Przedstawiono protokół operacji osteotomii kości udowej z użyciem wewnętrznego mocowania płytki u dojrzałych aksolotlów. Zabieg może być wykorzystany do wykonywania badań porównawczych nad regeneracją kończyn i gojeniem złamań u wodnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stabilizacja osteotomii kości udowej z mocowaniem płytki w Ambystoma mexicanum
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aksolotl (Ambystoma mexicanum) jest obiecującym organizmem modelowym dla medycyny regeneracyjnej ze względu na jego niezwykłą zdolność do regeneracji utraconych lub uszkodzonych organów, w tym kończyn, mózgu, serca, ogona i innych. Badania nad aksolotlem rzuciły światło na szlaki komórkowe i molekularne rządzące aktywacją progenitorów i odbudową tkanek po urazie. Wiedza ta może być zastosowana w celu ułatwienia leczenia urazów niezdolnych do regeneracji, takich jak brak zrostu kostnego. W obecnym protokole opisano stabilizację osteotomii kości udowej za pomocą wewnętrznego systemu mocowania płytki. Zabieg został dostosowany do stosowania u zwierząt wodnych (aksolotl, Ambystoma mexicanum). Zastosowano aksolotle o długości od pyska do ogona o długości od pyska do ogona o długości ≥20 cm z całkowicie skostniałymi, porównywalnymi wielkością mięśni udowych, a szczególną uwagę zwrócono na ułożenie i stabilizację płytki, a także na opiekę pooperacyjną. Ta technika chirurgiczna pozwala na standaryzowane i ustabilizowane unieruchomienie kości i może być przydatna do bezpośredniego porównania z regeneracją kończyn aksolotla i analogicznymi badaniami gojenia się kości u i ssaków.
Wprowadzenie
Aksolotl (Ambystoma mexicanum) jest ważnym modelem regeneracji narządów, w tym ogona, rdzenia kręgowego, mózgu, serca, skrzeli i kończyn1,2,3,4,5. Szczegółowe badania nad regeneracją kończyn aksolotla ujawniły mechanizmy odróżnicowania komórek i tworzenia się puli komórek macierzystych, blastemy, w miejscu amputacji. Ze względu na zdolność komórek blastemy do rekonstrukcji wszystkich brakujących części kończyn, w tym wzorzystego szkieletu6,7, aksolotl wydaje się być atrakcyjnym organizmem modelowym do badań nad gojeniem kości. Ostatnio kilka badań skupiło się bardziej na biologii kości u aksolotlów, opisując morfologię szkieletu, skład komórkowy i dynamikę kostnienia.
Stwierdzono u ssaków, że proces gojenia kości w długich kościach odbywa się poprzez kostnienie śródchrzęstne i składa się z kilku etapów: krwiaka, ziarniny tkanki i tworzenia miękkiego kalusa, kostnienia kalusa w twardy kalus i tkaną kość oraz przebudowy kości8. Niedawne badania wykazały, że podobne etapy można zaobserwować w procesie gojenia się kości aksolotla 9.
Do tej pory złamania aksolotla były badane w systemie niestabilizowanym, w którym kość jest po prostu cięta nożyczkami do irydektomii. Duże złamania powstały w zeugopodzie, gdzie osteotomia wykonywana jest na jednej z kości, podczas gdy druga służy jako podpora10,11. W przeciwieństwie do tego, złamania są rutynowo badane u ssaków, w tym szczurów i myszy, przy użyciu niezawodnych systemów mocowania, takich jak szpilka śródszpikowa i płytki wyrównujące kości, w celu kontrolowania wielkości złamań i zapewnienia wyrównania kości.
Tak więc, metoda ma na celu zapewnienie stabilnego i równomiernego mocowania kości udowej aksolotla przed osteotomią. Aby badania aksolotla były bardziej porównywalne ze ssakami, w tym myszami i ludźmi, pin12, zewnętrzny stabilizator płytki13,14, oraz wewnętrzna płytka wyrównująca kości15,16,17fiksacji. Wykazano, że ten ostatni zapewnia prawidłowe utrwalenie kości i pozwala na stworzenie szczeliny o określonej wielkości za pomocą jednego lub dwóch cięć piłą Gigly o określonej średnicy. Ponieważ aksolotle reprezentują wodne larwy Ambystoma mexicanum, zewnętrzny stabilizator mógł spowodować powikłania pooperacyjne z powodu otwartej rany i kontaktu z wodą. Ponieważ aksolotle nie rozwijają wtórnych centrów kostnienia nawet na bardzo późnym etapie rozwoju (20 years old18), a zatem standardowy gwóźdź śródszpikowy stosowany u myszy może nie być zabezpieczony przed nakłuciem nasad, podjęto decyzję o zastosowaniu metody wewnętrznego mocowania płytki do dużych aksolotlów. U dużych aksolotli rozmiar kości udowej i stopień kostnienia przypominają dorosłej myszy, co pozwala na osteotomię środkowej części trzonu z fiksacją płytki tytanowej1.
Rozmiar szczeliny między złamaniami w dużej mierze decyduje o dynamice gojenia i wyniku. Na przykład u myszy złamania stabilizowane o średnicy 0,25 mm goją się głównie przez kostnienie błoniaste ze względu na ich mały rozmiar i sztywną stabilizację; złamanie o średnicy 0,7 mm goi się przez kostnienie śródchrzęstne, z utworzeniem chrzęstnego kalusa wokół złamania; Duże defekty, takie jak defekty o krytycznym rozmiarze 3,5 mm, nie goją się całkowicie i dlatego są wykorzystywane do modelowania złamania kości bez zrostu16. W tym badaniu ustalono protokół mocowania płytki kości udowej aksolotla przed osteotomią na przykładzie szczeliny złamania 0,7 mm, a ostatecznym celem było porównanie gojenia kości aksolotla z gojeniem się kości mouse9.
Po osteotomii, złamania uległy procesowi kostnienia śródchrzęstnego, aczkolwiek wolniejszemu niż u myszy, prawdopodobnie z powodu wodnego trybu życia aksolotli i wolniejszego tempa podziałów komórkowych. W przedstawionej tutaj metodzie pokazano osteotomię szczeliny 0,7 mm z mocowaniem sztywnej płytki; Potencjalnie możliwe są jednak inne rozmiary szczelin i stabilizatory półelastyczne, a także płyty z różnych materiałów. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona tutaj metoda może być stosowana do standaryzowanego mocowania kości i będzie pomocna w badaniach porównujących regenerację kończyn aksolotla z gojeniem kości lub badaniu gojenia kości u aksolotli w różnych warunkach, aby zapewnić standaryzowane unieruchomienie złamań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Następująca procedura została przeprowadzona za zgodą Magistratu Wiednia (GZ: MA 58-65248-2021-26). 5-8 lat, ≥ 20 cm długości od pyska do końca ogona (od pyska do końca ogona) Aksolotle (Ambystoma mexicanum) były używane do operacji złamań i amputacji. Do operacji wykorzystywano zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Aksolotle zostały wyhodowane w Instytucie Badawczym Patologii Molekularnej. Ból i ryzyko infekcji były kontrolowane za pomocą odpowiednich leków przeciwbólowych i antybiotyków, aby zapewnić pomyślny wynik. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
- Kąpać zwierzę w 0,03% roztworze benzokainy przez około 15-20 minut, aż do osiągnięcia pełnej sedacji i braku odruchowych ruchów po dotknięciu kończyny pęsetą.
- Ułóż zwierzę brzuszną stroną do dołu na mokrych ręcznikach papierowych nasączonych 0,03% roztworem benzokainy i przykryj je ręcznikami papierowymi nasączonymi benzokainą. Skóra zwierząt wodnych, takich jak aksolotle, jest wrażliwa na wysuszenie, dlatego konieczne jest pokrycie powierzchni ciała, aby zapobiec odwodnieniu i zapewnić oddychanie skórne (skórne).
- Rozciągnij kończynę tylną, która ma być operowana za pomocą kleszczy pierścieniowych. Nie stosuj odczynników dezynfekujących, takich jak etanol, ponieważ skóra aksolotla jest wrażliwa na chemikalia i łatwo ulega podrażnieniom. Zamiast tego należy użyć 0,7x PBS (A-PBS) z 50 U/ml penicyliny i 20 μg/ml streptomycyny do czyszczenia kończyny, a później do irygacji kości po piłowaniu.
UWAGA: Infekcja na ogół nie stanowi problemu w przypadku operacji wykonywanych na aksolotlach. Jednak ze względu na wodny charakter tych zwierząt i szwy umieszczone na powierzchni skóry, zalecamy stosowanie antybiotyków, aby zapobiec zanieczyszczeniu miejsca operowanego.
2. Chirurgia
UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Do tego celu odpowiednie są popularne metody sterylizacji, takie jak sterylizacja termiczna, autoklawowanie i mycie w 70% etanolu, a następnie dokładne usunięcie resztek alkoholu. W przypadku pracy na wielu zwierzętach sterylizuj narzędzia pomiędzy nimi za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami lub 70% etanolu.
- Wykonaj boczne nacięcie podłużne (1,5-2 cm) skalpelem nad kością udową obejmującą całe udo w górnej kończynie tylnej. W tym celu należy wykonać badanie dotykowe kości przed przecięciem skóry.
- Ostrożnie przemieszcz mięśnie i nerwy z miejsca operacji bez cięcia. Użyj wygiętych kleszczy, aby zrobić to skutecznie.
- Delikatnie umieść zgięte kleszcze pod kością udową, aby odsłonić ją do operacji.
- Umieść sztywną płytkę stabilizującą 7,75 mm z 4 otworami wraz z trzonem kości udowej, unikając dotykania stawów, i zabezpiecz ją w wyrównanej pozycji za pomocą kleszczy.
- Użyj czterech tytanowych 2 mm, aby przymocować kość do płytki.
UWAGA: użyte w tym protokole mają złożoną konstrukcję i składają się z 4 części: części głównej (zostanie wkręcona w kość), łba (umożliwia wykręcenie i płytki za pomocą klucza kwadratowego), węższej szyjki (używanej jako punkt złamania po dokręceniu w kości) i uchwytu (używanej do mocowania do śrubokręta i urządzenia prowadzącego piłę). - Ważna jest kolejność mocowania. Zacznij najpierw od wewnętrznych, a następnie dwóch zewnętrznych, aby upewnić się, że płytka jest wyrównana z osią kości. Użyj wiertarki ręcznej, aby wykonać pierwszy otwór w kości w celu łatwego wkręcenia, a następnie wkręcenia 1.. Wywierć środek obwodu kości, aby uniknąć cieńszej kości po jednej stronie, co może spowodować samoistne złamanie kości. Podczas wiercenia należy stosować nawadnianie 0,7x PBS + 1% Pen/Strep. Nie odłamuj uchwytu 1st (opcjonalnie: 1st i 2nd) ().
- Nałóż przyrząd prowadzący piłę na 1(opcjonalnie: 1i 2) () i wyrównaj go z kością i płytką.
UWAGA: W tym protokole płyta,, prowadnica piły i piła są dostarczane przez tego samego producenta i zoptymalizowane tak, aby pasowały do siebie. Prowadnica piły może być dostępna w różnych rozmiarach, aby była kompatybilna z różnymi płytami i rozmiarami pił. - Użyj prowadnicy piły, aby wywiercić i włożyć resztę. Upewnij się, że płytka jest wyrównana z kością. Oderwij uchwyty.
- Umieść kawałek folii z tworzywa sztucznego (6-7 mm na 4-5 cm), wysterylizowanej przez przetarcie 70% etanolem, a następnie autoklawizowanej lub sterylizowanej termicznie (140 °C przez 4 godziny), pod kością udową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek miękkich podczas procesu osteotomii.
UWAGA: W tym celu można użyć kawałka folii z tworzywa sztucznego, odciąć worek do sterylizacji termicznej. - Umieść piłę drucianą Gigly między kością a folią ochronną.
- Wytnij kość za pomocą piły linowej Gigly 0,66 mm, tworząc pojedyncze cięcie o średnicy 0,7 mm w kości udowej. Stosuj ciągłe nawadnianie 0,7x PBS + 1% Pen/Strep podczas piłowania, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek i tarcie.
- Wyjmij piłę i prowadnicę piły i użyj śrubokręta, aby odłamać uchwyty od.
- Usuń folię ochronną i przepłucz miejsce operacji 0,7x PBS + 1% Pen/Strep.
- Przykryj górną część płytki i sterylnym woskiem pszczelim, aby chronić skórę i mięśnie przed podrażnieniem przez krawędzie.
- Umieść mięśnie i skórę na wosku pszczelim z kości.
- Zamknij miejsce nacięcia szwem syntetycznym 7,0 (polipropylen/polietylen) za pomocą prostych przerywanych szwów. Nici syntetyczne stosuje się w celu zminimalizowania zanieczyszczenia bakteriami i grzybami przenoszonymi przez wodę.
3. Postępowanie pooperacyjne
- Aby obudzić zwierzę, umieść je w zbiorniku ze świeżą sztuczną wodą w stawie, uzupełnioną 50 U/ml penicyliny, 20 μg/ml streptomycyny i przeciwbólowym butorfanolem (0,5 mg/l wody).
- Obserwuj, jak zwierzę zaczyna poruszać skrzelami, stawiać kroki i pływać - zwykle w ciągu 1 godziny po operacji.
- Trzymaj zwierzę przez 3 dni w sztucznej wodzie ze stawem z 50 μg/ml penicyliny i 20 μg/ml streptomycyny przed powrotem do zbiornika. Aby zapewnić działanie przeciwbólowe, dodaj butorfanol (0,5 mg/l wody).
- Upewnij się, że szwy pozostają na swoim miejscu i następuje prawidłowe gojenie się ran.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisana tutaj procedura chirurgiczna (Rysunek 1) trwa od 20 min do 30 min i wymaga udziału chirurga oraz asystenta. Opcjonalnie można użyć binokularowego mikroskopu sekcyjnego lub systemu powiększającego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecnie opisana metoda stabilizacji płytki udowej i osteotomii pozwala na jej zastosowanie u zwierząt wodnych, takich jak Ambystoma mexicanum (aksolotl). Ta metoda chirurgiczna została niedawno wykorzystana do porównania gojenia się złamań i regeneracji kończyn u aksolotli z gojeniem złamań u myszy9. Podobnie jak u myszy, 4-otworową płytkę stabilizującą można przymocować do kości za pomocą samołamiących się, a piła Gigly może być użyta do stworzenia złamania o jednolitym rozmiarze
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Sabine Stumpp za doskonałe wsparcie techniczne oraz Lidii Grösser za pomoc w operacjach. Badania zostały sfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy [stypendium Hertha Firnberg nr T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [CRC 1444].
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Piła druciana Gigly 0,66 mm | RISystem | RIS.590.120 | |
| 7.0 Szew Optilenowy | Braun | C3090538 | |
| Benzokaina | Sigma-Aldrich | E1501 | rozcieńczyć do 0,03% przed użyciem |
| Butorfanol (Butomidor 10 mg/mL) | Richter Pharma AG - | rozcieńczyć do 0,5 mg/L przed użyciem | |
| Wiertło 0,30 mm | RISystem | RIS.590.200 | |
| Dumont #5 Kleszcze - Standard/Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Wiertarka ręczna | RISystem | RIS.390.130 | lepiej mieć co najmniej 3 sztuki |
| Analizator danych Micro CT | Bruker, Billerica, MA, USA | Oprogramowanie | |
| Skaner próbek Micro CT | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan 1172 | |
| Kleszczyki do tęczówki Moria MC31b - gładkie, zakrzywione, 10 cm | Fine Science Tools | 11373-12FST | 2 sztuki |
| MouseFix Drill-& Prowadnica piły 1,75 mm, sztywna | RISystem | RIS.301.102 | |
| MouseFix płytka 4-otworowa, sztywna | RISystem | RIS.401.110 | |
| Śruba | RISystem | RIS.401.100 | potrzebna 4 na kość |
| Kleszcze wąskowzoru | VWR | FSCI11002-12 | |
| penicylina/streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Kleszcze pierścieniowe | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| skalpel #15 | B Braun, Thermo Fischer Scientific | 5518032 | |
| Klucz nasadowy kwadratowy 0,50 mm | RISystem | RIS.590.111 | |
| Sterylny wosk kostny, 2,5 g | Ethicon, Johnson & | W810 | |
| - proste/11.5 cm | Fine Science Tools | 91460-11 |
Bibliografia
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. Elife. 5, 13998(2016).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. J Exp Zool. 160 (1), 47-65 (1965).
- Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
- Vargas-Gonzalez, A., Prado-Zayago, E., Leon-Olea, M., Guarner-Lans, V., Cano-Martinez, A. Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury. Arch Cardiol Mex. 75 (3), S321-S329 (2005).
- Vieira, W. A., Wells, K. M., McCusker, C. D. Advancements to the axolotl model for regeneration and aging. Gerontology. 66 (3), 212-222 (2020).
- Song, F., Li, B., Stocum, D. L. Amphibians as research models for regenerative medicine. Organogenesis. 6 (3), 141-150 (2010).
- McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: Cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxf). 2 (2), 54-71 (2015).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions). Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Polikarpova, A., et al. The specialist in regeneration-the Axolotl-a suitable model to study bone healing. NPJ Regen Med. 7 (1), 35(2022).
- Chen, X., et al. The axolotl fibula as a model for the induction of regeneration across large segment defects in long bones of the extremities. PLoS One. 10 (6), e0130819(2015).
- Cosden-Decker, R. S., Bickett, M. M., Lattermann, C., MacLeod, J. N. Structural and functional analysis of intra-articular interzone tissue in axolotl salamanders. Osteoarthritis Cartilage. 20 (11), 1347-1356 (2012).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. J Vis Exp. (138), e58122(2018).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Jiang, S., Knapstein, P., Donat, A., Tsitsilonis, S., Keller, J. An optimized protocol for a standardized, femoral osteotomy model to study fracture healing in mice. STAR Protoc. 2 (3), 100798(2021).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4 S103-S109 (2009).
- Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Riquelme-Guzman, C., et al. Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum. Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2022).
- Gentz, E. J., et al. Medicine and surgery of amphibians. ILAR J. 48 (3), 255-259 (2007).
- Lang, A., et al. Collagen I-based scaffolds negatively impact fracture healing in a mouse-osteotomy-model although used routinely in research and clinical application. Acta Biomater. 86, 171-184 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
