Ten protokół opisuje metodę tworzenia szczurzego modelu zapalenia torebki. Model worka jelita krętego powstał poprzez wykonanie operacji zespolenia jelita krętego z odbytem (IPAA) z wykorzystaniem technik mikrochirurgicznych. Po operacji szczur był leczony 4% siarczanem dekstranu sodu (DSS) przez 4 dni.
Artykuł metodologiczny
Szczurzy model zapalenia torebki po proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego z odbytem przy użyciu siarczanu dekstranu sodu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) jest przewlekłą chorobą o podłożu immunologicznym, która atakuje całą okrężnicę i odbytnicę z przebiegiem nawracającym i remitteryjnym, powodując zachorowalność na całe życie. Kiedy leczenie jest nieskuteczne, zwłaszcza w przypadku masywnego krwawienia z przewodu pokarmowego, perforacji, toksycznej okrężnicy lub rakotwórczości, operacja staje się ostatnią linią obrony w leczeniu WZJG. Całkowita resekcja jelita grubego i zespolenie jelita krętego i odbytu (IPAA) dają największą szansę na długotrwałe leczenie. Zapalenie torebki jest najczęstszym i najbardziej kłopotliwym powikłaniem pooperacyjnym. W tym badaniu zastosowano mikrochirurgię do stworzenia modelu worka jelita krętego u szczurów doświadczalnych za pomocą operacji IPAA. Następnie ustala się trwały szczurzy model zapalenia torebki przez wywołanie zapalenia worka krętego za pomocą siarczanu dekstranu sodu (DSS). Pomyślne ustalenie zapalenia torebki szczura jest weryfikowane poprzez analizę pooperacyjnego stanu ogólnego, wagi, spożycia pokarmu i wody, danych dotyczących kału, a także patologii tkanki torebki, immunohistochemii i analizy czynników zapalnych. Ten eksperymentalny zwierzęcy model zapalenia torebki stanowi podstawę do badania patogenezy i leczenia tego schorzenia.
Wprowadzenie
Zapalenie torebki jest niespecyficznym stanem zapalnym, który wpływa na worek jelita krętego i jest powszechnym powikłaniem po całkowitej proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego i odbytu (IPAA) u osób z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (UC)1,2,3. Ten stan ma stosunkowo wysoki wskaźnik występowania do 50% i może powodować różne objawy kliniczne, w tym biegunkę, ból brzucha, utratę krwi w kale i gorączkę. Dokładna przyczyna zapalenia torebki pozostaje nieuchwytna, chociaż niektórzy badacze uważają, że zmiana flory torebki może wywołać aktywację immunologiczną i późniejsze stan zapalny4,5,6,7.
Ze względu na wyzwania związane z prowadzeniem badań klinicznych nad zapaleniem torebki, modele zwierzęce mogą służyć jako cenne narzędzia do badania leków i mechanizmów zapalenia torebki. Rosną obawy dotyczące tworzenia worków jelita krętego dla szczurów, z raportami wskazującymi na możliwe zapalenie8. Jednak badania w tej dziedzinie pozostają nieliczne ze względu na skomplikowany charakter procesu produkcyjnego, w którym brakuje jasnych wytycznych9,10. W 1998 roku Lichtman jako pierwszy ustalił model worka jelita krętego u szczurów Lewisa i szczurów Sprague-Dawley (SD), wykonując całkowitą kolektomię11. Zaobserwowali naciek makrofagów, owrzodzenie błony śluzowej i wzrost beztlenowej flory bakteryjnej w jelitach tych szczurów, co stanowi solidną podstawę do dalszych badań nad zapaleniem jelita krętego. Ten eksperymentalny model zapalenia woreczka szczura ściśle naśladuje objawy fizyczne i mechanizmy leżące u podstaw obserwowane w ludzkim zapaleniu torebki.
Powszechnie stosowane modele przedklinicznego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego obejmują modele DSS i TNBS. Indukujący substancję chemiczną kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS) zazwyczaj symuluje chorobę Leśniowskiego-Crohna12. Model DSS, szanowany ze względu na swoją skuteczność, profil bezpieczeństwa i przystępność cenową, jest często używany jako niezawodne narzędzie do indukcji WZJG ze względu na obserwowane oczywiste objawy. Biorąc pod uwagę kolonizację tkanki torebki, udało nam się wyindukować model zapalenia torebki za pomocą DSS13,14.
W obecnym badaniu, mikrochirurgia została wykorzystana do skutecznego stworzenia modelu worka jelita krętego u eksperymentalnych szczurów za pomocą operacji IPAA. Następnie ustalono model trwałego zapalenia woreczka szczura poprzez wywołanie zapalenia worka krętego za pomocą DSS. Precyzja podczas operacji jest niezbędna do pomyślnego tworzenia modelu, a opieka pooperacyjna jest również kluczowa. Model ten może być wykorzystany do zbadania patogenezy zapalenia torebki, oceny potencjalnych środków terapeutycznych i pogłębienia naszego zrozumienia tego złożonego schorzenia. Badanie usprawnia procedurę produkcji worków jelita krętego, skracając czas trwania operacji i zwiększając wydajność, tworząc w ten sposób solidne podstawy do podstawowych badań nad pooperacyjnymi zaburzeniami worków.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami komisji etycznych Szpitala Ogólnego Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Do badania wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley w wieku od 9 do 12 tygodni, o wadze około 320-360 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Selekcja i utrzymanie zwierząt
- Wybierz zdrowe zwierzę (masa ciała ~220-240 g).
- Upewnij się, że spełniają kryteria poziomu wolnego od określonych patogenów (SPF)15 i są hodowane adaptacyjnie przez co najmniej 2 tygodnie w środowisku z odpowiednią wentylacją (8 do 12 wymian powietrza na godzinę), komfortową temperaturą (20-25 °C), odpowiednią wilgotnością (40%-70%), minimalnym hałasem (poniżej 70 decybeli) i naturalnym cyklem światła (12 godzin światła i 12 godzin ciemności).
- W tym okresie trzymaj je w standardowych, czystych klatkach o zagęszczeniu od trzech do pięciu na klatkę i zmieniaj ściółkę dwa razy w tygodniu. Zapewnij ad libitum dostęp do pożywienia i wody, a także standardowej paszy pielęgnacyjnej dla szczurów laboratoryjnych.
2. Przygotowanie przedoperacyjne
- Wybierz zdrowego szczura o przybliżonej masie ciała od 320 g do 360 g. Pościć szczura przez 8-12 godzin przed operacją i zapewnić dostęp do roztworu soli fizjologicznej i 5% glukozy w stosunku 1:1 do dobrowolnego spożycia.
- Przygotuj autoklawowane narzędzia mikrochirurgiczne (przedoperacyjne moczenie w alkoholu przez 1 godzinę), mikroskop, stół sekcyjny dla szczurów, 8-0 niewchłanialny szew wysokocząsteczkowy, szew niewchłanialny 4-0, sterylna gaza, sterylne waciki bawełniane itp.
3. Ustanowienie modelu worka na jelito kręte szczura
- Wstrzyknąć dootrzewnowo 1% roztwór sodu pentobarbitalu w dawce 6 ml/kg i naciekać nacinanie znieczulenia miejscowego 0,5% ropiwakainą w celu znieczulenia szczura. Utrzymuj szczura w komfortowej temperaturze podczas znieczulenia za pomocą lampy elektrycznej.
- Wykonaj całkowitą resekcję jelita grubego, wykonując poniższe czynności:
- Zabezpiecz szczura w pozycji grzbietowej na anatomicznej ławce zgodnie z zadowalającym protokołem znieczulenia. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Użyj maszynki do golenia, aby usunąć resztki włosów, i dwukrotnie nałóż roztwór jodoforu do sterylizacji w polu operacyjnym.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości około 6 cm, aby przeciąć skórę, powięź z białą linią i otrzewną, zapewniając wejście do jamy brzusznej. Za pomocą retraktora odsłonić powierzchnię otrzewnej i przykryć ją sterylną gazą nasączoną solą bakteriostatyczną.
- Odizoluj przepływ naczyniowy końcowego jelita czczego, podwiąż jego pochodzenie za pomocą 8-0 zszyć nić, a następnie ją przeciąć. Ustaw kikut jelita ślepego, znajdujący się 1-2 cm od zastawki krętniczo-kątniczej, w spoczynku, a następnie odetnij go.
- Rozpocznij resekcję prawej półokrężnicy, podwiązując zachowawczo prawą półokrężnicę i środkową żyłę kolkową.
- Następnie należy oddzielić tętnicę krezkową dolną i wyizolować tętnicę odbytniczą dolną. Kontynuuj izolację w dół odbytnicy do odstępu równego dwóm centymetrom od krawędzi odbytu. Skośnie wyciąć dystalną część odbytnicy pod kątem około 45 stopni, aby uniknąć zwężenia pooperacyjnego.
- Wykonaj konstrukcję torby J.
- Za pomocą skalpela mikrotomowego oddzielić poprzeczny odcinek końcowego odcinka jelita krętego od jelita krezkowego, które powinno mierzyć około 6-7 cm.
- Złóż końcowe jelito kręte w kształcie litery J, aby utworzyć woreczek na jelito kręte. Wykonać zespolenie tylnej ściany za pomocą ściegu blokującego. Wzmocnij przednią ścianę za pomocą zmodyfikowanego ściegu Connella i zachowaj odpowiednie jelito, aby dopasować rozmiar przekroju poprzecznego dystalnego kikuta odbytnicy.
- Wzmocnij woreczek w kształcie litery J za pomocą 8-0 szwy w razie potrzeby. Długość woreczka J powinna mieścić się w przedziale od 2,5 cm do 3,5 cm.
- Wykonać zespolenie jelita krętego z workiem krętym, IPAA.
- Potwierdź brak skrętu w krezce i zszyj boczne ściany mrówki otworu torebki i boczną ścianę kikuta odbytnicy w odstępach za pomocą 8-0 nić do szycia dla trakcji.
- Ostatecznie nałóż pełnowarstwowy ciągły szew blokujący zarówno na przednią, jak i tylną ścianę.
- Sprawdź, czy nie ma aktywnego krwawienia i fizjologicznie oczyść jamę brzuszną zwykłą solą fizjologiczną. Sekwencyjnie zamknij powięź mięśni brzucha i skórę za pomocą szwów 4-0.
- Wykonaj postępowanie pooperacyjne.
- Podawać ketoprofen jako znieczulenie pooperacyjne (40 mg/kg, podskórnie) wszystkim szczurom po zamknięciu jamy brzusznej. Upewnij się, że szczur jest ogrzany za pomocą lampy elektrycznej, dopóki nie nastąpi przywrócenie.
- Ogranicz spożywanie pokarmu przez okres minimum 72 godzin po operacji, aby zmniejszyć ryzyko niedrożności jelit. Pozwól na dostęp do diety zawierającej 5% glukozy ad libitum, aby szybko uzupełnić energię i płyny ustrojowe oraz dostosuj częstotliwość karmienia zgodnie z wzorcami wypróżniania.
- Tydzień po zabiegu należy rozpocząć od ograniczonego odżywiania i stopniowo zwiększać spożywaną ilość. Następnie zapewnij szczurom regularną karmę dla gryzoni, aby mogły je swobodnie spożywać, jednocześnie prowadząc codzienną ewidencję ich spożycia z diety, spożycia wody i masy ciała.
4. Opracowanie modelu zapalenia jelita krętego u szczura za pomocą DSS
- Wykonaj grupowanie eksperymentalne.
- Losowo przypisz 12 szczurów, które przeszły całkowitą resekcję jelita grubego i operację IPAA, do grupy IPAA (grupa A, n = 6) i grupy zapalenia torebki (grupa B, n = 6).
- Przygotuj 4% roztwór DSS, dodając 4 g DSS do 100 ml czystej wody, świeżo przygotowanej codziennie.
- Podawać grupę IPAA i grupę z zapaleniem torebki z czystą wodą lub 4% DSS odpowiednio w 31. dnie pooperacyjnym do 35. dnia. Pozwól szczurom swobodnie pić i jeść karmę dla szczurów przez cztery kolejne dni po podaniu.
- Pobrać próbki z torebki.
- Rankiem 35 dnia po operacji należy znieczulić szczury dootrzewnowym wstrzyknięciem 1% pentobarbitalu roztworu sodu, podając dawkę 6 ml / kg (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
- Przeciąć worek prostopadle od stomii worka do połączenia worków wejściowych i wyjściowych w każdej grupie. Pobrać próbkę torebki.
- Otwórz worek wzdłuż linii szwu przedniej ściany i przemyj kanał jelitowy solą fizjologiczną.
- Umieścić fragment tkanki torebki w probówce do mikrowirówki i niezwłocznie schłodzić w temperaturze -80 °C. Użyj tej części do wykrywania wskaźników stanu zapalnego ELISA. Utrwal pozostałą część torebki 10% formaldehydem w celu oceny histopatologicznej i barwienia immunohistochemicznego.
- Na koniec poddaj szczura eutanazji przez zator powietrzny w głębokim znieczuleniu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
5. Analiza histologiczna
- Po pobraniu tkanki torebki od szczura zanurz ją w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny. Następnie postępuj zgodnie z protokołami odwadniania i osadzania. Wydziel przetworzoną tkankę do badania histologicznego16.
- Zastosuj barwienie hematoksyliną i eozyną, aby zidentyfikować różnice histopatologiczne między grupami. Zbadaj próbki pod mikroskopem i zrób zdjęcia do dokumentacji.
6. Test immunohistochemiczny
- Ostrożnie odwoskować i odwodnić skrawki tkanki. Następnie należy przeprowadzić pobieranie antygenu poprzez schłodzenie skrawków w roztworze cytrynianu sodu i zablokowanie ich surowicą blokującą na 20 minut.
- Następnie należy wystawić plastry na działanie pierwszorzędowego przeciwciała anty-okludynowego i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie należy je traktować przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut przed przeciwbarwieniem hematoksyliny16.
- Po wyschnięciu plastrów obserwuj je i fotografuj pod mikroskopem świetlnym.
7. Test ELISA
- 7.1 Zmielić i homogenizować fragmenty tkanek w buforze do lizy za pomocą sonikacji, aby zapewnić dokładną homogenizację. Wykorzystaj otrzymany supernatant do wykrywania.
- Przydziel studzienki na ślepe próby, próbki i kontrpróby na grupę. Określ stężenie białka, odczytując absorbancję przy 450 nm (wartość OD) i przeprowadzając analizę regresji liniowej16.
Wyniki
Ogólna ocena stanu zdrowia szczurów w modelu worka kątniczego po zabiegu
Po przejściu przez operatora okresu nauki techniki operacyjnej IPAA, szczury dobrze znosiły zabieg, który trwał średnio 192,94 min ± 27,15 min, a liczba powikłań pooperacyjnych była niewielka. W wczesnym okresie pooperacyjnym u szczurów zaobserwowano spadek spożycia pokarmu, jednak apetyt sprzed operacji powrócił w ciągu 10 do 14 dni po zabiegu. Aktywność we wczesnym okresie pooperacyjnym nieznacznie spadła; nie stwierdzono wyraźnych wydzielin z oczu i nosa. Utrata masy ciała przed i po operacji wyniosła 21,17 g ± 1,59 g. Początkowa masa ciała po operacji wykazywała tendencję spadkową, z maksymalną redukcją wynoszącą 69,58 g ± 33,19 g. Stabilny wzrost masy ciała rozpoczął się w 8,25 dniu ± 2,53 dnia po operacji, a do 31st dnia po zabiegu masa ta przekroczyła o 9,35% ± 4,7% wagę odnotowaną w dniu po operacji. Szczury były w stanie wypróżniać się w ciągu 24 h po operacji; stolce były luźne, ale bez domieszki krwi. Formowanie się stolców miękkich nastąpiło między 9th a 12th dniem po operacji.
Kompensacyjny wzrost worka kątniczego
W 35tym dniu po operacji, w znieczuleniu, otwarto jamę brzuszną szczura, co ujawniło silne zrosty między workiem kątniczym a jamą miedniczną. Po ostrożnym oddzieleniu zrostów między workiem a otaczającymi go tkankami zaobserwowano kompensacyjne powiększenie worka kątniczego, pogrubienie ściany jelita oraz lekkie rozszerzenie dystalnego odcinka jelita cienkiego (Rycina 1). Długość worka kątniczego w momencie operacji wynosiła 2,89 cm ± 0,28 cm, natomiast w 35tym dniu po zabiegu wynosiła 3,86 cm ± 0,87 cm, co wykazało istotną statystycznie różnicę (P = 0,000). Powierzchnia błony śluzowej (cm2) worka kątniczego była również istotnie zwiększona w porównaniu z pomiarem śródoperacyjnym (6,46 ± 0,85 vs. 17,02 ± 4,61, P = 0,000). Nie stwierdzono istotnej różnicy między grupą IPAA a grupą z zapaleniem worka kątniczego (P > 0,05).
Ocena stanu ogólnego i ocena kału u szczurów z zapaleniem torby jelitowej
W dniu 31.st dzień po operacji grupie z zapaleniem zbiornika jelitowego (pouchitis) podano DSS. Na początku podawania zarówno grupa IPAA, jak i grupa z zapaleniem zbiornika jelitowego miały taką samą masę ciała (352,00 g ± 30,03 g vs 352,00 g ± 25,92 g, P = 1) i generalnie znajdowały się w dobrym stanie. Jednakże w grupie z zapaleniem worka kątniczego zmniejszyła się ilość spożywanego pokarmu i wody, co doprowadziło do zmęczenia psychicznego, utraty blasku sierści, wydzieliny z oczu i nosa oraz zmniejszonej mobilności; w grupie IPAA nie zaobserwowano istotnych zmian. W 35.th dzień po operacji masa ciała grupy z zapaleniem zbiornika jelitowego była istotnie niższa niż w grupie IPAA (322,83 g ± 29,24 g kontra364,83 g ± 30,13 g, P = 0.028) (Rysunek 2).
W grupie z zapaleniem worka kątniczego wystąpiła znaczna biegunka w pierwszym dniu po podaniu DSS, a w drugim dniu po podaniu DSS odnotowano obecność śluzu, ropy i krwi w stolcu (Rycina 3). W 35tym dniu po operacji wyniki oceny stolca11 w grupie IPAA oraz w grupie z zapaleniem worka kątniczego wynosiły odpowiednio (4,33 ± 0,82 vs. 2,17 ± 0,75, P = 0,001). Szczury z grupy IPAA miały czysty i wolny od zanieczyszczeń odbyt, natomiast u szczurów z zapaleniem worka kątniczego stwierdzono obrzęk odbytu z towarzyszącym przywieraniem śluzu, ropy i krwi ze stolca.
Zmiany histopatologiczne w zbiorniku jelitowym
Makroskopowa obserwacja preparatów zbiornika z jelita krętego
W grupie IPAA ściana jelita krętego w obrębie zbiornika uległa pogrubieniu, nie zaobserwowano natomiast nadżerek, owrzodzeń ani punktów krwawienia. W grupie z zapaleniem zbiornika z jelita krętego naczynia krwionośne w krezce zbiornika uległy pogrubieniu, a błona śluzowa zbiornika była rozlegle lub miejscowo zapalona, z widocznymi nadżerkami, owrzodzeniami i punktami krwawienia, którym w niektórych przypadkach towarzyszyło znaczne poszerzenie dystalnego odcinka jelita cienkiego (Rycina 4).
Obserwacja mikroskopowa tkanki zbiornika kątniczego
W grupie szczurów IPAA wierzchołki niektórych kosmków jelitowych w tkance zbiornika uległy stępieniu, czemu towarzyszyła niewielka infiltracja neutrofili, a sporadycznie na powierzchni śluzówki obserwowano niewielką ilość wysięku.
W przeciwieństwie do tego, układ kosmków jelitowych w tkance worka końcowego jelita krętego u szczurów w grupie z zapaleniem worka końcowego jelita krętego był niezwykle zaburzony. Niektóre kosmki jelitowe były nieobecne, a widoczne były rozległe nadżerki i liczne owrzodzenia plamiste, które nie obejmowały warstwy mięśniowej. Towarzyszyła temu liczna infiltracja neutrofili i limfocytów, nadmierny wysięk oraz widoczne zapalenie krypt. Wynik patologiczny tkanki worka końcowego jelita krętego w grupie z zapaleniem worka końcowego był znacząco wyższy niż w grupie IPAA, przy czym zaobserwowano istotną różnicę statystyczną (8,50 ± 1,76 vs. 1,33 ± 0,52, P = 0,000) (Rycina 5).
Poziom ekspresji białka funkcjonalnego bariery jelitowej okludyny
Okludyna, ważne białko funkcjonalne bariery jelitowej, jest eksponowana na błonie komórkowej tkanki worka kątniczego u szczurów zarówno w grupie IPAA, jak i w grupie z zapaleniem worka kątniczego11. Jednakże poziom ekspresji białka okludyny w grupie z zapaleniem worka kątniczego był istotnie niższy niż w grupie IPAA (0.25 ± 0.03 vs. 0.15 ± 0.02, P = 0.000) (Rycina 6).
Wykrywanie czynników zapalnych w worku kątniczym
Poziomy ekspresji IL-6, IL-17, TNF-α oraz INF-γ w tkance worka kątniczego szczurów w grupie z zapaleniem worka kątniczego były znacznie wyższe niż w grupie IPAA (co określono za pomocą testu ELISA16). Odwrotnie, w przypadku IL-10 odnotowano przeciwstawne wyniki z istotnymi różnicami statystycznymi (P = 0.000) (Tabela 1).
Rycina 1: Stan zbiornika z jelita krętego. Strzałka wskazuje zbiornik z jelita krętego (A) w momencie operacji oraz (B) kompensacyjne powiększenie zbiornika z jelita krętego w 35tym dniu po operacji (podczas pobierania próbek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Trend zmian masy ciała szczurów po zabiegu IPAA. Słupek błędu odnosi się do odchylenia standardowego, n = 6 w każdej grupie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Zdjęcie odchodów szczura. (A) Grupa IPAA. (B) Grupa z zapaleniem workowatego jelita krętego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Obserwacja makroskopowa preparatów zbiornika jelitowego. (A) Grupa IPAA. (B) Grupa z zapaleniem zbiornika jelitowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Zmiany patologiczne w tkance workowatej części jelita krętego szczura. (A) grupa IPAA. (B) grupa z zapaleniem workowatej części jelita krętego. Paski skali: 60 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Detekcja immunohistochemiczna ekspresji białka okludyny w tkance zbiornika jelita krętego szczura. (A) Grupa IPAA. (B) Grupa z zapaleniem zbiornika jelita krętego. Paski skali: 60 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Grupa | n | IL-6 | IL-10 | IL-17 | TNF-α | IFN-γ |
| grupa IPAA | 6 | 2.60 ± 0.36 | 5.81 ± 0.66 | 17.48 ± 4.81 | 86.94 ± 24.06 | 4.08 ± 0.56 |
| Grupa z zapaleniem zbiornika | 6 | 6.94 ± 1.18 | 2.77 ± 0.60 | 34.82 ± 2.41 | 213.00 ± 26.11 | 9.67 ± 1.70 |
| P | 0 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
Tabela 1: Poziom ekspresji czynników zapalnych w tkance workowatej jelita krętego szczura (pg/mL).
Dyskusja
Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to przewlekłe zapalenie jelit charakteryzujące się nawracającym bólem w nadbrzuszu, biegunką i krwawym stolcem ze śluzu. Dotyczy przede wszystkim odbytnicy i może w różnym stopniu obejmować postępującą okrężnicę. Chirurgia odgrywa kluczową rolę w leczeniu WZJG 17,18,19. Odkąd Parks i wsp.20 wprowadzili w 1978 r. całkowitą kolektomię z zabiegiem zespolenia jelita krętego i odbytu (IPAA) w celu usunięcia zmienionej tkanki i przywrócenia ciągłości jelit, operacja ta stała się międzynarodowym standardem chirurgicznego leczenia WZJG. Zaburzenia zapalne worka są najczęstszymi powikłaniami po operacji IPAA.
Ze względu na wyzwania związane z prowadzeniem badań klinicznych nad zapaleniem torebki, modele zwierzęce zostały wykorzystane jako eksperymenty uzupełniające do badania leków i mechanizmów związanych z zapaleniem torebki. W 1998 roku Lichtman i wsp.11 opracowali model szczurzy polegający na całkowitym usunięciu jelita grubego i ponownym połączeniu torebki z odbytnicą. Model ten wykazywał oznaki stanu zapalnego, takie jak naciek komórek jednojądrzastych, wysięk świetlny, owrzodzenie błony śluzowej i zapalenie błony surowiczej w ciągu czterech tygodni po operacji. Poziom stanu zapalnego był skorelowany ze zwiększoną liczbą bakterii w woreczku i można było zaobserwować wyraźną podatność genetyczną gospodarza. W 2002 roku Shebani i wsp.21 z powodzeniem skonstruowali chirurgiczny model szczura IPAA za pomocą SDD, który skutecznie indukował zapalenie torebki. Model ten potwierdził skuteczność wykorzystania zwierząt do badania patogenezy zapalenia torebki i zapewnił solidną platformę doświadczalną dla podstawowych badań nad zapaleniem torebki. Zidentyfikowali również podobne wzorce obfitego wzrostu bakterii zarówno w rezerwuarach ludzi, jak i gryzoni, potwierdzając ich przydatność w badaniu zaburzeń równowagi bakteryjnej jelit i identyfikacji potencjalnych patogenów związanych z zapaleniem torebki.
Dzięki wcześniejszemu doświadczeniu w karmieniu myszy i modelowaniu operacji IPAA, możliwe jest skrócenie krzywej uczenia się do około dziesięciu przedmiotów. Krytycznym krokiem w tym procesie jest budowa i zespolenie worka J. Biorąc pod uwagę, że przewód pokarmowy myszy jest stosunkowo smukły, 8-0 Do szwów użyto szwu. Ciągłe szwy blokujące i ścieg Connela były oddzielnie stosowane do szwów tylnej ściany i przedniej ściany worka. Podczas zespolenia worka i kanału odbytu utworzenie nachylonej powierzchni może skutecznie zmniejszyć zwężenie w miejscu zespolenia, biorąc za przykład kikut odbytnicy. Początkowo założenie dwóch szwów z każdej strony miejsca zespolenia, a następnie przystąpienie do ciągłych szwów blokujących w celu zszycia ścian tylnych i przednich indywidualnie zapewnia integralność zespolenia i skraca czas operacji.
Postępowanie pooperacyjne również odgrywa kluczową rolę w skutecznym modelowaniu. 72-godzinny okres postu po operacji może skutecznie zmniejszyć występowanie niedrożności jelit. Z drugiej strony, wczesna, umiarkowana dieta płynna może zapewnić myszom zapotrzebowanie na składniki odżywcze i płyny. Po opanowaniu krzywej uczenia się chirurdzy mogą osiągnąć bardziej wydajny i stały wskaźnik sukcesu w tworzeniu modelu.
Niniejsze badanie opiera się na tych podstawach i dzięki wstępnym badaniom i udoskonaleniom z powodzeniem ustanowiono model worka krętego szczura przy użyciu mikrochirurgii. Model ten został następnie wykorzystany do zbadania stanu zapalenia torebki i wskaźników bariery jelitowej. Wyniki wykazały, że szczury wykazywały znaczące objawy, takie jak krwawy stolec, biegunka i utrata masy ciała po ekspozycji na DSS. Doprowadziło to do obrzęku i nadżerki błony śluzowej torebki, stanu zapalnego wskazanego w ocenie histopatologicznej oraz zwiększonego poziomu czynników prozapalnych, w tym interleukiny-6 (IL-6), IL-17, czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i interferonu gamma (INF-γ), wraz ze zmniejszonym poziomem czynnika przeciwzapalnego interleukiny-10 (IL-10). Ponadto zmniejszyła się ekspresja białka okludyny wskaźnika bariery jelitowej. Odkrycia te są zgodne z wcześniejszymi badaniami11 i potwierdzają pomyślne ustanowienie modelu zapalenia torebki u szczura, zapewniając solidną platformę dla późniejszych badań nad lekami i mechanizmami.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bezwodny etanol | Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd | Chiny | Barwienie hematoksyny-eozyny |
| Siarczan dekstranu Sód | Yeasen | 60316ES76 | Służy do wywoływania zapalenia torebki |
| Roztwór formaldehydu | Tianjin Zhiyuan Reagent Company | Chiny | Gaza barwiąca hematoksynę i eozynę |
| Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company | Chiny | Używany do mikrochirurgii zwierząt | |
| Hematoxylin | Beijing Zhongshan Jinqiao Company | Chiny | Barwienie hematoksyny i eozyny |
| Interferon i gamma; Zestaw odczynników do wykrywania | klonów chmur | SEA049Ra | Wykrywanie czynników zapalnych |
| Zestaw do wykrywania interleukiny-10 | Klon chmury | SEA056Ra | Wykrywanie czynników zapalnych |
| Zestaw do wykrywania interleukiny-17 | Klon w chmurze | SEA063Ra | Wykrywanie czynników zapalnych |
| Zestaw do wykrywania interleukiny-6 | Klon w chmurze | SEA079Ra | Wykrywanie czynników zapalnych |
| Iodophor | Tangpai Medical Equipment Co., Ltd | Chiny | Używany do mikrochirurgii zwierząt |
| Mikroskopijne instrumenty manipulacyjne | Aesculap | Niemcy | Używany do mikrochirurgii zwierząt |
| Occludin | abcam | ab216327 | Testy immunohistochemiczne |
| Igła do szycia | Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd | Chiny | Używany do mikrochirurgii zwierząt |
| czynnik martwicy nowotworu i alfa; Zestaw odczynników do wykrywania | Klon chmury | SEA133Ra | Wykrywanie czynników zapalnych |
| Dwuosobowy dwuokularowy mikroskop chirurgiczny | OPTON | Niemcy | Używany do mikrochirurgii zwierząt |
| Ksylen | Tianjin Yingda Fabryka rzadkich i cennych odczynników | Chiny | Barwienie hematoksyną i eozyną |
Bibliografia
- Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
- Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
- Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
- Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
- Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
- Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
- Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
- Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
- Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
- Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
- Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
- Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, Suppl 1 S61-S65 (2005).
- Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
- Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
- Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399(2019).
- Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291(2022).
- Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
- Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
- Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).
Przedruki i uprawnienia
