Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66657

⸱

26 kwietnia 2024

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, National Institute of Science Education and Research, 2Homi Bhabha National Institutes

W tym artykule

Podsumowanie

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Streszczenie

Bakteryjne białka cytoszkieletu, takie jak FtsZ i MreB, pełnią podstawowe funkcje, takie jak podział komórek i utrzymanie ich kształtu. Co więcej, FtsZ i MreB okazały się ważnymi celami dla nowych odkryć przeciwdrobnoustrojowych. Opracowano kilka testów w celu identyfikacji związków ukierunkowanych na wiązanie nukleotydów i polimeryzację tych białek cytoszkieletu, koncentrując się głównie na FtsZ. Co więcej, wiele testów jest albo pracochłonnych, albo kosztownych, a ustalenie, czy te białka są celem komórkowym leku, często wymaga wielu metod. Wreszcie, toksyczność leków dla komórek eukariotycznych również stanowi problem. W tym miejscu opisujemy jednoetapowy test oparty na komórkach w celu odkrycia nowych cząsteczek ukierunkowanych na cytoszkielet bakteryjny i zminimalizowania trafień, które mogą być potencjalnie toksyczne dla komórek eukariotycznych. Drożdże rozszczepieniowe są podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe oparte na mikroskopii, a wizualne badanie przesiewowe może łatwo zidentyfikować dowolną cząsteczkę, która zmienia polimeryzację FtsZ lub MreB. Nasz test wykorzystuje standardową 96-dołkową płytkę i opiera się na zdolności bakteryjnych białek cytoszkieletu do polimeryzacji w komórce eukariotycznej, takiej jak drożdże rozszczepienia. Chociaż opisane tutaj protokoły dotyczą drożdży rozszczepialnych i wykorzystują FtsZ ze Staphylococcus aureus i MreB z Escherichia coli, można je łatwo dostosować do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu, które łatwo łączą się w polimery w dowolnych eukariotycznych gospodarzach ekspresyjnych. Opisana tu metoda powinna ułatwić dalsze odkrywanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych ukierunkowanych na bakteryjne białka cytoszkieletu.

Wprowadzenie

Powszechna oporność na prawie wszystkie antybiotyki stosowane obecnie do zwalczania infekcji bakteryjnych stworzyła natychmiastową potrzebę nowych kategorii antybiotyków. Raport z 2019 r. wykazał, że infekcje oporne na antybiotyki spowodowały utratę 1,27 miliona istnień ludzkich, przyczyniając się do ogólnego wyniku 4,95 miliona zgonów, biorąc pod uwagę powikłania po zakażeniach opornymi bakteriami1. Chociaż nadal są skuteczne w praktyce klinicznej, obecny arsenał antybiotyków jest ukierunkowany głównie na wąskie spektrum procesów komórkowych, koncentrując się przede wszystkim na syntezie ścian komórkowych, DNA i białek. W ciągu ostatniego półwiecza mniej niż 30 białek zostało komercyjnie wykorzystanych jako cele do opracowania nowych środków przeciwbakteryjnych2,3. Ten ograniczony zakres realnych celów znacznie utrudnia odkrywanie nowych antybiotyków lub ich pochodnych do zwalczania bakterii opornych na antybiotyki. W związku z tym, aby przezwyciężyć pojawiający się problem oporności na antybiotyki, konieczne jest opracowanie nowych antybiotyków o nowych celach i mechanizmach działania.

Idealnie byłoby, gdyby cel przeciwbakteryjny był niezbędnym składnikiem wzrostu komórek bakteryjnych, był zachowany we wszystkich filogenetycznie zróżnicowanych gatunkach, wykazywał najmniejszą homologię eukariotyczną i był dostępny dla antybiotyków4. Od czasu odkrycia bakteryjnych białek cytoszkieletu biorących udział w podziale komórek i utrzymaniu ich kształtu, stały się one obiecującym punktem centralnym dla rozwoju związków przeciwbakteryjnych5. Białka te są niezbędne do żywotności bakterii i odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu kształtu komórki (MreB, CreS), podziale (FtsZ, FtsA) i segregacji DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), podobnie jak cytoszkielet w komórkach eukariotycznych. Warto zauważyć, że FtsZ wykazuje niezwykle wysoki poziom konserwacji w szerokim zakresie organizmów prokariotycznych, podczas gdy MreB znajduje się w prawie wszystkich bakteriach w kształcie pałeczek. Tak szerokie rozpowszechnienie i znaczenie dla żywotności komórek sprawiają, że białka te są fascynującym celem badań nad antybiotykami5,6,7.

Kluczowe jest przyjęcie wielotorowego podejścia, które łączy obserwacje in vivo, interakcje in vitro i eksperymenty enzymatyczne, aby dokładnie zweryfikować białka cytoszkieletu bakteryjnego jako główny cel potencjalnego inhibitora7. Pracochłonne procedury lub znaczne koszty obciążają wiele dostępnych w tym celu testów. Są to znaczące przeszkody w ich powszechnym wykorzystaniu w badaniach przesiewowych związków ołowiu, które mogą wpływać na cytoszkielet bakteryjny. Wśród nich mikroskopia wyróżnia się jako wyjątkowo skuteczna i szybka metoda oceny skuteczności związków poprzez bezpośrednie badanie zmian w morfologii komórek. Jednak heteroasocjacja białka docelowego z innymi kompleksami cytoszkieletu, pośrednie efekty wynikające z wiązania poza celem i zmian potencjału błony, trudności w efektywnej penetracji komórki oraz obecność pomp wypływowych, zwłaszcza u bakterii Gram-ujemnych, sprawiają, że określenie dokładnej przyczyny deformacji komórek bakteryjnych jest wspólnie złożone8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, lub drożdże rozszczepienia, jak to jest powszechnie znane, to jednokomórkowy organizm eukariotyczny w kształcie pręcika. Drożdże rozszczepieniowe są szeroko stosowane jako organizm modelowy w biologii komórkowej i molekularnej ze względu na niezwykłą ochronę procesów komórkowych, takich jak cykl i podział komórkowy, organizacja komórkowa i replikacja chromosomów u wyższych eukariontów, w tym ludzi11,12. Co więcej, Errington i współpracownicy wyrazili ekspresję zlokalizowanego na biegunie bakteryjnego białka cytoszkieletu DivIVA w drożdżach rozszczepienia, aby wykazać, że DivIVA gromadzi się na ujemnie zakrzywionych powierzchniach13. Ponownie, Balasubramanian i grupa po raz pierwszy ustanowili drożdże rozszczepienia jako system modelu komórkowego, aby uzyskać nowe informacje na temat mechanizmu, składania i dynamiki białka cytoszkieletu aktynowego E. coli, takiego jak MreB14 i homolog tubuliny FtsZ15. Wykazują również zdolność A22 do skutecznego hamowania polimeryzacji MreB za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, gdy ulega ekspresji w drożdżach14. Następnie inne grupy z powodzeniem wykorzystały drożdże rozszczepieniowe do zbadania właściwości składania białek chloroplastowych FtsZ1 i FtsZ2 16. Niedawno udało nam się udowodnić słuszność koncepcji wykorzystania drożdży rozszczepialnych jako platformy komórkowej do specyficznych badań przesiewowych w kierunku inhibitorów cytoszkieletu bakteryjnego, przeprowadzając kompleksową ocenę wpływu trzech znanych inhibitorów FtsZ - sangwinaryny, berberyny i PC190723 - na białka FtsZ pochodzące z dwóch bakterii chorobotwórczych, a mianowicie Staphylococcus aureus i Helicobacter pylori17. Ponadto ten jednoetapowy test oparty na komórkach okazuje się kluczowy w minimalizowaniu ryzyka identyfikacji związków, które mogą być potencjalnie toksyczne dla komórek eukariotycznych.

W tym raporcie, wykorzystując system rozszczepienia drożdży, proponujemy systematyczny przepływ pracy przy użyciu standardowej płytki 96-dołkowej do półautomatycznego badania przesiewowego i kwantyfikacji wpływu inhibitorów małych cząsteczek ukierunkowanych na FtsZ ze Staphylococcus aureus i MreB z Escherichia coli. W tym przypadku konfigurujemy i optymalizujemy półautomatyczny przepływ pracy przy użyciu uznanych inhibitorów PC190723 i A22, które są ukierunkowane odpowiednio na FtsZ i MreB. Ten przepływ pracy wykorzystuje mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w zmotoryzowany, precyzyjny stolik i automatyczną akwizycję obrazu na standardowej 96-dołkowej płytce, aby poprawić obecną standaryzację. W związku z tym może być stosowany zarówno do średnio-, jak i wysokoprzepustowych ekranów bibliotek syntetycznych substancji chemicznych i pozwala ominąć niektóre z wymienionych powyżej wyzwań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja białek cytoszkieletu bakteryjnego znakowanych GFP w S. pombe

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje na temat wszystkich plazmidów i szczepów użytych tutaj. Tabela 2 zawiera informacje o wszystkich składach mediów.

  1. Wykonaj klonowanie E. coli MreB z N-końcową fuzją GFP (GFP-MreB) i S. aureus FtsZ przenoszącym C-końcowy GFP (SaFtsZ-GFP) do wektora ekspresyjnego S. pombe, pREP42 z promotorem tiaminy o średniej mocy, nmt4118,19 zgodnie z wcześniejszym opisem14,15. Utrzymaj, amplifikuj i izoluj plazmidy ze szczepów E. coli (DH10β) zgodnie z opisem w20,21.
    UWAGA: Można również stosować inne szczepy E. coli, takie jak DH5α, XL1Blue, TOP10 itp. lub inne dostępne na rynku kompetentne komórki rutynowo wykorzystywane do klonowania molekularnego.
  2. Przemiana plazmidów pREP42-GFP-EcMreB i pREP42-SaFtsZ-GFP w S. pombe
    1. Przekształć plazmidy pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) i pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) w szczep S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) przy użyciu metody octanu litu22, jak wspomniano w poniższych krokach.
    2. Dzień 1 - Kultura pierwotna: Zaszczep pętlę świeżo rozpylonej kultury S. pombe w 3 ml autoklawizowanego ekstraktu drożdżowego i bulionu z suplementami (TAK). Inkubować go w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 °C przez noc (O/N).
    3. Dzień 2:
      1. Kultura wtórna: Dodaj około 500 μl kultury podstawowej do 30 ml autoklawowanego bulionu YES. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 - 4 godziny z wytrząsaniem, aż OD600 osiągnie 0,4 - 0,6,
        UWAGA: Do każdej przemiany stosuje się 30 ml.
      2. Osadzać 30 ml kultury w 2,500 x g przez 6-8 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 50 ml sterylnej wody destylowanej (D/W). Ponownie spulchnić i wyrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml sterylnego roztworu i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Odwirować jak powyżej i odrzucić supernatant.
      3. Dodać 1 ml 0,1 M roztworu octanu litu, Tris-EDTA (LiAc-TE) i odwirować jak powyżej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml 0,1 M LiAc-TE. Odwirować i odrzucić supernatant, pozostawiając 100 μl roztworu.
      4. Dodać 10 - 20 μg DNA nośnika (DNA plemników łososia; denaturowane i błyskawicznie schładzane na lodzie) i 2 - 3 μg DNA plazmidu, które należy przekształcić. Delikatnie wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
      5. Dodać 260 μl 40% PEG/LiAc-TE; delikatnie wymieszać. Inkubować przez 60 minut w wytrząsarce lub termomikserze w temperaturze 30 °C, delikatnie mieszając. Dodać 43 μl DMSO; Delikatnie wymieszaj.
      6. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 10 min w termomikserze. Osad w ilości 2 500 x g przez 6-8 minut i odrzucić supernatant. Umyj granulkę 1x 1 ml sterylnego D/W.
      7. Osad należy wyrzucić supernatantem i ponownie zawiesić osad w 200 μl sterylnego roztworu D/W. Płytka 100 μl na płytkach z minimalnym podłożem Edynburga (EMM) zawierających 5 μg/ml tiaminy (w celu tłumienia promotora nmt41) i suplementy aminokwasowe adeninę (0,225 mg/ml), histydynę (0,225 mg/ml) i leucynę (0,225 mg/ml), ale bez uracylu (marker selekcyjny plazmidu pREP42).
        UWAGA: Na przemian podawaj 70 μL i 130 μL na dwóch różnych płytkach. Dwie różne objętości (70 μl i 130 μl) są siane w celu uzyskania izolowanych kolonii na co najmniej jednej z płytek w zależności od wydajności transformacji, która może się różnić w zależności od eksperymentu.
      8. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aż pojawią się kolonie. Wymieszać pojedynczą kolonię ze 100 μl sterylnego roztworu i rozprowadzić na świeżej płytce EMM zawierającej tiaminę, ale pozbawionej uracylu, jak opisano powyżej.
      9. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aż pojawi się kompletny trawnik. Zezłomuj wyrośnięty trawnik komórek za pomocą pętli zaszczepiającej i ponownie zawieś go do 1 ml pożywki YES zawierającej 30% glicerolu w kriofiolce.
      10. Błyskawicznie zamrozić kriofiolkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu zachowania zamrożonych zapasów drożdży.
  3. Ekspresja białek cytoszkieletu bakteryjnego w drożdżach rozszczepieniowych
    1. Aseptycznie rozprowadź plaster z wywaru glicerolu na świeżą płytkę specyficzną dla drożdży, aby uzyskać wystarczającą ilość kultury do dalszych eksperymentów.
      UWAGA: W przypadku pREP42 użyliśmy płytki agarowej EMM (minimalna pożywka) zawierającej adeninę, histydynę i leucynę (jak przy użyciu szczepu S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) bez uracylu (uracyl obecny w pREP42 jako marker selekcyjny). Do płytek agarowych dodajemy 15 - 20 μM tiaminy (ponieważ pREP42 ma tiaminowy promotor nmt41), aby stłumić ekspresję interesującego genu podczas wzrostu na płytce.
    2. Zaszczepić małą pętlę inokulum z prążkowanego plastra do 5 ml specyficznej dla drożdży pożywki EMM pozbawionej tiaminy i inkubować przez 10 - 12 godzin w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Ekspresja FtsZ i MreB z różnych gatunków pod promotorem nmt41 w S. pombe może się różnić, zwykle od 16 do 30 godzin. Optymalny czas ekspresji białek GFP-EcMreB i SaFtsZ-GFP w S. pombe wynosi odpowiednio 20 - 24 h i 16 - 20 h w temperaturze 30 °C bez tiaminy.

2. Leczenie kultur S. pombe wykazujących ekspresję białek bakteryjnych cytoszkieletu znakowanych GFP

UWAGA: Wiele różnych cząsteczek leków jest testowanych na wyhodowanych przez noc kulturach drożdży na 96-dołkowej płytce.

  1. Zaszczepić świeżą kulturę, przenosząc 50 μl nocnej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 150 μl świeżych drożdży EMM za pomocą półautomatycznego, 96-dołkowego wielokanałowego urządzenia do pipetowania.
  2. Podczas pipetowania w celu prawidłowego wymieszania za pomocą półautomatycznej, 96-dołkowej pipety wielokanałowej, powoli wprowadzaj różne rosnące stężenia leków do rosnącej kultury, każdy z nich w trzech egzemplarzach, jak pokazano na schemacie w Rysunek 1.
  3. Jako kontrolę pozytywną należy stosować znane już leki, PC190723 na (S. aureus FtsZ) i A22 (na E. coli MreB) w dwóch egzemplarzach.
    UWAGA: Jak wcześniej informowaliśmy, PC190723 i A22 zastosowano odpowiednio w stężeniu 56,2 μM17 i 72,6 μM14,17. Tymczasem traktowanie A22 SaFtsZ i PC190723 traktowanie EcMreB służyły odpowiednio jako kontrole negatywne.
  4. Stosować DMSO jako kontrolę rozpuszczalnika w trzech różnych stężeniach w zależności od najniższego i najwyższego stężenia leków.
    UWAGA: Rozpuszczalnik, w którym rozpuszczane są leki, jest używany jako kontrola rozpuszczalnika.
  5. Inkubować kultury kontrolne i poddane działaniu substancji w temperaturze 30 °C przez 6-10 godzin (do momentu, gdy komórki wykazują ekspresję bakteryjnych białek fluorescencyjnych), a następnie obrazować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.

3. Wizualizacja polimerów

  1. Nałożyć warstwę 20 μl 1 mg/ml konkanawaliny A na każdą studzienkę optycznie przezroczystej dolnej płytki 96-dołkowej (o czarnych ściankach do obrazowania fluorescencyjnego) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odessać płyn i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
  2. Przenieś 20 μl komórek z płytki hodowlanej do każdej odpowiedniej studzienki i pozostaw na 10 minut. Umyj komórkę 3x-4x sterylną pożywką EMM.
  3. Mając założoną soczewkę obiektywu, która ma być używana (patrz krok 3.6), użyj trybu nawigatora w panelu akwizycji oprogramowania do akwizycji obrazu, aby wyrównać 96-dołkową płytkę i pokrycie dołka. Wyrównaj krawędzie studni w nawigatorze.
  4. Następnie wybierz parametry pokrycia studzienki, które obejmują wielopozycyjny wybór obszaru zainteresowania w studzience i użyj adaptacyjnego sterowania autofokusem z trybem na żądanie, aby utrzymać ostrość próbki podczas obrazowania.
  5. Rejestruj obrazy za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i fluorescencji. Ustaw filtry wzbudzenia i emisji odpowiednio 475/28 nm i 525/48 nm, aby zobrazować białka bakteryjne znakowane GFP ulegające ekspresji w drożdżach. Uzyskać stosy Z w kroku o wielkości 0,2 μm przez grubość komórek drożdży (5 μm).
  6. Rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw olejowy 100x 1,4-NA i kamerę sCMOS o wymiarach 2,000 x 2,000 (rozmiar piksela 6,5 μm x 6,5 μm). Użyj systemu oświetlenia LED do wzbudzenia fluoroforu.
    UWAGA: Każdy system mikroskopu epifluorescencyjnego, który ma zmotoryzowany stolik dla płytki 96-dołkowej z precyzyjnym pozycjonowaniem wielopunktowym, powinien być odpowiedni. Uzyskaj wszystkie obrazy komórek kontrolnych i leczonych lekami z podobnym czasem ekspozycji (zwykle w zakresie 0,3 - 0,5 s) przy binowaniu 1 x 1 i oświetleniu na poziomie 15% - 20%, aby zminimalizować zmienne eksperymentu i zachować spójność.

4. Kwantyfikacja obrazów za pomocą ImageJ

  1. Przetwarzaj obrazy komórek i mierz liczbę plamek na komórkę oraz gęstość dla FtsZ17. W przypadku MreB zmierz gęstość i anizotropię23 i porównaj komórki kontrolne i leczone za pomocą Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. Korzystając z obrazów z kanału DIC, najpierw obrysuj poszczególne komórki drożdży za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego i zapisz jako obszar zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI. Ten krok nie jest jeszcze zautomatyzowany, ale niedawno opracowane narzędzia wykorzystujące uczenie maszynowe25,26 mogą zostać podjęte i włączone w najbliższej przyszłości.
  3. Zamaskuj zewnętrzny obszar komórki i wypełnij go na czarno zgodnie z opisem w27.
  4. Użyj makra analizy OPS threshold IJ1, wbudowanej funkcji na Fidżi, aby policzyć liczbę spotów24.
  5. Użyj metody otsu do automatycznego progowania i zamaskuj segmentowane cząstki. Uruchom wtyczkę, aby przeanalizować cząstki za pomocą makra.
  6. Aby zmierzyć gęstość polimeru (ilość cytoszkieletu na jednostkę powierzchni w komórce), przetwarzaj obrazy zgodnie z opisem, w tym etapy maskowania i szkieletyzacji27,28. Użyj filtra Lpx 2Dfilter we wtyczce lpx, aby zszkieletować obrazy.
  7. Aby uzyskać szczegółowe informacje, sprawdź tę ostatnią publikację17. Przeprowadź kwantyfikację polimerów EcMreB, jak wspomniano wcześniej w23, użyj anizotropii, aby określić ilościowo organizację przestrzenną za pomocą FibrilTool29 zgodnie z wcześniejszym opisem23.
    UWAGA: Te metody analizy mogą być stosowane do ilościowego oznaczania wszelkich innych białek cytoszkieletu bakteryjnego, które są leczone lub nieleczone lekami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie płytki 96-dołkowej do przesiewania leków
Zastosowanie S. pombe do ekspresji białka FtsZ z S. aureus z GFP przyłączonym do końca C-końcowego z wektora (pREP42) zawierającego represowalny tiaminą promotor nmt41 o średniej sile zostało wcześniej opisane17; podobnie białko MreB z E. coli z GFP przyłączonym do końca N-końcowego było również ekspresjonowane w S. pombe14. Wykazaliśmy również, że PC1907...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi poważne globalne zagrożenie dla zdrowia i istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe antybiotyki o nowych celach. Cytoszkielet bakteryjny stał się atrakcyjnym celem do opracowania nowych antybiotyków, a małocząsteczkowe inhibitory białka podziału komórkowego FtsZ, takie jak TXA709, są już w fazie I badań klinicznych30. Opracowano kilka metod identyfikacji inhibitorów polimeryzacji FtsZ 7,31

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

SMP, SR i AKS dziękują za stypendia otrzymane od National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS potwierdza wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej, a prace te są wspierane przez grant badawczy dla RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) z Wydziału Biotechnologii (DBT). Autorzy dziękują również V Badireenathowi Konkimalli za jego komentarze, sugestie i dyskusje podczas opracowywania protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowy CC2 Optical CVG sterylny, z pokrywką. BlackThermo Naukowo-Handlowy;
Płytka 96-dołkowaCorning  
A22 ChlorowodorekSigma SML0471rozpuszczony w DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L podłoża 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 
Minimalny nośnik w Edynburgu (EMM Agar lub EMM Broth)FormediumTMPMD0210Poniżej znajduje się skład
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 z 2-pozycyjnym suwakiemEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L podłoża 
Mikroskop odwróconej fluorescencji Leica DMi8Leica MicrosystemsNiemiecka firma
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L podłoża 
Octan litu Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Rozpuszczony w DMSO
Glikol polietylenowy (PEG)Sigma 
ThiamineSigmaT4625Filtr sterylizowany
Tris-ChlorowodorekMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L podłoża, Przechowywać roztwór w temperaturze 36&; C
TAK (Ekstrakt drożdżowy + suplementy) AgarFormediumTMPCM0410Poniżej znajduje się skład
TAK (Ekstrakt drożdżowy + suplementy) BulionFormediumTMPCM0310Poniżej znajduje się skład
Drożdże (S. pombe) Media 
Ekstrakt drożdżowy + suplementy (TAK)
Składg/L
Ekstrakt drożdżowy5
Dekstroza30
Agar17
Adenina0,05
L-histydyna0,05
L-leucyna0,05
L-lizyna HCl0,05
Uracyl0,05
Edinburg minimal medium (EMM)
Składg/Lstężenie
ftalan potasu 314,7 mM
Na2HPO4 2,215,5 mM
NH4Cl 593,5 mM
glukozy2% (w/v) lub 20 g/L  111 mM
Sole (magazynowe x 50)20 ml/L (v/v)
Witaminy (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerały (Stock x 10 000)0,1 mL/L (v/v)
Sole x 50  52,5 g/l MgCl2,6H20 (0,26 M) 52,50,26 M
0,735 mg/l CaCl2,2H20 (4,99 mM) 0,0007354,99 mM
50 g/l KCl (0,67 m) 500,67 M
2 g/l Na2SO4 (14,l mM)214,1 mM
Witaminy x 1000  1 g/l kwas pantotenowy 14,20 mM
10 g/l kwasu nikotynowego 1081,2 mM
10 g/l inozytolu 1055,5 mM
10 mg/l biotyny 0,0140,8 i mikro; M
Minerals x 10 000  kwas borowy580,9 mM
MnSO4   423,7 mM
ZnSO4,7H2O413,9 mM
FeCl2,6H2O   27,40 mM
kwas molibdenowy 0,42,47 mM
KI 16,02 mM
CuSO4,5H2O 0,41,60 mM
kwas cytrynowy 1047,6 mM
Szczepy/ Plazmidy
SzczepyOpisOdniesienie
CCD190Escherichia coli DH10β  Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan i wsp., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma i wsp., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan i wsp., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma i wsp., 2023
160376CLS3370317275202398

Bibliografia

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69(2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151(2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092(2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26(2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825(2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754(2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364(2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przesiewy drożdży rozszczepiającychodkrywanie leków przeciwbakteryjnychpolimeryzacja FtsZpolimeryzacja MreBtest oparty na komórkachprzesiewy wysokoprzepustowemikroskopia fluorescencyjnapłytka 96-dołkowaeukariotyczny system ekspresyjny
Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.