Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szczurzy model zapalenia torebki po proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego z odbytem przy użyciu siarczanu dekstranu sodu

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66623

⸱

31 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę tworzenia szczurzego modelu zapalenia torebki. Model worka jelita krętego powstał poprzez wykonanie operacji zespolenia jelita krętego z odbytem (IPAA) z wykorzystaniem technik mikrochirurgicznych. Po operacji szczur był leczony 4% siarczanem dekstranu sodu (DSS) przez 4 dni.

Streszczenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) jest przewlekłą chorobą o podłożu immunologicznym, która atakuje całą okrężnicę i odbytnicę z przebiegiem nawracającym i remitteryjnym, powodując zachorowalność na całe życie. Kiedy leczenie jest nieskuteczne, zwłaszcza w przypadku masywnego krwawienia z przewodu pokarmowego, perforacji, toksycznej okrężnicy lub rakotwórczości, operacja staje się ostatnią linią obrony w leczeniu WZJG. Całkowita resekcja jelita grubego i zespolenie jelita krętego i odbytu (IPAA) dają największą szansę na długotrwałe leczenie. Zapalenie torebki jest najczęstszym i najbardziej kłopotliwym powikłaniem pooperacyjnym. W tym badaniu zastosowano mikrochirurgię do stworzenia modelu worka jelita krętego u szczurów doświadczalnych za pomocą operacji IPAA. Następnie ustala się trwały szczurzy model zapalenia torebki przez wywołanie zapalenia worka krętego za pomocą siarczanu dekstranu sodu (DSS). Pomyślne ustalenie zapalenia torebki szczura jest weryfikowane poprzez analizę pooperacyjnego stanu ogólnego, wagi, spożycia pokarmu i wody, danych dotyczących kału, a także patologii tkanki torebki, immunohistochemii i analizy czynników zapalnych. Ten eksperymentalny zwierzęcy model zapalenia torebki stanowi podstawę do badania patogenezy i leczenia tego schorzenia.

Wprowadzenie

Zapalenie torebki jest niespecyficznym stanem zapalnym, który wpływa na worek jelita krętego i jest powszechnym powikłaniem po całkowitej proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego i odbytu (IPAA) u osób z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (UC)1,2,3. Ten stan ma stosunkowo wysoki wskaźnik występowania do 50% i może powodować różne objawy kliniczne, w tym biegunkę, ból brzucha, utratę krwi w kale i gorączkę. Dokładna przyczyna zapalenia torebki pozostaje nieuchwytna, chociaż niektórzy badacze uważają, że zmiana flory torebki może wywołać aktywację immunologiczną i późniejsze stan zapalny4,5,6,7.

Ze względu na wyzwania związane z prowadzeniem badań klinicznych nad zapaleniem torebki, modele zwierzęce mogą służyć jako cenne narzędzia do badania leków i mechanizmów zapalenia torebki. Rosną obawy dotyczące tworzenia worków jelita krętego dla szczurów, z raportami wskazującymi na możliwe zapalenie8. Jednak badania w tej dziedzinie pozostają nieliczne ze względu na skomplikowany charakter procesu produkcyjnego, w którym brakuje jasnych wytycznych9,10. W 1998 roku Lichtman jako pierwszy ustalił model worka jelita krętego u szczurów Lewisa i szczurów Sprague-Dawley (SD), wykonując całkowitą kolektomię11. Zaobserwowali naciek makrofagów, owrzodzenie błony śluzowej i wzrost beztlenowej flory bakteryjnej w jelitach tych szczurów, co stanowi solidną podstawę do dalszych badań nad zapaleniem jelita krętego. Ten eksperymentalny model zapalenia woreczka szczura ściśle naśladuje objawy fizyczne i mechanizmy leżące u podstaw obserwowane w ludzkim zapaleniu torebki.

Powszechnie stosowane modele przedklinicznego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego obejmują modele DSS i TNBS. Indukujący substancję chemiczną kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS) zazwyczaj symuluje chorobę Leśniowskiego-Crohna12. Model DSS, szanowany ze względu na swoją skuteczność, profil bezpieczeństwa i przystępność cenową, jest często używany jako niezawodne narzędzie do indukcji WZJG ze względu na obserwowane oczywiste objawy. Biorąc pod uwagę kolonizację tkanki torebki, udało nam się wyindukować model zapalenia torebki za pomocą DSS13,14.

W obecnym badaniu, mikrochirurgia została wykorzystana do skutecznego stworzenia modelu worka jelita krętego u eksperymentalnych szczurów za pomocą operacji IPAA. Następnie ustalono model trwałego zapalenia woreczka szczura poprzez wywołanie zapalenia worka krętego za pomocą DSS. Precyzja podczas operacji jest niezbędna do pomyślnego tworzenia modelu, a opieka pooperacyjna jest również kluczowa. Model ten może być wykorzystany do zbadania patogenezy zapalenia torebki, oceny potencjalnych środków terapeutycznych i pogłębienia naszego zrozumienia tego złożonego schorzenia. Badanie usprawnia procedurę produkcji worków jelita krętego, skracając czas trwania operacji i zwiększając wydajność, tworząc w ten sposób solidne podstawy do podstawowych badań nad pooperacyjnymi zaburzeniami worków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami komisji etycznych Szpitala Ogólnego Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Do badania wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley w wieku od 9 do 12 tygodni, o wadze około 320-360 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Selekcja i utrzymanie zwierząt

  1. Wybierz zdrowe zwierzę (masa ciała ~220-240 g).
  2. Upewnij się, że spełniają kryteria poziomu wolnego od określonych patogenów (SPF)15 i są hodowane adaptacyjnie przez co najmniej 2 tygodnie w środowisku z odpowiednią wentylacją (8 do 12 wymian powietrza na godzinę), komfortową temperaturą (20-25 °C), odpowiednią wilgotnością (40%-70%), minimalnym hałasem (poniżej 70 decybeli) i naturalnym cyklem światła (12 godzin światła i 12 godzin ciemności).
  3. W tym okresie trzymaj je w standardowych, czystych klatkach o zagęszczeniu od trzech do pięciu na klatkę i zmieniaj ściółkę dwa razy w tygodniu. Zapewnij ad libitum dostęp do pożywienia i wody, a także standardowej paszy pielęgnacyjnej dla szczurów laboratoryjnych.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Wybierz zdrowego szczura o przybliżonej masie ciała od 320 g do 360 g. Pościć szczura przez 8-12 godzin przed operacją i zapewnić dostęp do roztworu soli fizjologicznej i 5% glukozy w stosunku 1:1 do dobrowolnego spożycia.
  2. Przygotuj autoklawowane narzędzia mikrochirurgiczne (przedoperacyjne moczenie w alkoholu przez 1 godzinę), mikroskop, stół sekcyjny dla szczurów, 8-0 niewchłanialny szew wysokocząsteczkowy, szew niewchłanialny 4-0, sterylna gaza, sterylne waciki bawełniane itp.

3. Ustanowienie modelu worka na jelito kręte szczura

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 1% roztwór sodu pentobarbitalu w dawce 6 ml/kg i naciekać nacinanie znieczulenia miejscowego 0,5% ropiwakainą w celu znieczulenia szczura. Utrzymuj szczura w komfortowej temperaturze podczas znieczulenia za pomocą lampy elektrycznej.
  2. Wykonaj całkowitą resekcję jelita grubego, wykonując poniższe czynności:
    1. Zabezpiecz szczura w pozycji grzbietowej na anatomicznej ławce zgodnie z zadowalającym protokołem znieczulenia. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Użyj maszynki do golenia, aby usunąć resztki włosów, i dwukrotnie nałóż roztwór jodoforu do sterylizacji w polu operacyjnym.
    2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości około 6 cm, aby przeciąć skórę, powięź z białą linią i otrzewną, zapewniając wejście do jamy brzusznej. Za pomocą retraktora odsłonić powierzchnię otrzewnej i przykryć ją sterylną gazą nasączoną solą bakteriostatyczną.
    3. Odizoluj przepływ naczyniowy końcowego jelita czczego, podwiąż jego pochodzenie za pomocą 8-0 zszyć nić, a następnie ją przeciąć. Ustaw kikut jelita ślepego, znajdujący się 1-2 cm od zastawki krętniczo-kątniczej, w spoczynku, a następnie odetnij go.
    4. Rozpocznij resekcję prawej półokrężnicy, podwiązując zachowawczo prawą półokrężnicę i środkową żyłę kolkową.
    5. Następnie należy oddzielić tętnicę krezkową dolną i wyizolować tętnicę odbytniczą dolną. Kontynuuj izolację w dół odbytnicy do odstępu równego dwóm centymetrom od krawędzi odbytu. Skośnie wyciąć dystalną część odbytnicy pod kątem około 45 stopni, aby uniknąć zwężenia pooperacyjnego.
  3. Wykonaj konstrukcję torby J.
    1. Za pomocą skalpela mikrotomowego oddzielić poprzeczny odcinek końcowego odcinka jelita krętego od jelita krezkowego, które powinno mierzyć około 6-7 cm.
    2. Złóż końcowe jelito kręte w kształcie litery J, aby utworzyć woreczek na jelito kręte. Wykonać zespolenie tylnej ściany za pomocą ściegu blokującego. Wzmocnij przednią ścianę za pomocą zmodyfikowanego ściegu Connella i zachowaj odpowiednie jelito, aby dopasować rozmiar przekroju poprzecznego dystalnego kikuta odbytnicy.
    3. Wzmocnij woreczek w kształcie litery J za pomocą 8-0 szwy w razie potrzeby. Długość woreczka J powinna mieścić się w przedziale od 2,5 cm do 3,5 cm.
  4. Wykonać zespolenie jelita krętego z workiem krętym, IPAA.
    1. Potwierdź brak skrętu w krezce i zszyj boczne ściany mrówki otworu torebki i boczną ścianę kikuta odbytnicy w odstępach za pomocą 8-0 nić do szycia dla trakcji.
    2. Ostatecznie nałóż pełnowarstwowy ciągły szew blokujący zarówno na przednią, jak i tylną ścianę.
    3. Sprawdź, czy nie ma aktywnego krwawienia i fizjologicznie oczyść jamę brzuszną zwykłą solą fizjologiczną. Sekwencyjnie zamknij powięź mięśni brzucha i skórę za pomocą szwów 4-0.
  5. Wykonaj postępowanie pooperacyjne.
    1. Podawać ketoprofen jako znieczulenie pooperacyjne (40 mg/kg, podskórnie) wszystkim szczurom po zamknięciu jamy brzusznej. Upewnij się, że szczur jest ogrzany za pomocą lampy elektrycznej, dopóki nie nastąpi przywrócenie.
    2. Ogranicz spożywanie pokarmu przez okres minimum 72 godzin po operacji, aby zmniejszyć ryzyko niedrożności jelit. Pozwól na dostęp do diety zawierającej 5% glukozy ad libitum, aby szybko uzupełnić energię i płyny ustrojowe oraz dostosuj częstotliwość karmienia zgodnie z wzorcami wypróżniania.
    3. Tydzień po zabiegu należy rozpocząć od ograniczonego odżywiania i stopniowo zwiększać spożywaną ilość. Następnie zapewnij szczurom regularną karmę dla gryzoni, aby mogły je swobodnie spożywać, jednocześnie prowadząc codzienną ewidencję ich spożycia z diety, spożycia wody i masy ciała.

4. Opracowanie modelu zapalenia jelita krętego u szczura za pomocą DSS

  1. Wykonaj grupowanie eksperymentalne.
    1. Losowo przypisz 12 szczurów, które przeszły całkowitą resekcję jelita grubego i operację IPAA, do grupy IPAA (grupa A, n = 6) i grupy zapalenia torebki (grupa B, n = 6).
    2. Przygotuj 4% roztwór DSS, dodając 4 g DSS do 100 ml czystej wody, świeżo przygotowanej codziennie.
    3. Podawać grupę IPAA i grupę z zapaleniem torebki z czystą wodą lub 4% DSS odpowiednio w 31. dnie pooperacyjnym do 35. dnia. Pozwól szczurom swobodnie pić i jeść karmę dla szczurów przez cztery kolejne dni po podaniu.
  2. Pobrać próbki z torebki.
    1. Rankiem 35 dnia po operacji należy znieczulić szczury dootrzewnowym wstrzyknięciem 1% pentobarbitalu roztworu sodu, podając dawkę 6 ml / kg (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    2. Przeciąć worek prostopadle od stomii worka do połączenia worków wejściowych i wyjściowych w każdej grupie. Pobrać próbkę torebki.
    3. Otwórz worek wzdłuż linii szwu przedniej ściany i przemyj kanał jelitowy solą fizjologiczną.
    4. Umieścić fragment tkanki torebki w probówce do mikrowirówki i niezwłocznie schłodzić w temperaturze -80 °C. Użyj tej części do wykrywania wskaźników stanu zapalnego ELISA. Utrwal pozostałą część torebki 10% formaldehydem w celu oceny histopatologicznej i barwienia immunohistochemicznego.
    5. Na koniec poddaj szczura eutanazji przez zator powietrzny w głębokim znieczuleniu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).

5. Analiza histologiczna

  1. Po pobraniu tkanki torebki od szczura zanurz ją w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny. Następnie postępuj zgodnie z protokołami odwadniania i osadzania. Wydziel przetworzoną tkankę do badania histologicznego16.
  2. Zastosuj barwienie hematoksyliną i eozyną, aby zidentyfikować różnice histopatologiczne między grupami. Zbadaj próbki pod mikroskopem i zrób zdjęcia do dokumentacji.

6. Test immunohistochemiczny

  1. Ostrożnie odwoskować i odwodnić skrawki tkanki. Następnie należy przeprowadzić pobieranie antygenu poprzez schłodzenie skrawków w roztworze cytrynianu sodu i zablokowanie ich surowicą blokującą na 20 minut.
  2. Następnie należy wystawić plastry na działanie pierwszorzędowego przeciwciała anty-okludynowego i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie należy je traktować przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut przed przeciwbarwieniem hematoksyliny16.
  3. Po wyschnięciu plastrów obserwuj je i fotografuj pod mikroskopem świetlnym.

7. Test ELISA

  1. 7.1 Zmielić i homogenizować fragmenty tkanek w buforze do lizy za pomocą sonikacji, aby zapewnić dokładną homogenizację. Wykorzystaj otrzymany supernatant do wykrywania.
  2. Przydziel studzienki na ślepe próby, próbki i kontrpróby na grupę. Określ stężenie białka, odczytując absorbancję przy 450 nm (wartość OD) i przeprowadzając analizę regresji liniowej16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólna ocena stanu zdrowia szczurów w modelu worka kątniczego po zabiegu
Po przejściu przez operatora okresu nauki techniki operacyjnej IPAA, szczury dobrze znosiły zabieg, który trwał średnio 192,94 min ± 27,15 min, a liczba powikłań pooperacyjnych była niewielka. W wczesnym okresie pooperacyjnym u szczurów zaobserwowano spadek spożycia pokarmu, jednak apetyt sprzed operacji powrócił w ciągu 10 do 14 dni po zabiegu. Aktywność we wczesnym okresie pooperacyjnym nieznacznie spadła; nie stwierdzono wyra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to przewlekłe zapalenie jelit charakteryzujące się nawracającym bólem w nadbrzuszu, biegunką i krwawym stolcem ze śluzu. Dotyczy przede wszystkim odbytnicy i może w różnym stopniu obejmować postępującą okrężnicę. Chirurgia odgrywa kluczową rolę w leczeniu WZJG 17,18,19. Odkąd Parks i wsp.20 wprowadzili w 1978 r. całkowitą kolektomię z zabiegiem zespolenia jelita ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezwodny etanolTianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., LtdChinyBarwienie hematoksyny-eozyny
Siarczan dekstranu Sód   Yeasen 60316ES76Służy do wywoływania zapalenia torebki
Roztwór formaldehyduTianjin Zhiyuan Reagent CompanyChinyGaza barwiąca hematoksynę i eozynę
Jiangxi Zhonggan Medical Equipment CompanyChinyUżywany do mikrochirurgii zwierząt
HematoxylinBeijing Zhongshan Jinqiao CompanyChinyBarwienie hematoksyny i eozyny
Interferon i gamma;   Zestaw odczynników do wykrywaniaklonów chmurSEA049RaWykrywanie czynników zapalnych
Zestaw do wykrywania interleukiny-10Klon chmurySEA056RaWykrywanie czynników zapalnych
Zestaw do wykrywania interleukiny-17Klon w chmurzeSEA063RaWykrywanie czynników zapalnych
Zestaw do wykrywania interleukiny-6Klon w chmurzeSEA079RaWykrywanie czynników zapalnych
IodophorTangpai Medical Equipment Co., LtdChinyUżywany do mikrochirurgii zwierząt
Mikroskopijne instrumenty manipulacyjneAesculapNiemcyUżywany do mikrochirurgii zwierząt
Occludinabcamab216327Testy immunohistochemiczne
Igła do szyciaYangzhou Fuda Medical Equipment Co., LtdChinyUżywany do mikrochirurgii zwierząt
czynnik martwicy nowotworu i alfa; Zestaw odczynników do wykrywaniaKlon chmurySEA133RaWykrywanie czynników zapalnych
Dwuosobowy dwuokularowy mikroskop chirurgicznyOPTONNiemcyUżywany do mikrochirurgii zwierząt
KsylenTianjin Yingda Fabryka rzadkich i cennych odczynnikówChinyBarwienie hematoksyną i eozyną

Bibliografia

  1. Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
  2. Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
  3. Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
  4. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  5. Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
  6. Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
  7. Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
  8. Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
  9. Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
  10. Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
  11. Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
  12. Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, Suppl 1 S61-S65 (2005).
  13. Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
  14. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  15. Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399(2019).
  16. Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291(2022).
  17. Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
  18. Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
  19. Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
  20. Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
  21. Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model pouchitis u szczurawrzodziejące zapalenie jelita grubegoeksperymentalny model zwierzęcypatogeneza pouchitistechnika mikrochirurgicznaanaliza czynników zapalnychimmunohistochemiaopieka pooperacyjna
Szczurzy model zapalenia torebki po proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego z odbytem przy użyciu siarczanu dekstranu sodu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.