Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66627

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Groningen

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Streszczenie

Prezentujemy metodę włączania do pęcherzyków złożonych sieci białkowych, obejmujących integralne białka błonowe, enzymy i czujniki oparte na fluorescencji, przy użyciu oczyszczonych składników. Metoda ta jest istotna dla projektowania i budowy bioreaktorów oraz badania złożonych sieci reakcji metabolicznych w nierównowadze. Zaczynamy od odtworzenia (wielu) białek błonowych w duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) zgodnie z wcześniej opracowanym protokołem. Następnie kapsułkujemy mieszaninę oczyszczonych enzymów, metabolitów i czujników opartych na fluorescencji (białek fluorescencyjnych lub barwników) poprzez wytłaczanie przez zamrażanie, rozmrażanie i usuwanie niewłączonych składników za pomocą wirowania i / lub chromatografii wykluczającej rozmiar. Wydajność sieci metabolicznych jest mierzona w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie stosunku ATP/ADP, stężenia metabolitów, wewnętrznego pH lub innych parametrów za pomocą odczytu fluorescencji. Nasze pęcherzyki błonowe zawierające białka o średnicy 100-400 nm można przekształcić w pęcherzyki gigantyczno-jednowarstwowe (GUV), przy użyciu istniejących, ale zoptymalizowanych procedur. Podejście to umożliwia włączenie rozpuszczalnych składników (enzymów, metabolitów, czujników) do pęcherzyków o rozmiarach mikrometrów, zwiększając w ten sposób objętość bioreaktorów o rzędy wielkości. Sieć metaboliczna zawierająca GUV jest uwięziona w urządzeniach mikroprzepływowych w celu analizy za pomocą mikroskopii optycznej.

Wprowadzenie

Dziedzina syntetycznej biologii oddolnej (bottom-up) koncentruje się na konstruowaniu (minimalnych) komórek1,2 oraz metabolicznych bioreaktorów do celów biotechnologicznych3,4 lub biomedycznych5,6,7,8. Konstrukcja syntetycznych komórek dostarcza unikalnej platformy, która pozwala badaczom na studiowanie białek (błonowych) w ściśle określonych warunkach naśladujących środowiska natywne, co umożliwia odkrywanie właściwości emergentnych oraz ukrytych funkcji biochemicznych białek i sieci reakcji9. Jako krok pośredni w kierunku autonomicznie funkcjonującej komórki syntetycznej, opracowywane są moduły odwzorowujące kluczowe cechy żywych komórek, takie jak metaboliczna konserwacja energii, synteza białek i lipidów oraz homeostaza. Takie moduły nie tylko poszerzają naszą wiedzę o życiu, ale mają również potencjalne zastosowania w medycynie8 i biotechnologii10.

Białka transbłonowe stanowią centrum niemal każdej sieci metabolicznej, ponieważ transportują cząsteczki do wnętrza komórki lub na zewnątrz, przekazują sygnały, reagują na jakość środowiska oraz pełnią liczne role biosyntetyczne. W związku z tym inżynieria modułów metabolicznych w komórkach syntetycznych wymaga w większości przypadków rekonstytucji integralnych i/lub peryferyjnych białek błonowych w dwuwarstwie lipidowej składającej się ze specyficznych lipidów i charakteryzującej się wysoką integralnością (niską przepuszczalnością). Praca z tymi białkami błonowymi jest trudna i wymaga specjalistycznej wiedzy oraz umiejętności eksperymentalnych.

Opracowano wiele metod rekonstytucji białek błonowych w pęcherzykach fosfolipidowych, najczęściej w celu zbadania funkcji11,12, regulacji13, właściwości kinetycznych14,15, zależności od lipidów15,16 i/lub stabilności17 konkretnego białka. Metody te obejmują szybkie rozcieńczanie białka solubilizowanego detergentem w środowisku wodnym w obecności lipidów18, usuwanie detergentów poprzez inkubację białka solubilizowanego detergentem z pęcherzykami lipidowymi destabilizowanymi detergentem i absorpcję detergentów na kuleczkach polistyrenowych19 lub usuwanie detergentów za pomocą dializy lub chromatografii wykluczania cząsteczkowego20. Do tworzenia pęcherzyków lipidowych stosowano rozpuszczalniki organiczne, na przykład poprzez tworzenie międzyfaz olej-woda21, jednak większość integralnych białek błonowych ulega inaktywacji po wystawieniu na działanie takich rozpuszczalników.

W naszym laboratorium białka błonowe rekonstruujemy głównie metodą absorpcji detergentu w celu utworzenia dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUVs)19. Metoda ta pozwala na jednoczesną rekonstrukcję wielu białek błonowych oraz enkapsulację enzymów, metabolitów i sond w świetle pęcherzyka22,23. LUVs zawierające białka błonowe mogą zostać przekształcone w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs), z enkapsulacją lub bez enkapsulacji komponentów rozpuszczalnych w wodzie, wykorzystując elektroformowanie24 lub pęcznienie wspomagane żelem25 przy zastosowaniu specyficznych warunków w celu zachowania integralności białek błonowych26.

Niniejsza praca przedstawia protokół rekonstrukcji w LUV pozarównowagowej sieci metabolicznej, która regeneruje ATP poprzez rozkład L-argininy do L-ornityny27. Tworzenie ATP jest sprzężone z produkcją glicerolo-3-fosforanu (G3P), który stanowi istotny budulec dla syntezy fosfolipidów22,28. Ścieżka metaboliczna składa się z dwóch białek integralnych błony: antyportera argininy/ornityny (ArcD) oraz antyportera G3P/Pi (GlpT). Ponadto do recyklingu ATP wymagane są trzy enzymy rozpuszczalne (ArcA, ArcB, ArcC), a GlpK jest wykorzystywany do przekształcania glicerolu w glicerolo-3-fosforan przy użyciu ATP pochodzącego z rozkładu L-argininy; schematyczny przegląd tej ścieżki przedstawiono na Ryc. 1. Protokół ten stanowi dobry punkt wyjścia do przyszłej konstrukcji jeszcze bardziej złożonych sieci reakcji – służących do syntezy lipidów lub białek bądź do podziału komórek. Skład lipidowy pęcherzyków wspiera aktywność szerokiej gamy białek integralnych błony i został zoptymalizowany pod kątem transportu różnorodnych cząsteczek do wnętrza lub na zewnątrz pęcherzyków27,29,30.

figure-introduction-1
Rycina 1: Przegląd ścieżki produkcji ATP oraz syntezy i wydzielania glicerolu 3-fosforanu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Krótko mówiąc, oczyszczone białka błonowe (solubilizowane w dodecyl-β-D-maltosydzie, DDM) dodaje się do wcześniej przygotowanych pęcherzyków lipidowych, które zostały zdestabilizowane Tritonem X-100, co umożliwia wbudowanie białek w błonę. Następnie cząsteczki detergentu są (powoli) usuwane poprzez dodanie aktywowanych kulek polistyrenowych, co prowadzi do powstania szczelnych proteoliposomów. Do pęcherzyków można następnie dodać komponenty rozpuszczalne i enkapsulować je za pomocą cykli zamrażania i rozmrażania, co więzi cząsteczki w procesie fuzji błon. Uzyskane pęcherzyki są wysoce heterogeniczne i wiele z nich jest wielowarstwowych. Są one następnie przeciskane przez filtr poliwęglanowy o rozmiarze porów 400, 200 lub 100 nm, co pozwala uzyskać pęcherzyki o bardziej jednolitym rozmiarze; im mniejszy rozmiar porów, tym pęcherzyki są bardziej jednorodne i jednowarstwowe, jednak odbywa się to kosztem mniejszej objętości wewnętrznej. Białka nie wbudowane oraz małe cząsteczki są usuwane z roztworu zewnętrznego za pomocą chromatografii wykluczania rozmiaru. ProteoLUV można przekształcić w pęcherzyki o rozmiarach mikrometrycznych poprzez pęcznienie wspomagane żelem, a tak otrzymane proteoGUV są następnie zbierane i uwięzione w chipie mikrofluidycznym w celu charakterystyki mikroskopowej i manipulacji. Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd pełnego protokołu.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Przegląd protokołu rekonstytucji białek błonowych oraz enkapsulacji enzymów i komponentów rozpuszczalnych w wodzie w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach submikrometrycznych (LUVs) i mikrometrycznych (GUVs). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokoły rekonstytucji i enkapsulacji działają sprawnie, a funkcjonalność białek zostaje zachowana, jednak proteoLUV i proteoGUV są niejednorodne pod względem rozmiaru. Podejścia mikrofluidyczne31,32 umożliwiają tworzenie pęcherzyków o rozmiarach mikrometrycznych, które są bardziej jednorodne, lecz funkcjonalna rekonstytucja białek błonowych jest zazwyczaj niemożliwa, ponieważ pozostałości rozpuszczalnika w dwuwarstwie inaktywują białka. Rozmiar proteoLUV mieści się w zakresie od 100 do 400 nm, a przy niskich stężeniach enzymów enkapsulacja może prowadzić do powstania pęcherzyków z niekompletnymi szlakami metabolicznymi (efekty stochastyczne; patrz Rycina 3). LUV są idealne do konstruowania specyficznych modułów metabolicznych, co pokazano tutaj na przykładzie produkcji ATP oraz bloków budulcowych, takich jak G3P. Takie proteoLUV mogą potencjalnie zostać zamknięte w GUV i służyć jako przedziały przypominające organelle dla pęcherzyków gospodarzy.

figure-introduction-3
Rysunek 3: Liczba cząsteczek na pęcherzyk o średnicy 100, 200 lub 400 nm. (A) Gdy inkapsulowane białka (enzymy, sondy) znajdują się w zakresie 1-10 µM. (B) Rekonstytucję przeprowadzono przy stosunku białek błonowych do lipidów wynoszącym 1:1 000, 1:10 000 i 1:100 000 (mol/mol). Przyjmujemy założenie, że cząsteczki są inkapsulowane w indicated stężeniach i włączane do błony w tych stosunkach białko-lipid. W przypadku niektórych enzymów zaobserwowaliśmy, że wiążą się one z błonami, co może zwiększyć ich pozorne stężenie w pęcherzykach. Skrót: LPR = Lipid-Protein-Ratio (stosunek lipidów do białek) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie ogólne

  1. Odczynniki chemiczne
    1. Rozpuścić lipidy (w formie proszku) do stężenia 25 mg/mL w CHCl33 do przygotowania liposomów wstępnie sformowanych.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżych zapasów lipidów, jednak roztwory stokowe można również przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Praca z lipidami w formie proszku jest bardziej precyzyjna niż stosowanie lipidów uprzednio rozpuszczonych w CHCl33CHCl₃3 należy przenosić za pomocą pipet szklanych i/lub strzykawek i przechowywać w naczyniach szklanych, ponieważ CHCl33 rozpuszcza tworzywa sztuczne.
    2. Rozpuścić małe cząsteczki (nukleotydy, aminokwasy, sondy fluorescencyjne) do procedury enkapsulacji w 50 mM KPi (bufor A, patrz Tabela 1) i dostosować pH do wartości 7,00 ± 0.01. Rozpuścić MgCl22 w wodzie dejonizowanej, aby uniknąć tworzenia się osadów fosforanu magnezu.
      UWAGA: Roztwory zapasowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni, z wyjątkiem DTT, który jest przygotowywany na świeżo w dniu eksperymentu.
    3. Rozpuścić jonofory (np. walinomycynę, nigerycynę) w DMSO lub EtOH do stężenia zapasu 100-500 µMPrzechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni; należy zapobiegać odparowywaniu.
      UWAGA: DMSO nie jest lotny, dlatego jest preferowany nad EtOH. Należy używać fiolek szklanych zamiast plastikowych, aby uniknąć przylegania jonoforów do powierzchni fiolek.
  2. Bufory
    1. Przygotuj świeże bufory w dniu przeprowadzenia eksperymentu (Tabela 1). Nie przechowywać dłużej niż przez 24 h.
  3. Oczyszczanie białek rozpuszczalnych
    1. Ekspresować ArcA, ArcB, ArcC (stosujemy specyficzny wariant o nazwie ArcC1), PercevalHR oraz GlpK zgodnie z wcześniejszym opisem27,28,33Należy dodać 10% v/v glicerolu do buforu do lizy komórek, co zwiększa stabilność białek. Białka rozpuszczalne należy oczyścić zgodnie z opisem27,28,33 o czym krótko wspomniano poniżej.
    2. Rozmrozić 10 ml lizatu komórkowego (ok. 5 g masy mokrej) w łaźni lodowo-wodnej. W międzyczasie nanieść 2 ml (1 CV) Ni2+- żywicę Sepharose do kolumny do przepływu grawitacyjnego (pojemność 20 ml) wodą dejonizowaną (12 objętości kolumny) i buforem B (4 objętości kolumny), aby przemyć. Przenieść rozmrożony lizat na lód; wszystkie kolejne czynności wykonywać w warunkach chłodniczych (na lodzie), chyba że wskazano inaczej.
    3. Do rozmrożonego lizatu należy dodać imidazol do stężenia końcowego 10 mM, a następnie przelać roztwór na kolumnę do filtracji grawitacyjnej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy delikatnym nutowaniu.
    4. Po 1 h odrzuć frakcję przepływową i wypłucz żywicę Buforem C (20 CV).
    5. Eluuj białko za pomocą buforu D. W pierwszym etapie elucji użyj 60% CV, a następnie wykonaj 4–6 kroków po 40% CV.
    6. Należy oznaczyć stężenie białka i dodać Na-EDTA do stężenia końcowego 5 mM.
    7. Odwiruj oczyszczone białko w chłodzonej wirówce nakładkowej (prędkość maksymalna, 10 minut, 4 °C). Oczyścić metodą chromatografii wykluczania za pomocą buforu E. Połączyć frakcje elucyjne i zagęścić je do stężenia ok. 10 mg/mL, używając filtra zagęszczającego o odcięciu 30 kDa. Przygotować aliquoty o odpowiedniej wielkości (ok. 20 µL), zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
      UWAGA: Ważne jest, aby skoncentrować enzymy do poziomu 50-100 µM aby zminimalizować objętość potrzebną do enkapsulacji.
  4. Oczyszczanie białek błonowych
    1. Przeprowadzić nadekspresję ArcD i GlpT zgodnie z wcześniejszym opisem22,27,33Należy upewnić się, że do buforu do lizy komórek dodano 10% v/v glicerolu; do oczyszczania ArcD, do buforu należy dodać 2 mM środka redukującego (np. DTT). Oczyść białka z tagiem powinowactwa za pomocą Ni2+-Chromatografia na Sepharosie.
      1. Rozmrozić alikwot surowych pęcherzyków błonowych (10–20 mg całkowitego białka błonowego) w kąpieli lodowo-wodnej.
        UWAGA: Po rozmrożeniu należy zawsze pracować w lodzie, chyba że wskazano inaczej. Patrz Tabela 1 dla buforów użytych w tej sekcji.
      2. Dodać pęcherzyki błonowe do buforu F (ArcD) lub buforu G (GlpT) do uzyskania objętości końcowej 6 ml. Inkubować próbkę przez 1 h w temperaturze 4 °C przy łagodnym wytrząsaniu z nutacją.
      3. Oddziel rozpuszczone białka błonowe od pozostałości błonowych za pomocą ultrawirowania (337 000 × g, 30 min, 4 °C). W tym czasie nanieś 0,25 ml (1 CV) Ni2+-żywicę Sepharose na kolumnę do chromatografii grawitacyjnej (pojemność 10 ml) wodą dejonizowaną (40 CV) i 20 CV buforu H (ArcD) lub buforu I (GlpT).
      4. Przenieś rozpuszczone białko na kolumnę do filtracji grawitacyjnej i dodaj imidazol do stężenia końcowego 10 mM. Inkubuj przez 1 h w temperaturze 4 °C przy łagodnej nutacji.
      5. Po 1 h odrzuć frakcję przepływową i przemyj żywicę 20 objętościami kolumny (CV) buforu J (ArcD) lub buforu K (GlpT).
      6. Eluuj białko błonowe w 60% CV (1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) oraz 40% CV (2nd-6th) etapy z użyciem buforu L (ArcD) lub buforu M (GlpT).
      7. Należy określić stężenie białka, a następnie przejść do sekcji 2.2. w celu rekonstytucji błon.
        ​UWAGA: Oczyszczanie za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczek nie jest konieczne w przypadku białek błonowych, ponieważ rekonstytucja w błonach zapewnia podobny stopień oczyszczenia. Kroki 1.4 i 2.2 można przeprowadzić w ciągu jednego dnia pracy. Należy rozpocząć od oczyszczania białka (krok 1.4) rano, a następnie kontynuować rekonstytucję (krok 2.2) po południu. Rekonstytucja kończy się następnego dnia (szczegóły w sekcji 2.2). PUNKT ZATRZYMANIA: Oczyszczone i solubilizowane w DDM białka ArcD i GlpT można przechowywać w temperaturze -80°C. oC do późniejszego użycia, jednak nie dotyczy to wszystkich białek błonowych. Przygotować alikwoty o odpowiedniej wielkości (50-200 µL), zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia. Białka te pozostają aktywne przez kilka miesięcy podczas przechowywania w temperaturze -80 °C w obecności 10% v/v glicerolu.
  5. Przygotowanie β-kazeina do celów pasywacji
    1. Resuspender 100 mg β-kazeinę w 20 ml wody dejonizowanej i miareczkować 1 M NaOH, aż do β-kazeina jest całkowicie rozpuszczona. Następnie należy dodać 1 M kwas octowy w celu dostosowania pH do wartości 7,0 i uzupełnić objętość do 50 mL wodą dejonizowaną. Roztwór należy przefiltrować przez 0.2 µm przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego i przygotować alikwoty 500 µL.
      UWAGA βKazeinę można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. Zaleca się przefiltrowanie β-kazeinę przed użyciem, aby uniknąć β-agregaty kazeiny przed zapchaniem układu mikrofluidycznego.

Bufor Skład
Bufor A 50 mM KPi pH 7,0
Bufor B50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolu, 10 mM imidazolu, pH 7,5 
Bufor C50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolu, 50 mM imidazolu, pH 7,5
Bufor D50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolu, 500 mM imidazolu, pH 7,5
Bufor E50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolu, pH 7,0
Bufor F50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5% w/v DDM, 10% v/v glicerolu, 2 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5
Bufor G50 mM Tris-HCl, 0,5% w/v DDM, 20% v/v glicerolu, pH 8
Bufor H50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02% (m/v) DDM, 10% (v/v) glicerolu, 2 mM β-merkaptoetanol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Bufor I50 mM Tris-HCl, 0,04% m/v DDM, 20% v/v glicerolu, 10 mM imidazolu, pH 8,0
Bufor J50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% m/v DDM, 10% v/v glicerolu, 2 mM β-merkaptoetanol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Bufor K50 mM Tris-HCl, 0,04% m/v DDM, 20% v/v glicerolu, 50 mM imidazolu, pH 8
Bufor L50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% m/v DDM, 10% v/v glicerolu, 2 mM β-merkaptoetanol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Bufor M50 mM Tris-HCl, 0,04% m/v DDM, 20% v/v glicerolu, 500 mM imidazolu, pH 8
Bufor N50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Bufor O50 mM KPi, 0,5 mM L-ornityny, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl22, 2 mM DTT, pH 7,0
Bufor P50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glukozy (x jest zmienne w celu dopasowania osmolarności do zewnętrznego i wewnętrznego medium)
Bufor Q50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM sacharozy, 2 mM DTT
Bufor R50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginina, x mM glukoza

Tabela 1: Bufory wykorzystane w tym protokole.

2. Proteoliposomy: rekonstytucja oczyszczonych białek błonowych w preformowanych pęcherzykach lipidowych

  1. Dzień 1
    1. Przygotowanie preformowanych pęcherzyków lipidowych
      1. Wybierz skład lipidowy (np. syntetyczne fosfolipidy, lipidy polarne E. coli) na podstawie wymagań białek błonowych.
        UWAGA: Mieszanina DOPE, DOPG i DOPC (25:25:50 mol%) jest dobrym punktem wyjścia, jednak w przypadku niektórych białek mogą być wymagane sterole lub kardiolipina; dla białek błony plazmatycznej drożdży stosujemy lipidy palmitylo-oleojlowe zamiast dioleojlowych30. Mieszanina DOPE, DOPG i DOPC (25:25:50 mol%) jest wystarczająca do rekonstytucji ArcD i GlpT.
      2. Wymieszaj wybrane lipidy (rozpuszczone w CHCl3) i odparuj CHCl3 w rotacyjnym odparowywaczu, aż utworzy się film lipidowy. Przemyj lipidy, dodając eter dietylowy w objętości równej objętości CHCl3. Odparuj eter dietylowy, aby uzyskać suchy film lipidowy.
      3. Resuspenduj film lipidowy do stężenia 20 mg/mL całkowitych lipidów w medium wodnym (Bufor A). Zacznij od połowy całkowitej objętości i delikatnie wstrząśnij; następnie ostrożnie przenieś lipidy do czystej probówki lub butelki o odpowiedniej wielkości. Dodaj świeży Bufor A do kolby i powtórz procedurę, aby rozpuścić pozostałe lipidy i przenieść je do nowego naczynia. Dodaj dodatkowy Bufor A, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mg/mL.
      4. Sonicuj resuspendowane lipidy za pomocą sonikatora wypustkowego. Dla końcówki sonikatora o średnicy 6 mm zastosuj następujące parametry: intensywność 4 µm, amplituda 70%, 5 s włączony, 45 s wyłączony, 16 cykli. Zanurz lipidy w łaźni lodowo-wodnej z dodatkiem EtOH, aby uniknąć przegrzania podczas sonikacji.
      5. Szybko zamroź sonikowaną próbkę (objętość 40 mL w probówce wirówkowej 50 mL) w ciekłym azocie, a następnie rozmroź ją w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej. Powtórz czynność raz; następnie podziel liposomy na porcje o pożądanych objętościach (np. 1 mL lub 20 mg całkowitych lipidów w plastikowej probówce 1,5 mL).
        ​PUNKT ZATRZYMANIA: Procedurę można przerwać w tym miejscu. Szybko zamroź każdą porcję jeszcze raz (trzeci cykl) i przechowuj w ciekłym azocie do kilku miesięcy. Pamiętaj o dwukrotnym przebiciu zakrętek probówek igłą, aby uniknąć ich eksplozji podczas gwałtownego wrzenia ciekłego azotu.
  2. Dzień 2
    1. Rekonstytucja oczyszczonych białek błonowych w preformowanych liposomach
      1. Rozmroź jedną porcję liposomów (20 mg całkowitych lipidów) w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj ekstruder, aplikując wybrany filtr (np. poliwęglanowy o średnicy porów 400 nm); wstępnie zrównoważ ekstruder Buforem A; załaduj rozmrożone liposomy („mleczny roztwór”) do ekstrudera i przepuść je 13x przez filtr. Zbierz ekstrudowane liposomy (obecnie duże pęcherzyki jednowarstwowe; „mętny roztwór”) do szklanego lub plastikowego naczynia o odpowiedniej wielkości (np. 15 mL). Rozcieńcz liposomy do stężenia 4 mg/mL Buforem A  z dodatkiem 2 mM DTT.
      2. Przenieś 1 mL liposomów o stężeniu 4 mg/mL do przezroczystej kuwety 1 mL. W spektrofotometrze zmierz początkową gęstość optyczną przy 540 nm. Wlej zmierzoną próbkę z powrotem i dodaj do liposomów 50 µL 10% v/v Triton X-100.
        UWAGA: Objętość miareczkująca 50 µL 10% Triton-X100 jest odpowiednia dla 20 mg lipidów w objętości 5 mL; dodanie Triton X-100 rozcieńczy lipidy o ok. 5%. Dostosuj objętość miareczkowania przy pracy z różnymi ilościami liposomów. Aby uzyskać stabilne sygnały gęstości optycznej, miareczkuj liposomy Triton X-100 w temperaturze pokojowej.
      3. Powtórz krok 2.2.1.2 i odnotuj moment osiągnięcia maksymalnej gęstości optycznej (Rsat). Kontynuuj miareczkowanie, aż gęstość optyczna osiągnie około 60% Rsat (Rycina 4). Wlej destabilizowane detergentem pęcherzyki z powrotem do szklanej/plastikowej probówki (objętość końcowa wynosi teraz około 5,2 mL), przenieś próbkę na lód i poczekaj, aż ostygnie.
      4. Dodaj oczyszczone białko(białka) błonowe do destabilizowanych liposomów, aby osiągnąć pożądany stosunek lipidów do białka (w/w). Stosuj stosunek od 400:1 do 100:1 w/w; ponieważ zarówno ArcD, jak i GlpT mają masę cząsteczkową ok. 55 kDa, stosunek lipidów do białka 400:1 w/w odpowiada ok. 30 000 lipidów na białko oraz ok. 50 cząsteczek ArcD i GlpT każda na pęcherzyk o średnicy 400 nm.
        UWAGA: Tutaj stosujemy 400:1 w/w, co odpowiada 50 µg każdego białka na 20 mg lipidów.
      5. Mieszaj próbki na mieszadle nutacyjnym w 4 °C przez 15 min, aby umożliwić wbudowanie białek błonowych w destabilizowaną błonę liposomalną.
      6. Aby usunąć detergent, dodaj 200 mg suchych kulek polistyrenowych, przygotowanych zgodnie z instrukcją producenta. Mieszaj na mieszadle nutacyjnym w 4 °C przez kolejne 15 min.
        UWAGA: Ilość 200 mg suchych kulek jest odpowiednia dla 20 mg lipidów, ale należy ją dostosować przy użyciu innej wielkości próbki.
      7. Powtórz krok 2.2.1.6 dwa razy, aby łącznie dodać kulki polistyrenowe trzy razy. Następnie inkubuj przez noc w 4 °C przy delikatnym mieszaniu nutacyjnym.
  3. Dzień 3
    1. Powtórz krok 2.2.1.6; tym razem jednak mieszaj w 4 °C przez 1 h.
    2. Umieść pustą kolumnę do filtracji grawitacyjnej (pojemność 10 mL) nad pustą probówką do ultrawirowania 6,5 mL na lodzie. Wlej próbkę do kolumny i zbierz proteoliposomy do probówki do ultrawirowania (kulki zostaną zatrzymane w kolumnie).
    3. Przemyj kulki 0,5 mL Buforu A z dodatkiem 2 mM DTT i zbierz filtrat do probówki do ultrawirowania.
    4. Skoncentruj proteoliposomy za pomocą ultrawirowania (337 000 × g, 30 min, 4 oC). Resuspenduj proteoliposomy w całkowitej objętości 200 µL (100 mg lipidów/mL) w Buforze A z dodatkiem 2 mM DTT; objętość osadu pęcherzyków po wirowaniu wynosi ok. 40 do 120 µL27. Podziel na porcje o pożądanej wielkości (np. trzy porcje po 6,66 mg całkowitych lipidów).
      UWAGA: Wielkość porcji jest dowolna, ale wpłynie na wielkość osadu w późniejszych krokach (patrz krok 3.2.3.1). PUNKT ZATRZYMANIA: Procedurę można tutaj przerwać. Szybko zamroź każdą porcję i przechowuj w ciekłym azocie do kilku tygodni. Pamiętaj o dwukrotnym przebiciu zakrętek probówek igłą, aby uniknąć ich eksplozji podczas gwałtownego wrzenia ciekłego azotu.

figure-protocol-1
Rysunek 4: Miareczkowanie wcześniej przygotowanych liposomów Tritonem X-100. Liposomy o stężeniu lipidów 5 mg/mL są przeciskane przez filtr poliwęglanowy (400 nm) w 50 mM KPi (pH 7.0), a następnie miareczkowane Tritonem X-100 (krok protokołu 2.2.1.2). Mętność pęcherzyków jest mierzona przy A540. Strzałka wskazuje stężenie Tritonu X-100, przy którym pęcherzyki są wystarczająco zdestabilizowane, aby umożliwić spontaniczną insercję białek błonowych, jak opisano w19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Enkapsulacja sieci metabolicznej do recyklingu ATP i syntezy glicerolu 3-P w pęcherzykach o rozmiarze submikronowym

  1. Dzień 1
    1. Mieszanie składników
      1. W przypadku standardowej enkapsulacji należy zastosować 66.6 µL proteoliposomów w końcowej objętości wynoszącej 200 µL (33,33 mg/ml całkowitej zawartości lipidów). Oblicz objętość każdego składnika (enzymu, kofaktora) niezbędną do osiągnięcia pożądanego stężenia, dodaj te składniki do proteoliposomów, a następnie uzupełnij objętość do 200 µL z buforem A (Tabela 2).
        UWAGA: Stężenie białka można dostosować w zależności od układu doświadczalnego. Należy jednak zadbać o to, aby kilka kopii (>10) każdego enzymu znajduje się średnio w pęcherzyku, aby uniknąć niepożądanych efektów stochastycznych. Stężenia > 1 µM są zazwyczaj bezpieczne; 1 µM w pęcherzyku o średnicy 400 nm odpowiada to około 20 kopiom (Rycina 3).
      2. Pipetuj bufor A do pustej probówki 1,5 ml, a następnie dodaj DTT, Na-ADP oraz MgCl22, L-ornityny (oraz pyraniny, jeśli jest wymagana do wewnętrznych pomiarów pH). Następnie należy dodać enzymy i delikatnie wymieszać. Roztwór należy nanieść na uprzednio przygotowane proteoliposomy i krótko wymieszać w wirówce typu vortex z niską prędkością.
        UWAGA: Ważne jest, aby dodać Na-ADP przed MgCl22 aby uniknąć niepożądanego tworzenia się osadów fosforanu magnezu. W celu prawidłowego wymieszania lepki roztworu konieczne jest użycie wstrząsarki vortex, należy jednak zminimalizować czas i prędkość mieszania, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia białek. PercevalHR i pyranina nie mogą być współinkapsulowane ze względu na nakładanie się ich widm.
    2. Oznaczanie osmolalności wewnątrzkomórkowej
      1. Przygotuj 50 µL roztwór opisany w kroku 3.1.1.1, ale bez proteoliposomów, a następnie zmierzyć osmolalność za pomocą osmometru krzepnięcia.
      2. Przygotować krzywą kalibracyjną, wykorzystując bufor (50 mM KPi pH 7,0) oraz zmienne stężenia soli (np. NaCl lub KCl) lub cukru. Wyznaczyć stężenie osmolitu odpowiadające osmolalności wewnętrznej (bufor N).
        UWAGA: Składników przenikalnych przez błonę (np. glicerolu) nie można stosować do dopasowania osmolalności wewnętrznej. W przypadku białek solubilizowanych w buforze zawierającym glicerol (np. Bufor E), należy użyć tego samego buforu, ale bez glicerolu. Osmolity wybrany do przygotowania izoosmotycznego buforu zewnętrznego powinien być nieprzenikalny przez błonę i nie zakłócać sieci metabolicznej.
    3. Zamrażanie i odmrażanie
      1. Szybko zamrozić (w ciekłym azocie) proteoliposomy wraz z komponentami rozpuszczalnymi, a następnie rozmrozić w łaźni wodno-lodowej w temperaturze około 10 °C.
      2. Powtórz krok 3.1.3.1 łącznie 5 razy.
        PUNKT ZATRZYMANIA: Na tym etapie procedurę można przerwać. Należy pominąć ostatni etap rozmrażania i przechowywać zamrożoną próbkę w ciekłym azocie przez 1–3 dni. Należy pamiętać o dwukrotnym przekłucie nakrętek probówek igłą, aby uniknąć ich rozsadzenia w wyniku gwałtownego wrzenia ciekłego azotu. Przechowywanie w ciekłym azocie jest preferowane nad -80 °C aby zminimalizować utlenianie lipidów.
  2. Dzień 2
    1. Ekstruzja
      UWAGA: Wszystkie etapy wytłaczania należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, w przeciwnym razie szczelne strzykawki mogą przeciekać.
      1. Przygotować ekstruder, zakładając wybrany filtr (np. poliwęglanowy o średnicy porów 400 nm). Przepłukać ekstruder roztworem zawierającym ten sam bufor i metabolity, które zostały użyte do enkapsulacji pęcherzyków (np. bufor O z dodatkiem 0,1 mM pyraniny).
        UWAGA: Do ładowania proteoliposomów pyraniną należy używać osobnego ekstrudera, ponieważ barwnik przylega do powierzchni urządzenia, co może prowadzić do zanieczyszczenia kolejnych próbek.
      2. Należy wprowadzić mieszaninę do enkapsulacji do ekstrudera i przepuścić ją przez filtr 13 razy. Wytłoczone rozwiązanie należy zebrać do probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Chromatografia wykluczania cząsteczkowego (opcjonalnie)
      UWAGA: Krok ten wykonuje się w celu usunięcia cząsteczek zewnętrznych, takich jak barwniki (np. pyranina), za pomocą chromatografii wykluczania. Jeśli w układzie nie ma barwników, a inne składniki nie wywierają wpływu przy niskich stężeniach (należy zauważyć, że pęcherzyki są następnie przemywane za pomocą ultrawirowania), krok 3.2.2 można pominąć.
      1. Rehydratować żywicę Sephadex G-75 i przelać ją do szklanej kolumny (o długości 22 cm i szerokości 1,5 cm). Równoważyć żywicę nadmiarem buforu zewnętrznego (np.., Bufor N).
      2. Załaduj ekstrudowane proteoliposomy z kroku 3.2.1.2 na uprzednio ekwilibrowaną kolumnę do chromatografii wykluczania i zastosuj przepływ buforu zewnętrznego grawitacyjnie. Odrzuć objętość martwą (około 7 ml), a następnie pobierz dziesięć alikwotów po 1 ml. Alikwoty zawierające proteoliposomy zidentyfikuj poprzez krótką ekspozycję na lampę UV. Połącz frakcje zawierające większość proteoliposomów (2–4 ml).
    3. Przemywanie i resuspensja
      1. Przemyj wyciskanymi proteoliposomami za pomocą ultrawirowania. Napełnij probówkę do ultrawirowania o pojemności 6,5 ml 5,8 ml Buforu N, a następnie nanieś na wierzch wyciskaną próbkę. Jeśli przeprowadzono chromatografię wykluczania cząsteczkowego, napełnij probówkę połączonymi frakcjami elucji (2–4 ml) i dodaj Bufor N do uzyskania końcowej objętości 6 ml.
      2. Wirować przy 337 000 g × g, 30 min, 4 °COdrzuć nadsącz i dokładnie osusz probówkę do ultrawirówki za pomocą bezpyłowej chusteczki, uważając, aby nie dotknąć osadu. Resuspenduj osad w niewielkiej objętości buforu N (200 µL). Gdy osad zostanie całkowicie resuspensowany, należy dopełnić probówkę Buforem N do objętości 6 mL.
        UWAGA: resuspensja osadu wymaga czasu i powinna być przeprowadzona ostrożnie.
      3. Powtórzyć kroki 3.2.3.1-3.2.3.2 dwukrotnie, aby w sumie przeprowadzić trzy przemycia, chyba że stosowana jest chromatografia wykluczania (w takim przypadku wystarczy jeden etap wirowania). Ostatecznie resuspender osad do pożądanego stężenia (np. 5,55 mg/ml całkowitej zawartości lipidów), dodając odpowiednią objętość buforu N.
        ​ETAP PRZERWANIA: Proteoliposomy można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4°C ow temperaturze C przez co najmniej 48 h. Rozmiar probówek do ultrawirowania należy dobrać w zależności od wielkości próbki. Dla osadu zawierającego 6,66 mg lipidów całkowitych odpowiednia jest probówka o pojemności 6,5 ml. Przemywanie 200 µL proteoliposomów (łącznie 33,33 mg lipidów/ml; objętość suchego osadu ~40 µL)28 przy zastosowaniu 3 x 6 ml buforu, składniki zewnętrzne są rozcieńczane stukrotnie w każdym etapie płukania. W przypadku użycia probówek o innych rozmiarach zaleca się odpowiednie dostosowanie liczby płukań.
  3. Dzień 3
    1. Detekcja syntezy ATP metodą fluorescencji
      1. Wymieszać składniki reakcji do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 120 µL (Tabela 3) w czarnej kuwecie kwarcowej z okienkiem o wymiarach 3 x 5 mm i minimalną objętością wewnętrzną wynoszącą 100 µL.
        UWAGA: W celu rozproszenia elektrochemicznych gradientów jonowych można dodać jonofory. Mieszaninę walinomycyny i nigerycyny (1 µM (każdy) skutecznie znosi wszelkie gradienty protonowe i potasowe.
      2. Podgrzej wstępnie próbkę w fluorometrze ustawionym na 30 °C oraz zarejestrować widma wzbudzenia PercevalHR (wzbudzenie 400–520 nm, szerokość pasma 5 nm; emisja 550 nm, szerokość pasma 5 nm). Po ustabilizowaniu się sygnału sondy należy uruchomić sieć metaboliczną poprzez dodanie nadmiaru L-argininy (5–10 mM) oraz glicerolu (400 µM), gdy recykling ATP jest sprzężony z syntezą glicerolu 3-fosforanu. Monitoruj przebieg reakcji w czasie.
    2. Analiza danych
      1. Wykreśl stosunek F500/F430 w funkcji czasu, co stanowi jakościowy wskaźnik stosunku ATP/ADP. Aby uzyskać bardziej ilościową ocenę powstawania ATP, należy sporządzić krzywą kalibracyjną w proteoliposomach lub zastosować metodę komplementarną (np. ilościowe oznaczenie ATP metodą chemiluminescencji28).
KomponentStężenie końcowe
Bufor A50 mM KPi pH 7,0
DTT2 mM
Na-ADP 10 mM
MgCl₂210 mM
L-ornityna 0,5 mM
Sonda fluorescencyjna (PercevalHR lub pyranina)5.8 µM lub odpowiednio 0,1 mM
ArcA (argininowa deiminaza)1 µM
ArcB (Karbamoiloornitynotransferaza)2 µM
ArcC1 (Karbaminian kinaza)5 µM
GlpK (kinaza glicerolu)1.6 µM
Proteoliposomy33,33 mg/mL całkowitych lipidów

Tabela 2: Składniki enkapsulacji. Składniki wymieniono w kolejności dodawania. Białka rozpuszczalne znajdują się w Buforze E; wszystkie pozostałe składniki (z wyjątkiem MgCl2, w wodzie dejonizowanej) znajdują się w Buforze A.

KomponentStężenie końcowe
Bufor K 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Proteoliposomy (5,55 mg/ml lipidów)2,7 mg/ml lipidów
Jonofory (walinomycyna, nigerycyna)1 µM każdy

Tabela 3: Warunki eksperymentalne. Składniki wymieniono w kolejności dodawania. Proteoliposomy znajdują się w Buforze N, a jonofory w DMSO lub EtOH.

4. Skalowanie sieci metabolicznej dla pęcherzyków o rozmiarach mikrometrycznych

  1. Dzień 1
    1. Przygotowanie chipa mikroprzepływowego
      ​UWAGA: W tym doświadczeniu wykorzystano urządzenie mikroprzepływowe opracowane przez zespół Robinsona i wsp.34Dostępne są również inne konstrukcje chipów mikrofluidycznych.35,36,37 i mogą zostać łatwo wprowadzone do niniejszego protokołu.
      1. Odetnij 200 µL odciąć końcówkę pipety w jednej trzeciej wysokości od dołu i wprowadzić dolną część końcówki do gotowego urządzenia mikrofluidycznego do wychwytywania.
      2. Do zbiornika wlotowego chipa należy dodać 400 µL z β-roztwór kazeiny (2 mg/mL; patrz krok 1.5), dbając o to, aby na tym etapie do układu nie dostało się powietrze. Umieść koszyczek do płytek 96-dołkowych oraz chusteczkę laboratoryjną w wirówce stołowej z probówkami stożkowymi. Umieść chip na chusteczce i wiruj przez 6 min przy 900 × g aby umożliwić pasywację chipa mikrofluidycznego. Po etapie wirowania poziom cieczy powinien być taki sam w zbiorniku wlotowym i w końcówce wylotowej chipa mikrofluidycznego; należy sprawdzić, czy chip nie przecieka. Inkubować β-roztwór kazeiny w chipie mikrofluidycznym przez co najmniej 30 min.
      3. Usunąć większość roztworu pasywującego, nie dopuszczając do dostania się powietrza, a następnie dodać 400 µl buforu płuczącego (bufor P). Umieść chip w koszyczku do płytek 96-dołkowych i wiruj przy 900 × g przez 6 min. Pozostawić chip w roztworze piorącym do momentu użycia (maksymalnie przez 4 h).
  2. Przygotowanie żelu do wytwarzania proteo-GUV
    UWAGA: Poniższy opis został zaczerpnięty i zaadaptowany z25,38.
    1. Rozpuść 0,5% (m/m) agarozy o niskiej temperaturze żelowania (LGT) w wodzie dejonizowanej, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej; upewnij się, że agaroza całkowicie się rozpuściła i unikaj zagotowania roztworu. Przechowuj agarozę w 50 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Rozpuszczoną agarozę można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni. Aby ponownie wykorzystać agarozę, wystarczy stopić żel w kuchence mikrofalowej.
    2. Należy pobrać dwa szkiełka przedmiotowe i narysować na nich obrys dystansera. W celu nadania szkiełkom właściwości hydrofilowych należy przeprowadzić czyszczenie plazmowe, stosując plazmę wysokotlenową przez 1 min.
    3. Nanieś agarozę LGT na preparat, aż zostanie on całkowicie nią pokryty (~500 µL); następnie przechylić preparat pod kątem 90 ° i odsączyć nadmiar agarozy za pomocą chusteczki. Pozostawić preparaty na 30 min w 50 °C.
    4. Należy wziąć proteoliposomy przechowywane w ciekłym azocie (sekcja 3) i rozmrozić je na lodzie. Pęcherzyki należy rozcieńczyć buforem Q do stężenia lipidów 5 mg/ml.
      UWAGA: Proteoliposomy przygotowane w sekcji 3 nie zawierają białek rozpuszczalnych i mogą zostać sporządzone z dużym wyprzedzeniem, pod warunkiem przechowywania w ciekłym azocie. Podczas pracy z proteoGUV należy pamiętać o stałym filtrowaniu roztworów roboczych, aby zapobiec zapychaniu urządzenia mikrofluidycznego.
    5. Poddaj proteoliposomy sonikacji przy użyciu przenośnego sonikatora z sondą o średnicy 1 mm. Sonikuj przez 10 cykli po 0,5 s. włączony oraz 0,5 s wyłączony przy amplitudzie 70%. Przechowywać pęcherzyki, zwane dalej proteoSUV, w lodzie przez 30 s, a następnie powtórzyć proces sonikacji 5 razy.
    6. Napełnij 100 µL strzykawkę (w ręcznym dozowniku LCP) z zawiesiną proteo-SUV. Nanieść 0.5 µL krople proteo-SUV na wcześniej przygotowany żel agarozowy; należy uważać, aby nie naruszyć warstwy agarozy i zachować odpowiedni odstęp, aby zapobiec łączeniu się kropel.
      ​UWAGA: Użycie ręcznego dozownika LCP umożliwia powtarzalne nanoszenie kropel, jednak można zastosować również alternatywne systemy pipetowania. Nanoszenie za pomocą kapilary szklanej jest mniej odpowiednie, ponieważ powoduje naruszenie wysuszonego żelu agarozowego.
    7. Wysuszyć krople SUV w ciągu ok. 10 min, stosując strumień azotu zamiast sprężonego powietrza, aby zmniejszyć ryzyko utlenienia lipidów.
    8. Przygotować 1 ml 1,25-krotnie skoncentrowanego buforu O (Tabela 4) w buforze A i przepuścić przez 0.2 µm filtr z octanu celulozy. Pobrać 800 µL roztworu o stężeniu 1,25x, a następnie dodać rozpuszczalne enzymy i sondy do stężenia wskazanego w Tabela 4Do uzupełnienia końcowej objętości do 1 ml należy użyć filtrowanej wody dejonizowanej.
    9. Przygotuj 100 µL roztworu pęczniejącego zawierającego wszystkie składniki Tabela 4z wyjątkiem białek i glicerolu. Osmolalność roztworu pęczniejącego należy zmierzyć za pomocą osmometru z zamrażaniem, skalibrowanego w trzech punktach.
      UWAGA: Przygotuj 100 µL roztworu pęczniejącego bez białka i glicerolu, aby dokładnie określić osmolalność tego roztworu. Glicerol, który znajduje się w roztworze białka, wpływa na osmolalność, jednak w przypadku GUV glicerol szybko dyfunduje przez błonę i tylko prowadzi do przejściowych różnic osmotycznych.
    10. Złożyć komorę pęcznienia GUV, tworząc kanapkę z dwóch szkiełek przedmiotowych zawierających żel i wysuszone SUV, przedzielonych przekładką teflonową o grubości 1,5 lub 3,0 mm. Następnie, za pomocą strzykawki z igłą, wprowadzić roztwór pęcznienia do komory przez niewielki otwór z boku.
      UWAGA: Objętość roztworu pęczniejącego można dostosować, zmieniając dystansery z 1,5 do 3,0 mm.
  3. Pęcznienie pęcherzyków i pozyskiwanie GUV
    1. Należy pozwolić na pęcznienie pęcherzyków, umieszczając komorę w 22 °C przez co najmniej 30 min.
      UWAGA: Pęcznienie pęcherzyków można monitorować za pomocą mikroskopii świetlnej (np. nakładkowego mikroskopu fazowego lub szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego), jeżeli białka lub lipidy są znakowane fluorescencyjnie.
    2. Zabierz GUV-y z żelu, stosując delikatne wytrząsanie fizyczne poprzez opukiwanie komory o twardą powierzchnię (np. blat laboratoryjny); odessij jedną trzecią objętości i wykorzystaj powstałą pęcherzyk powietrza, aby łagodnie wprawić w ruch pozostały płyn, odrywając w ten sposób GUV-y od żelu.
    3. Podczas pęcznienia GUV-ów należy przygotować bufor P i dopasować jego osmolalność do roztworu pęczniejącego poprzez regulację stężenia glukozy. Bufor należy przefiltrować przez 0.2 µm filtr strzykawkowy
      UWAGA: Generalnie roztwór piorący oraz roztwór substratu należy przechowywać w zakresie ± 5 mosmol/kg. Każdy roztwór przepływający przez chip powinien być bardzo czysty, ponieważ zanieczyszczenia mogą zapchać kanały. Przygotowywać świeże bufory przed każdym użyciem lub przechowywać przygotowane bufory w temperaturze -20 °C i przefiltrować przed użyciem.
  4. Pułapkowanie GUV do eksperymentów mikroskopowych
    1. Zamocuj pasywowany chip mikrofluidyczny na stoliku mikroskopu. Sprawdź, czy nie występują ewentualne defekty (np. nieszczelności, pęcherzyki powietrza, zapchane kanały).
      UWAGA: Kontrolę chipa można przeprowadzić na długo przed jego użyciem, aby w razie potrzeby przygotować nowy chip.
    2. Podłączyć rurkę za pomocą zgiętej igły do wylotu zbiornika, a drugi koniec rurki podłączyć do strzykawki o pojemności 1 ml. Zamontować strzykawkę w pompie i ustawić prędkość przepływu na maksymalnie 10 µL/min.
    3. Usunąć bufor piorący z zbiornika (krok 4.1.1.3) i zastąpić go świeżym medium (bufor P). Rozpocząć przepływ buforu przez chip, wprowadzając go za pomocą strzykawki z prędkością 1-10 µL/minPrzemyć co najmniej 80 µL buforu płuczącego o zrównoważonej osmolarności (Bufor P).
    4. Usuń nadmiar buforu płuczącego z rezerwuaru, a następnie dodaj (proteo)GUV do rezerwuaru. Ustaw szybkość przepływu na 0,1- 1 µL/min aby umożliwić przepływ GUV przez chip. Należy monitorować chip w czasie, aż w chipie zostanie uwięziona odpowiednia liczba GUV.
      UWAGA: Pęcherzyki zawierające stosunkowo duże ilości (>(20 mol%) lipidów naładowanych, takich jak fosfatydyloglicerol (PG), fosfatydyloseryna (PS) lub kwas fosfatydowy (PA), lub lipidów nietworzących dwuwarstw, takich jak fosfatydyloetanoloamina (PE), wprowadza się przez chip z mniejszą prędkością przepływu, aby zapobiec pękaniu. Pęcherzyki składające się z czystej fosfatydylocholiny (PC) wykazują tendencję do większej stabilności.
    5. Usunąć nadmiar roztworu GUV i dodać bufor płuczący P, stosując stały przepływ na poziomie 0,1-1 µL/minnastępnie należy wymienić medium zewnętrzne i płukać uwięzione GUV przez co najmniej 1 h, aby usunąć związki nieinkapsulowane i obniżyć fluorescencję tła w przypadku inkapsulacji fluoroforu. Należy monitorować fluorescencję tła w czasie; jeśli fluorescencja tła nie spada, może to oznaczać zablokowanie chipa.
    6. Zlokalizuj pułapki zawierające wystarczającą liczbę pęcherzyków i zapisz ich pozycje. Skonfiguruj ustawienia mikroskopu (np. intensywność lasera, wzmocnienie, długość fali) i rozpocznij eksperyment z serii czasowej.
    7. Należy dodać osmotycznie zrównoważony roztwór podłoża (bufor R) do zbiornika i ustawić szybkość przepływu na poziomie 0.5 µL/min.

Składniki buforu L
SkładnikStężenie 1,25xStężenie robocze
Bufor A62,5 mM KPi pH 7,050 mM KPi pH 7,0
Sacharoza 125 mM100 mM
DTT2,5 mM2 mM
Na-ADP 12,5 mM10 mM
MgCl212,5 mM10 mM
L-ornityna 0,625 mM0,5 mM
Składniki do enkapsulacji
Pyranina lub PercevalHR1 mM lub 20 µM
ArcA (argininodeiminaza)1 µM
ArcB (ornitynokarbamoilotransferaza)2 µM
ArcC1 (kinaza karbaminowa)5 µM

Tabela 4: Bufor O i składniki enkapsulacji. Składniki wymieniono w kolejności dodawania. Wszystkie składniki (z wyjątkiem MgCl2 w wodzie dejonizowanej) znajdują się w Buforze A. Składniki enkapsulacji wymieniono w kolejności dodawania. Wszystkie białka rozpuszczalne w wodzie znajdują się w Buforze E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rekonstytucja solubilizowanych białek błonowych w liposomach wymaga destabilizacji wcześniej utworzonych pęcherzyków. Dodanie niewielkich ilości Triton X-100 powoduje początkowo wzrost absorbancji przy 540 nm (A540) ze względu na zwiększenie rozpraszania światła wywołane pęcznieniem pęcherzyków (Rycina 4). Maksymalna wartość A540 oznacza punkt, w którym liposomy są nasycone detergentem (Rsat); każde dalsze dodanie Triton X-100 prowadzi do częściowej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy protokół syntezy białka (błonowego) zawierającego pęcherzyki lipidowe o rozmiarach submikrometrowych (proteoLUVs) oraz konwersji proteoLUV w pęcherzyki gigantyczno-unimelarne (proteoGUVs). Protokół powinien mieć zastosowanie do rekonstytucji innych białek błonowych 13,19,30,40 i enkapsulacji sieci metabolicznych innych niż przedstawione tutaj szlaki rozkładu L-argininy i syntezy 3-fosforanu glicerolu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Adityi Iyerowi za klonowanie genu pBAD-PercevalHR oraz Gei Schuurman-Wolters za pomoc w produkcji i oczyszczaniu białek. Badania zostały sfinansowane w ramach programu NWO Gravitation "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma AldrichA9414-25g
Filtr odcinający AmiconFiltryodśrodkowe Sigma Aldrich Milipore Amicon Ultra 
BioKoralikiBioRad152-3920
CHCl3Macron Chemikalia wysokowartościoweMFCD00000826
D(+)-glukozaFormedium-D
(+)-sacharozaFormedium-DDM
GlikonD97002 -C
Eter dietylowyBiosolve52805
DMSOSigma-Aldrich276855-100ml
DOPCAvanti850375P-1g
DOPEAvanti850725P-1g
DOPGAvanti840475P-1g
DTTFormedium DTT005
EtOHJ.T.Baker AvantorMFCD00003568
WytłaczarkaAvestin IncLF-1
FluorymetrJascoSpektrofluorometr FP-8300
Wysięgnikglicerolu51171608
Kolumna przepływu grawitacyjnegoBio-Rad732-1010
Strzykawka Hamilton 100 µ LHamilton7656-01
Strzykawka Hamilton 1000 &mikro; LHamilton81320
Ręczny dozownik LCPArt Robbins Instruments620-411-00
Ręczny sonografHielscher Ultrasound TechnologyUP50H
HClBOOMx76021889.1000
ImidazolRothX998.4-250g
K2HPO4Supelco1.05099.1000
KClBOOM76028270.1
KH2PO4Supelco1.04873.1000
KimwipeKimtech Science7552
Duża wirówka rurkowa FalconEppendorfWirówka 5810 R
L-argininaSigma-AldrichA5006-100G
Mikroskop świetlnyLeicaDM LS2
L-ornitynaRothT204.1
LSM Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM 710 ConfoCor 3
MgCl2Sigma-AldrichM2670-1KG
Układ mikroprzepływowydomowej roboty Na podstawie PDMSDOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADPSigma-AldrichA2754-1G
NaClSupelco1.06404.1000
Spektrometr Nanodrop SpektrofotometrIsogen Life ScienceND-1000 NanoDrop
NaOHSupelco1.06498.1000
Igły do GUVHenke-Ject14-1457527 G x 3/4'' 0,4 x 20 mm
Igły do mikrofluidykiHenke-Ject14-1553818 G x 1 1/2'' 1,2 x 40 mm
Ni2+ SepharoseCytiva17526802
NigericinSigma-AldrichN7143-5MG
NutatorVWR83007-210
MiernikosmolalnościGonotec SalmenkippOsmomat 3000 podstawowy osmometr
Plasmacleaner PlasmaEtchPE-Avenger
Filtr poliwęglanowyCytiva WhatmanNuclepor Track-Etch Membrane Produkt: 104171040,4 i mikro;
m Rurka ultrawirówkowa z poliwęglanuBeckman Coulter355647
PyranineAcros OrganicsH1529-1G
Kuweta kwarcowa ()Żywica Hellma Analytics108B-10-40
Sephadex G-75 GE Healthcare17-0050-01
SonicatorSonics Sonics & Materiały: INCSonics, vibra cell
, filtr strzykawkowySarstedt,Filtropur S, plus 0,20,2 i mikro; m
Pompa strzykawkowaAparat HarvardA-42467
Wirówka stołowaWirówka Eppendorf5418
Przekładka teflonowaDomowej roboty Na bazie teflonu45 x 26 x 1,5 lub 45 x 26 x 3 lub 20 x 20 x 3 mm
TrisPanReac AppliChemA1086.1000
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100 ml
UltrawirówkaLampa UV Beckman CoulterOptima Max-E
SpektrolineENB-280C/FE
UV/VIS SpektrofotometrJascoV730
ValinomycinSigma-AldrichV0627-10MG
Szerokokątny mikroskop fluorescencyjnyZeissAxioObserver
β-CaseinSigma AldrichC5890-500g
do pomiaru temperatury zamarzania,

Bibliografia

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389(2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wesiały syntetycznerekonstytucja białek błonowychduże pęcherzyki jednowarstwowegigantyczne pęcherzyki jednowarstwowepułapkowanie mikrofluidycznesensory fluorescencyjneprodukcja ATPchromatografia żelowa
Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.