Method Article

Kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania Yersinia pseudotuberculosis typu III po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym

DOI:

10.3791/66642

⸱

May 31st, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie kolonizują tkanki gospodarza, które różnią się biodostępnością tlenu i żelaza, jednak większość podejść do badania bakterii wykorzystuje napowietrzone, bogate media. Protokół ten opisuje hodowlę ludzkiego patogenu Yersinia pseudotuberculosis przy różnych stężeniach żelaza i ciśnieniu tlenu oraz ilościowe określenie aktywności układu wydzielania Yersinia typu III, który jest ważnym czynnikiem wirulencji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym mechanizmem wirulencji dla wielu patogenów Gram-ujemnych jest system wydzielania typu III (T3SS), przypominający igłę wyrostek, który przemieszcza cytotoksyczne lub immunomodulujące białka efektorowe do komórek gospodarza. T3SS jest celem kampanii odkrywania środków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ jest dostępny pozakomórkowo i w dużej mierze nieobecny u bakterii niepatogennych. Ostatnie badania wykazały, że T3SS Yersinia i Salmonella są regulowane przez czynniki reagujące na żelazo i tlen, które są ważnymi sygnałami specyficznymi dla niszy występującymi podczas infekcji ssaków. Opisano tutaj metodę głodzenia żelaza w postaci Yersinia pseudotuberculosis, z późniejszą opcjonalną suplementacją żelaza nieorganicznego. Aby ocenić wpływ dostępności tlenu, ten proces głodu żelaza wykazano zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Wreszcie, inkubacja kultur w temperaturze gospodarza ssaków wynoszącej 37 °C indukuje ekspresję T3SS i umożliwia ilościowe określenie aktywności Yersinia T3SS poprzez wizualizację białek efektorowych uwolnionych do supernatantu. Opisane tutaj kroki dają przewagę nad stosowaniem chelatorów żelaza przy braku głodu żelaza, który jest niewystarczający do wywołania silnego głodu żelaza, prawdopodobnie ze względu na wydajne systemy pobierania i oczyszczania żelaza Yersinia. Podobnie, szkło laboratoryjne do mycia kwasem jest szczegółowo oczyszczone z desztek żelaza, które jest niezbędne do wywołania silnego głodu żelaza. Dodatkowo opisano stosowanie środka chelatującego w celu usunięcia pozostałości żelaza z pożywki i hodowli bakterii przez kilka pokoleń w przypadku braku żelaza w celu wyczerpania bakteryjnych zapasów żelaza. Dzięki zastosowaniu standardowych protokołów wytrącania białek indukowanego kwasem trichlorooctowym, SDS-PAGE i barwienia srebrem, procedura ta demonstruje dostępne sposoby pomiaru aktywności T3SS. Chociaż procedura ta jest zoptymalizowana pod kątem Y. pseudotuberculosis, stanowi ona ramy do badań nad patogenami o podobnych silnych systemach wychwytu żelaza. W dobie oporności na antybiotyki metody te można rozszerzyć w celu oceny skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych ukierunkowanych na T3SS w warunkach istotnych dla gospodarza.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele klinicznie istotnych patogenów Gram-ujemnych, takich jak Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas i Shigella, koduje system sekrecji typu III (T3SS) do wstrzykiwania białek efektorowych do komórek gospodarza1. U wielu gatunków bakterii T3SS znajduje się pod ścisłą kontrolą regulacyjną2. Na przykład translokacja białek efektorowych Yersinia T3SS do docelowych komórek gospodarza ma kluczowe znaczenie dla obalenia mechanizmów obronnych gospodarza i umożliwienia kolonizacji bakteryjnej tkanek gospodarza. Jednak aktywność Yersinia T3SS jest metabolicznie uciążliwa i może wywołać rozpoznanie przez receptory immunologiczne gospodarza3. W związku z tym regulatory, które wyczuwają określone sygnały środowiskowe, kontrolują ekspresję genów T3SS u wielu gatunków bakterii. Ponieważ patogeny, takie jak Yersinia, doświadczają zmian środowiskowych podczas cyklu infekcji, które wpływają na ekspresję krytycznych czynników wirulencji, ważne jest, aby opracować warunki laboratoryjne, które naśladują istotne cechy nisz żywicielskich zajmowanych przez patogeny bakteryjne. W szczególności napięcie tlenu i dostępność żelaza różnią się w różnych miejscach tkanki w sposób czasoprzestrzenny i wpływają na ekspresję genów wirulencji, takich jak T3SS4,5,6. Dlatego celem tej metody jest ocena, w jaki sposób tlen i żelazo wpływają na ekspresję Yersinia T3SS. Zapewni to wgląd w dynamikę interakcji gospodarz-patogen

.

Opisana tutaj metoda szczegółowo opisuje, jak hodować Yersinia pseudotuberculosis tlenowo i beztlenowo, a także jak wyczerpywać zapasy żelaza Yersinia podczas wzrostu tlenowego lub beztlenowego. Podkreślono tutaj kilka ważnych kwestii dotyczących udanej hodowli bakterii w tych zmiennych warunkach. Po pierwsze, hodowla beztlenowa wymaga dodatkowej suplementacji glukozy, modyfikacji, która jest odnotowana w recepturze pożywki. Po drugie, ponieważ Y. pseudotuberculosis wykorzystuje siderofory i inne systemy pochłaniania żelaza, które mogą skutecznie usuwać żelazo ze środowiska, szczególną uwagę zwraca się na zapewnienie, że podłoża hodowlane i szkło laboratoryjne są jak najbardziej wolne od żelaza7. W poprzednich badaniach stosowano chelatory żelaza, takie jak dipirydyl, do zubożania żelaza z kultur bakteryjnych bogatych w pożywki, aby naśladować głód żelaza8,9. Jednak wyczerpywanie się zapasów żelaza Yersinia w celu wywołania głodu żelaza wymaga usunięcia resztek żelaza ze szkła i mediów, a także długotrwałego wzrostu przy braku żelaza. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak myć kwasem naczynia szklane i chelatować podłoża w celu usunięcia resztek żelaza, a także hodować bakterie przez kilka pokoleń, aby zapewnić dokładny głód żelaza. Głód żelaza można zapewnić, mierząc względne poziomy transkryptów dobrze scharakteryzowanych genów reagujących na żelazo w różnych warunkach, jak wykazano w przypadku yfeA i bfd.

Punkt kulminacyjny tego protokołu pokazuje, jak wytrącić wydzielane białka efektorowe T3SS z każdego z tych warunków, traktując supernatant hodowli kwasem trichlorooctowym (TCA) i wizualizując wydzielane białka za pomocą SDS-PAGE. Wreszcie, względną aktywność T3SS ocenia się poprzez wizualizację wydzielanych białek za pomocą barwienia srebrem i ilościowe określenie względnych poziomów białek efektorowych T3SS, określanych jako białka zewnętrzne Yersinia (Yops)10.

Testy aktywności T3SS zazwyczaj wykorzystują specyficzne przeciwciała do wykrywania poziomów białek efektorowych T3SS w supernatancie hodowli. Jednak przeciwciała western blot dla białek efektorowych T3SS często nie są dostępne na rynku. W związku z tym zwrócono szczególną uwagę na to, aby ostateczna wizualizacja aktywności T3SS w tej metodzie nie wymagała specyficznych przeciwciał, a zamiast tego mogła wykorzystywać barwienie srebrem, co pozwala na wizualizację wszystkich wydzielanych białek. Chociaż metoda ta jest specjalnie dostosowana i zoptymalizowana pod kątem Y. pseudotuberculosis, można ją dostosować do innych gatunków bakterii, chociaż dokładne warunki pożywki i czas inkubacji będą się różnić.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników, składu podłoża, sekwencji starterów i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów. Rysunek 1 ilustruje ogólny przebieg eksperymentu.

1. Przygotowanie szkła mytego kwasem i chelatowanych pożywek M9

UWAGA: Zanim zaczniesz, zapoznaj się z sekcją materiałów, aby zapoznać się z dokładnymi odczynnikami i recepturami, które zostaną użyte. Pożywka M9 została po raz pierwszy użyta do testów Yersinia T3SS w Cheng et al.11.

  1. Wlać 100 ml 6 N HCl do szklanej kolby o pojemności 250 ml.
    UWAGA: HCl jest niezwykle niebezpieczny; Należy zapewnić podjęcie odpowiednich środków ostrożności podczas obchodzenia się z tą substancją.
  2. Uszczelnić wylot szklanego pojemnika szklanym korkiem i ostrożnie obracać kolbą przez 1 minutę, aby dokładnie rozprowadzić HCl, od czasu do czasu zmieniając kierunki.
  3. 6 N HCl należy zutylizować w odpowiedni sposób.
  4. Wypłucz szklany pojemnik, dodając 100 ml dejonizowanegoH2O, zamykając usta, potrząsając przez 20 s, a następnie wylewając wodę.
  5. Powtórz etap płukania w sumie 3 razy.
  6. Pozostaw powietrze do wyschnięcia. Autoklaw do sterylizacji.
  7. Aby chelatować pożywkę, należy zmieszać składniki M9 z odczynnikiem chelatującym i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze pokojowej przez ~18 godzin. Przefiltrować-wysterylizować i dodaćMgSO4 do końcowego stężenia 1 mM.

2. Hodowla pseudotuberculosy Y. przy różnych poziomach żelaza i napięciu tlenu

  1. Smuga Y. pseudotuberculosis (szczep IP2666pIB1 jest używany w tym badaniu) na płytkach agarowych Lysogeny Broth (LB) i inkubować w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Inkubacja Yersinia w temperaturze 37 °C, szczególnie w pożywce o niskiej zawartości wapnia, prowadzi do aktywności T3SS, zatrzymania wzrostu i ostatecznie selekcjonuje utratę plazmidu dla reguły Yersinia vi(pYV), która koduje klasę T3SS12. W związku z tym protokół ten wykorzystuje inkubację Yersinia w temperaturze 26 °C do czasu zmierzenia aktywności T3SS.
  2. Po 48 godzinach, gdy utworzą się widoczne kolonie, zaszczepić 4 ml pożywki M9 zawierającej 0,2% glukozy, 1 mg/L FeSO4,7H 2O i uzupełnić kazaaminokwasami (określanymi tutaj jako pożywki M9) z pojedynczej, izolowanej kolonii i hodować przez noc w temperaturze 26 °C z napowietrzaniem przy 250 obr./min przez około 18 godzin
    UWAGA: Używaj naczyń szklanych mytych kwasem, zaczynając od następnego kroku i przechodząc dalej.
  3. Subkultura na chelatowane pożywki M9 zgodnie z poniższymi krokami.
    UWAGA: Do wszystkich kolejnych etapów stosuje się pożywkę M9 z 0,9% glukozy zamiast standardowej 0,2% glukozy.
    1. Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną (OD600) nocnej hodowli.
    2. Rozcieńczyć kulturę przez noc do wartości OD600 wynoszącej 0,1 w sumie 14 ml sterylnych chelatowanych pożywek M9 zawierających 0,9% glukozy i bez FeSO 4,7H2 O w250 ml kolby przemytej kwasem bez suplementacji żelaza.
    3. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 26 °C z napowietrzaniem przy 250 obr./min.
  4. Subkultura na kultury tlenowe i beztlenowe równolegle.
    1. Zmierz OD600 rosnących kultur.
    2. W celu kontynuacji inkubacji tlenowej, należy przeprowadzić subkulturę rosnących kultur do wartości OD600 wynoszącej 0,1 w 14 ml sterylnego chelatowanego podłoża M9 zawierającego 0,9% glukozy i bez FeSO 4,7H2 O w kolbie przemytej kwasem o pojemności 250 ml i hodowli z napowietrzaniem w temperaturze 26 °C przez 12 godzin bez suplementacji żelaza.
    3. W przypadku hodowli beztlenowej subkultura do wartości OD600 wynoszącej 0,1 na 14 ml sterylnego chelatowanego podłoża M9 do dwóch szklanych probówek przemytych kwasem. Do pierwszej probówki dodać wysterylizowany filtrem (przy użyciu membrany polieterosulfonowej 0,22 μm) FeSO4,7H 2O dla końcowego stężenia 1 mg/L (określanego jako "wysoka zawartość żelaza"). W drugiej probówce dodać FeSO 4,7H2 O, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 mg/l (określane jako "niska zawartość żelaza"). Można to zrobić za pomocą 10 mg/ml FeSO4,7H 2O roztworu podstawowego. Inkubować obie probówki beztlenowo w komorze beztlenowej w temperaturze pokojowej przez 12 h.
      UWAGA: 1 mg/L FeSO 4,7H2 O zapewnia warunkibogate w żelazo dla silnego wzrostu Yersinia. I odwrotnie, dodanie tylko 0,01 mg/L FeSO4,7H 2O do kultur beztlenowych zapewnia wystarczający wzrost w warunkach beztlenowych, ale nadal umożliwia reakcje głodu żelaza, podczas gdy kultury tlenowe są hodowane przez 12 godzin przy braku dodatku żelaza w celu stymulowania reakcji głodu żelaza przed stymulacją aktywności T3SS.
  5. Indukuj aktywność układu sekrecji typu III.
    1. Przesunąć kultury beztlenowe do temperatury 37 °C i kontynuować inkubację beztlenową przez 4 godziny w celu wywołania T3SS.
    2. Zmierz OD600 kultury rosnącej tlenowo.
    3. Do dwóch kolb przemytych kwasem przeprowadzić subkulturę kultur rosnących tlenowo do wartości OD600 wynoszącej 0,2 w 14 ml sterylnych chelatowanych pożywek M9. Do pierwszej kolby dodać wysterylizowany przez filtr FeSO 4,7H2 O dla końcowegostężenia 1 mg/L. Do drugiej kolby dodać FeSO 4,7H2 O dla końcowego stężenia 0,01 mg/L. Inkubować obie kolby z napowietrzaniem w temperaturze 26 °C przy 250 obr./min przez 2 godziny.
    4. Po 2 godzinach przesunąć kultury tlenowe do temperatury 37 °C z napowietrzeniem przy 250 obr./min i inkubować przez 4 godziny w celu indukcji T3SS.

3. Wytrącanie białek efektorowych T3SS kwasem trichlorooctowym (TCA)

  1. Po zakończeniu inkubacji beztlenowej zmierzyć OD600 kultur.
  2. Znormalizować wszystkie próbki beztlenowe, aby uzyskać równą masę komórek (patrz przykład podany w tabeli 1). W przypadku hodowli beztlenowej generalnie należy spodziewać się wartości OD600 wynoszącej ~0,5 w kulturach pozbawionych żelaza i ~1 w kulturach bogatych w żelazo. W takim przypadku należy użyć 6 ml kultur pozbawionych żelaza i 3 ml kultur bogatych w żelazo.
    UWAGA: Pozostała kultura może być wykorzystana do innych celów, takich jak zbieranie całkowitego RNA i stosowanie ilościowego PCR do pomiaru poziomów docelowego mRNA w stanie ustalonym (nieopisane tutaj).
  3. Przenieś znormalizowane objętości każdej kultury do probówek o pojemności 15 ml.
  4. Aby kontrolować skuteczność wytrącania wydzielanych białek, dodaj 4 μl 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdej probówki.
  5. Kultury osadów w temperaturze 3200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Podłącz filtr PVDF 0,22 μm do strzykawki o pojemności 10 ml i przefiltruj supernatant z każdej granulowanej kultury do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Ten etap filtracji minimalizuje ryzyko przeniesienia całych komórek bakteryjnych, co skutkowałoby niepożądanymi białkami cytoplazmatycznymi w próbce.
  7. Dodać 10% objętości supernatantu wynoszącej 6,1 N TCA do każdej próbki.
  8. Wirować energicznie przez 1 minutę. Inkubować probówki na lodzie w chłodni o temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Czas trwania inkubacji można zoptymalizować w zależności od potrzeb. Zaledwie 1-godzinna inkubacja może działać w przypadku warunków lub szczepów, w których wydzielanie jest silne.
  9. Powtórzyć etapy zbierania osadów i wytrącania TCA z kulturami tlenowymi po zakończeniu 4-godzinnej inkubacji.
    UWAGA: Normalizować kultury tlenowe, granulując objętości o równoważnej masie komórkowej.
  10. Dodać 2 ml każdej próbki do świeżej probówki o pojemności 2 ml i odwirować przy 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Odessać supernatant za pomocą nasadki próżniowej i uważać, aby nie dotknąć dna ani boków probówki.
    UWAGA: Granulka może być trudna do uwidocznienia i może wyglądać jak mgła na całej długości tuby.
  12. Powtarzać kroki 3.10 i 3.11 aż do momentu, gdy cała zawartość z każdej reakcji wytrącania zostanie wytrącona do pojedynczej probówki o pojemności 2 ml. Może to wymagać trzech lub czterech sekwencyjnych etapów wirowania, ale pozwala na zagęszczenie wszystkich wydzielanych białek z każdej próbki w probówce o pojemności 2 ml.
  13. Aby umyć granulki, delikatnie dodaj 1 ml lodowatego 100% acetonu do każdej probówki. Aby uniknąć utraty próbki, nie zawieszaj ponownie i nie dotykaj boków probówki.
  14. Odwirować próbki o masie 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Zassać supernatant i uważać, aby nie dotknąć dna ani boków probówki.
  16. Powtórzyć kroki mycia acetonem w lodowatym getonie 3.13 i 3.14.
  17. Po ostatnim zassaniu supernatantu należy otworzyć probówki i pozostawić osad do całkowitego wyschnięcia na stole przez około 1 godzinę.
  18. Dodać 50 μl roztworu FSB: DTT do każdej wysuszonej próbki. Aby uniknąć utraty białka, nie należy go ponownie zawieszać.
  19. Dokładnie wirować każdą próbkę przez 1 minutę, upewniając się, że roztwór FSB: DTT pokrywa ścianki całej probówki. Można to zoptymalizować za pomocą nasadki wirowej, która może pomieścić wiele rurek jednocześnie.
  20. Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 15 minut.
  21. Odwirować próbki krótko przez 30 s z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej.
  22. Przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłego użycia.

4. SDS-PAGE i barwienie srebrem do wizualizacji białek efektorowych T3SS

  1. Załadować 15 μl każdej próbki beztlenowej i 10 μl każdej próbki tlenowej do 12,5% żelu SDS-PAGE, wraz z 3 μl dostępnego w handlu niebarwionego wzorca jako drabiny.
  2. Uruchom żel na około 90 minut przy napięciu 100 V. Ustawienia te mogą się różnić w zależności od używanego urządzenia.
  3. Postępuj zgodnie z protokołem barwienia srebrem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, w wyniku czego otrzymasz żel, jak pokazano na Rysunek 2.

5. Kwantyfikacja względnej aktywności T3SS

  1. Umieść żel w systemie obrazowania, upewniając się, że wszystkie prążki przeznaczone do oznaczania ilościowego znajdują się w ramce obrazu.
    UWAGA: Masa cząsteczkowa BSA wynosi ~66 kDa, podczas gdy masa cząsteczkowa białka efektorowego T3SS YopE wynosi ~23 kDa.
  2. W oprogramowaniu wybierz wszystkie pasma YopE we wszystkich studzienkach.
  3. Ustaw referencyjne pasmo YopE na odpowiednią próbkę.
  4. Eksportuj względne wartości kwantyfikacji obliczone przez oprogramowanie dla wszystkich pasm YopE.
  5. Wracając do oprogramowania, wybierz wszystkie pasma BSA we wszystkich odwiertach.
  6. Ustaw referencyjne pasmo BSA, aby upewnić się, że pochodzi ono z tej samej próbki, co referencyjne pasmo YopE.
  7. Eksport względnych wartości kwantyfikacji obliczonych przez oprogramowanie dla wszystkich pasm BSA.
  8. Aby obliczyć względne poziomy wyrażenia YopE, należy podzielić wartość YopE względnej ilości przez względną wartość ilości BSA dla każdej próbki.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda pozwala na względne porównanie wydzielanych Yops w różnych warunkach w stosunku do interesującego warunku referencyjnego. Ogólny przebieg eksperymentu jest przedstawiony w Rysunek 1. Tabela 1 przedstawia reprezentację, w jaki sposób normalizacja hodowli komórkowej zwykle zachodziłaby w przypadku każdego warunku hodowli oraz objętość TCA, która zostałaby dodana do każdego supernatantu. W tym przypadku przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu wildtype (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1, a także dwóch mutantów kongenicznych, ΔyscNU i ΔyopE. Mutant ΔyopE jest używany jako kontrola pozbawiona YopE, podczas gdy mutant ΔyscNU jest używany jako kompletna kontrola negatywna T3SS, ponieważ nie jest w stanie złożyć funkcjonalnej klasy T3SS13,14. Reprezentatywny obraz barwionego srebrem 12,5% żelu SDS-PAGE zawierającego wydzielane białka jest przedstawiony na Rysunek 2. Jak opisano powyżej, każda próbka zawierała wzbogacony BSA jako kontrolę wydajności wytrącania białek. Analizując dane, zestawy danych beztlenowych i tlenowych powinny być traktowane jako niezależne zestawy danych, ponieważ każdy z nich został znormalizowany oddzielnie. W próbkach beztlenowych ~38-krotnie więcej YopE było obecne w próbkach o niskiej zawartości żelaza w porównaniu z próbkami o wysokiej zawartości żelaza, co jest zgodne z poprzednimi wynikami15,16. W próbkach tlenowych podobną ilość wydzielanego YopE zaobserwowano w próbkach o niskiej i wysokiej zawartości żelaza, co jest zgodne z poprzednimi wynikami16. Ogólnie rzecz biorąc, do ustalenia istotności statystycznej wykorzystuje się co najmniej trzy powtórzenia biologiczne każdego stanu.

Aby potwierdzić, że ten protokół powoduje odpowiedni głód żelaza, przeprowadzono analizę qPCR na genach reagujących na żelazo yfeA i bfd w szczepie typu dzikiego we wszystkich warunkach. YfeA jest peryplazmatycznym białkiem wiążącym system transportu ABC odpowiedzialnym za transport żelaza, podczas gdy Bfd jest ferredoksją związaną z bakterioferrytyną, biorącą udział w mobilizacji zapasów żelaza17,18,19,20. RNA wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem21, i zgodnie z oczekiwaniami, yfeA i bfd były znacznie podwyższone w warunkach zubożenia w żelazo w stosunku do warunków bogatych w żelazo, zarówno tlenowo, jak i beztlenowo, jak pokazano w Rysunek 3. Dodatkowo określiliśmy ilościowo poziomy mRNA yopE w stanie ustalonym za pomocą qPCR, aby potwierdzić, że obserwowane wyniki dla względnego YopE na poziomie białka były zgodne z poziomami transkryptu yopE (patrz Rysunek 3).

Na koniec, ponieważ bakterie są podatne na lizę w stresujących warunkach hodowli, ważne było pokazanie, że kroki w tym protokole nie powodują lizy bakteryjnej, która mogłaby potencjalnie zakłócić wyniki. Aby to potwierdzić, próbki supernatantu wytrącone przez TCA poddano Western blot i zbadano pod kątem YopE i RpoA, podjednostki polimerazy RNA i białka cytoplazmatycznego. Jak pokazano na Rysunek 4, podczas gdy wzorzec ekspresji YopE był zgodny z tym pokazanym w Rysunek 3, nie było dowodów na obecność RpoA w próbkach supernatantów, co sugeruje, że nie było obserwowalnej lizy, która uwolniłaby cytoplazmatyczne RpoA do supernatantu.

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperymentalny proces uprawy Yersinia pseudotuberculosis przy różnej dostępności żelaza i tlenu. Graficzne przedstawienie etapów hodowli. Należy pamiętać, że naczynia szklane umyte kwasem muszą być używane od 4 dnia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wyniki 12,5% żelu SDS-PAGE barwionego srebrem białka wytrąconego TCA z supernatantów hodowlanych. Wytrącone supernatanty hodowlane załadowano do 12,5% żelu SDS-PAGE i zabarwiono srebrem. (A) Profil wydzielania szczepów WT, ΔyscNU i ΔyopE hodowanych beztlenowo. Reprezentatywne względne wartości YopE znormalizowane do beztlenowej próbki WT zawierającej żelazo. (B) Profil wydzielania szczepów WT, ΔyscNU i ΔyopE uprawianych tlenowo. Reprezentatywne względne wartości YopE znormalizowane do tlenowej próbki WT bogatej w żelazo. Białe strzałki wskazują YopE (~23 kDa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Względne poziomy mRNA genów reagujących na żelazo wskazują na głód żelaza. RNA wyizolowano z WT Y. pseudotuberculosis hodowanego w warunkach opisanych w Rysunek 1. qPCR użyto do pomiaru względnej ekspresji poziomów yfeA, bfd i yopE znormalizowanych do 16S rRNA w warunkach beztlenowych (A-C) i tlenowych (D-F). ****p < 0,0001 zgodnie z niesparowanym testem t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Brak cytoplazmatycznego RpoA w próbkach supernatantu świadczy o braku lizy komórek w warunkach hodowli. 5 μL wytrąconych supernatantów (A) beztlenowych i (B) próbek tlenowych z Rysunek 3 przeprowadzono na 12,5% żelu SDS-PAGE wraz z kontrolą granulek. Białka przeniesiono na błonę PVDF w celu western blotting. Błona została przecięta, a górna połowa sondowana pod kątem RpoA za pomocą przeciwciała anty-RpoA, a dolna połowa sondowana pod kątem YopE za pomocą przeciwciała anty-YopE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.
(A)
ANEROBOWY
warunekODObjętość do zebrania (ml)Objętość 6,1 N TCA dodana do Sup (ml)
WT o niskiej zawartości żelaza0,560,6
WT o wysokiej zawartości żelaza130,3
(B)
AEROBIC
warunekODObjętość do zebrania (ml)Objętość 6,1 N TCA dodana do Sup (ml)
WT o niskiej zawartości żelaza0,960,6
WT o wysokiej zawartości żelaza1.43,8570,386

Tabela 1: Reprezentatywny przepływ pracy pobierania próbek. W dniu 5 (A) po zakończeniu 4-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C dla próbek beztlenowych, pobrano 6 ml próbki o najniższej wartości OD600, a pozostałe objętości próbki odpowiednio znormalizowano. Po przefiltrowaniu supernatantu dodano 6,1 N TCA. (B) Po zakończeniu inkubacji tlenowej (2 h w temperaturze 26 °C i 4 h w temperaturze 37 °C) zebrano 6 ml próbki o najniższej wartości OD600, a pozostałe objętości próbki odpowiednio znormalizowano. Po przefiltrowaniu supernatantu dodano 6,1 N TCA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T3SS jest ważnym czynnikiem wirulencji wielu bakterii chorobotwórczych; Dlatego opracowanie technik laboratoryjnych do badania jego regulacji jest ważne dla zrozumienia patogenezy i opracowania potencjalnych terapii1. Wiadomo, że żelazo i tlen są ważnymi sygnałami gospodarza wyczuwanymi przez patogeny bakteryjne w celu regulacji ekspresji T3SS5; w związku z tym metoda ta przedstawia strategię hodowli Y. pseudotuberculosis w warunkach beztlenowych lub tlenowych, z niedoborem lub niedoborem żelaza, oraz pokazuje, jak określić ilościowo względną aktywność T3SS w tych różnych warunkach, oceniając względne ilości wydzielanych poziomów białka efektorowego YopE T3SS.

Chociaż przepływ pracy w tym eksperymencie jest stosunkowo prosty, istnieje kilka punktów, które należy dokładnie rozważyć, aby zoptymalizować wyniki. Na etapie wytrącania białek za pośrednictwem TCA ważne jest, aby unikać zasysania granulki białka, która może być trudna do zauważenia. Podjęcie dodatkowych środków ostrożności, aby końcówka aspiratora nie dotykała ścianek lub dna rurki, ma kluczowe znaczenie. Dodatkowo, gdy mamy do czynienia ze zmutowanymi szczepami o niższym poziomie aktywności T3SS, zaleca się pobranie większej próbki do przetworzenia. Wreszcie, jeśli pasy wydają się rozmazane po przetworzeniu próbki i barwieniu żelem zamiast wytwarzania wyraźnych pasm, może to być spowodowane lizą komórek podczas hodowli lub przeniesieniem całych bakterii z osadu do frakcji supernatantu. W takim przypadku eksperyment należy powtórzyć i zachować większą ostrożność, aby uniknąć pobrania osadu podczas usuwania supernatantu. Należy zauważyć, że protokół ten może nie być wystarczająco czuły, aby wykryć białka, które są wydzielane w bardzo małych ilościach, w takim przypadku może być konieczne zastosowanie innych metod wykrywania. Ponadto, ponieważ wiele czynników chelatujących usuwa z pożywki kationy dwuwartościowe inne niż żelazo i magnez, inne kationy dwuwartościowe mogą być dodawane z powrotem do pożywki po chelatacji w celu określenia ich wpływu na wydzielanie.

Innym ważnym punktem, który należy wziąć pod uwagę w tych eksperymentach, jest skłonność soli w pożywkach M9 do wytrącania się, co skutkuje zmiennością między partiami eksperymentalnymi. Aby złagodzić ten problem, możliwe jest dodanie wysterylizowanego filtrem MgSO4 do pożywki bezpośrednio przed hodowlą.

Ogólnie rzecz biorąc, metody te zapewniają solidne ramy do ilościowego określania względnej aktywności Yersinia T3SS poprzez pomiar poziomu białka. Wraz z równoległymi podejściami, które mają na celu ocenę ekspresji T3SS, przedstawione tutaj metody pozwalają na kompleksowe zrozumienie dynamiki T3SS w odpowiedzi na sygnały środowiskowe istotne dla gospodarza. Protokół ten może być również dostosowany do innych bakterii, które mogą być hodowane w określonym pożywce, w której można pominąć źródło żelaza, oraz do zastosowań, w których pomiar wydzielanych białek jest istotny dla kwestii naukowej.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy graficzne utworzone za pomocą BioRender.com. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (www.NIH.gov) grant R01AI119082.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ml strzykawka Luer-Lok TipBD301029
10x SDS Bufor do biegania Domowabaza 0,25 M Tris, 1,92 M glicyna, 1% SDS w 1 litrowej objętości
12,5% SDS-Page GelDomowe
probówki hodowlane 15 mlFalcon352059Na początek na noc 
15 ml probówki FalconFalcom352196Do zbierania supernatantu
Kolba hodowlana 250 mlBelco251000250
500 mL System filtrówCorning431097
6 N Roztwór kwasu solnegoFisher Scientific7732185
AcetonFisher ChemicalA949-44 L
Bio Rad ChemiDoc MP Obrazowanie SystemBio RadNumer modelu: Uniwersalny kaptur III
Probówki hodowlane ze szkła borokrzemianowegoFisherbrand14-961-34Do hodowli beztlenowej
Chelex 100 ResinBio Rad142-1253
Chelex M9 +0,9% Pożywki glukozoweDomowej roboty6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casaminokwasów, 0,9% dekstrozy, 0,0005% tiaminy, 5 g/L żywicy Chelex 100. Mieszaj pożywkę przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, przefiltruj za pomocą 500 ml jednostki filtracyjnej Corning, a następnie dodaj MgSO4 dla 1 mM MgSO4 końcowy
roztwór Bufor próbki końcowej (FSB)Domowy0,1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glicerol, 0,2% błękitu bromofenolowego
FSB: Rozwiązanie DTTDomoweoprogramowanie FSB+0,2 M DTT
Image LabOprogramowanieBio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z
Isotemp Heat BlockFisher Scientific88860021
LB Płytki agaroweDomowa robota10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl, 15 g Agar w 1 l całkowitej objętości. Autoklawizowane
podłoże glukozowe M9 + 0,2%Domoweg / L Na2< / sub>HPO4< / sub>, 3 g / L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% casaminokwasy, 0,2% dekstroza, 0,0005% tiamina 
Nasadka filtrująca Millex-GP PES 0,22um do strzykawkiMilliporeSLGPR33RSDo filtracji FeSO47H2O
Nasadka filtrująca Millex-GV PVDF 0,22um do strzykawkiMilliporeSLGVR33RSDo filtracji supernatantu
Precision Plus Protein Unstained StandardBio Rad1610363
SDS-PAGE Aparat żelowyBio RadNumer modelu: Mini PROTEAN Tetra Cell
SilverXpress Zestaw do barwienia srebra InvitrogenLC6100
Shaker BellyDancerIBI ScientificBDRAA1155
Roztwór kwasu trichlorooctowego 6.1NSigma AldrichT0699
Komora winylowa beztlenowaCoy Lab Productshttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Sekwencje starterów 
yfeA forward - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A BFD FORWARD
- CCAGCATCAGCCCCATACAG
BFD REVERSE - TGGCTTGTCGGATGCACTTC
YOPE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE rewers - CTTGGCATTGAGTGATACTG
6

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type III SecretionYersinia PseudotuberculosisIron StarvationAnaerobic GrowthEffector Protein SecretionSDS PAGE AnalysisSilver StainingOxygen AvailabilityProtein PrecipitationBacterial Virulence

Related Articles