tym procesie17,18. Niemniej jednak dereplikacja jest pracochłonna; Samo adnotowanie (tj. przypisywanie przypuszczalnych struktur) alkaloidów w całym chromatogramie LC-MS/MS próbki jest czasochłonne. Ostatnio zarówno sieć molekularna19,20, jak i ręczna dereplikacja18,21,22 były używane do benzylizochinoliny, indolu monoterpenowego i alkaloidów tropanowych, a PrIS były używane do "filtrowania strukturalnego" widm w celu identyfikacji alkaloidów typu pirolizydyny i solaniny23,24. Nie ma jednak żadnych konkretnych metod ani przepływów pracy do szybkiej dereplikacji próbek zawierających TA opartej na LC-MS/MS, mimo że TA posiadają wspólne, łatwe do zidentyfikowania fragmenty (Rysunek 1). Opisana tutaj metoda wykorzystuje kombinację zależnych od danych (DD) skanów jonów produktowych, PrIS i NLS do opisywania i klasyfikowania struktur TA w roślinach w oparciu zarówno o odrębne wzorce fragmentacji dla mono-, di- i tripodstawionych tropanów (Rysunek 1A), jak i straty wspólnych grup estrowych występujących w tych alkaloidach (Figura 1B). Badane organizmy to kilka gatunków z rodzaju psiankowatych Datura. Bogate źródło różnorodnych TA, Datura była używana w całej historii świata do celów medycznych i kulturowych17- i jest trudną matrycą do dereplikacji ze względu na liczne, strukturalnie podobne TA, dostarczając nam atrakcyjnych próbek, na których możemy przetestować naszą metodę.

Protokół

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem wymienionych chemikaliów.

1. Przygotowanie próbki

UWAGA: Ciekły azot może powodować oparzenia kriogeniczne. Używaj rękawic kriogenicznych i ochrony oczu w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Próbki roślin zawierające alkaloidy mogą działać drażniąco na skórę; Zawsze obchodź się z nimi w rękawiczkach. Metanol jest toksyczny i łatwopalny i należy go przenosić w dygestorium, z dala od potencjalnych źródeł zapłonu.

UWAGA: Teoretycznie można użyć uprawianej lub dzikiej tkanki roślinnej (suszonej lub mielonej świeżej); poniższa procedura jest właśnie tą wykorzystywaną podczas opracowywania metody.

  1. Jeśli interesująca nas tkanka roślinna jest świeża, zamroź ją, umieszczając ją w stożkowej rurce polipropylenowej i zanurzając w ciekłym azocie na 2-3 minuty.
  2. Zamrożoną tkankę roślinną umieścić we wstępnie schłodzonym moździerzu (w chłodnicy styropianowej z ciekłym azotem) i za pomocą wstępnie schłodzonego tłuczka zmielić tkankę na jednolity proszek.
  3. Szybko zważyć żądaną ilość tkanki do wytarowanej polipropylenowej probówki wirówkowej za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki i natychmiast dodać 20% metanolu (w temperaturze pokojowej [RT]) w stężeniu 1 ml na każde 100 mg tkanki.
    UWAGA: Metanol (20%) jest powszechnie używany do ekstrakcji TAs25. Czasami dodaje się 0,1% kwasu mrówkowego, chociaż podczas opracowywania tej i innych metod nie zaobserwowano różnicy w wydajności ekstrakcji.
  4. Umieść zakręcone rurki na wytrząsarce na biegunach (średnia prędkość) na minimum 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Odwirować probówki o sile 9464 x g przez 10 minut. Odpipetować supernatant do fiolki z automatycznym samplerem LC-MS lub, jeśli nadal jest mętny, przefiltrować najpierw przez filtr strzykawkowy 0,45 μm.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu, chociaż przetworzone świeże próbki i ekstrakty roślinne powinny być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C przed analizą, aby uniknąć potencjalnej degradacji alkaloidów.

2. Konfiguracja przyrządu LC-MS i zbieranie danych

UWAGA: Acetonitryl jest toksyczny i łatwopalny; trzymaj z dala od źródeł zapłonu i kontroluj opary za pomocą dygestorium. Kwas mrówkowy jest; Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

  1. Użyj przyrządu LC-MS ze źródłem jonizacji elektrorozpylania (ESI) i kolumną HPLC z odwróconymi fazami (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. W przypadku HPLC należy użyć 0,1% kwasu mrówkowego wH2Ojako rozpuszczalnika A i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu jako rozpuszczalnika B; zrównoważyć kolumnę z 99% A i 1% B. Skonfigurować 30-minutowy gradient 1%-50% B przez 26 minut, powracając do 1% B po 26,01 min i utrzymując 1% B przez 4 minuty. Użyj temperatury pieca kolumnowego 45 °C i natężenia przepływu 0,5 ml/min.
  3. W metodzie LC-MS stosuje się następujące parametry pracy spektrometru mas: napięcie interfejsu: 4,0 kV, przepływ gazu nebulizacyjnego: 3 l/min, przepływ gazu grzewczego: 10 l/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura bloku grzewczego: 400 °C, temperatura interfejsu: 300 °C, przepływ gazu suszącego: 10 l/min oraz ciśnienie gazu (argonu) wywołanej zderzeniem (CID) 17 kPa.
  4. Zbuduj metodę MS w trybie dodatnim ESI, która obejmuje zarówno skanowanie Q3, jak i Q1 (100-1000 Da), które działa jako zdarzenie badawcze (ustawione na długość metody LC), z włączonym automatycznym wykluczaniem izotopów. Uwzględnij skan jonów produktu jako zdarzenie zależne od skanu Q1 (analiza DD), z oknem masowym 50-1000 Da, energią ogniwa zderzeniowego -20 V i czasem zdarzenia <0,2 s.
    UWAGA: Próg zliczania dla wyzwolenia skanowania jonów produktu DD w Q1 może być zmienny, ale zazwyczaj używany jest poziom 7 000-10 000 zliczeń. W przypadku niektórych instrumentów, takich jak ten, który został użyty do opracowania metody, skan Q3 zapewnia większą dokładność masy i czułość niż Q1 i jest uwzględniany w celu potwierdzenia jonów zaobserwowanych w skanie Q1, chociaż można go bez problemu pominąć w kroku 2.4.
  5. Do powyższej metody MS należy dodać PrIS w postaci dodatniej równe długości metody LC o energiach ogniw zderzeniowych -20 V i czasach zdarzeń 0,75 s. Upewnij się, że we wszystkich przypadkach włączone są funkcje automatycznego wykluczania izotopów lub deizotopowania. Upewnij się, że interesujące wartości m/z dla fragmentów TA (w Da, patrz Rysunek 1A) wynoszą 124.1 (dla monopodstawionych TA, okno masowe 125-1000 Da), 122.1 i 140.1 (dla podstawionych TA, okna mas zaczynające się odpowiednio od 123 i 141 Da) oraz 156.1 i 138.1 (dla trójpodstawionych TA, okna masowe zaczynające się od 157 i 139 Da, odpowiednio).
    UWAGA: Podczas opracowywania metody, PrIS zostały podzielone na dwie różne metody, jedną dla mono- i dipodstawionych TA, a drugą dla tripodstawionych TA, chociaż można je podzielić lub połączyć w dowolny sposób.
  6. Utwórz drugą metodę MS, która zawiera parametry w kroku 2.4.
    1. Do tej metody MS/MS dodaj NLS w trybie dodatnim równą długości metody LC, z energiami ogniw zderzeniowych -20 V i czasami zdarzeń 0,75 s. Upewnij się, że we wszystkich przypadkach włączone są funkcje automatycznego wykluczania lub deizotopowania izotopów.
    2. Upewnij się, że neutralne masy strat będące przedmiotem zainteresowania dla estrów na TA (w Da, patrz Rysunek 1B) wynoszą 100,05 (dla estrów pochodzących z kwasu tiglowego, okno masowe 110-1000 Da), 60,03 (dla grup acetylowych, okno masowe 100-1000 Da) i 166,06 (estry kwasu fenylomlekowego lub tropikalnego, okno masowe 170-1000 Da).
  7. Pobierz metodę LC-MS i utwórz pliki danych dla interesujących Cię próbek. Po zrównoważeniu kolumny HPLC w temperaturze 45 °C, należy uruchomić próbki będące przedmiotem zainteresowania w pliku partii lub projektu z odpowiednimi ślepymi próbami rozpuszczalnika ekstrakcyjnego między różnymi gatunkami lub typami tkanek. Typowa objętość wtrysku wynosi 10-20 μL.
    UWAGA: Przy szczególnie dużych głośnościach detektor spektrometru mas może być nasycony. W przypadku bardzo skoncentrowanych próbek, należy upewnić się, że źródło ESI jest oczyszczone, a instrument jest regularnie strojony. W tym miejscu protokół można wstrzymać po zebraniu wszystkich danych.

3. Analiza danych

  1. Zbadaj całkowity chromatogram jonowy skanów Q1 i Q3 (oraz skan jonów produktu DD) i zanotuj masę macierzystą wszelkich obfitych jonów, które mają cechy podobne do TA: a) masa <500 Da dla jonu [M+H]+, zwykle o masie parzystej, b) typowy r.t.s między 2-22 min przy użyciu powyższej metody LC, oraz c) fragmenty z poniższej listy: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 lub 128 Da.
  2. Zbadać chromatogram/kanał PrIS dla m/z 124 i zanotować, które piki/jony są przy których rt (zarejestrowane w kroku 3.1) wytwarzają ten fragment. Kliknij skan po skanie przez chromatogram, a także zbadaj pełne widma MS/MS uzyskane w skanowaniu jonów produktu DD, szczególnie dla gatunków o niższej liczebności.
    UWAGA: Prawdziwy gatunek zawierający ten fragment będzie istniał przez wiele skanów i pojawi się zarówno w skanach Q1, jak i Q3 (jeśli ten drugi jest używany). Arkusz kalkulacyjny jest dołączony do informacji uzupełniających (plik uzupełniający 1), aby pomóc w dodawaniu adnotacji.
  3. Powtórzyć krok 3.2 z pozostałymi chromatogramami PrIS. Ponieważ zarówno m/z 122, jak i 140 wskazują na dipodstawione TA, a zarówno m/z 138, jak i 156 wskazują na tripodstawione TA, należy zbadać te chromatogramy / kanały razem.
  4. Zbadaj chromatogram/kanały NLS dla m/z 100, 60 i 166 i zanotuj, które piki/jony, przy których RT (zarejestrowane w kroku 3.1) wytwarzają te neutralne straty. Podobnie jak w przypadku PrIS, należy przechodzić przez chromatogram skan po skanie i porównać z fragmentacją uzyskaną w skanowaniu jonów produktu DD, szczególnie w przypadku gatunków o niższej liczebności.
  5. Korzystając z kombinacji danych PrIS i NLS, popartych wynikami skanowania jonów produktu DD, dokonaj przypuszczalnych adnotacji obserwowanych alkaloidów, dodając najmniejszą masę tropanu (np. 124, 122 lub 138) i ubytek obojętny, a następnie uwzględniając pozostałą masę.
    UWAGA: Typowymi grupami podstawiącymi TA (i ich masami w Da) są hydroksyl (18), acetyl (60), propionyl (74), izobutyryl (88), tigloyl (100), nasycony tigloyl/2-metylobutyryl (102) lub fenylolmleczan/kwas tropowy (166).
  6. Porównaj adnotacje dotyczące alkaloidów z tymi opisanymi w literaturze17 i bazach danych (np. MoNA)26, aby określić, które wzorce substytucji TA są zgłaszane (a które są potencjalnie nowe). Dodatkowo należy stosować wzorce niektórych popularnych alkaloidów tropanowych (np. atropiny, littoryny, skopolaminy), które są dostępne w handlu w celu potwierdzenia.
  7. Aby uzyskać dodatkowe informacje strukturalne dla próbek o niskiej obfitości (PrIS i NLS mogą wychwytywać jony poniżej progów zdarzenia zależnego), należy pobrać skan określonych jonów produktu (wykorzystując masę będącą przedmiotem zainteresowania jako jon prekursorowy) na bardziej skoncentrowanej próbce.
    UWAGA: Ta metoda została opracowana na instrumencie QQQ o niskiej rozdzielczości. W przypadku wszystkich przypuszczalnych nowych związków należy użyć instrumentu MS o wysokiej rozdzielczości w celu uzyskania dokładnych widm masowych.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność tej metody, przygotowano standardową mieszaninę TA (10 µg/mL po jednej porcji mieszaniny acetyltropiny/acetylpseudotropiny [monopodstawionej], 10 µg/mL każdy z nich, w tym mieszanina dwóch izomerów anisodaminy [disubstytuowanych], a także hioacyjamina [monosubstytuowana], litorina [monosubstytuowana] i skopolamina [trisubstytuowana], został przeanalizowany jako kontrola pozytywna (Rysunek 2). Pełny chromatogram skanowania Q1 (wyświetlony w widoku chromatogramu szczytu podstawowego) przedstawiono w Rysunek 2A, z zaznaczonymi standardowymi strukturami TA w odpowiadających im pikuach. PrIS dla m/z 124 (Rysunek 2B) wykazuje piki w chromatogramie dla monopodstawionych TA; zatem wyświetlane są mieszanina acetyltropiny/pseudotropiny, hioscyamina i litorina. Piki odpowiadające acetyltropinie i pseudotropinie w m/z chromatogramy 124 są niewielkie (prawdopodobnie dlatego, że ich stężenie jest niższe niż w przypadku pozostałych wzorców i być może dlatego, że mogą one generować mniej obfity m/z 124 fragmentu niż pozostałe monopodstawione TA). Niemniej jednak są one nadal wykrywalne zarówno w tym chromatogramie, jak i w odpowiadającym mu kanale PrIS. Rysunek 2C i Rysunek 2D do czego służą chromatogramy PrIS m/z odpowiednio 122 i 140. Wykrywając disubstytuowane fragmenty TA, oba sygnały wskazują na dwa izomery anisodaminy, przy czym silniejszy sygnał jest widoczny na m/z kanał 140. Ponieważ różne TA mogą posiadać fragmenty o różnej intensywności, the m/z Należy wspólnie zbadać kanały 122 i 140. Na koniec, m/z 156 (Rysunek 2E) oraz m/z 138 (Rycina 2F) kanały, diagnostyczne dla TA trójpodstawionych, oba wykazują jeden pik dla skopolaminy (jedynego trójpodstawionego TA w mieszaninie wzorcowej).

Następnie wykorzystano chromatogramy NLS do przypisania obecnych grup estrowych. Rysunek 2G przedstawia chromatogram NLS dla 60 Da (utrata kwasu octowego z estrów octanowych): widoczne są dwa acetylowane, monosubstytuowane izomery TA. Chromatogram NLS dla 166 Da (Rysunek 2I), przeznaczony do identyfikacji estrów fenylomleczanowych lub tropinowych, poprawnie identyfikuje wszystkie alkaloidy zawierające jedną z tych grup (hiocyjaminę, litorynę, dwa izomery anisodaminy oraz skopolaminę). Wreszcie, zgodnie z przewidywaniami, chromatogram (Rysunek 2H) dla utraty 100 Da (charakterystycznej dla estrów tygloilowych) jest pusty, z wyjątkiem niewielkiej zanieczyszczenia przy r.t. 1,75 min, ponieważ żaden z alkaloidów wzorcowych nie zawiera tej grupy.

Następnie metodę przetestowano pod kątem wyników fałszywie dodatnich. Jako kontrolę negatywną wykorzystano ekstrakt wodno-metanolowy z liści pomidora (Solanum lycopersicum). Mimo przynależności do psiankowatych, pomidory nie produkują TA. Pełny chromatogram pików bazowych ze skanowania Q1 przedstawiono na Ryc. 3A. PrIS dla m/z 124 (Ryc. 3B) jest w większości pusty, z niewielkimi fluktuacjami linii bazowej, które prawdopodobnie są szumem detektora (żadne sygnały nie odpowiadały tym masom w skanowaniach Q1 lub Q3). Dwie cechy o czasach retencji (r.t.) 2,6 i 3,4 min generują fragment 124, jednak analiza skanowania jonów produktowych DD wykazuje, że cechy te nie produkują żadnych innych monosubstytuowanych fragmentów tropanu (m/z 93 lub 142), co sugeruje, że nie są to TA. Przykład ten podkreśla również użyteczność włączenia skanowania jonów produktowych DD w tej metodzie w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich. Podobnie, kanał m/z 122 dla disubstytuowanych TA (Ryc. 3C) wykazuje jedynie szum. Chromatogramy PrIS dla m/z 140, m/z 138 i m/z 156 oraz trzy NLS, które w skanowaniach DD sugerują obecność wyłącznie cech innych niż TA, przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1A-F.

Aby zademonstrować zastosowanie tej metody w dereplikacji próbki zawierającej TA, przeanalizowano ekstrakt z korzenia D. metel var. 'fastuosa'. Korzenie są głównym miejscem biosyntezy TA u psiankowatych i przewidywano obecność wielu zróżnicowanych TA. Pełny chromatogram skanu Q1 przedstawiono na Rysunku 4A. Zgodnie z oczekiwaniami, na PrIS dla m/z 124 (Rysunek 4B), m/z 122 (Rysunek 4C), m/z 140 (Rysunek 4D), m/z 156 (Rysunek 4E) i m/z 138 (Rysunek 4F) wykryto liczne sygnały o różnej intensywności. Wiele z tych TA było również acetylowanych lub tygloylowanych bądź pochodziło z kwasu fenylomlecznego/tropowego, co wskazują liczne sygnały w chromatogramach NLS na Rysunku 4G-I, odpowiednio.

Do wstępnego udokumentowania cech (mas lub czasów retencji r.t.), które wykazywały charakterystykę typową dla TA (zgodnie z kryteriami z kroku 3.1), wykorzystano arkusz kalkulacyjny w formacie .xls (pusty arkusz do użytku czytelnika znajduje się w Supplementary File 1, a dane dla korzenia D. metel w Supplementary File 2). Następnie odnotowano fragmenty i straty neutralne przypisane do tych cech. Metoda ta jest niezwykle czuła: kanały PrIS bez trudu wykryły nawet niskostężone TA, które nie generowały widocznych pików na odpowiadających im chromatogramach. Na podstawie fragmentów i strat neutralnych, zgodnie z krokiem 3.5, zaproponowano strukturę alkaloidu.

Przykład wykorzystania danych spektralnych do adnotacji alkaloidów przedstawiono na Rysunku 5. Pełny chromatogram skanu Q1 dla korzenia D. metel znajduje się na Rysunku 5A. Wybrano sygnał w 14,4 min; widmo skanu Q1 (Rysunek 5B) wykazuje masę jonu rodzica m/z 224 dla tego piku. Widmo skanu jonów produktowych DD przedstawiono na Rysunku 5C. Kanał PrIS dla m/z 124 (Rysunek 5D) wskazuje, że jon 224 generuje ten fragment (widoczny również w skanie jonów produktowych DD). Kanał NLS dla 100 Da (do wykrywania tigloylowanych TA) również oznacza m/z 224 (co potwierdzono również w skanie jonów produktowych DD). Suma utraty neutralnej i fragmentu TA o najniższej masie (100 + 124 Da) równa się masie rodzica, 224, co potwierdza, że grupa tigloylowa jest jedynym podstawnikiem; prawdopodobną strukturę tego alkaloidu wskazano na Rysunku 5C. W przypadku TA podstawionych dwu- i trzykrotnie, obserwowane masy utraty neutralnej dodawano do najniższej masy TA, a następnie proponowano kolejny podstawnik, aby wyjaśnić pozostałą masę: na przykład m/z 222, z fragmentami TA podstawionych dwukrotnie o masach 140 i 122 oraz utratą neutralną 100 Da, ma masę pozostałą 100 (222-122 = 100), co prawdopodobnie jest drugą grupą tigloylową. Ten schemat postępowania można intuicyjnie wykorzystać w procesie eliminacji: sygnał pozbawiony fragmentów tropanowych (nawet jeśli może tracić 60, 100 lub 166 Da) prawdopodobnie nie jest TA. W przykładzie dokładnej i szybkiej dereplikacji z wykorzystaniem tego schematu, w korzeniu D. metel zidentyfikowano 71 różnych TA o różnej obfitości i polarności, w tym wiele związków izomerycznych (Supplementary File 2). Niektóre z tych związków posiadały grupy estrowe, których nie można było łatwo przypisać, a niektóre dodatkowe związki oznaczono jako potencjalne TA, jednak nie można było ich zidentyfikować z wysoką pewnością.

Przeanalizowano również ekstrakt metanolowo-wodny z mielonych nasion D. stramonium. Pełny chromatogram szczytowy skanu Q1 dla korzenia D. metel przedstawiono na Ryc. 6A. PrIS dla m/z 124 przedstawiono na Ryc. 6B, a PrIS dla m/z 122 na Ryc. 6C; pozostałe chromatogramy znajdują się na Ryc. uzupełniającej 2A-F. Rycyna 6B wskazuje na bardzo obfity monosubstytuowany alkaloid tropanowy przy r.t. = 12,6 min, prawdopodobnie hyoscyjaminę. Arkusz kalkulacyjny z adnotacjami TA dla nasion zawarto w Pliku uzupełniającym 3. Wydajność metody wydawała się niższa w przypadku tej konkretnej próbki: dwie bardzo obfite cechy o m/z 259 przy r.t. 8,5 i 10,2 min generowały piki na chromatogramach NLS dla 60 i 100 Da (Ryc. uzupełniająca 2 D,E) z masą m/z 260 (izotop M+1) wskazaną na odpowiadających im widmach. Związki te nie są TA, lecz tworzą fragmenty zgodne z alkaloidami beta-karbolinami27. Nie są one acetylowane ani tygloilowane, lecz tracą 60 lub 100 ze swojego izotopu M+1, co sprawia, że ich pojawienie się w tych dwóch kanałach NLS jest błędne. Dodatkowo skopolamina (r.t. = 10,5 min) generowała fragment m/z 122 z piku izotopu M+1 o m/z 305, będącego izotopem oczekiwanego fragmentu skopolaminy o m/z 121. Mimo że metody te wykorzystują funkcje usuwania izotopów, przy tak wysokich stężeniach próbek możliwe jest pewne „wyciekanie” izotopów. Choć może to być zjawisko charakterystyczne dla instrumentu użytego w tej badaniu lub dla tej konkretnej próbki, warto o tym wspomnieć.

Przy użyciu tej metody w nasionach D. stramonium zidentyfikowano czterdzieści TA, w tym kilka, które wydają się być glikozylowane, tracąc masy 162 (heksoza), 146 (deoksyheksoza) lub 132 Da (ksyloza lub podobny cukier). Choć TA zawierające heksozę opisywano u Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 oraz Atropa25, jest to pierwszy raport dotyczący TA zawierających deoksyheksozę lub ksylozę. Jeden TA miał czas retencji r.t. 13,8 min (Rycina 7A) i masę m/z 436 (skan Q1 na Rycynie 7B). Sygnał ten pojawił się na kanale m/z 124, co wskazuje na monopodstawiony TA (Rycina 7D), jednak nie wygenerował sygnałów na żadnym innym kanale PrIS lub NLS. Skan jonów produktowych DD (Rycina 7C) wykazał oczekiwaną wartość m/z 124, co oznacza utratę 312 Da (prawdopodobnie 166 + 146 Da) z jonu macierzystego. Wysokorozdzielcze MS/MS uzyskano za pomocą spektrometru kwadrupolowego czasu przelotu (widmo na Rycynie 7E), co wykazało fragment m/z 290, sugerując obecność hyoscyjaminy lub littoriny glikozylowanej w części grupy hydroksylowej estru ramnozą lub podobnym cukrem; zmierzona masa dokładna była również bardzo bliska masie teoretycznej obliczonej dla ramnozylo-hyoscyjaminy lub littoriny (struktura na Rycynie 7E). Ze względu na niespotykaną strukturę i obfitość, alkaloid ten zasługuje na wyizolowanie z nasion D. stramonium, co stanowi przykład zastosowania tej metody w odkrywaniu nowych alkaloidów.

Schemat analizy fragmentów tropanowych z strukturami jednopodstawionymi, dwupodstawionymi i trójpodstawionymi.
Rycina 1: Istotne fragmenty i straty obserwowane w MS alkaloidów tropanowych (TAs). (A) Charakterystyczne fragmenty (oraz ich masy diagnostyczne) powstałe z jednopodstawionych, dwupodstawionych i trójpodstawionych TAs, a także reprezentatywne przykłady alkaloidów z każdej klasy. (B) Typowe straty neutralne obserwowane w grupach estrowych TAs (oraz ich masy diagnostyczne). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki chromatograficzne, struktury chemiczne i piki; schematy porównujące rozdzielenia różnych analitów.
Rycina 2Skanowanie jonów prekursorowych i strat neutralnych dla kontroli pozytywnej. Na wszystkich chromatogramach oś X przedstawia czas retencji, a oś Y liczbę zliczeń (obfitość jonów).A) Całkowity chromatogram jonowy mieszaniny standardów alkaloidów w widoku chromatogramu szczytowego (base-peak chromatogram). Wskazano struktury standardów; odpowiadające im piki zaznaczono czerwonymi strzałkami. (B-F) są chromatogramami PrIS dla (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 oraz (F) 138. (G-I) Chromatogramy NLS dla 60 Da (acetylo, G), 100 Da (tygloylowy, H), oraz 166 Da (kwas fenylomlekowy/tropicowy, I). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wyniki chromatografii; wykresy A, B, C; analiza piku; intensywność widma; rozdzielenie związków.
Rycina 3: Skanowanie jonów prekursorowych i strat neutralnych dla kontroli negatywnej.Na wszystkich chromatogramach oś X przedstawia czas retencji, a oś Y liczbę zliczeń (obfitość jonów). (A) Całkowity chromatogram jonowy, w widoku chromatogramu piku bazowego, ekstraktu z liści S. lycopersicum w metanolu/wodzie. (B) Chromatogram PrIS dla m/z 124, wykazujący tylko dwie cechy nietropanowe w czasie retencji 2,6 i 3,4 min. (C) Chromatogram PrIS dla m/z 122, pusty z wyjątkiem szumu detektora. Zastosowano te same skale, co na Rycynie 2; pozostałe chromatogramy znajdują się w Uzupełniającej Rycini 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki chromatografii; wiele chromatogramów porównujących czasy retencji związków i intensywność piku.
Rycina 4: Zastosowanie metody MS/MS do korzeni D. metel var. 'fastuosa'. Na wszystkich chromatogramach oś X oznacza czas retencji, a oś Y oznacza liczbę zliczeń (obfitość jonów). (A) Całkowity chromatogram jonowy, w widoku chromatogramu piku bazowego, ekstraktu z metanolu/wody z korzeni D. metel var. 'fastuosa'. (B-F) to chromatogramy PrIS dla m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 oraz (F) 138. (G-I) to chromatogramy NLS dla 60 Da (acetylowy, G), 100 Da (tigloylowy, H) i 166 Da (kwas fenylo-mlekowy/tropicowy, I). Zauważalna jest obfitość sygnałów na każdym chromatogramie, odpowiadająca licznym TAs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Chromatogramy spektrometrii mas z budową chemiczną, pikami jonowymi i danymi m/z do analizy.
Rycina 5: Zastosowanie połączonej metody skanowania jonów produktowych DD, skanowania jonów prekursorowych oraz skanowania strat neutralnych w celu zaproponowania struktury dla TA. (A) Całkowity chromatogram jonowy, w widoku chromatogramu pików bazowych, ekstraktu z korzeni D. metel var. 'fastuosa' w metanolu/wodzie. Pik przy r.t. = 14,4 min jest wskazany czerwoną strzałką. (B) Skan Q1 (skanowanie przeglądowe), z obfitą masą m/z 224 dla tego piku. Dla wszystkich widm oś X przedstawia masę, a oś Y intensywność. (C) Skanowanie jonów produktowych DD, pokazujące fragmentację jonu m/z 224, wskazujące na stratę 100 Da i fragment m/z 124 (czerwone strzałki). Związek ten pojawia się zarówno na (D) kanale PrIS m/z 124, jak i na (E) kanale NLS 100 Da, co wskazuje, że jest on zarówno jednosubstytuowany, jak i tygloylowany (struktura na panelu C). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza chromatograficzna; wykresy chromatograficzne A-C; porównanie piku; detekcja chemiczna.
Rysunek 6: Zastosowanie metody MS/MS do nasion D. stramonium. Na wszystkich chromatogramach oś X oznacza czas retencji, a oś Y liczbę zliczeń (obfitość jonów). (A) Całkowity chromatogram jonowy, w widoku chromatogramu piku bazowego, ekstraktu z nasion D. stramonium wykonanego w mieszaninie metanol/woda. (B) Chromatogram PrIS dla m/z 124; (C) przedstawia chromatogram PrIS dla m/z 140. Pozostałe chromatogramy znajdują się w Supplementary Figure 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Chromatogram i widma analizy spektrometrią mas; identyfikacja peptydów; piki m/z i struktura chemiczna.
Rycina 7: Adnotacja nowego alkaloidu w nasionach D. stramonium. Dla wszystkich chromatogramów oś X to czas retencji, a oś Y to liczba zliczeń (obfitość jonów). (A) Całkowity chromatogram jonowy, w widoku chromatogramu pików bazowych, ekstraktu z nasion D. stramonium w mieszaninie metanol/woda. Wskazano cechę przy r.t. = 13,7 min. (B) Skan Q1 (skan przeglądowy) pokazujący masę m/z 436 dla tego piku. Dla wszystkich widm oś X to masa, a oś Y to intensywność. (C) Skan jonów produktowych DD pokazujący fragmentację jonu m/z 436. (D) Ten monosubstytuowany związek TA pojawia się na kanale PrIS m/z 124. (E) Widmo MS/MS o wysokiej rozdzielczości dla tego nowego TA, wraz z proponowanymi strukturami i dokładną masą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Dodatkowe skany jonów prekursorowych i strat neutralnych dla kontroli negatywnej. (A-C) Chromatogramy PrIS dla m/z (A) 140, (B) 156 oraz (C) 138. (D-F) Chromatogramy NLS dla 60 Da (acetylo, D), 100 Da (tygloilo, E) oraz 166 Da (kwas fenylomlekowy/tropowy, F). Zastosowane skale są takie same jak na Rycini 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Zastosowanie metody MS/MS do nasion D. stramonium; dodatkowe chromatogramy. (A-C) to chromatogramy PrIS dla m/z (A) 140, (B) 156 oraz (C) 138. (D-F) chromatogramy NLS dla 60 Da (acetylo, D), 100 Da (tygloilo, E) oraz 166 Da (kwas fenylomlekowy/tropowy, F). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Pusty arkusz kalkulacyjny używany do adnotacji alkaloidów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Arkusz kalkulacyjny z adnotacjami i strukturami alkaloidów dla korzeni D. metel var. 'fastuosa'. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Arkusz kalkulacyjny z adnotacjami i strukturami alkaloidów dla nasion D. stramonium. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Chociaż parametry urządzenia podane w protokole pozwalają na zadowalającą wydajność, pomyślne zastosowanie tej metody może wymagać szczególnej uwagi lub optymalizacji kilku krytycznych kroków. Chociaż gradient rozpuszczalnika HPLC podany w kroku 2.2 jest ogólnie odpowiedni dla alkaloidów tropanowych, może być konieczna jego modyfikacja w zależności od profilu alkaloidów tropanowych badanej próbki lub gatunku rośliny. Objętość wstrzykiwanej próbki może być również zmieniana w zależności od czułości urządzenia i sposobu stosowania metody. "Głębokie" profilowanie metaboliczne lub dereplikacja powinny wymagać większej objętości wstrzyknięcia (w tym badaniu użyto 15-20 μl), podczas gdy proste wykrywanie alkaloidów może wymagać mniejszych objętości. Przy stosowaniu dużych objętości próbek należy zachować ostrożność w celu a) regularnego czyszczenia źródła jonów, b) monitorowania kolumny HPLC pod kątem zmian ciśnienia lub zatorów (zawsze należy stosować odpowiednią kolumnę ochronną), c) zapobiegania przenoszeniu między próbkami oraz d) badania chromatogramów pod kątem potencjalnego "wycieku izotopu", jak opisano powyżej. Temperatury i napięcia interfejsu nie powinny ulegać znaczącym zmianom w stosunku do temperatur i napięć określonych w metodzie, aby uniknąć przedwczesnej fragmentacji w źródle. Ponadto, chociaż zalecane jest napięcie ogniwa zderzeniowego wynoszące 20 V, może ono nie zapewnić optymalnego sygnału chromatogramu (lub diagnostycznych fragmentów skanowania jonów produktu DD) dla wszystkich TA. Niektóre instrumenty i funkcje MS mają funkcję "narastania energii zderzenia" lub zdolność do zbierania skanów przy wielu lub zoptymalizowanych energiach zderzeń, co również może znaleźć zastosowanie w metodzie takiej jakta.

Ta metoda MS sama w sobie jest również łatwo modyfikowalna: podczas gdy estry kwasu tigliczowego, octowego i fenylolaktowego/tropowego są powszechne u gatunków Datura, wzorce substytucji estrów TA mogą być różne w innych roślinach lub próbkach. Masy NLS można zmienić, aby wykryć inne grupy estrów (np. Utrata 74 Da dla estrów propionowych) lub potencjalnie wykryć glikozylacje (np. Utrata 162 Da dla heksoz). Masy PrIS można również zmieniać. Na przykład, TA w obu próbkach Datura (r.t. = 12,5 min; patrz Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2) oznaczono jako norhyoscyjaminę lub norlitorynę (hioscyjamina/littoryna minus grupa N-metylowa tropanu) na podstawie fragmentów skanu jonów produktu DD (m/z 110 i 93) i dopasowano do widm literaturowych31 ; ta TA nie pojawiła się na żadnym z kanałów PrIS fragmentu tropanu. Dla tych dwóch mas można dodać kanał do wykrywania nortropanów. Fragment m/z 93 jest również obecny w większości monopodstawionych TAs17; Dodanie tego kanału może zapewnić dodatkowe potwierdzenie obecności monopodstawionej TA i pomóc w zmniejszeniu liczby wyników fałszywie dodatnich.

Oprócz możliwości adaptacji do różnych typów TA, jedną z głównych zalet tego protokołu (w porównaniu z istniejącymi metodami adnotacji alkaloidów) jest jego szybkość. W zależności od tego, jak skonfigurowana jest metoda MS (i zastosowany czas pracy HPLC), wszystkie dane MS/MS dla próbki można zebrać w ciągu 60-90 minut. Na przykład podczas naszych badań mono- i di-podstawione PrSIS TA były wbudowane w jedną metodę, tripodstawione PrIS TA były w innej metodzie, a NLS były w trzeciej (wszystkie metody zawierały skan jonów produktu DD), w sumie trzy wstrzyknięcia po trzydzieści minut każda. Pełna adnotacja próbki z wykorzystaniem połączonych danych MS/MS jest znacznie szybsza niż ręczne badanie każdego piku lub zbieranie indywidualnych skanów jonów produktu pod kątem wielu interesujących pików. Metoda ta może być wykonywana na dowolnym urządzeniu ze skanowaniem jonów produktu, trybami PrIS i NLS i może być używana do szybkiej oceny jakościowej (tj. czy TA są obecne, czy nie?), do rozróżniania lub "odcisków palców" różnych rodzajów roślin, gatunków, odmian lub odmian, organów lub etapów wzrostu oraz do porównywania obserwowanych TA z tymi zgłoszonymi (w ramach przepływu pracy dereplikacji). Jak wykazano, protokół może być również wykorzystywany do odkrywania nowych TA jako wskazówek do izolacji, oczyszczania lub testów biologicznych, a także do identyfikacji gatunków kandydujących i tkanek, od których należy je wyizolować. Metoda ta może być stosowana w dziedzinie produktów naturalnych i metabolomiki, w tym w celu pomocy w zrozumieniu biochemii roślin i do badań nad odkrywaniem leków na wczesnym etapie. Dodatkowe zastosowania można znaleźć w bezpieczeństwie żywności lub kryminalistyce (np. wykrywanie TA w żywności, suplementach lub płynach biologicznych).

Metoda ma kilka wad, które wymagają dyskusji. Po pierwsze, w zależności od użytego urządzenia i celu zastosowania protokołu, może być wymagana duża objętość wstrzyknięcia próbki, co może powodować problemy z wydajnością urządzenia i w niektórych przypadkach możliwość uzyskania wyników fałszywie dodatnich (jak opisano powyżej). Po drugie, metoda ta została opracowana na instrumencie QQQ o niskiej rozdzielczości, a wyniki fałszywie dodatnie mogą wynikać z niskiej rozdzielczości (np. cecha zawierająca fragment m/z 124 w kontroli ujemnej, która nie jest TA). Przyrząd o wyższej rozdzielczości zapewniłby lepszą zdolność diagnostyczną, a dokładne widma masowe MS / MS powinny być uzyskane dla każdego proponowanego nowego alkaloidu. Dodatkowymi wadami tej metody są po prostu wady analizy MS/MS jako całości. Chociaż MS/MS jest przydatny do proponowania struktur ("adnotacja" zgodnie z Inicjatywą Standardów Metabolomicznych32), nie zapewnia konkretnych przypisań łączności molekularnej ("identyfikacja"). Na przykład w obu próbkach Datury znaleźliśmy kilka izomerów m/z 306 TA, które wydawały się mieć zarówno fragmenty m/z 124, jak i m/z 140 (plik uzupełniający 2), co utrudnia ostateczne przypisanie wzorca podstawienia. Może to reprezentować jeszcze nieodkryty mechanizm fragmentacji, a inna technika (taka jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego) może być pomocna w rozwiązywaniu niejasności. Metody oparte na MS/MS często zmagają się z izomerią: ester kwasu fenylomlekowego littoryna (lub jej pochodne) jest trudny do odróżnienia od hioscyjaminy (ester kwasu tropikalnego), a inne rośliny psiankowate zawierają TA podstawione izomerycznymi grupami tigloyl, senecioyl i angeloilo33,34; W przypadku braku norm odróżnienie tych związków może być trudne, jeśli nie niemożliwe. Metoda nie pozwoli również na rozróżnienie enancjomerów (np. 3,6- vs. 3,7-dihydroksytropanu; numeracja znajduje się na rysunku 1) lub regioizomerów (np. rozróżnienie 3-acetylu od 7-acetylu bez wzorca). Przypisaliśmy większość monopodstawionych tropanów jako 3-podstawione na podstawie wcześniejszych wzorców zgłoszonych w rodzaju Datura i innych roślinach psiankowatych17,35. Ergo, wszelka wiedza biochemiczna lub literatura na temat badanego organizmu (jeśli jest dostępna) powinna być zawsze konsultowana wraz z jakąkolwiek analizą instrumentalną.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Grant Badawczy Wydziału (Northern Michigan University, przyznany M.A.C.), stypendium badawcze dla studentów (Northern Michigan University, przyznane J.C.) oraz Wydział Chemii. Autorzy pragną podziękować Johnowi Bergerowi (NMU) za pomoc w przygotowaniu tkanek roślinnych, Hannah Hawkins (NMU) za konserwację LC-MS i pomoc w rozwiązywaniu problemów, a także dr Ryanowi Fornwaldowi i jego studentom CH 495 (Synteza Produktów Naturalnych) za przygotowanie mieszanki acetylotropiny. Autorzy pragną również podziękować dr. Danielowi Jonesowi (Michigan State University) za uzyskanie widm MS/MS o wysokiej rozdzielczości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acetonitryl, Do UHPLC, nadaje się do spektrometrii masSigma-Aldrich900667HPLC
rozpuszczalnik Gaz argonAirGasAR UHP300CID Gaz
Kwas mrówkowy, 99% do analizyThermo ScientificAC270480010Dodatek HPLC
Uchwyt kolumny ochronnejRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58Kolumna HPLC
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Spektrometr masowy; uruchomiliśmy oprogramowanie LabSolutions, które jest standardem dla instrumentów Shimadzu
Ciekły azotAirGasNI 180LT22
Metanol, do HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400Do wytwarzania rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Mikrowirówka VWR2400-37
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Moździerz Fisher ScientificFB961CDo mielenia tkanek roślinnych
TłuczekFisher ScientificFB961MDo mielenia tkanek roślinnych
Pipeta 1000 mlGilson 
Końcówka do pipety 1000 mlFisher scientific02-707-404
Tkanki roślinneRóżne źródłaNie dotyczyMoże to być cokolwiek dzikiego lub uprawianego
Probówki stożkowe z polipropylenu, 15 mlFisher Scientific05-539-4
Chłodnica polistyrenowaULINES-18312Rodzaj chłodnic, w których wysyłane są odczynniki do biologii molekularnej, to odpowiedni
Roc C18 3 i mikro; m, 100 mm x 4,6 mmRestek9534315kolumna HPLC
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Kolumna ochronna
Wytrząsarka kołysanaThemo Scientific11-676-680
Wygodny zestaw fiolek z gwintem śrubowym (9 mm)Fisher scientific13-622-190Fiolki z automatycznym samplerem LCMS
Strzykawka, 3 mlFisher Scientific03-377-27
Filtr strzykawkowy 0,45 &mikro; m Avantor/VWR76479-008
Woda, do stosowania w chromatografii cieczowej i spektrometrii masJT Baker9831-03Do wytwarzania rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Roztwór wodny, zawiera 0,1% v/v kwasu mrówkowego, Do UHPLC, odpowiedni do spektrometrii masRozpuszczalnik Sigma-Aldrich900687-1LHPLC
F144059M

Bibliografia

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  3. Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796(2019).
  4. Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).
  5. Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , World Health Organization. Geneva. 24-28 (2023).
  6. Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
  7. Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
  8. Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
  9. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407(2022).
  10. Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
  11. Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. Prasain, J. , InTech. London. (2012).
  12. Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
  13. Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
  14. Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872(2017).
  15. Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
  16. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650(2022).
  17. Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629(2021).
  18. Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629(2023).
  19. Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683(2020).
  20. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157(2023).
  21. Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
  22. Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270(2022).
  23. Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
  24. Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329(2022).
  25. Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
  26. MassBank of North America. , Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024).
  27. Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
  28. Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
  29. Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
  30. Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
  31. Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
  32. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
  33. Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
  34. Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
  35. Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , Academic Press. New York, NY. (1993).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

LC MS MSskanowanie jon w prekursorowychskanowanie strat neutralnychskanowanie jon w produktowychDatura stramoniumDatura metel
Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.