Artykuł metodologiczny

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66651

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biotecnología y Biomedicina (BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universitat de València

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Streszczenie

Izolacja i ekspansja nerwowych komórek macierzystych (NSC) ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy może być osiągnięta w pożywce uzupełnionej o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) jako mitogeny, wytwarzające agregaty klonalne znane jako neurosfery. Ten system in vitro jest cennym narzędziem do badania potencjału NSC. Transfekcja siRNA lub genów przenoszonych w plazmidach może być wykorzystana do wywołania zaburzeń ekspresji genów i badania biologii NSC. Jednak dostarczanie egzogennych kwasów nukleinowych do kultur NSC jest trudne ze względu na niską skuteczność transfekcji komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W tym miejscu prezentujemy ulepszony system nukleofekcji, który osiąga wysoką skuteczność dostarczania genów w ekspandowanych NSC z dorosłego mysiego SVZ. Wykazaliśmy, że ta stosunkowo prosta metoda zwiększa perturbację genów w dorosłych NSC, przewyższając tradycyjne protokoły transfekcji ze wskaźnikami przeżycia przekraczającymi 80%. Co więcej, metoda ta może być również stosowana w pierwotnych izolowanych NSC, zapewniając kluczowy postęp w badaniach funkcji genów poprzez manipulację ekspresją genów poprzez knockdown lub nadekspresję w kulturach neurosfery.

Wprowadzenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) to multipotencjalne komórki macierzyste rezydujące w mózgu. Komórki te posiadają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania w trzy linie nerwowe: astrocyty, oligodendrocyty i neurony1. W związku z tym NSC odgrywają kluczową rolę w neurogenezie dorosłych ssaków, procesie, w którym nowe neurony są generowane w brain2. NSC znajdują się głównie w dwóch regionach mózgu dorosłego zwanych niszami neurogennymi: strefie podkomorowej (SVZ) wzdłuż ścian komór bocznych i strefie podziarnistej (SGZ) w zakręcie zębatym hipokampa3,4. NSC (znane również jako limfocyty B) w SVZ, najbardziej aktywnej niszy neurogennej u dorosłej myszy, samoodnawiają się i wytwarzają komórki progenitorowe wzmacniające tranzyt (TAP lub komórki C), które następnie różnicują się w neuroblasty (komórki A). Te neuroblasty migrują przez rostralny strumień migracyjny (RMS) do opuszki węchowej (OB), gdzie ulegają pełnemu różnicowaniu w interneurony, integrując się z wcześniej istniejącymi obwodami3,4,5,6.

Zrozumienie skomplikowanej zależności między molekularnymi sygnałami i sygnałami, które regulują NSC w tych niszach, jest ważne, aby wykorzystać ich potencjał do zastosowań terapeutycznych. W tym celu opracowano różne metody badania tej populacji komórek, począwszy od selektywnej hodowli pierwotnej NSC, a skończywszy na selekcji komórek za pomocą markerów powierzchniowych7,8,9,10. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje izolację i hodowlę NSC SVZ in vitro przy użyciu selektywnej pożywki bez surowicy zawierającej oba mitogeny: podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Pożywka ta ułatwia proliferację komórek i utrzymuje macierzystość NSC uzyskanych z SVZ mózgów dorosłych myszy, tworzących in vitro klonalne, trójwymiarowe, nieprzylegające agregaty znane jako neurosfery9. Kultury neurosfery służą jako kontrolowana platforma do manipulowania i badania mechanizmów molekularnych i czynników wpływających na proliferację, samoodnowę, różnicowanie i przeżycie NSC11. Warto zauważyć, że liczba pierwotnych neurosfer powstałych w kulturze pozwala na oszacowanie liczby NSC obecnych w SVZ in vivo, co czyni go potężnym narzędziem do badania wpływu różnych warunków na pulę dorosłych NSC12,13. Ponadto, po ustaleniu kultury pierwotnej, NSC mogą generować nowe agregaty (neurosfery wtórne) po przejściu przez symetryczne podziały w warunkach proliferacji14. W związku z tym wysiewanie wtórnych komórek neurosfery o niskiej gęstości (test klonalny) może być wykorzystane do oceny szybkości samoodnawiania się tych kultur4,15,16,17.

Pomimo potencjału neurosfer w odkrywaniu mechanizmów rządzących regulacją NSC, niektórzy badacze kwestionują wiarygodność wyników badań in vitro, twierdząc, że sztuczne warunki, w których rosną komórki, mogą nie odtwarzać wiernie skomplikowanego mikrośrodowiska in vivo nisz neurogennych18,19,20,21,22. Kolejny kontrowersyjny punkt dotyczy obserwowanej heterogeniczności w neurosferach. Niemniej jednak uważa się, że ta zmienność odzwierciedla symetryczne i asymetryczne podziały NSC, które naturalnie występują in vivo23,24. Co więcej, niedawna walidacja poparła wykorzystanie kultur NSC do przewidywania mechanizmów działających w niszy neurogennej SVZ in vivo, a kilka badań wykazało, że NSC hodowane in vitro dokładnie utrzymują profil transkryptomiczny obserwowany in vivo11,25.

Dlatego kultury neurosfery nie tylko służą jako metoda do badania zdolności do proliferacji i różnicowania NSC, ale także oferują system do badania wpływu genów rządzących biologią NSC. Kluczową techniką badania funkcji genów w NSC jest zaburzenie ekspresji genów. siRNA lub geny dostarczane przez plazmidy mogą być transfekowane do kultur komórkowych, co powoduje knockdown lub regulację w górę docelowego genu. To wszechstronne podejście znacznie skraca czas i koszty w porównaniu z zakładaniem kultur przy użyciu myszy z warunkowym nokautem, stanowiąc obiecującą drogę do rozwikłania genetycznych podstaw neurogenezy i zbadania perspektyw terapeutycznych. Zmiana ekspresji określonych genów w NSC umożliwia modulację ich zachowania, wpływając na kluczowe procesy biologiczne, takie jak proliferacja, różnicowanie i migracja. Jednak perspektywa transfekcji NSC, szczególnie w obrębie neurosfer myszy, stanowi poważne wyzwanie. Trójwymiarowa struktura neurosfer wpływa negatywnie na efektywność transfekcji, często skutkując niskimi wskaźnikami skutecznego dostarczania egzogennych kwasów nukleinowych, co ogranicza zakres manipulacji genetycznych26,27. Ponadto procedury transfekcji mogą niekorzystnie wpływać na żywotność i funkcjonalność komórek27. W tym kontekście przedstawiamy system nukleofekcji jako metodę łagodzenia uszkodzeń komórek, osiągania wysokiego wskaźnika przeżywalności i zapewnienia wyższej skuteczności w testach dostarczania genów stosowanych do zaburzania hodowli NSC.

Ten manuskrypt ma na celu zilustrowanie procedury izolacji, rozszerzania i nukleofektowania NSC z dorosłej niszy neurogennej SVZ w celu zakłócenia genów za pomocą systemu hodowli neurosfery. Metoda ta przewyższa skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji, zapewniając znacznie wyższe wskaźniki przeżycia i lepszą wydajność dostarczania genów wśród docelowych komórek.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na zwierzętach zostały wcześniej zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu w Walencji i autoryzowane przez Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Hiszpania).

1. Pierwotna kultura neurosfer

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować roztwór buforowy buforu fosforanowego soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco w wodzie dejonizowanej i sterylizować w autoklawie. Alternatywnie przygotuj 0,1 M PBS pH 7,4, dodając 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4 roztwór w wodzie dejonizowanej.
    2. Napełnij dwie 12-dołkowe płytki wcześniej schłodzonymi DPBS i trzymaj je na lodzie: jedna zostanie użyta do zachowania całego mózgu przed preparacją, a druga do zachowania wypreparowanych SVZ do czasu przetworzenia tkanki.
    3. Przygotuj mieszankę enzymatyczną zawierającą papainę, jak opisano poniżej.
      1. Przygotować roztwór dysocjacji EDTA/L-cysteiny w zrównoważonym roztworze soli Earla (EBSS) do końcowego stężenia 0,2 mg/ml każdy. Aby osiągnąć całkowite rozpuszczenie, inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
      2. Rozpuścić 12 j./ml papainy w roztworze EDTA/L-cysteiny. Weź pod uwagę, że na jeden mózg zostanie zużyte 500 μl roztworu enzymatycznego.
      3. Wprowadzić roztwór papainy do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 20 minut, aż enzym całkowicie się rozpuści.
      4. Przefiltruj i wysterylizuj mieszaninę enzymatyczną za pomocą strzykawki i filtra porowego 0,22 μm i utrzymuj ją w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
        UWAGA: Papaina aktywuje się po 30 minutach w temperaturze 37 °C i może być przechowywana przez 12 godzin w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować kontrolną pożywkę hodowlaną, dodając roztwór mieszaniny hormonów zgodnie z tabelą 1 i wysterylizować ją metodą filtracyjną za pomocą filtrów nitrocelulozowych o średnicy 0,22 μm. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C, a przed użyciem ogrzać je w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    5. Przygotować kompletną pożywkę, uzupełniając pożywkę kontrolną EGF i bFGF tuż przed użyciem, jak podano w tabeli 1. Nie filtruj całego podłoża, ponieważ mitogeny mogą zostać utracone podczas filtrowania.
  2. Ekstrakcja mózgu i rozwarstwienie SVZ
    UWAGA: Myszy mają swobodny dostęp do jedzenia i wody przed eutanazją. Używane są myszy C57BL/6 w wieku od 8 do 16 tygodni. Obie płcie stosuje się bez zauważalnych różnic w preparacie.
    1. Wysterylizuj narzędzia do preparowania przez autoklawowanie przed operacją. Następnie zanurz skalpele, pęsety, nożyczki i szpatułki w zlewce wypełnionej 70% etanolem. Dokładnie wyczyść każdą powierzchnię roboczą 70% etanolem.
    2. Poświęć mysz przez przedawkowanie CO2 i potwierdź przez zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj głowę 70% etanolem, aby zminimalizować możliwość zanieczyszczenia tkanki mózgowej.
    3. Oddziel głowę myszy od reszty ciała za pomocą nożyczek. Przetnij skórę nad czaszką małymi nożyczkami wzdłuż osi ostro-ogonowej, aż czaszka zostanie całkowicie odsłonięta.
    4. Odsłoń mózg, początkowo przecinając czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego małymi nożyczkami, a następnie usuń kości za pomocą cienkiej pęsety. Uważaj, aby nie spowodować uszkodzenia tkanki mózgowej pod czaszką podczas tego kroku.
    5. Ostrożnie wyjmij mózg z czaszki za pomocą szpatułki i umieść go w 12-dołkowej płytce zawierającej zimny DPBS. Trzymaj talerz na lodzie do momentu zakończenia sekcji.
    6. Przenieś cały mózg na podkładkę silikonową, na której będzie miała miejsce sekcja i nałóż kilka kropli zimnego DPBS na mózg (Rysunek 1A).
    7. Użyj skalpela, aby usunąć OB znajdujący się na rostralnym końcu mózgu i móżdżku znajdującym się w części ogonowej, zachowując centralną część mózgu zawierającą obie boczne komory (Ryc. 1B).
    8. Podziel mózg wzdłuż podłużnej szczeliny na dwie półkule, a następnie przystąp do sekcji obu półkul osobno (Rysunek 1C).
    9. Pracując z jedną półkulą, zmień jej orientację tak, aby obszar przyśrodkowy był skierowany do góry. Otwórz mózg wzdłuż linii ciała modzelowatego, oddzielając korę i prążkowie od hipokampa, przegrody i międzymózgowia, odsłaniając w ten sposób komory boczne (Rysunek 1D).
      UWAGA: SVZ znajduje się pomiędzy jamą komory a prążkowiem, dlatego kolejne kroki mają na celu jak najdokładniejsze odizolowanie SVZ od otaczającej tkanki.
    10. Usuń hipokamp, przegrodę i międzymózgowie zgodnie z brzuszną granicą komór ( Rysunek 1E, F), tkankę poza rostralnymi i ogonowymi końcami SVZ (Figura 1G) i korę podążającą za ciałem modzelowatym ( Rysunek 1H, I).
    11. Przechyl tkankę tak, aby SVZ był skierowany na boki (Rysunek 1J), umożliwiając usunięcie tkanki prążkowia poniżej SVZ (Rysunek 1K) w celu uzyskania cienkiego kawałka tkanki zawierającego NSC ( Rysunek 1L).
    12. Przechowuj oba wypreparowane SVZ od tej samej myszy na 12-dołkowej płytce zawierającej zimny, sterylny DPBS do czasu rozpoczęcia przetwarzania tkanki.
      UWAGA: Wypreparowanie obu SVZ z jednego mózgu powinno zająć 10 minut. Dłuższy czas może mieć wpływ na żywotność komórek. Jeśli potrzebna jest zwiększona wydajność kultur, można połączyć SVZ od wielu myszy w tym samym wieku, płci, tła genetycznego i genotypu.
  3. Izolacja i wysiewanie NSC
    1. Pokrój każdy SVZ na 4-5 małych kawałków, aby ułatwić dezagregację tkanki.
      UWAGA: Od tego kroku cała procedura musi być wykonywana w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Przenieść posiekane SVZ do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej plastikowej pipety Pasteura. Upewnij się, że na płycie nie pozostały żadne fragmenty.
    3. Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie probówki i usuń pozostały DPBS.
    4. Dodać 500 μl przefiltrowanej mieszanki enzymatycznej zawierającej papainę na mózg (2 SVZ) i inkubować probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    5. Po inkubacji do każdej próbki dodać 5 ml pożywki kontrolnej podgrzanej wstępnie w temperaturze 37 °C.
    6. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 5 minut. Następnie ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety lub pompy próżniowej.
    7. Dodać 1 ml pożywki kontrolnej i ostrożnie mechanicznie zdezagregować osad, pipetując w górę i w dół 10x do 20x, używając wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek.
      UWAGA: Jest to jeden z najbardziej krytycznych kroków w protokole, ponieważ nadmierna lub niewystarczająca dezagregacja negatywnie wpłynie na wydajność kultur.
    8. Dodać 4 ml pożywki kontrolnej i wymieszać przez odwrócenie, aby umyć komórki. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Następnie usunąć supernatant.
    9. Dodać 1 ml kompletnej pożywki i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół 10 razy, aby homogenizować zawiesinę komórek.
    10. Odliczyć zawiesinę komórkową za pomocą komory Neubauera pod mikroskopem po rozcieńczeniu 1/2 podwielokrotności zawiesiny komórek błękitem trypanowym lub użyć automatycznego licznika komórek. Upewnij się, że kultury są zdezagregowane na poziomie pojedynczej komórki.
    11. Po przygotowaniu zawiesiny komórkowej uzyskane komórki należy wysiać równomiernie w 8 dołkach 48-dołkowej płytki w końcowej objętości 500 μl kompletnej pożywki.
      UWAGA: Zwykle uzyskujemy 20 000 komórek z dwóch SVZ, co daje końcową gęstość wysiewu około 2 500 komórek/ml, aby osiągnąć maksymalny plon w kulturach.
  4. Powstawanie neurosfer
    1. Inkubować komórki przez 5 do 7 dni in vitro (DIV) w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W tych warunkach zróżnicowane komórki umierają, podczas gdy NSC i progenitorzy proliferują w odpowiedzi na stymulację mitogenną, tworząc agregaty klonalne rozpoznawane jako pierwotne neurosfery.
      UWAGA: Zarówno EGF, jak i bFGF mogą być używane do indukowania tworzenia neurosfery. Jednak te dwa czynniki wzrostu nie są całkowicie substytucyjne.
    2. Sprawdź rozmiar neurosfer za pomocą kamery sprzężonej z odwróconym mikroskopem, a gdy neurosfery osiągną zakres wielkości od 50 do 100 μm, policz wszystkie pierwotne neurosfery utworzone w studzience w 10-krotnym powiększeniu. Całkowita liczba utworzonych pierwotnych neurosfer służy jako oszacowanie liczby NSC obecnych w niszy SVZ.
    3. Po upływie 10 dni zbierz pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, aby rozpocząć pasażowanie. Kolejne pasażowanie należy przeprowadzić po 5 do 7 DIV, chociaż warto zauważyć, że kule pierwotne mogą wymagać nieco dłuższego czasu, aby osiągnąć idealny rozmiar do subkulturacji (około 100 μm).

Tabela 1: Rozwiązania w zakresie podłoży hodowlanych. Opisano recepturę pożywki kontrolnej. Sporządza się wstępnie zmieszany roztwór mieszanki hormonów. Podstawowe roztwory hormonów można przygotować z wyprzedzeniem, jak wskazano, i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed hodowlą komórkową należy uzupełnić pożywkę kontrolną EGF i bFGF, aby przygotować kompletną pożywkę. Specyfikacje przechowywania, zapasy i stężenia robocze są podane dla każdego składnika. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Ekspansja kultur neurosfery

  1. Przejście neurosfer
    1. Zebrać pożywkę zawierającą neurosfery z płytek wielodołkowych i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zapewnij odzysk jak największej liczby komórek, przepłukując studzienki kilkoma mililitrami DPBS.
    2. Wirować neurosfery przez 5 minut przy 300 x g. Następnie usunąć supernatant.
    3. Dodać 200 μl roztworu enzymatycznego (patrz Tabela Materiałów) do granulki i delikatnie postukać w dno probówki, aby ją usunąć. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby ułatwić dysocjację neurosfer.
    4. Dodać 1 ml pożywki kontrolnej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną i mechanicznie zdysocjować neurosfery za pomocą mikropipety P1000, pipetując w górę iw dół od 10 do 20 razy.
    5. Dodać dodatkową objętość 4 ml pożywki kontrolnej i wymieszać przez odwrócenie, aby przemyć komórki.
    6. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g. Następnie usunąć supernatant.
    7. Dodać 1 ml kompletnej pożywki i ponownie zawiesić osad w celu homogenizacji zawiesiny komórkowej poprzez pipetowanie w górę i w dół 10x.
      UWAGA: Jeśli pierwotna liczba i rozmiar neurosfer są zbyt duże, dodaj bardziej kompletną pożywkę, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek, zapewniając wiarygodną liczbę komórek.
    8. Policz zawiesinę komórek za pomocą komory Neubauera po rozcieńczeniu 1/2 podwielokrotności zawiesiny komórek błękitem trypanowym lub użyj automatycznego licznika komórek.
    9. Aby rozszerzyć hodowlę komórkową, należy wysiać komórki o gęstości 10 000 komórek/cm2 przy użyciu kompletnej pożywki na odpowiedniej płytce hodowlanej lub kolbie (patrz tabela 2).
    10. Inkubować komórki przez 5 do 7 działek w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na każde przejście.
      UWAGA: Kultury neurosfery mogą być konsekwentnie rozszerzane i rozmnażane poprzez wielokrotne subkulturowanie, nie przekraczające 10 pasaży, bez zmiany ich zdolności do proliferacji. Do hodowli można wykorzystać EGF lub bFGF; jednak długoterminowa ekspansja kultur może być osiągnięta tylko w obecności EGF.
  2. Test samoodnawiania
    1. Po pasażowaniu kultur neurosferycznych należy umieścić 1000 pojedynczych komórek na 96-dołkowej płytce, uzupełniając do końcowej objętości 200 μl kompletną pożywką, co daje końcową gęstość komórek kultur wynoszącą 5 komórek/μl.
      UWAGA: Liczba wysiewanych komórek musi być jak najdokładniejsza. W razie potrzeby należy przygotować rozcieńczenia pośrednie, aby zapewnić wiarygodną objętość zawiesiny komórek przed posiewem. Ponadto zaleca się wykonanie od 4 do 5 powtórzeń na warunek w celu zmniejszenia zmienności technicznej.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze przez 5 dni lub do momentu, gdy neurosfery osiągną odpowiednią wielkość (60 do 100 μm). Unikaj przesuwania lub potrząsania płytką wielodołkową, aby zapobiec agregacji neurosfery.
    3. Po utworzeniu neurosfery policz liczbę neurosfer utworzonych w każdej studzience za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w dołączoną kamerę. Test samoodnawiania można przeprowadzić oddzielnie przy użyciu EGF lub bFGF.
  3. Kriokonserwacja kultur NSC
    UWAGA: Kultury neurosfery mogą być kriokonserwowane do wykorzystania w przyszłości, minimalizując liczbę wymaganych myszy. Zalecamy zachowanie komórek do pasażu 10.
    1. Aby dokonać kriokonserwacji komórek, przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej w kompletnym podłożu do odpowiednio oznakowanej krioprobówki.
    2. Dodać dimetylosulfotlenek (DMSO) do końcowego stężenia 10% do zawiesiny komórek i delikatnie wymieszać, odwracając probówki.
      UWAGA: DMSO służy jako krioprotektant, ale może być toksyczny dla komórek, więc ten krok należy wykonać szybko.
    3. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C za pomocą pojemnika do zamrażania, który umożliwia stopniowy spadek temperatury o 1 °C/min. Ten stopniowy proces zamrażania zapobiega uszkodzeniom komórek spowodowanym tworzeniem się kryształków lodu podczas krioprezerwacji. W przypadku długotrwałego przechowywania probówki należy przechowywać w zbiorniku z ciekłym azotem w temperaturze -196 °C.
  4. Rozmrażanie kultur NSC
    UWAGA: W razie potrzeby komórki można rozmrozić, a kultury ponownie rozprężyć w celach eksperymentalnych.
    1. Wyjąć krioprobówki zawierające zamrożone NSC ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu i natychmiast umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia, około 5 min.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas kąpieli, ponieważ DMSO jest toksyczny i może wpływać na żywotność komórek.
    2. Szybko przenieś rozmrożone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki kontrolnej.
    3. Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Dodać 1 ml kompletnego podłoża i ponownie zawiesić granulkę, delikatnie pipetując w górę i w dół 10x, aby homogenizować zawiesinę komórkową przed wysiewem.
      UWAGA: Rozmrażanie może wpływać na żywotność komórek; Dlatego zaleca się pasaż komórek co najmniej raz przed wysiewem do nowych eksperymentów.
  5. Testy na obecność mykoplazmy
    UWAGA: Zanieczyszczenie mykoplazmą może zagrozić zdrowiu komórek, wpływając na tempo wzrostu. Dlatego badanie mykoplazmy ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia integralności i wiarygodności eksperymentów.
    1. Ekstrakcja DNA
      1. Zebrać co najmniej 100 μl kultury komórkowej do ekstrakcji DNA. Do ekstrakcji DNA można użyć zarówno supernatantu, jak i osadu komórkowego. Przechowywać tę podwielokrotność w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji.
      2. Przekłuć pokrywkę probówki i gotować podwielokrotność w temperaturze 99 °C przez 15 minut za pomocą termobloku.
        UWAGA: Przekłuwanie pokrywek probówek zapobiega otwieraniu się probówek podczas gotowania w wysokich temperaturach.
      3. Wirować przez 5 minut przy 16 900 x g. Przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki. Przechowywać probówkę z DNA w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia testu PCR.
    2. PCR do wykrywania Mycoplasmy
      1. Przygotuj mieszaninę PCR, używając następujących składników: 8,9 μl wody wolnej od nukleaz, 3 μl 5x buforu reakcyjnego, 1,2 μL 25 mM MgCl2, 0,25 μL 2,5 mM dNTP, 0,15 μl polimerazy Taq i 0,25 μl każdego startera specyficznego dla mykoplazmy w stężeniu 10 μM (Naprzód, Pzód: 5'GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3' i bieg wsteczny, Rv: 5'GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3').
      2. Dodać 1 μl wyekstrahowanego genomowo DNA. Przygotuj mieszaninę PCR w okapie z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu DNA.
      3. Inkubować reakcję w termocyklerze w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 53 °C przez 1 minutę, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
      4. Aby określić rozmiar powstałego prążka (około 500 pz), należy załadować 15 μl produktu DNA PCR zmieszanego z 3 μl 6-krotnie obciążającego roztworu barwnika na 2% żel agarozowy i uruchomić elektroforezę przez 40 do 50 minut przy napięciu 100 V.

Tabela 2: Płytki i kolby używane do hodowli. Podano wymiary i objętości najczęściej używanych płytek i kolb wysiewających. Tabela zawiera średnicę, obszar wzrostu i objętość podłoża użytego dla każdego naczynia, wraz z przykładem liczby NSC, które mają być wysiane w warunkach ekspansji (10 000 komórek/cm2). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Jądro kultur neurosfery

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotowanie DNA
      1. Przygotuj 25 μl kompetentnych komórek DH5α E. coli w probówce o pojemności 1,5 ml do transformacji.
      2. Dodać 1 μl interesującego plazmidu (w stężeniu 100 do 200 ng/μl) do komórek i poddać je szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 45 s. W tym przypadku stosuje się plazmid zawierający krótki spinkę do włosów (sh)RNA do wyciszania ekspresji Snrpn i plazmid kontrolny shSCRAMBLE.
        UWAGA: Utrzymuj kompetentne komórki na lodzie przez cały czas trwania procedury, aby utrzymać skuteczność transformacji.
      3. Umieścić przekształcone komórki na płytkach agarowych LB z odpowiednim antybiotykiem i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 18 godzin. Utrzymać szalki Petriego odwrócone, aby zapobiec tworzeniu się kropelek w wyniku kondensacji, która mogłaby zakłócić tworzenie się kolonii bakteryjnych.
        UWAGA: Dodać odpowiednie antybiotyki do pożywki hodowlanej LB, aby umożliwić wyłącznie wzrost przekształconych bakterii.
      4. Za pomocą sterylnej końcówki pipety wybierz pojedyncze kolonie bakteryjne i przenieś je do kolby Erlenmeyera uprzednio wypełnionej 250 ml LB w celu zainicjowania płynnej hodowli. Unikaj wybierania małych kolonii satelitarnych umieszczonych wokół większych kolonii docelowych, ponieważ mogły one nie zawierać pożądanego plazmidu.
      5. Inkubować kolbę, energicznie wytrząsając na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C przez noc.
      6. Użyj zestawu maxiprep bez endotoksyn i wyekstrahuj czyste plazmidowe DNA z kultur bakteryjnych zgodnie z instrukcjami producenta. Odpuścić DNA w odpowiedniej objętości wody wolnej od endotoksyn, aby uzyskać stężenie plazmidu od 1 do 2 μg/μL.
        UWAGA: Wydajność maxiprep zależy od wzrostu kultury. Zwykle ponowne zawieszenie osadu plazmidowego DNA w objętości 200 μl spowoduje uzyskanie pożądanego stężenia DNA.
      7. Przechowywać probówkę z plazmidowym DNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Przygotować probówkę o pojemności 1,5 ml i końcowej objętości 5 μl, zawierającą od 2 do 6 μg plazmidowego DNA przeznaczonego do nukleofekcji.
    2. Przygotowanie materiału
      1. Przygotować roztwór nukleofekcji. W przypadku korzystania z zalecanego zestawu (patrz Tabela materiałów), przygotuj 95 μl roztworu nukleofekcji w probówce o pojemności 1,5 ml dla każdej żądanej nukleofekcji. Pipety i kuwety są zwykle dołączone do zestawu. Przygotuj po jednym z każdego z nich dla każdego warunku nukleofekcji.
      2. Przygotować kolbę T25 wypełnioną 4 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki na warunki i przechowywać ją w inkubatorze do czasu użycia.
  2. Nukleofekcja NSC
    1. Do oceny użyj 1 do 2 x 106 pojedynczych komórek na warunek. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g, a następnie usunąć supernatant.
    2. Dodać 1 ml DPBS i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół 10x, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.
    3. Powtórzyć wirowanie (etap 2.1.6) do drugiego przemycia i na koniec ponownie zawiesić osad w 95 μl roztworu nukleofekcji.
      UWAGA: Etapy mycia mają kluczowe znaczenie dla usunięcia antybiotyków z pożywki kontrolnej i zapewnienia skutecznej nukleofekcji.
    4. Połączyć 95 μl komórek z wstępnie zmieszanym roztworem zawierającym 5 μl każdego plazmidu (łącznie 2 μg) wybranego do nukleofekcji.
    5. Za pomocą mikropipety P200 przenieś ten roztwór do kuwety i umieść go w urządzeniu nucleofector.
    6. Nucleofektuj komórki z pożądanymi plazmidami za pomocą zoptymalizowanego programu NSC systemu nukleofektorowego.
    7. Po zakończeniu elektroporacji ostrożnie wprowadzić ciepłe kompletne podłoże do kuwety za pomocą pipet Pasteura dostarczonych w zestawie. Następnie przenieść zawartość kuwety do uprzednio przygotowanej kolby T25 zawierającej wstępnie podgrzane kompletne podłoże. Po elektroporacji może dojść do śmierci komórki, wytrącenia DNA i powstania lepkiego agregatu. Należy unikać przenoszenia tego do kolby T25, ponieważ może to zmniejszyć przeżywalność komórek.
      UWAGA: Ten krok jest kluczowy i powinien być wykonany tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić wysoką wydajność nukleofekcji i późniejsze przeżycie hodowli.
    8. Inkubować komórki nukleektyczne w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 3 do 5 dni.
  3. Selekcja komórek nukleofektycznych
    1. Strategia A: Wybór cytometrii przepływowej za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
      1. Po 3 do 5 dniach od nukleofekcji należy przejść kultury nukleofekcji zgodnie z krokiem 2.1 i zebrać wszystkie uzyskane zindywidualizowane komórki.
      2. Przefiltruj próbki przez sitko o średnicy 40 μm w celu usunięcia agregatów komórkowych i przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego sortownika komórek.
        UWAGA: Bardzo ważne jest, aby posortować tę samą liczbę komórek w każdym warunku, aby uzyskać porównywalne wyniki.
      3. Korzystając z oprogramowania cytometru, bramkuj żywe komórki w oparciu o dwie miary: światło rozproszone do przodu (FSC-A), które odpowiada rozmiarowi komórki i światło rozproszone bocznie (SSC-A), które odpowiada złożoności wewnątrzkomórkowej. Wybierz populację żywych komórek charakteryzujących się wysokim poziomem FSC-A i wysokim SSC-A.
        UWAGA: Opcjonalnie dodaj 0,1 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do zawiesiny komórek przed sortowaniem. Umożliwi to odrzucenie martwych komórek i ciał apoptotycznych z bramkowania.
      4. Odrzuć dublety i trojaczki komórek, wykreślając parametry FSC-A w stosunku do FSC-H. Wybierz zdarzenia znajdujące się po przekątnej wykresu, reprezentujące singlety.
        UWAGA: Gdy komórki przechodzą przez laser, cytometr wykrywa zmiany napięcia w czasie. FSC-A reprezentuje obszar sygnału, a FSC-H oznacza wysokość szczytu. Pojedyncze ogniwa wykazują proporcjonalną zależność między FSC-A i FSC-H (znajdującymi się po przekątnej wykresu), podczas gdy agregaty komórek wykazują większą FSC-A w stosunku do FSC-H ze względu na dłuższy sygnał.
      5. Wybierz komórki nukleofektyczne na podstawie intensywności fluorescencji genu reporterowego kodowanego przez użyty plazmid. Na przykład, w przypadku korzystania z GFP+, komórki można wybierać na podstawie poziomów fluorescencji FITC-A w porównaniu z wykresem SSC-A.
      6. Wyizoluj żądaną liczbę komórek docelowych dla każdego warunku i zbierz je bezpośrednio do probówki zbiorczej wypełnionej kompletnym podłożem.
      7. Jądra nasienne NSC o gęstości 10 000 komórek/cm2. Posortowane kultury komórkowe inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
    2. Strategia B: Selekcja z wykorzystaniem oporności na antybiotyki zakodowanej w plazmidzie
      1. Po 48 godzinach nukleofekcji dodać odpowiednie stężenie antybiotyku, aby wybrać oporne komórki.
        UWAGA: Przed rozpoczęciem zaleca się przetestowanie wielu stężeń antybiotyku na komórkach niejądrowych. Optymalne stężenie antybiotyku to najniższa ilość, przy której eliminowane są wszystkie nieoporne komórki. Na przykład określiliśmy optymalne stężenie 4 μg/ml antybiotyku blasticydyny dla hodowli NSC.
      2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 48 godzin.
      3. Po 48 godzinach antybiotykoterapii przeprowadzić subhodowlę komórek nukleofektycznych zgodnie z krokiem 2.1. Jeśli neurosfery pozostają małe, usunąć antybiotyk z pożywki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki i hodować je w kolbie, używając tylko kompletnej pożywki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze do czasu, aż będą mogły się rozprężyć zgodnie z krokiem 2.1.

Wyniki

Optymalne warunki hodowli umożliwiają izolację i ekspansję dorosłych NSC pochodzących z SVZ in vitro
Hodowle NSC pochodzących z dorosłego SVZ stanowią cenną metodę in vitro badania mechanizmów molekularnych i sygnałów niszy regulujących NSC w obrębie ich specyficznych mikrośrodowisk. Analiza neurosfer opisana w niniejszym manuskrypcie została zastosowana do oceny liczby NSC w dorosłym SVZ. Tkanka SVZ została wyizolowana z mózgów 3-miesięcznych myszy, dysocjowana i hodowana w pełnym medium dla NSC uzupełnionym zarówno o EGF i bFGF, jak i o każdy z nich osobno. Po 10 dniach in vitro (DIV), całkowita liczba pierwotnych sfer utworzonych w tych trzech różnych warunkach hodowli została określona za pomocą mikroskopii kontrastowej (Rycina 2A,B). Co istotne, nasze wyniki wykazują, że obecność EGF prowadziła do maksymalnego tworzenia się pierwotnych sfer, co wynika z mniejszej liczby pierwotnych sfer zaobserwowanej w hodowlach z samym bFGF (Rycina 2A,B). Aby ocenić zdolność do samoodnawiania NSC w różnych warunkach pożywkowych, komórki poddano subkulturowaniu i wysiano przy niskiej gęstości (5 cells/µL) w mediach uzupełnionych wspomnianymi kombinacjami mitogenów. Ilościowe oznaczenie sfer wtórnych wykazało, że NSC z SVZ wymagają co najmniej EGF do efektywnego samoodnawiania oraz że kombinacja EGF i bFGF poprawia zdolność komórek do samoodnawiania (Rycina 2B). Ponadto, dla szczegółowej analizy dynamiki wzrostu w różnych warunkach pożywkowych, zarejestrowano liczbę wysianych i uzyskanych komórek w ciągu 7 pasaży. Krzywe wzrostu otrzymane dla różnych warunków pożywkowych potwierdziły, że hodowle uzupełnione samym EGF lub kombinacją EGF z bFGF wykazywały lepszą dynamikę wzrostu w porównaniu z hodowlami uzupełnionymi wyłącznie bFGF (Rycina 2C). Zbiorczo wyniki te potwierdzają, że jednoczesne zastosowanie EGF i bFGF zwiększa wydajność hodowli NSC in vitro.

Aby zbadać liczbę NSC w obszarze SVZ w różnych okresach wieku postnatalnego oraz ocenić wpływ starzenia się myszy na wydajność hodowli neurosfer, wypreparowano tkankę SVZ z myszy w wieku od 1 do 12 miesięcy. Warto zauważyć, że nasze wyniki wykazały znaczny spadek liczby sfer pierwotnych wraz z wiekiem, przy czym maksymalna wydajność w zakresie liczby sfer wystąpiła w wieku około 2 do 4 miesięcy (Rysunek 2D). Dodatkowo, aby ocenić zdolność do samoodnawiania NSC podczas subkultywacji, NSCs z myszy w wieku od 2 do 4 miesięcy poddano subkultywacji i wysiano w gęstości klonalnej (5 komórek/µL) w medium kompletnym. Ilościowe oznaczenie liczby sfer wtórnych w kolejnych pasażach wskazało na znaczny spadek wydajności hodowli wraz z liczbą pasaży (Rysunek 2E). Na podstawie wszystkich tych obserwacji, w celu dalszej optymalizacji warunków hodowli NSC, zaleca się przeprowadzanie testów samoodnawiania podczas wczesnych pasaży.

Nukleofekcja jest wysoce wydajną techniką manipulacji ekspresją genów w dorosłych NSCs
Z uwagi na to, że NSCs są trudne do transfekcji, w celu manipulacji ekspresją genów przedstawiamy tutaj protokół nukleofekcji zapewniający wyższy odsetek skutecznego dostarczenia genów bez konieczności stosowania transdukcji wirusowej. Po wyizolowaniu i hodowli poszczególnych SVZ od myszy w wieku od 2 do 4 miesięcy, NSCs poddano nukleofekcji plazmidem niosącym GFP, zgodnie z opisem (Rycina 3A). Detekcja komórek GFP-dodatnich 2 dni po nukleofekcji wykazała wydajność w zakresie od 30% do 50%, co jest zgodne z poprzednią literaturą28. Aby specyficznie wyizolować pomyślnie nukleofektowane NSCs, komórki posortowano za pomocą FACS na podstawie intensywności fluorescencji GFP od 3 do 5 dni po nukleofekcji (Rycina 3A-C). Około 40% analizowanych przed FACS komórek wykazywało wysokie poziomy fluorescencji GFP i zostało następnie wybranych poprzez sortowanie (Rycina 3C). Ponowne wysiewanie posortowanych GFP+ NSCs wykazało, że wszystkie komórki były GFP-dodatnie, co potwierdziło poprawność metody izolacji komórek opartej na nukleofekcji (Rycina 3D). Co istotne, nukleofektowane NSCs zachowały żywotność podczas kolejnych pasaży, co potwierdza wykonalność nukleofekcji dla dorosłych NSCs. Wyniki te podkreślają skuteczność łączenia nukleofekcji i FACS w celu uzyskania czystej hodowli zmodyfikowanych NSCs.

Jako przykład modulacji genów w dorosłych NSC zastosowano osłabienie ekspresji genu za pomocą nukleofekcji krótkich interferujących RNA (shRNA). W szczególności, shRNA celujące w gen Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N (Snrpn), zawierające reporter CAG-GFP (shSNRPN), poddano nukleofekcji w kulturach NSC pochodzących od 2-miesięcznych myszy. Obniżenie poziomu Snrpn zostało potwierdzone za pomocą qPCR oraz immunocytochemii w komórkach poddanych nukleofekcji plazmidem shSNRPN, natomiast nie zaobserwowano go w przypadku kontrolnego plazmidu shSCRAMBLE (Rysunek 3E,F)29. Aby wyjaśnić wpływ obniżenia ekspresji Snrpn na zdolność NSC do samoodnowy, w nuklefekowanych komórkach przeprowadzono test niskiej gęstości (Rysunek 3F,G). Ilościowe oznaczenie wtórnych neurosfer w nuklefekowanych kulturach wykazało zwiększoną zdolność do tworzenia neurosfer po obniżeniu ekspresji Snrpn (Rysunek 3G). Test ten podkreśla skuteczność nukleofekcji w manipulowaniu ekspresją genów w dorosłych NSC i, co bardziej szczegółowe, identyfikuje rolę Snrpn w utrzymywaniu właściwości macierzystości w dorosłych NSC.

Procedura sekcji neurologicznej, przekroje mózgu A-L, analiza anatomiczna krok po kroku.
Rysunek 1: Szczegółowy opis sekcji SVZ. (A) Po wyjęciu mózgu myszy, cały organ jest przenoszony w DPBS na silikonową podkładkę do sekcji. (B) Za pomocą skalpela usuwa się z mózgu OB i móżdżek. (C) Mózg jest dzielony na dwie półkule, aby móc przeprowadzić sekcję każdej z nich osobno. (D) Mózg jest otwierany wzdłuż linii ciała modzelowatego, oddzielając korę i prążkowie od hipokampa, przegrody i wzgórza, co odsłania komory boczne. (E-F) Hipokamp, przegroda i wzgórze są usuwane wzdłuż brzusznej granicy komór. (G-I) Tkanka poza rostralnym i kaudalnym końcem SVZ oraz kora są usuwane wzdłuż ciała modzelowatego. (J-K) Tkankę przechyla się tak, aby SVZ znajdowało się z boku, co umożliwia usunięcie tkanki prążkowia znajdującej się pod SVZ. (L) Otrzymywany jest cienki fragment tkanki zawierający SVZ. Czarne przerywane linie wskazują miejsce cięcia. Czarne kropkowane linie wskazują lokalizację SVZ na każdym etapie. Skróty: OB = opuszka węchowa; CB = móżdżek. Pasek skali w A-H: 5 mm; w I-L: 3 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza tworzenia neurosfer; wykresy pokazujące efekty EGF, bFGF; dane dotyczące wzrostu komórek, pasażowania.
Rycina 2: Oba mitogeny EGF i bFGF są niezbędne do optymalnej hodowli i ekspansji NSC in vitro. (A) Obrazy z mikroskopii kontrastowej pierwotnych i wtórnych kultur neurosfer w medium NSC uzupełnionym o oba mitogeny EGF i bFGF lub o każdy z mitogenów osobno. (B) Liczba pierwotnych sfer uzyskanych na mysz i na studzienkę w zależności od składu mitogenów w medium hodowlanym: brak mitogenów (szary, n=9), EGF+bFGF (niebieski, n=33), tylko EGF (zielony, n=20) lub tylko bFGF (różowy, n=19; panel lewy). Liczba wtórnych neurosfer utworzonych przy niskiej gęstości (5 cells/μL) na studzienkę w zależności od składu mitogenów w medium hodowlanym: brak mitogenów (szary, n=11), bFGF (różowy, n=18), EGF (zielony, n=18) lub EGF+bFGF (niebieski, n=37; panel prawy). Zastosowano test Kruskala-Wallisa z analizą post hoc Dunna. (C) Krzywe wzrostu przedstawiające całkowitą liczbę komórek po 8 pasażach w różnych kulturach neurosfer, zależnie od obecności mitogenów w medium hodowlanym: bFGF (różowy, n=5), EGF (zielony, n=5) lub EGF+bFGF (niebieski, n=10). Zastosowano analizę regresji liniowej. (D) Liczba pierwotnych neurosfer pochodzących od poszczególnych myszy, wyizolowanych i zagregowanych z zwierząt na różnych etapach rozwoju postnatalnego. Zastosowano analizę regresji liniowej. Wartość n podano w nawiasach. (E) Liczba wtórnych neurosfer utworzonych przy niskiej gęstości (5 cells/µL) w kolejnych pasażach in vitro w celu oceny ich zdolności do samoodnawiania. Zastosowano test Kruskala-Wallisa; podano wartości p: *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. n.s: brak istotności statystycznej. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali w A wynosi 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat nukleofekcji i analiza FACS ekspresji GFP; ekspresja mRNA Snrpn; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 3: Schemat procesu nukleofekcji oraz selekcji komórek nukleofektowanych za pomocą FACS. (A) Przegląd procesu nukleofekcji i selekcji komórek nukleofektowanych za pomocą FACS. 1) Roztwór plazmidowego DNA łączy się z roztworem do nukleofekcji i dodaje do komórek. Mieszaninę tę przenosi się następnie do kuwety w celu przeprowadzenia nukleofekcji. 2) Kuwetę zawierającą DNA i komórki umieszcza się w nukleofektorze, gdzie przyłożony jest impuls elektryczny. Dla kultur neurosfer izolowanych z dorosłej SVZ zaleca się stosowanie programu A-031 NSC. 3) Po nukleofekcji komórki przenosi się do kolby zawierającej pełną pożywkę uzupełnioną o EGF i bFGF. 4) Komórki są sortowane metodą FACS na podstawie ekspresji reportera zawartego w plazmidowym DNA. 5) Posortowane komórki poddawane są dalszej hodowli do następnych eksperymentów.(B) Strategia selekcji oparta na FACS i bramkowanie dla nukleofektowanych NSCs. Najpierw wybierane są żywe komórki na podstawie wysokiego FSC-A i wysokiego SSC-A (wykres po lewej), a następnie eliminowane są dublety i triplety komórkowe poprzez analizę parametrów FSC-A względem FSC-H (wykres po prawej). (C) Bramkowanie FACS dla komórek nukleofektowanych na podstawie ich ekspresji GFP (fluorescencja SSC-A względem FITC-A). (D) Obrazy z mikroskopii kontrastowej i obrazy fluorescencji GFP nukleofektowanych NSCs przed (n=3) i po (n=4) selekcji FACS (panel lewy). Procent nukleofektowanych komórek GFP+ przedstawiono przed i po selekcji FACS (panel prawy). Zastosowano test t. (E) Analiza ilościowej PCR (qPCR) ekspresji Snrpn w proliferujących NSCs nukleofektowanych specyficznym dla Snrpn shRNA (n=4). Jako kontrolę zastosowano nukleofekcję za pomocą shRNA SCRAMBLE (n=4). Zastosowano test t. (F) Obrazy immunocytochemiczne przedstawiające SNRPN (na czerwono) w NSCs 7 dni po nukleofekcji shRNA (panele zewnętrzne). Do barwienia kontrastowego DNA wykorzystano DAPI. Reprezentatywne obrazy przedstawiające neurosfery pochodzące z NSCs w warunkach shSNRPN i shSCRAMBLE (panele środkowe). (G) Koni quantyfikacja liczby neurosfer utworzonych w kulturach NSC po nukleofekcji shSNRPN (n=8) lub shSCRAMBLE (n=8). Zastosowano test t. Podano wartości p: *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. n.s: nieistotne. Słupki błędu reprezentują SEM. Pasek skali w D, 10 µm; w F, 100 µm (obrazy o dużym powiększeniu w F, 7 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ze względu na brak ostatecznych markerów do identyfikacji populacji NSC in vivo, analiza NSC opierała się przede wszystkim na obserwacji zachowania komórek wyizolowanych z nisz neurogennych w warunkach ex vivo . Pionierskie prace Reynoldsa i Weissa położyły podwaliny pod ustalenie precyzyjnych warunków hodowli, umożliwiających izolację i ekspansję pojedynczych komórek z tkanki SVZ myszy młodych dorosłych (2 miesiące) w warunkach nieadhezyjnych. Komórki te są zwykle rozmnażane w pożywce wolnej od surowicy zawierającej EGF i bFGF, warunki, które całkowicie uniemożliwiają różnicowanie się w neurony i glej, jednocześnie promując proliferację. Rzeczywiście, w tych warunkach hodowli9 większość komórek umiera w ciągu pierwszych dni hodowli, ale niewielka podgrupa zaczyna się dzielić i przede wszystkim tworzy unoszące się neurosfery9. Dysocjacja enzymatyczna i subkultura tych agregatów komórkowych ułatwiają rozmnażanie kultur, wykazując zdolność tych kultur do samoodnawiania się.

Warto zauważyć, że kultury neurosfery wykazują potencjał ekspansji tylko z dodatkiem EGF, podczas gdy NSC hodowane w pożywce zawierającej tylko bFGF nie wykazują długoterminowej proliferacji komórek30. Oba dowody wskazują na EGF jako główny mitogen samoodnawiający się NSC. Niemniej jednak obecność zarówno EGF, jak i bFGF w pożywce hodowlanej poprawia zdolność NSC31 do samoodnawiania, a także przyczynia się do zrównoważenia potencjału różnicowania w astrocyty, neurony i oligodendrocyty 32,33,34,35. Co więcej, zastosowanie określonej mieszaniny hormonów i czynników zamiast komercyjnych alternatyw w celu uzupełnienia pożywki zapewnia wysoką jakość i powtarzalność kultur NSC. W tych warunkach mysie hodowle NSC mogą przetrwać jako stabilne linie komórkowe bez ulegania unieśmiertelnieniu. Niemniej jednak problemem w hodowlach neurosfery jest potencjał proliferacyjnych populacji komórek do przechodzenia transformacji genetycznych, omijając mechanizmy regulacyjne cyklu komórkowego i prowadząc do unieśmiertelnionego fenotypu. Dlatego, chociaż kultury neurosfery są wysoce rozszerzalne, kultury powyżej 10 pasaży in vitro są zwykle odrzucane do badań, ponieważ mogą ulegać starzeniu replikacyjnemu i mogą pojawić się komórki o nieprawidłowej zawartości chromosomów lub nieregularnej dynamice wzrostu. Co więcej, stosowanie długoterminowych kultur neurosfery musi być stale monitorowane. Hodowle neurosfery oferują również możliwość zbadania ich cech i potencjału w kontrolowanym środowisku, zapewniając bardziej precyzyjne i regulowane ustawienia, które mogą być modulowane i monitorowane dokładniej niż in vivo. Dzięki analizom klonogennym lub populacyjnym in vitro możliwe jest ilościowe określenie zdolności tych komórek do samoodnawiania się i proliferacji, ułatwiając identyfikację mechanizmów leżących u podstaw tych właściwości.

Niemniej jednak, pomimo obszernej listy zalet pracy z NSC in vitro, charakter tego protokołu hodowli i delikatność NSC stanowią wyzwanie w tej dziedzinie. Na przykład liczba pierwotnych neurosfer generowanych podczas typowej sekcji może się znacznie różnić w zależności od umiejętności i precyzji eksperymentatora. Wyniki neurosfery pierwotnej ilustrują tę zmienność w liczbie neurosfer pierwotnych uzyskanych z SVZ 2-miesięcznych myszy, w zakresie od 500 do 3000 neurosfer. Do tej zmienności mogą przyczyniać się różne czynniki. Po pierwsze, precyzja precyzji preparacji minimalizuje niechcianą tkankę miąższową, która hamuje powstawanie pierwotnej sfery. Po drugie, generowanie małych fragmentów tkanki SVZ pozwala na wydajne trawienie enzymatyczne i rozcieranie, zmniejszając w ten sposób utratę komórek. Podkreśla to potrzebę wystarczającego wcześniejszego przećwiczenia protokołu preparacji i dopracowanego rozwoju przetwarzania tkanek podczas tworzenia kultur neurosfery.

Innym ograniczeniem tych kultur jest fakt, że neurosfery mogą składać się zarówno z NSC, jak i komórek progenitorowych, co utrudnia rozróżnienie tych dwóch populacji w kulturach pierwotnych. Chociaż doniesiono, że różne markery, takie jak GFAP, Nestin, Musashi i SOX2, są wyrażane przez NSC8, żaden z nich nie był związany wyłącznie z NSC. Pojawiające się techniki FACS oparte na ekspresji antygenu na powierzchni komórki umożliwiły izolację NSC i ich potomstwa. Badania te wykazały, że przodkowie wzmacniający tranzyt nie są w stanie tworzyć neurosfer po przejściu25,36. Tak więc, podczas gdy związek między komórkami SVZ a komórkami inicjującymi neurosferę wymaga dalszego udoskonalenia 18,19,20,21,22,23, zdolność neurosfer do szeregowego pasażowania przez dłuższy czas może odzwierciedlać obecność NSC w hodowlach.

Ten system hodowli neurosfery posłużył jako solidny model do badania wpływu szlaków sygnałowych i ekspresji genów na utrzymanie zdolności do samoodnawiania się NSC in vitro15,29. Jednym z podejść do badania tych aspektów jest transfekcja NSC w celu nadekspresji lub zniszczenia określonych genów. Można to osiągnąć za pomocą różnych technik, w tym metod wirusowych i niewirusowych. Chociaż wektory wirusowe często osiągają wysoką wydajność transferu genów, mają one istotne ograniczenia, takie jak wysokie wymogi bezpieczeństwa i czasochłonna produkcja wektorów26. I odwrotnie, klasyczne metody transfekcji, takie jak lipofekcja i elektroporacja, osiągają bardzo niskie wskaźniki transfekcji, co czyni je niewykonalnymi w przypadku komórek trudnych do transfekcji. Technologia nucleofekcji oferuje przyjazne dla użytkownika podejście poprzez połączenie specyficznych dla typu komórki rozwiązań nukleofekcji z unikalnymi parametrami elektrycznymi dla każdego typu komórki37,38. Zapewnia to transfer DNA bezpośrednio do jądra komórkowego39, umożliwiając włączenie DNA w sposób niezależny od cyklu komórkowego. W związku z tym nukleofekcja jawi się jako realna technika transfekcji trudnych do transfekcji komórek, takich jak mysie NSC28,40.

Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że dla każdego nukleofekcji zalecane i konieczne jest minimum 2 x 106 komórek, chociaż w optymalnych warunkach można użyć mniejszej liczby komórek na pojedynczy nukleofekcję (tj. 5 × 105 komórek). Kolejną wadą tej metody jest to, że jakość i stężenie DNA wykorzystywanego do nukleofekcji znacząco wpływają na efektywność transferu genów. Stosowanie przygotowanego DNA wolnego od endotoksyn jest wysoce zalecane, aby zapobiec zwiększonej śmiertelności komórek z powodu obecności endotoksyn. Ponadto użycie więcej niż 6 μg całkowitego DNA do nukleofekcji może znacznie zmniejszyć zarówno wydajność transferu genów, jak i żywotność komórek. Wreszcie, podawanie impulsów elektrycznych ma również kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek nukleofektowanych.

W tej pracy zilustrowaliśmy manipulację ekspresją genu Snrpn poprzez zastosowanie strategii polegającej na regulacji w dół jego ekspresji za pomocą plazmidów episomalnych. Plazmidy te nie są zintegrowane z genomem komórek, a ponieważ NSC nadal namnażają się in vitro, wprowadzone DNA zostanie następnie rozcieńczone wzdłuż podziału komórkowego, a tym samym straci efekt manipulacji genetycznej. Dlatego strategia ta jest cenna dla badania skutków ostrej zmiany w krótkim czasie lub do datowania narodzin komórek in vitro. Dostępne są pewne alternatywy do oceny bardziej długotrwałego efektu perturbacji genów. Na przykład można zastosować system integracyjny, taki jak piggyBAC oparty na transpozonach. System ten polega na wprowadzeniu pożądanej sekwencji kodującej zawartej w plazmidzie otoczonej sekwencjami transpozycyjnymi i konukleofekcie komórek z plazmidem zawierającym sekwencję dla enzymu transpozazy41. Alternatywnie można zastosować transpozony lub systemy CRISPR/Cas.

Dalszy rozwój technologii transfekcji będzie ważnym krokiem w kierunku wysokoprzepustowych testów oceniających rolę różnych genów w fizjologii dorosłych nerwowych komórek macierzystych. W połączeniu z coraz bardziej wyrafinowanymi metodami oczyszczania i namnażania, badania te umożliwią zrozumienie biologii in vitro dorosłych NSC oraz porównanie różnic biologicznych między pływającymi neurosferami a NSC in vivo.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty od Ministerio de Ciencia e Innovación i Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 i EUR2023-143479) do SRF. EJV (FPU20/00795) i DSL (FPU22/03797) są finansowane przez hiszpański program stypendialny Formación de Profesorado Universitario (FPU). LLC (PRE2020-094137) i JDM (PREP2022-000680) są finansowane przez hiszpański program stypendialny Formación de Personal Investigador (FPI). CMM (CIACIF/2022/366) jest finansowany przez Generalitat Valenciana. MIL (CPI-22-481) jest finansowany ze stypendium Programa INVESTIGO (Next Generation EU). Finansowanie w ramach otwartego dostępu zapewnia Ministerio de Ciencia e Innovación.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m butelki z filtrem porów (250 ml)VWR514-0330P
0,22 μ m butelki z filtrem porów (500 ml)VWR514-0332P
12-dołkowapłytka LabClinicsPLC30012
probówka 15 mlFisher10738771
24-dołkowapłytka LabClinicsPLC30024
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)BioWestL0180-100
4&,6- diamidino-2-fenyloindol (DAPI)SigmaD9542
48-dołkowa płytkaThermoFisher150687
6-dołkowaLabClinicsPLC30006
96-dołkowa płytkaLabclinicsPLC30096
Roztwór AccutaseSigmaA6964-100MLOkreślany jako roztwór enzymatyczny
Amaxa Mouse Neural Stem Stem Cell Nucleofector ZestawLonzaVPG-1004
Amaxa Nucleofector IibLonza10700807
Antybiotyk/Antybiotyk (A/A)SigmaA5955
Apo-t-TransferrynaSigmaT2252-1G
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)SigmaF0291
BlasticidinSigma203350
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaB4287-25MG
Sitko komórkowe 40 μ mLabClinicsPLC93040
Trifosforan deoksynukleotydu (dNTPs)NZYTechMB08701
dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418
Dulbecco' s Bufor soli fosforanowej (DPBS)Gibco14080-055
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) F12 1:1Gibco11320-074
E. coli DH5α Competent CellsThermoFisherEC0112
Zrównoważony roztwór soli Earlesa (EBSS)Gibco24010-043
Naskórkowy czynnik wzrostu - rekombinowany przez człowieka (EGF)Gibco53003-018
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)SigmaE-6511
Kleszcze drobnoziarnisteNarzędzia naukowe11274-20
Drobne nożyczki Ostrenarzędzia do nauki14060-09
GlukozaSigmaG-7021
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerazaPromegaM7805Zestaw zawiera odczynniki do PCR
HeparynaSigmaH-3149
InsulineSigmaI6634
LB agar (Lennox)LabKemAGLB-00P-500
Rosół LB (Lennox)LabKemLBBR-00P-500
L-CysteinaSigmaC-8277
L-GlutaminaGibco25030-024
Komora NeubaueraBlaubrandBR718620
Woda wolna od nukleazLabboxWATR-00A-10K
NZYMaxiprep Zestaw bez endotoksynNZYTechMB39901
Papaina LiofilizowanaWorthingtonLS003119
ProgesteronSigmaP-6149
PutrescynaSigmaP-7505
SkalpelFine Science Tools10316-14
Misja shSCRAMBLE(Sigma)SHC003
Misja shSNRPN(Sigma)TRCN0000109285
seleninitem soduSigmaS-9133
Fine Science Tools10090-17
Sterylne filtry strzykawkowe PES (0,22 i mu; m filtr porów)EpicaSFPE-22E-050
T12.5 cm2 KolbaBiofilTCF012025
T25 cm2 KolbaLabClinicsPLC70025
T75 cm2 KolbaLabClinicsPLC70075
PęsetaFine Science Tools91150-20
Szpatułka z

Bibliografia

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  2. Ming, G., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).
  3. Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  4. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  5. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).
  6. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  7. Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone. Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).
  8. Cebrian-Silla, A., et al. Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis. eLife. 10, e67436(2021).
  9. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), New York, N.Y. 1707-1710 (1992).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393(2010).
  11. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  12. Ferrón, S. R., et al. Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis. Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).
  13. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay. Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  14. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), 156059(2019).
  15. Ferrón, S. R., et al. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).
  16. Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).
  17. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).
  18. Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture. Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).
  19. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  20. Wan, F., et al. The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research. Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).
  21. Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. The neurosphere assay, a method under scrutiny. Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).
  22. Campos, L. S. Neurospheres: Insights into neural stem cell biology. Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).
  23. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship. Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).
  24. Parker, M. A. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).
  25. Belenguer, G., et al. Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling. Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).
  26. Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons. Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).
  27. Hagemann, C., et al. High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments. J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).
  28. Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene. Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).
  29. Montalbán-Loro, R., et al. TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn. Nat Comm. 10 (1), 1726(2019).
  30. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
  31. Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation. PLoS One. 8 (1), 53594(2013).
  32. Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells. Neuroscience. 162 (1), 39-54 (2009).
  33. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).
  34. Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6. Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).
  35. Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification. Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).
  36. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).
  37. Kobayashi, N., et al. Gene delivery to embryonic stem cells. Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).
  38. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).
  39. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).
  40. von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6. J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).
  41. Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla neurosferdorosły mózg myszynuklefekcja komórekperturbacja ekspresji genówizolacja komórekekspansja komórektransfekcja plazmidowatechnika elektroporacji
Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.