Generowanie anionów ponadtlenkowych jest niezbędne do stymulacji płytek krwi, a jeśli są rozregulowane, krytyczne dla chorób zakrzepowych. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły selektywnego wykrywania anionów ponadtlenkowych oraz badania regulacji płytek krwi zależnej od redoks.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reaktywne formy tlenu (ROS) są wysoce niestabilnymi cząsteczkami zawierającymi tlen. Ich niestabilność chemiczna sprawia, że są niezwykle reaktywne i dają im zdolność reagowania z ważnymi cząsteczkami biologicznymi, takimi jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy. Aniony ponadtlenkowe są ważnymi ROS generowanymi przez redukcję redukcji tlenu cząsteczkowego (tj. Akwizycję jednego elektronu). Pomimo ich początkowego wpływu wyłącznie na procesy starzenia, zwyrodnieniowe i patogenne, ich udział w ważnych reakcjach fizjologicznych stał się ostatnio widoczny. Wykazano, że w układzie naczyniowym aniony ponadtlenkowe modulują różnicowanie i funkcję komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, proliferację i migrację komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w angiogenezie, odpowiedź immunologiczną i aktywację płytek krwi w hemostazie. Rola anionów ponadtlenkowych jest szczególnie ważna w rozregulowaniu płytek krwi i powikłaniach sercowo-naczyniowych związanych z wieloma schorzeniami, w tym rakiem, infekcjami, stanami zapalnymi, cukrzycą i otyłością. W związku z tym stało się to niezwykle istotne w badaniach sercowo-naczyniowych, aby móc skutecznie mierzyć wytwarzanie anionów ponadtlenkowych przez ludzkie płytki krwi, zrozumieć zależne od redoks mechanizmy regulujące równowagę między hemostazą a zakrzepicą i ostatecznie zidentyfikować nowe narzędzia farmakologiczne do modulacji odpowiedzi płytek krwi prowadzących do zakrzepicy i powikłań sercowo-naczyniowych. W pracy przedstawiono trzy protokoły eksperymentalne z powodzeniem przyjęte do wykrywania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi oraz badania zależnych od redoks mechanizmów regulujących hemostazę i zakrzepicę: 1) wykrywanie anionów ponadtlenkowych na bazie dihydroetydydy (DHE) za pomocą cytometrii przepływowej; 2) Wizualizacja i analiza anionów ponadtlenkowych na podstawie DHE za pomocą obrazowania pojedynczych płytek krwi; oraz 3) kwantyfikacja produkcji anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi za pomocą sondy spinowej za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR).
Wprowadzenie
Anion ponadtlenkowy (O2•-) jest najbardziej funkcjonalnym ROS generowanym w płytkach krwi1. O2•- jest produktem redukcji tlenu cząsteczkowego i prekursorem wielu różnych ROS 2. Dysmutacja O2•- prowadzi do wytworzenia nadtlenku wodoru (H2O2) w wyniku spontanicznych reakcji w roztworze wodnym lub reakcji katalizowanych przez dysmutazy ponadtlenkowe (SODs3). Chociaż sugerowano różne źródła enzymatyczne (np. oksydaza ksantynowa4, lipooksygenaza5, cyklooksygenaza
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobieranie krwi obwodowej od ochotników, którzy wyrazili zgodę, jest zatwierdzane przez lokalną Komisję Etyki i Krajowy Urząd ds. Badań nad Zdrowiem Służby Zdrowia (REC ref: 21/SC/0215; Identyfikator IRAS: 283854).
1. Metoda 1: Wykrywanie anionów ponadtlenkowych za pomocą DHE metodą cytometrii przepływowej
- Wstępnie podgrzej (37 °C) roztwór cytrynianu sodu (4% w/v) i użyj go jako antykoagulantu, dodając go bezpośrednio do krwi w momencie nakłucia żyły w stosunku 1:7 (0,5% w/v final).
- Pobrać obwodową krew ludzką od zdrowych ochotników przez nakłucie żyły łokciowej środkowej.
- Otrzymać osocze bog....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W przypadku detekcji fluorescencji DHE metodą cytometrii przepływowej przedstawiamy reprezentatywne wyniki dla płytek krwi w stanie spoczynku (Ryc. 3A) lub stymulowanych 0,1 jednostką/mL trombiny (Ryc. 3B). Produkcję O2•- określono jako średnią intensywność fluorescencji (MFI) płytek krwi, co zaprezentowano dla stymulacji 0,1 jednostką/mL trombiny (Ryc. 3C) lub 3 µg/mL peptydu związanego z kolagenem .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie przedstawiamy trzy różne techniki, które mogą zwiększyć możliwości badania zależnej od redoks regulacji funkcji płytek krwi poprzez selektywne wykrywanie O2•-. Pierwsze dwie metody stanowią ulepszenie istniejących technik ze względu na zastosowaną sondę redoks (DHE zamiast bardziej powszechnej, ale mniej niezawodnej DCFDA). Techniki te są zatem łatwo dostępne, a większość laboratoriów może je skutecznie stosować bez specjalnego sprzętu lub kosztów szkolenia. Trzecia tec.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez granty British Heart Foundation (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) oraz European Research Council (#10102507) dla G. Puli.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna (CMH) | Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbH | NOX-02.1-50mg | Odczynnik do EPR (sondy spinowej) |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | NA | Cytometr przepływowy |
| Albumina surowicy bydlęcej | Merck/Sigma | A7030 | Do powłoki μ-slide |
| Bruker E-scan M (Noxyscan) | Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbH | NOX-E.11-BES | Spektrometr EPR |
| Katalaza– glikol polietylenowy (PEG-Cat.) | Merck/Sigma | C4963 | Pochłaniacz nadtlenku wodoru (kontrola swoistości) |
| ChronoLog Model 490+4 | Labmedics/Chronolog | NA | Aggregometr |
| CM radykalny | Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbH | NOX-20.1-100mg | Odczynnik do EPR (kontrola kalibracyjna) |
| deferoksamina | Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbH | NOX-09.1-100mg | Odczynnik do EPR |
| dietyloditiokarbaminian (DETC) | Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbH | NOX-10.1-1g | Odczynnik do EPR |
| Dihydroethidium | Thermo Fisher Scientifics | D11347 | Sonda anionowa ponadtlenkowa |
| Dimetylosulfotlenek | Merck/Sigma | 34869 | Do przygotowania roztworu podstawowego |
| Woskowe płytki uszczelniające EPR Noxygen | Science transfer and Diagnostics GmbH | NOX-A.3-VPM | Materiał eksploatacyjny do EPR |
| Woda klasy EPR | Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbH | NOX-07.7.1-0.5L | Odczynnik do EPR |
| Fibrynogen z ludzkiego osocza | Merck/Sigma | F4883 | Do powłoki μ-slide |
| FITC anty-ludzkie przeciwciało CD41 | BioLegend | 303704 | Barwienie płytkowe do cytometrii przepływowej |
| Kuwety szklane | Labmedics/Chronolog | P/N 312 | Materiał eksploatacyjny do inkubacji w agregegometrze |
| Horm Collagen | Labmedics/Chronolog | P/N 385 | Do stymulacji płytek |
| krwi ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | NA | ImageJ 1.53t (Wayne Rasband) |
| Indometacyna | Merck/Sigma | I7378 | Do izolacji płytek krwi |
| Mikropipety DURAN 50µ l | Technologia i diagnostyka Noxygen Science GmbH | NOX-G.6.1-50µ L | Materiał eksploatacyjny do EPR |
| Chlorowodorek poli-L-lizyny | Merck/Sigma | P2658 | Do powłoki μ-slide |
| Prostaglandyna E1 (PGE1) | Merck/Sigma | P5515 | Do izolacji płytek |
| krwi Cytrynian sodu (4% w/v roztwór) | Merck/Sigma | S5770 | Do izolacji płytek |
| Mieszadła (pokryte teflonem) | Labmedics/Chronolog | P/N 313 | Materiał eksploatacyjny do inkubacji w agregegometrze |
| Dysmutaza ponadtlenkowa– glikol polietylenowy (PEG-SOD) | Merck/Sigma | S9549 | Wymiatacz anionów ponadtlenkowych (kontrola specyficzności) |
| Trombina z ludzkiego osocza | Merck/Sigma | T6884 | Do stymulacji płytek krwi i powłoki μ-slide |
| VAS2870 | Enzo Life Science | BML-EI395 | Inhibitor NOX |
| Mikroskop konfokalny Zeiss 510 LSM | Mikroskop konfokalny | Zeiss | NA |
Bibliografia
- Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
- Fridovich, I.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
