Obecny protokół opisuje szczurzy model okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu, który zachowuje anatomiczną strukturę naczyń mózgowych bez powodowania uszkodzeń.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Udar niedokrwienny jest główną przyczyną długotrwałej niepełnosprawności i śmiertelności wśród dorosłych na całym świecie. Zwierzęce modele udaru niedokrwiennego znacząco przyczyniły się do zrozumienia jego patologicznych mechanizmów i opracowania potencjalnych metod leczenia. Obecnie istnieją dwie powszechne metody wykorzystujące techniki włókien (szwów wewnątrznaczyniowych) w celu wywołania zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu. Jednak metody te mają nieodłączne ograniczenia, takie jak zmniejszona perfuzja krwi do mózgu, uszkodzenie zewnętrznego układu tętnicy szyjnej, upośledzone spożycie pokarmu i/lub wody oraz dysfunkcja czuciowa twarzy. W artykule przedstawiono nową metodę indukowania modelu udaru niedokrwiennego u szczura bez uszczerbku dla anatomii naczyń mózgowych. W tym badaniu odsłonięto wspólną tętnicę szyjną (CCA) szczurów Sprague-Dawley i wykonano nacięcie. Następnie włókno zostało wprowadzone przez nacięcie do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zamknąć tętnicę środkową mózgu. Po 1,5 h od wywołanego niedokrwienia włókno okluzyjne zostało całkowicie usunięte zarówno z tętnicy szyjnej wewnętrznej, jak i z CCA. Nacięcie w CCA zostało następnie zszyte za pomocą nici mikrochirurgicznych 11-0 pod mikroskopem (powiększenie 4x). Dzięki wykorzystaniu technik mikrochirurgicznych do naprawy CCA, w badaniu tym z powodzeniem opracowano unikalną metodę wywoływania modelu udaru niedokrwiennego u szczurów przy jednoczesnym zachowaniu integralności anatomicznej naczyń krwionośnych mózgu.
Wprowadzenie
Udar mózgu, główna przyczyna zgonów i długotrwałych zaburzeń neurologicznych u dorosłych na całym świecie, obejmuje różne typy, przy czym udar niedokrwienny stanowi około 81,9% przypadków, podczas gdy krwotok mózgowy i krwotok podpajęczynówkowy stanowią odpowiednio 14,9% i 3,1%1. Udar niedokrwienny często wynika z miażdżycy lub niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCA), co prowadzi do lokalnego zmniejszenia przepływu krwi w mózgu, a następnie uszkodzenia mózgu. To zmniejszenie dopływu składników odżywczych do komórek niedokrwionych powoduje wyczerpanie energii, powodując utratę integralności błony, obrzęk komórek i ostateczną lizę. Ponadto czynniki takie jak zwiększony wewnątrzkomórkowy wapń, pobudzające uwalnianie aminokwasów, zwiększona produkcja wolnych rodników i aktywacja komórek zapalnych przyczyniają się do uszkodzenia tkanki mózgowej po udarze2.
Cele leczenia udaru niedokrwiennego są wieloaspektowe: zmniejszenie trwających uszkodzeń neurologicznych oraz zmniejszenie śmiertelności i długotrwałej niepełnosprawności; zapobieganie powikłaniom wynikającym z unieruchomienia i dysfunkcji neurologicznej; oraz zminimalizowanie ryzyka nawrotu udaru. Biorąc pod uwagę złożoność patofizjologii udaru niedokrwiennego, solidny model udaru mózgu ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju terapii ukierunkowanych na udar niedokrwienny.
Obecnie, niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAo) jest powszechnym zwierzęcym modelem udaru niedokrwiennego3. MCAo jest zwykle wykonywany przez wprowadzenie silikonowej końcówki lub stępionej płomieniowo żyłki przez naczynia szyjne, aż dotrze do początku tętnicy środkowej mózgu (MCA). W 1986 roku Koizumi i jego koledzy opracowali technikę polegającą na wprowadzeniu żyłki z silikonową końcówką przez nacięcie w tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), co pozwoliło jej dotrzeć do wejścia do MCA i zablokować przepływ krwi4. W 1989 roku grupa Longa opisała inną metodę MCAo, która polegała na wprowadzeniu monofilamentu przez nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Żyłka przechodzi następnie przez rozwidlenie tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i ECA, zanim dotrze do punktu początkowego klasy MCA5.
Ograniczenia dwóch istniejących metod indukowania MCAo są oczywiste. Metoda Koizumiego wymaga trwałego zablokowania ipsilateralnego CCA, co prowadzi do zmniejszonej perfuzji MCA, ponieważ reperfuzja opiera się wyłącznie na okręgu klasy Willis4. Z drugiej strony, metoda Longa polega na przecięciu ECA, co skutkuje uszkodzeniem układu ECA, a następnie upośledzeniem funkcji mięśni twarzy5. Uszkodzenie to może wpływać na spożycie pokarmu i wody, a także powodować dysfunkcję czuciową twarzy, wpływając na rehabilitację i ocenę funkcji neurologicznych po udarze niedokrwiennym6.
Obecny protokół stara się rozwiązać te ograniczenia, opracowując nową metodę wywoływania modelu udaru niedokrwiennego bez uszkadzania anatomicznej struktury naczyń mózgowych. To nowatorskie podejście wykorzystuje techniki mikrochirurgiczne do naprawy CCA, unikając w ten sposób wad związanych z poprzednimi metodami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura eksperymentalna została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Yantai (Numer Zgody: YTDX20230410) i przestrzegała wytycznych National Institutes of Health dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Do tego badania wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley o wadze od 300 do 350 g. Pełna lista używanych zwierząt, odczynników i sprzętu znajduje się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
- Trzymaj zwierzęta w środowisku utrzymującym 12-godzinny cykl światła/ciemności, kontrolowaną temperaturę i wilgotność. Upewnij się, że mają nieograniczony dostęp do jedzenia i wody.
2. Znieczulenie
- Znieczulić szczury poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe mieszaniną zawierającą ketaminę (80 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg).
UWAGA: Przechyl głowę i ciało szczurów w dół. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się w prawym dolnym kwadrancie brzucha zwierzęcia. Przed wstrzyknięciem należy odciągnąć tłok. Średnia objętość wstrzyknięcia wynosi 0,4 ml. - Potwierdź indukcję znieczulenia, oceniając odruch wycofania tylnej łapy i odruch mrugania. Jeśli nie zostanie osiągnięta odpowiednia głębokość znieczulenia, należy suplementować izofluranem podczas zabiegu chirurgicznego.
3. Procedura modelowania niedokrwiennego
- Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu. Zdezynfekuj stoły operacyjne i związany z nimi sprzęt za pomocą 70% etanolu.
- Przygotuj miejsce operacji, goląc sierść wokół przewidywanego miejsca nacięcia. Trzykrotnie zdezynfekuj skórę w miejscu operacji betadyną i 70% etanolem.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej po stronie brzusznej o długości około 1,5 cm i otwórz powięź powierzchowną.
- Wykonaj ostre i rozwarstwienie, aby odsłonić tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę szyjną wspólną (CCA) zgodnie z wcześniej opisaną metodą7.
- Umieść trzy jedwabne szwy 4-0 wokół CCA i jeden jedwabny szew przez ECA w pobliżu rozwidlenia ICA. Zawiąż rozpinany węzeł poślizgowy na bliższym CCA. Zaciśnij szew na dystalnym CCA za pomocą hemostatu, aby zablokować przepływ krwi. Podczas szycia luźno zawiąż kolejny węzeł poślizgowy wokół CCA, aby upewnić się, że naczynie nie jest zasłonięte.
UWAGA: Upewnij się, że węzeł poślizgowy nie jest zbyt ciasny, tylko na tyle, aby zablokować przepływ krwi, ponieważ będzie musiał zostać zwolniony podczas szycia naczyniowego. - Wykonaj nacięcie 0,5 mm między bliższym szwem jedwabnym a środkowym szwem na CCA za pomocą nożyczek.
UWAGA: Upewnij się, że nacięcie umożliwia włókno (końcówka pokryta silikonem) wejście do CCA. - Wprowadź filament 4-0 o długości 3 cm (końcówka pokryta silikonem) do CCA. Zaciśnij jedwabne szwy wokół CCA, aby zabezpieczyć włókno śródświetlne i zapobiec krwawieniu; następnie usuń szew z dystalnego CCA.
- Kontynuuj wkładanie filamentu do światła MCA, kontrolując szwy wokół ECA, aby upewnić się, że włókno nie dostanie się do ECA. Długość wsunięcia wynosi zwykle od 18 mm do 20 mm.
- Uruchom minutnik i zarejestruj czas, w którym rozpoczyna się okluzja. Zszyj nacięcie szyi jedwabnymi szwami 3-0 i ostrożnie umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej. Podawać dootrzewnowo 0,5 ml soli fizjologicznej.
4. Szycie mikrochirurgiczne CCA
- Ponownie znieczulić szczura 1,5 godziny po niedokrwieniu. Zdezynfekuj miejsce nacięcia trzykrotnie 70% etanolem i ponownie otwórz nacięcie.
- Delikatnie wycofaj filament zasłaniający, aż biała końcówka będzie wyraźnie widoczna w pobliżu nacięcia CCA. Umieść mikrozacisk poziomo blisko zabezpieczonego węzła szwu śródświetlnego w pobliżu rozwidlenia CCA.
UWAGA: Unikaj zaciskania białej końcówki filamentu, aby zapobiec oderwaniu silikonu i późniejszej zakrzepicy. - Zwolnij zabezpieczony węzeł szwu śródświetlnego i całkowicie usuń włókno.
- Umieść kolejny mikro zacisk w pobliżu strony końca serca bliższego węzła CCA. Następnie usuń węzeł szwu wokół bliższego CCA.
UWAGA: Prawidłowe umieszczenie klamer ma kluczowe znaczenie dla podnoszenia stałych naczyń w późniejszych krokach, aby ułatwić szycie mikronaczyniowe. Umieść zaciski poziomo na otaczających mięśniach, aby zapobiec poślizgowi. - Opłucz miejsce nacięcia zwykłą solą fizjologiczną i osusz obszar sterylnym wacikiem, aby usunąć krew i uzyskać czyste pole operacyjne.
- Pod mikroskopem (4-krotne powiększenie) zszyj nacięcie CCA za pomocą szwów mikrochirurgicznych 11-0 w przerywanym wzorze, zwykle wymagającym dwóch szwów w zależności od wielkości nacięcia.
- Po zszyciu usuń mikrozaciski z obu końców CCA, aby przywrócić przepływ krwi.
- Uciskaj sterylnym wacikiem w miejscu szwu CCA przez 30 s. Obserwuj CCA przez 2 minuty, aby upewnić się, że nie dojdzie do krwawienia. Zszyj nacięcie szyi szczura i umieść zwierzę w pojemniku do pielęgnacji w temperaturze 35 °C w celu odzyskania znieczulenia przed powrotem do klatki.
UWAGA: Podawać dootrzewnowo z meloksykamem w dawce 2 mg/kg mc. w celu znieczulenia pooperacyjnego.
5. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)
- Trzy dni po reperfuzji niedokrwiennej poddać zwierzęta eutanazji w głębokim znieczuleniu 4% izofluranem i zwichnięciu szyjki macicy.
- Usuń mózgi i pokrój je na odcinki koronalne o grubości 2 mm za pomocą ostrza skalpela8.
- Inkubować skrawki mózgu z 2% TTC przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
- Opłucz sekcje mózgu dwukrotnie 10% formaliną, a następnie utrwal je 10% formaliną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Rób cyfrowe zdjęcia kolejnych wycinków i ilościowo mierz obszary zawału za pomocą oprogramowania Image J.
6. Test neurologiczny
UWAGA: Funkcja neurologiczna została oceniona za pomocą testu Garcii, zgodnie z poprzednim raportem9.
- Oceń spontaniczną aktywność, symetrię w ruchu wszystkich czterech kończyn, wyciąganie przedniej łapy, wspinanie się, propriocepcję ciała i reakcję na dotyk wibrysów. Przypisz wyniki na podstawie kryteriów testu Garcii, przy czym maksymalny wynik 18 punktów wskazuje na normalne funkcje neurologiczne.
7. Analiza statystyczna
- Wykorzystaj GraphPad Prism do przeprowadzenia analizy statystycznej za pomocą testu t-Studenta. Wyrazić dane jako średnią ± odchylenie standardowe. Rozważ różnice między średnimi istotnymi statystycznie, jeśli P < 0,05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Proces mikroszycia
Nicią wycofano filament w pobliżu nacięcia CCA, aż do momentu, gdy widoczny stał się biały koniec filamentu (Rysunek 1A). Następnie na CCA założono mikrozaciski (Rysunek 1B). Pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu nacięcie CCA zaszyto szwami mikrosurgicalnymi w sposób przerywany (Rysunek 1C). Następnie usunięto mikrozaciski z CCA, przywracając strukturę anatomiczną oraz przepływ krwi (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
MCAo jest szeroko stosowaną metodą tworzenia zwierzęcych modeli udaru, skutecznie odwzorowującą proces udaru obserwowany u pacjentów poprzez przywrócenie przepływu krwi po niedokrwieniu 10,11,12. Nasze laboratorium opracowało model udaru niedokrwiennego, który umożliwia reperfuzję z CCA bez powodowania uszkodzenia ECA. Po indukcji niedokrwienia przeprowadza się mikrochirurgiczną naprawę CCA. Chociaż nie przeprowadzono bezpośredn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych potencjalnie sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Projekt Wprowadzający Wywiad Zagraniczny Prowincji Hebei w 2023 roku. Dziękujemy dr Lisie Kreiner z Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), za zredagowanie angielskiego tekstu szkicu tego manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% formalina | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | BL913A | |
| 11-0 szwy mikrochirurgiczne | Ningbo Medical Seture Needle Co., Ltd. | 3/8 1 razy; | |
| chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 szew jedwabny | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3-0 | |
| 4% izofluranu | Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Sp. z o.o. | ||
| 6-0 jedwabny szew | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 6-0 | |
| 70% etanol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Filament | Xinong Technologies Co Ltd. | 2838-A5 | |
| Ketamina | Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Sp. z o.o. | 230613BL | |
| Samiec szczurów Sprague Dawley | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Microclips | Szanghaj Jinzhong Fabryka urządzeń medycznych | W40150 | |
| Mikroskop | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| Skrzynka pielęgniarska | Pekin Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd. | FYL-YS-100L | |
| Ksylazyna | SIGMA | PHR3263 |
Bibliografia
- Tu, W. J., et al. China stroke surveillance report 2021. Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).
- Wu, L., et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury. Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
- Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), e2879(2011).
- Yu, Z., et al. Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway. Mol Med. 28 (1), 142(2022).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).
- Bracko, O., et al. 3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).
- Goldmacher, G. V., et al. Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model. PLoS One. 8 (3), e60049(2013).
- Lee, H. J., et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
- Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
