Przedstawiono protokół operacji osteotomii kości udowej z użyciem wewnętrznego mocowania płytki u dojrzałych aksolotlów. Zabieg może być wykorzystany do wykonywania badań porównawczych nad regeneracją kończyn i gojeniem złamań u wodnych.
Artykuł metodologiczny
Stabilizacja osteotomii kości udowej z mocowaniem płytki w Ambystoma mexicanum
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aksolotl (Ambystoma mexicanum) jest obiecującym organizmem modelowym dla medycyny regeneracyjnej ze względu na jego niezwykłą zdolność do regeneracji utraconych lub uszkodzonych organów, w tym kończyn, mózgu, serca, ogona i innych. Badania nad aksolotlem rzuciły światło na szlaki komórkowe i molekularne rządzące aktywacją progenitorów i odbudową tkanek po urazie. Wiedza ta może być zastosowana w celu ułatwienia leczenia urazów niezdolnych do regeneracji, takich jak brak zrostu kostnego. W obecnym protokole opisano stabilizację osteotomii kości udowej za pomocą wewnętrznego systemu mocowania płytki. Zabieg został dostosowany do stosowania u zwierząt wodnych (aksolotl, Ambystoma mexicanum). Zastosowano aksolotle o długości od pyska do ogona o długości od pyska do ogona o długości ≥20 cm z całkowicie skostniałymi, porównywalnymi wielkością mięśni udowych, a szczególną uwagę zwrócono na ułożenie i stabilizację płytki, a także na opiekę pooperacyjną. Ta technika chirurgiczna pozwala na standaryzowane i ustabilizowane unieruchomienie kości i może być przydatna do bezpośredniego porównania z regeneracją kończyn aksolotla i analogicznymi badaniami gojenia się kości u i ssaków.
Wprowadzenie
Aksolotl (Ambystoma mexicanum) jest ważnym modelem regeneracji narządów, w tym ogona, rdzenia kręgowego, mózgu, serca, skrzeli i kończyn1,2,3,4,5. Szczegółowe badania nad regeneracją kończyn aksolotla ujawniły mechanizmy odróżnicowania komórek i tworzenia się puli komórek macierzystych, blastemy, w miejscu amputacji. Ze względu na zdolność komórek blastemy do rekonstrukcji wszystkich brakujących części kończyn, w tym wzorzystego szkieletu6,7, aksolotl wydaje się być atrakcyjnym organizmem modelowym do badań nad gojeniem kości. Ostatnio kilka badań skupiło się bardziej na biologii kości u aksolotlów, opisując morfologię szkieletu, skład komórkowy i dynamikę kostnienia.
Stwierdzono u ssaków, że proces gojenia kości w długich kościach odbywa się poprzez kostnienie śródchrzęstne i składa się z kilku etapów: krwiaka, ziarniny tkanki i tworzenia miękkiego kalusa, kostnienia kalusa w twardy kalus i tkaną kość oraz przebudowy kości8. Niedawne badania wykazały, że podobne etapy można zaobserwować w procesie gojenia się kości aksolotla 9.
Do tej pory złamania aksolotla były badane w systemie niestabilizowanym, w którym kość jest po prostu cięta nożyczkami do irydektomii. Duże złamania powstały w zeugopodzie, gdzie osteotomia wykonywana jest na jednej z kości, podczas gdy druga służy jako podpora10,11. W przeciwieństwie do tego, złamania są rutynowo badane u ssaków, w tym szczurów i myszy, przy użyciu niezawodnych systemów mocowania, takich jak szpilka śródszpikowa i płytki wyrównujące kości, w celu kontrolowania wielkości złamań i zapewnienia wyrównania kości.
Tak więc, metoda ma na celu zapewnienie stabilnego i równomiernego mocowania kości udowej aksolotla przed osteotomią. Aby badania aksolotla były bardziej porównywalne ze ssakami, w tym myszami i ludźmi, pin12, zewnętrzny stabilizator płytki13,14, oraz wewnętrzna płytka wyrównująca kości15,16,17fiksacji. Wykazano, że ten ostatni zapewnia prawidłowe utrwalenie kości i pozwala na stworzenie szczeliny o określonej wielkości za pomocą jednego lub dwóch cięć piłą Gigly o określonej średnicy. Ponieważ aksolotle reprezentują wodne larwy Ambystoma mexicanum, zewnętrzny stabilizator mógł spowodować powikłania pooperacyjne z powodu otwartej rany i kontaktu z wodą. Ponieważ aksolotle nie rozwijają wtórnych centrów kostnienia nawet na bardzo późnym etapie rozwoju (20 years old18), a zatem standardowy gwóźdź śródszpikowy stosowany u myszy może nie być zabezpieczony przed nakłuciem nasad, podjęto decyzję o zastosowaniu metody wewnętrznego mocowania płytki do dużych aksolotlów. U dużych aksolotli rozmiar kości udowej i stopień kostnienia przypominają dorosłej myszy, co pozwala na osteotomię środkowej części trzonu z fiksacją płytki tytanowej1.
Rozmiar szczeliny między złamaniami w dużej mierze decyduje o dynamice gojenia i wyniku. Na przykład u myszy złamania stabilizowane o średnicy 0,25 mm goją się głównie przez kostnienie błoniaste ze względu na ich mały rozmiar i sztywną stabilizację; złamanie o średnicy 0,7 mm goi się przez kostnienie śródchrzęstne, z utworzeniem chrzęstnego kalusa wokół złamania; Duże defekty, takie jak defekty o krytycznym rozmiarze 3,5 mm, nie goją się całkowicie i dlatego są wykorzystywane do modelowania złamania kości bez zrostu16. W tym badaniu ustalono protokół mocowania płytki kości udowej aksolotla przed osteotomią na przykładzie szczeliny złamania 0,7 mm, a ostatecznym celem było porównanie gojenia kości aksolotla z gojeniem się kości mouse9.
Po osteotomii, złamania uległy procesowi kostnienia śródchrzęstnego, aczkolwiek wolniejszemu niż u myszy, prawdopodobnie z powodu wodnego trybu życia aksolotli i wolniejszego tempa podziałów komórkowych. W przedstawionej tutaj metodzie pokazano osteotomię szczeliny 0,7 mm z mocowaniem sztywnej płytki; Potencjalnie możliwe są jednak inne rozmiary szczelin i stabilizatory półelastyczne, a także płyty z różnych materiałów. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona tutaj metoda może być stosowana do standaryzowanego mocowania kości i będzie pomocna w badaniach porównujących regenerację kończyn aksolotla z gojeniem kości lub badaniu gojenia kości u aksolotli w różnych warunkach, aby zapewnić standaryzowane unieruchomienie złamań.
Protokół
Następująca procedura została przeprowadzona za zgodą Magistratu Wiednia (GZ: MA 58-65248-2021-26). 5-8 lat, ≥ 20 cm długości od pyska do końca ogona (od pyska do końca ogona) Aksolotle (Ambystoma mexicanum) były używane do operacji złamań i amputacji. Do operacji wykorzystywano zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Aksolotle zostały wyhodowane w Instytucie Badawczym Patologii Molekularnej. Ból i ryzyko infekcji były kontrolowane za pomocą odpowiednich leków przeciwbólowych i antybiotyków, aby zapewnić pomyślny wynik. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
- Kąpać zwierzę w 0,03% roztworze benzokainy przez około 15-20 minut, aż do osiągnięcia pełnej sedacji i braku odruchowych ruchów po dotknięciu kończyny pęsetą.
- Ułóż zwierzę brzuszną stroną do dołu na mokrych ręcznikach papierowych nasączonych 0,03% roztworem benzokainy i przykryj je ręcznikami papierowymi nasączonymi benzokainą. Skóra zwierząt wodnych, takich jak aksolotle, jest wrażliwa na wysuszenie, dlatego konieczne jest pokrycie powierzchni ciała, aby zapobiec odwodnieniu i zapewnić oddychanie skórne (skórne).
- Rozciągnij kończynę tylną, która ma być operowana za pomocą kleszczy pierścieniowych. Nie stosuj odczynników dezynfekujących, takich jak etanol, ponieważ skóra aksolotla jest wrażliwa na chemikalia i łatwo ulega podrażnieniom. Zamiast tego należy użyć 0,7x PBS (A-PBS) z 50 U/ml penicyliny i 20 μg/ml streptomycyny do czyszczenia kończyny, a później do irygacji kości po piłowaniu.
UWAGA: Infekcja na ogół nie stanowi problemu w przypadku operacji wykonywanych na aksolotlach. Jednak ze względu na wodny charakter tych zwierząt i szwy umieszczone na powierzchni skóry, zalecamy stosowanie antybiotyków, aby zapobiec zanieczyszczeniu miejsca operowanego.
2. Chirurgia
UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Do tego celu odpowiednie są popularne metody sterylizacji, takie jak sterylizacja termiczna, autoklawowanie i mycie w 70% etanolu, a następnie dokładne usunięcie resztek alkoholu. W przypadku pracy na wielu zwierzętach sterylizuj narzędzia pomiędzy nimi za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami lub 70% etanolu.
- Wykonaj boczne nacięcie podłużne (1,5-2 cm) skalpelem nad kością udową obejmującą całe udo w górnej kończynie tylnej. W tym celu należy wykonać badanie dotykowe kości przed przecięciem skóry.
- Ostrożnie przemieszcz mięśnie i nerwy z miejsca operacji bez cięcia. Użyj wygiętych kleszczy, aby zrobić to skutecznie.
- Delikatnie umieść zgięte kleszcze pod kością udową, aby odsłonić ją do operacji.
- Umieść sztywną płytkę stabilizującą 7,75 mm z 4 otworami wraz z trzonem kości udowej, unikając dotykania stawów, i zabezpiecz ją w wyrównanej pozycji za pomocą kleszczy.
- Użyj czterech tytanowych 2 mm, aby przymocować kość do płytki.
UWAGA: użyte w tym protokole mają złożoną konstrukcję i składają się z 4 części: części głównej (zostanie wkręcona w kość), łba (umożliwia wykręcenie i płytki za pomocą klucza kwadratowego), węższej szyjki (używanej jako punkt złamania po dokręceniu w kości) i uchwytu (używanej do mocowania do śrubokręta i urządzenia prowadzącego piłę). - Ważna jest kolejność mocowania. Zacznij najpierw od wewnętrznych, a następnie dwóch zewnętrznych, aby upewnić się, że płytka jest wyrównana z osią kości. Użyj wiertarki ręcznej, aby wykonać pierwszy otwór w kości w celu łatwego wkręcenia, a następnie wkręcenia 1.. Wywierć środek obwodu kości, aby uniknąć cieńszej kości po jednej stronie, co może spowodować samoistne złamanie kości. Podczas wiercenia należy stosować nawadnianie 0,7x PBS + 1% Pen/Strep. Nie odłamuj uchwytu 1st (opcjonalnie: 1st i 2nd) ().
- Nałóż przyrząd prowadzący piłę na 1(opcjonalnie: 1i 2) () i wyrównaj go z kością i płytką.
UWAGA: W tym protokole płyta,, prowadnica piły i piła są dostarczane przez tego samego producenta i zoptymalizowane tak, aby pasowały do siebie. Prowadnica piły może być dostępna w różnych rozmiarach, aby była kompatybilna z różnymi płytami i rozmiarami pił. - Użyj prowadnicy piły, aby wywiercić i włożyć resztę. Upewnij się, że płytka jest wyrównana z kością. Oderwij uchwyty.
- Umieść kawałek folii z tworzywa sztucznego (6-7 mm na 4-5 cm), wysterylizowanej przez przetarcie 70% etanolem, a następnie autoklawizowanej lub sterylizowanej termicznie (140 °C przez 4 godziny), pod kością udową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek miękkich podczas procesu osteotomii.
UWAGA: W tym celu można użyć kawałka folii z tworzywa sztucznego, odciąć worek do sterylizacji termicznej. - Umieść piłę drucianą Gigly między kością a folią ochronną.
- Wytnij kość za pomocą piły linowej Gigly 0,66 mm, tworząc pojedyncze cięcie o średnicy 0,7 mm w kości udowej. Stosuj ciągłe nawadnianie 0,7x PBS + 1% Pen/Strep podczas piłowania, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek i tarcie.
- Wyjmij piłę i prowadnicę piły i użyj śrubokręta, aby odłamać uchwyty od.
- Usuń folię ochronną i przepłucz miejsce operacji 0,7x PBS + 1% Pen/Strep.
- Przykryj górną część płytki i sterylnym woskiem pszczelim, aby chronić skórę i mięśnie przed podrażnieniem przez krawędzie.
- Umieść mięśnie i skórę na wosku pszczelim z kości.
- Zamknij miejsce nacięcia szwem syntetycznym 7,0 (polipropylen/polietylen) za pomocą prostych przerywanych szwów. Nici syntetyczne stosuje się w celu zminimalizowania zanieczyszczenia bakteriami i grzybami przenoszonymi przez wodę.
3. Postępowanie pooperacyjne
- Aby obudzić zwierzę, umieść je w zbiorniku ze świeżą sztuczną wodą w stawie, uzupełnioną 50 U/ml penicyliny, 20 μg/ml streptomycyny i przeciwbólowym butorfanolem (0,5 mg/l wody).
- Obserwuj, jak zwierzę zaczyna poruszać skrzelami, stawiać kroki i pływać - zwykle w ciągu 1 godziny po operacji.
- Trzymaj zwierzę przez 3 dni w sztucznej wodzie ze stawem z 50 μg/ml penicyliny i 20 μg/ml streptomycyny przed powrotem do zbiornika. Aby zapewnić działanie przeciwbólowe, dodaj butorfanol (0,5 mg/l wody).
- Upewnij się, że szwy pozostają na swoim miejscu i następuje prawidłowe gojenie się ran.
Wyniki
Opisana tutaj procedura chirurgiczna (Rysunek 1) trwa od 20 min do 30 min i wymaga udziału chirurga oraz asystenta. Opcjonalnie można użyć binokularowego mikroskopu sekcyjnego lub systemu powiększającego.
Rysunek 1Schematy procedury chirurgicznej i układu eksperymentalnego. (AKość udową odsłania się poprzez rozcięcie skóry i odsunięcie mięśni od pola operacyjnego.B) Płytka tytanowa zostaje wyrównana względem kości udowej. (C) 1st Otwór wewnętrzny wykonuje się za pomocą wiertła ręcznego.D) Śrubę umieszcza się w 1st otwór. (E) Prowadnicę piły i wiertła wprowadza się i mocuje do uchwytu 1Niestety, nie dostarczyłeś tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Prześlij proszę treść, którą chcesz przełożyć na język polski. śruba. (FPozostałe śruby mocuje się w wskazanej kolejności.G) Prowadnice piły i wiertła są ostrożnie usuwane, a łebki śrub zostają odłamane podczas obracania śrubokrętem ze względu na większą sztywność kości w porównaniu z szyjką śruby. (H) Pod kością umieszczono folię ochronną oraz piłę Gigli. (IOsteotomia jest wykonywana przy stałym nawadnianiu miejsca cięcia.J) Głowice śrub zostają pokryte sterylnym woskiem kostnym przed przywróceniem mięśni i zamknięciem skóry za pomocą szwów. (D,E,F): liczby wskazują kolejność wiercenia otworów i umieszczania wkrętów. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.
Szczególną uwagę należy zwrócić na etapy dopasowania płytki do kości oraz jej mocowania (Rysunek 2). Różnice w wieku aksolotli prowadzą do niewielkich odmienności w wielkości, kształcie i stopniu kostnienia kości udowej. W związku z tym w niektórych przypadkach trudne było znalezienie optymalnej pozycji płytki, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do przykręcenia śrub. Łącznie niepowodzenia w stabilizacji zaobserwowano u 23,5% zwierząt, co mogło wynikać z węższych lub słabiej zkostniałych kości u młodszych osobników (Rysunek 3). Niepowodzenie stabilizacji skutkowało nieprawidłowym ustawieniem osteotomizowanej kości. Można to było stwierdzić po obecności poluzowanych śrub, przemieszczeniu fragmentów kości z odchyleniem od osi kości >20° lub wyraźnym przemieszczeniu bocznym. Podczas gdy pierwszy z tych objawów mógł być zauważony podczas pobierania próbek, pozostałe mogły nie być oczywiste aż do momentu przeprowadzenia analizy microCT. W kończynach prawidłowo ustawionych tkanka ziastkowa znajdowała się w szczelinie złamania 3 tygodnie po operacji, natomiast w próbkach z nieprawidłowym ustawieniem była ona znacznie większa, co prawdopodobnie stanowiło próbę stabilizacji kości.
Rysunek 2: Przegląd procedury chirurgicznej i zwierzęcia po wykonanej osteotomii lewej kończyny tylnej. (A) Przedstawiono główne etapy operacji: odsłonięcie kości udowej, prawidłowe ustawienie płytki tytanowej, wykorzystanie prowadnicy piły do wykonania otworów w kości za pomocą wiertarki ręcznej i aplikację śrub, użycie folii ochronnej i prowadnicy piły (żółta strzałka) do wykonania osteotomii, złamanie kości udowej o szerokości 0,7 mm (biała strzałka), pokrycie łebków śrub sterylnym woskiem kostnym (fioletowa strzałka) oraz końcowy wynik z zamkniętą kończyną. (B) Zwierzę po operacji. Strzałka wskazuje lewą kończynę tylną, w której wykonano zabieg osteotomii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Zastosowanie sterylnego wosku pszczelego do kości przed zszyciem skóry (Rycina 2) ograniczyło pooperacyjne rozstąpienie się rany w skórze nad płytką stabilizującą. Kończyna pozostała funkcjonalna i mogła być wykorzystywana do stania oraz chodzenia wkrótce po ustąpieniu działania znieczulenia.
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki osteotomii ustabilizowanej płytką u aksolotla. (A) Skanowanie MicroCT nienaruszonych i złamanych kości udowych. Zauważalna przerwa w kości 3 tygodnie po złamaniu. W 23,5% kończyn wystąpiła nieudana stabilizacja, co doprowadziło do nieprawidłowego ustawienia kości. W próbkach stabilizowanych w 6-9 miesiącach po złamaniu tworzy się twardy zrost. (B) Barwienie Safranin O/Light Green nienaruszonych i złamanych kości udowych. Zauważalna przerwa z tkanką ziarninową w kości 3 tygodnie po złamaniu. W 6 miesiącu po złamaniu twardy zrost składa się z kości tkankowej i chrząstki. Paski skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Analiza MicroCT oraz analiza histologiczna (barwienie safraniną O i zielenią jasną) pozwoliły na wizualizację położenia fragmentów kości i wielkości szczeliny złamania, a także stanu gojenia kości. Dane MicroCT pozyskano przy nominalnej rozdzielczości wynoszącej 10.05 µm w komercyjnie dostępnym skanerze preparatów, a następnie przeanalizowano przy użyciu zgodnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów) zgodnie z opisem Polikarpovej i wsp.9W przeciwieństwie do ssaków, u których złamanie o tej samej wielkości (0,7 mm) ulega zamknięciu poprzez wytworzenie kostnej i chrzęstnej kostni w ciągu 3–5 tygodni po zabiegu, u axolotla nie zaobserwowano kostni 3 tygodnie po operacji. Zazwyczaj kostna chrzęstna była widoczna 3 miesiące po zabiegu.9oraz zkostniały zrost kostny – 6 miesięcy po operacji (Rycina 3).
Dyskusja
Obecnie opisana metoda stabilizacji płytki udowej i osteotomii pozwala na jej zastosowanie u zwierząt wodnych, takich jak Ambystoma mexicanum (aksolotl). Ta metoda chirurgiczna została niedawno wykorzystana do porównania gojenia się złamań i regeneracji kończyn u aksolotli z gojeniem złamań u myszy9. Podobnie jak u myszy, 4-otworową płytkę stabilizującą można przymocować do kości za pomocą samołamiących się, a piła Gigly może być użyta do stworzenia złamania o jednolitym rozmiarze15. Mocowanie płytki ułatwia zachowanie wielkości szczeliny i zapewnia wyrównanie fragmentów kości. Metoda analgezji została również zoptymalizowana poprzez wdrożenie kąpieli butorfanolowych, ponieważ jest ona mniej inwazyjna (w porównaniu z zastrzykami z buprenorfiny), co nie wpływa na gojenie się kości (jak w przypadku karprofenu). Ponieważ jednak niewiele wiadomo na temat leczenia bólu u w ogóle, a bólu pooperacyjnego w szczególności, można zasugerować zastosowanie prewencyjnego leczenia przeciwbólowego jako dalsze udoskonalenie procedury. W tym przypadku można uznać za adaptację protokołów stosowanych u innych gatunków19. W celu dalszej obiektywnej oceny stanu zdrowia zwierzęcia po operacji zaleca się wdrożenie i stosowanie specjalnych arkuszy punktacji w celu określenia interwencyjnych i punktów końcowych dla ludzi.
W przeciwieństwie do metody opisanej dla myszy16, folia z tworzywa sztucznego jest używana do ochrony tkanki leżącej pod spodem przed osteotomią. Ponadto, ze względu na wodny charakter i mniej wyraźną muskulaturę kończyn, aksolotle wymagały plastra ochronnego z wosku pszczelego na wierzchu płytki i, a także należało zwrócić szczególną uwagę na stosowanie syntetycznych szwów skórnych, ponieważ biofilmy zbierano na wchłanialnych szwach (na bazie poliglaktyny 910). Penicylina-streptomycyna jest stosowana w ramach leczenia pooperacyjnego w celu zapobiegania zanieczyszczeniu ran i szwów.
Metoda została zoptymalizowana dla 5-8 letnich aksolotle o długości od pyska do ogona o długości ≥20 cm, a tym samym ograniczona do dużych, dość starych zwierząt. Może to być również przyczyną wolniejszego gojenia się kości niż u ssaków ze względu na ogólnie niższe tempo proliferacji komórek u tak starych zwierząt. Może to być jednak korzystne, jeśli trzeba rozwiązać drobniejsze etapy gojenia kości20. Kolejną ważną cechą metody jest komercyjny charakter głównych materiałów eksploatacyjnych użytych w protokole: płytki mocującej, i piły Gigly. Ze względu na zoptymalizowaną kompatybilność tych urządzeń powstają ubytki kostne o niezawodnych rozmiarach i odległości od końców kości. W obecnym protokole opisano zastosowanie tytanowej płytki metalowej na kościach aksolotl. Dla myszy opracowano płytki z tworzywa sztucznego PEEK, aby ułatwić obrazowanie mikrotomografiąpróbek17. Płytki PEEK w aksolotlach również zostały przetestowane z podobnymi wynikami; Można je jednak stosować tylko u większych zwierząt ze względu na nieco większą objętość plastikowych płytek stabilizujących w porównaniu z płytkami metalowymi.
W tym badaniu wykorzystaliśmy zwierzęta w wieku 5-8 lat i zaobserwowaliśmy niepowodzenie fiksacji w 23,5% wszystkich operacji, z wyższymi wskaźnikami niepowodzeń u młodszych zwierząt. Dlatego zalecamy wykorzystanie starszych zwierząt o wyższym stopniu kostnienia kości. Wskaźnik niepowodzeń był niezależny od płci; Tak więc obie płcie są jednakowo wykwalifikowane. W przypadku planowania wielkości próby należy obliczyć około 20% straty próbki z powodu niekorzystnego wyniku. Dokładna liczba zwierząt zależy od planu doświadczenia i liczby warunków, które mają być analizowane; Jednak zalecana minimalna liczba zwierząt w grupie powinna wynosić 5+20% = 6 zwierząt.
Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta daje znaczną poprawę w porównaniu z poprzednio stosowanymi operacjami niefiksowanymi lub z sąsiednimi kośćmi. Co więcej, za pomocą tej metody możliwe jest badanie dużych aksolotlów, które mają kości podobne pod względem wielkości i dojrzałości do tych stosowanych w badaniach na myszach. Jest to ważne, ponieważ mikrotomografia komputerowa jest możliwa tylko u dużych aksolotli ze względu na stopień kostnienia.
Metoda ta stanowi istotny postęp w tej dziedzinie, ponieważ pozwala na bezpośrednie porównanie regeneracji kończyn aksolotla z gojeniem złamań, z kontrolowaną wielkością szczeliny i prawidłowym ustawieniem kości (w 76,5% wykonanych operacji). Co więcej, dzięki płytkom mocującym z tworzywa PEEK, mikrotomografia komputerowa i promieniowanie rentgenowskie mogą być używane do oceny procesu gojenia kości. Wreszcie, opisana tutaj operacja może być dostosowana do innych wodnych, takich jak traszki i żaby, co dodatkowo ułatwia międzygatunkowe badania gojenia złamań kości.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Sabine Stumpp za doskonałe wsparcie techniczne oraz Lidii Grösser za pomoc w operacjach. Badania zostały sfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy [stypendium Hertha Firnberg nr T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [CRC 1444].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Piła druciana Gigly 0,66 mm | RISystem | RIS.590.120 | |
| 7.0 Szew Optilenowy | Braun | C3090538 | |
| Benzokaina | Sigma-Aldrich | E1501 | rozcieńczyć do 0,03% przed użyciem |
| Butorfanol (Butomidor 10 mg/mL) | Richter Pharma AG - | rozcieńczyć do 0,5 mg/L przed użyciem | |
| Wiertło 0,30 mm | RISystem | RIS.590.200 | |
| Dumont #5 Kleszcze - Standard/Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Wiertarka ręczna | RISystem | RIS.390.130 | lepiej mieć co najmniej 3 sztuki |
| Analizator danych Micro CT | Bruker, Billerica, MA, USA | Oprogramowanie | |
| Skaner próbek Micro CT | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan 1172 | |
| Kleszczyki do tęczówki Moria MC31b - gładkie, zakrzywione, 10 cm | Fine Science Tools | 11373-12FST | 2 sztuki |
| MouseFix Drill-& Prowadnica piły 1,75 mm, sztywna | RISystem | RIS.301.102 | |
| MouseFix płytka 4-otworowa, sztywna | RISystem | RIS.401.110 | |
| Śruba | RISystem | RIS.401.100 | potrzebna 4 na kość |
| Kleszcze wąskowzoru | VWR | FSCI11002-12 | |
| penicylina/streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Kleszcze pierścieniowe | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| skalpel #15 | B Braun, Thermo Fischer Scientific | 5518032 | |
| Klucz nasadowy kwadratowy 0,50 mm | RISystem | RIS.590.111 | |
| Sterylny wosk kostny, 2,5 g | Ethicon, Johnson & | W810 | |
| - proste/11.5 cm | Fine Science Tools | 91460-11 |
Bibliografia
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. Elife. 5, 13998(2016).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. J Exp Zool. 160 (1), 47-65 (1965).
- Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
- Vargas-Gonzalez, A., Prado-Zayago, E., Leon-Olea, M., Guarner-Lans, V., Cano-Martinez, A. Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury. Arch Cardiol Mex. 75 (3), S321-S329 (2005).
- Vieira, W. A., Wells, K. M., McCusker, C. D. Advancements to the axolotl model for regeneration and aging. Gerontology. 66 (3), 212-222 (2020).
- Song, F., Li, B., Stocum, D. L. Amphibians as research models for regenerative medicine. Organogenesis. 6 (3), 141-150 (2010).
- McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: Cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxf). 2 (2), 54-71 (2015).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions). Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Polikarpova, A., et al. The specialist in regeneration-the Axolotl-a suitable model to study bone healing. NPJ Regen Med. 7 (1), 35(2022).
- Chen, X., et al. The axolotl fibula as a model for the induction of regeneration across large segment defects in long bones of the extremities. PLoS One. 10 (6), e0130819(2015).
- Cosden-Decker, R. S., Bickett, M. M., Lattermann, C., MacLeod, J. N. Structural and functional analysis of intra-articular interzone tissue in axolotl salamanders. Osteoarthritis Cartilage. 20 (11), 1347-1356 (2012).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. J Vis Exp. (138), e58122(2018).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Jiang, S., Knapstein, P., Donat, A., Tsitsilonis, S., Keller, J. An optimized protocol for a standardized, femoral osteotomy model to study fracture healing in mice. STAR Protoc. 2 (3), 100798(2021).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4 S103-S109 (2009).
- Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Riquelme-Guzman, C., et al. Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum. Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2022).
- Gentz, E. J., et al. Medicine and surgery of amphibians. ILAR J. 48 (3), 255-259 (2007).
- Lang, A., et al. Collagen I-based scaffolds negatively impact fracture healing in a mouse-osteotomy-model although used routinely in research and clinical application. Acta Biomater. 86, 171-184 (2019).
Przedruki i uprawnienia
