Zastosowanie nienadzorowanej analizy czynników multiomicznych w celu odkrycia wzorców zmienności i procesów molekularnych związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi

Podsumowanie

Prezentujemy elastyczny, rozszerzalny przepływ pracy oparty na laboratorium Jupyter do nienadzorowanej analizy złożonych zestawów danych multi-omicznych, który łączy różne etapy wstępnego przetwarzania, oszacowanie modelu analizy czynnikowej multi-omicznej i kilka dalszych analiz.

Streszczenie

Mechanizmy choroby są zazwyczaj skomplikowane i regulowane przez interakcję kilku różnych procesów molekularnych. Złożone, wielowymiarowe zestawy danych są cennym zasobem do generowania większej ilości informacji na temat tych procesów, ale analiza takich zestawów danych może być trudna ze względu na dużą wymiarowość wynikającą na przykład z różnych stanów chorobowych, punktów czasowych i omiki rejestrującej proces w różnych rozdzielczościach.

Tutaj prezentujemy podejście do analizy i eksploracji tak złożonego zestawu danych multiomicznych w sposób nienadzorowany, stosując multi-omiczną analizę czynnikową (MOFA) do zestawu danych wygenerowanych z próbek krwi, które rejestrują odpowiedź immunologiczną w ostrych i przewlekłych zespołach wieńcowych. Zestaw danych składa się z kilku testów o różnych rozdzielczościach, w tym danych cytokin na poziomie próbki, proteomiki osocza i sekwencji pierwszych neutrofili oraz danych sekwencyjnych RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq). Dodatkową komplikacją jest pomiar kilku różnych punktów czasowych dla każdego pacjenta i kilku podgrup pacjentów.

Procedura analizy przedstawia sposób integracji i analizy danych w kilku krokach: (1) Wstępne przetwarzanie i harmonizacja danych, (2) Szacowanie modelu MOFA, (3) Dalsza analiza. W kroku 1 opisano, jak przetwarzać cechy różnych typów danych, odfiltrowywać obiekty o niskiej jakości i normalizować je w celu zharmonizowania ich rozkładów na potrzeby dalszej analizy. Krok 2 pokazuje, jak zastosować model MOFA i zbadać główne źródła wariancji w zestawie danych we wszystkich parametrach omicznych i cechach. W kroku 3 przedstawiono kilka strategii dalszej analizy przechwyconych wzorców, łącząc je z warunkami chorobowymi i potencjalnymi procesami molekularnymi rządzącymi tymi stanami.

Ogólnie rzecz biorąc, prezentujemy przepływ pracy do eksploracji danych bez nadzoru w złożonych zbiorach danych multi-omicznych, aby umożliwić identyfikację głównych osi zmienności składających się z różnych cech molekularnych, które mogą być również zastosowane w innych kontekstach i zbiorach danych multi-omicznych (w tym innych testach przedstawionych w przykładowym przypadku użycia).

Wprowadzenie

Mechanizmy chorobowe są zazwyczaj złożone i sterowane przez oddziaływanie kilku odrębnych procesów molekularnych. Odczytanie złożonych mechanizmów molekularnych, które prowadzą do konkretnych schorzeń lub sterują ewolucją choroby, jest zadaniem o dużym znaczeniu medycznym, ponieważ może dostarczyć nowych informacji niezbędnych do zrozumienia i leczenia chorób.

Ostatnie postępy technologiczne umożliwiają pomiar tych procesów z wyższą rozdzielczością (np. na poziomie pojedynczych komórek) i na różnych poziomach biologicznych (np. DNA, mRNA, dostępność chromatyny, metylacja DNA, proteomika) w tym samym czasie. Prowadzi to do coraz większej ilości generowanych wielowymiarowych zbiorów danych biologicznych, które mogą być analizowane wspólnie w celu uzyskania głębszego wglądu w zachodzące procesy. Jednocześnie łączenie i analiza różnych źródeł danych w sposób biologicznie istotny pozostaje trudnym zadaniem¹.

Wyzwanie stanowią różne ograniczenia technologiczne, szumy oraz zakresy zmienności występujące pomiędzy poszczególnymi omikami. Na przykład dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) są bardzo rzadkie i często podlegają silnym efektom technicznym lub efektom seryjnym. Ponadto przestrzeń cech jest zazwyczaj bardzo rozległa i obejmuje kilka tysięcy mierzonych genów lub białek, podczas gdy wielkość próby jest ograniczona. Sytuację dodatkowo komplikują złożone schematy badawcze, które mogą obejmować kilka stanów chorobowych, czynniki zakłócające, punkty czasowe oraz różne rozdzielczości. Przykładowo, w przedstawionym przypadku użycia różne typy danych były dostępne albo na poziomie pojedynczych komórek, albo na poziomie całej próbki (bulk). Poza tym dane mogą być niekompletne i nie wszystkie pomiary mogą być dostępne dla wszystkich analizowanych obiektów.

Ze względu na te wyzwania, różne omiki oraz zawarte w nich cechy są wciąż często analizowane jedynie oddzielnie², mimo że przeprowadzenie zintegrowanej analizy może nie tylko zapewnić pełny obraz procesu, ale także pozwolić na skompensowanie szumów biologicznych i technicznych z jednej omiki przez inne omiki^3,4. Zaproponowano kilka różnych metod przeprowadzania zintegrowanej analizy danych multiomicznych, w tym metody bayesowskie, metody oparte na sieciach^5,6, multimodalne głębokie uczenie⁷ oraz metody redukcji wymiarowości za pomocą faktoryzacji macierzy^8,9. W przypadku tych ostatnich, wyniki szeroko zakrojonego badania benchmarkingowego¹⁰ wykazały, że metoda MOFA⁹ (multi-omic factor analysis) jest jednym z narzędzi najlepiej dostosowanych do sytuacji, w których dane powinny zostać powiązane z adnotacjami klinicznymi.

Zwłaszcza w złożonych układach, nienadzorowane metody faktoryzacji macierzy stanowią przydatne podejście do redukcji złożoności oraz wyodrębniania wspólnych i komplementarnych sygnałów z różnych źródeł danych i cech. Poprzez dekompozycję złożonej przestrzeni na latentne reprezentacje o niższym rzędzie, główne źródła wariancji w danych mogą być szybko badane i powiązane ze znanymi kowariantami. W przypadku, gdy ten sam wzorzec zmienności jest wspólny dla wielu cech (np. genów lub białek), może on zostać zagregowany do kilku czynników, przy jednoczesnej redukcji szumu. Regularyzację można wykorzystać do zwiększenia rzadkości współczynników modelu, co sprawia, że podejście to jest szczególnie odpowiednie w sytuacjach, gdy przestrzeń cech jest duża, a liczba próbek ograniczona⁹.

Niniejszy protokół przedstawia elastyczny schemat analizy wykorzystujący model MOFA, aby zademonstrować, jak szybko badać złożony wieloomiczny zbiór danych i wyodrębniać główne wzorce zmienności charakteryzujące ten zbiór. Schemat składa się z trzech głównych etapów. W pierwszym etapie, wstępnym przetwarzaniu i harmonizacji danych, zaprezentowano różne strategie preprocessingu w zależności od rodzaju danych wejściowych (scRNA-seq, proteomika, cytokiny, dane kliniczne). Protokół szczegółowo opisuje sposób przetwarzania cech z różnych zbiorów danych wejściowych, filtrowanie cech o niskiej jakości oraz ich normalizację w celu zharmonizowania rozkładów. Pokazujemy również, w jaki sposób decyzje dotyczące wstępnego przetwarzania mogą wpływać na wyniki końcowe. W drugim etapie model MOFA jest stosowany do danych, a wynikający z tego rozkład wariancji może zostać wykorzystany do oceny integracji różnych zbiorów danych. Trzeci etap pokazuje, jak powiązać uchwycone czynniki ze współzmiennymi i odkryć programy molekularne definiujące te czynniki. Dzięki przedstawionemu schematowi byliśmy w stanie wyodrębnić kilka ukrytych czynników powiązanych ze współzmiennymi klinicznymi w zbiorze danych pacjentów cierpiących na zespoły wieńcowe oraz zidentyfikować potencjalne leżące u ich podstaw wielokomórkowe programy odpornościowe z poprzedniego projektu¹¹. W niniejszym opracowaniu wykorzystamy ten zbiór danych, jednak protokół można łatwo zastosować w innych kontekstach, w tym do innych danych omicznych.

Zbiór danych składa się z próbek pobranych od pacjentów ze stabilnymi zespołami wieńcowymi (CCS), ostrymi zespołami wieńcowymi (ACS) oraz z grupy kontrolnej ze zdrowymi tętnicami wieńcowymi (non-CCS) (Rycina 1). ACS jest wywoływane przez pęknięcie blaszki miażdżycowej w istniejącym wcześniej CCS, co prowadzi do nagłego przerwania przepływu krwi do mięśnia sercowego i następującego po tym niedokrwiennego uszkodzenia serca. Uszkodzenie to wywołuje odpowiedź zapalną układu odpornościowego, po której następuje faza naprawcza, trwająca do kilku dni po ostrym zdarzeniu¹². Aby móc scharakteryzować tę odpowiedź immunologiczną u pacjentów z ACS, próbki krwi pobierano w czterech różnych punktach czasowych: w fazie ostrej (TP1); po rekanalizacji (14 [± 8] h) (TP2); 60 [± 12] h później (TP3); przed wypisem (6,5 [±1,5] dni) (TP4) (Rycina 1A). W przypadku osób z CCS oraz pacjentów ze zdrowymi tętnicami wieńcowymi dostępny był tylko jeden punkt czasowy (TP0). Dla wszystkich pacjentów i punktów czasowych wykonano różne analizy na podstawie próbek krwi: pomiary klinicznych markerów stanu zapalnego (kinaza kreatynowa (CK), CK-MB, troponina, białko C-reaktywne (CRP)), scRNA-seq mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs), analizę cytokin, proteomikę osocza oraz dane prime-seq¹³ neutrofili.

Rycina 1: Multiomiczny zestaw danych wejściowych dla zawału mięśnia sercowego. Zestaw danych wejściowych: analizowane dane obejmują próbki krwi pobrane od pacjentów (n = 62) z ostrym zespołem wieńcowym (ACS), przewlekłymi zespołami wieńcowymi (CCS) oraz pacjentów ze zdrowymi tętnicami wieńcowymi (non-CCS). W przypadku pacjentów z ACS próbki krwi pobierano w czterech różnych punktach czasowych (TP1-4), a dla pacjentów z CCS i non-CCS w jednym punkcie czasowym (TP0). Każda kombinacja pacjenta i punktu czasowego jest traktowana w analizie jako oddzielna próbka. W próbkach zmierzono różne analizy omiczne: kliniczne badania krwi (n = 125), scRNA-seq (n = 121), proteomikę osocza (n = 119), analizę cytokin (n = 127) oraz neutrophil prime-seq (n = 121). Następnie zastosowano opisany protokół w celu zintegrowania danych ze wszystkich omik i ich eksploracji przy użyciu modelu MOFA oraz dalszych analiz (analiza czynnikowa, analiza wzbogacenia szlaków). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Jako dane wejściowe do przedstawionego tutaj przepływu pracy wykorzystujemy surowe liczby z danych scRNA-seq po przetworzeniu programem cellranger i kontroli jakości (QC), zgodnie z opisem np. w samouczku preprocessingu scanpy¹⁴. Do adnotacji typów komórek wykorzystaliśmy zautomatyzowany rurociąg Azimuth¹⁵. Liczby są następnie agregowane na poziomie próbki dla każdego typu komórek poprzez wyznaczenie średniej dla wszystkich komórek w każdej próbce i typie komórek (agregacja pseudobulk). Proteomika osocza została uwzględniona jako intensywności znormalizowane i wycentrowane względem mediany, a w przypadku neutrofili przyjęto liczby eksonów UMI (unique molecular identifier) z prime-seq. W przypadku wartości cytokin i klinicznych nie zastosowano wcześniejszego preprocessingu. Dalsze szczegóły dotyczące generowania danych (eksperymentalnych) opisano w odpowiadającym im manuskrypcie¹¹. Ponieważ wyniki przedstawione tutaj opierają się na wykorzystaniu zautomatyzowanej adnotacji Azimuth dla typów komórek w danych scRNA-seq, w przeciwieństwie do strategii opartej na markerach zastosowanej w cytowanej publikacji, wyniki tutaj zaprezentowane są podobne, lecz nie identyczne z tymi przedstawionymi w publikacji. W manuskrypcie wykazano, że strategia adnotacji typów komórek nie zmienia głównych wzorców i interpretacji biologicznych analizy, jednak mogą występować niewielkie różnice w dokładnych wartościach wynikających z modelu. Ogólnie dane wejściowe stanowiły złożony, wielowymiarowy zestaw danych obejmujący różne punkty czasowe i poziomy pomiarów (pojedyncze komórki vs. bulk) dla ponad 10 000 różnych cech (genów, białek, wartości klinicznych). Wykazano, że rygorystyczna strategia preprocessingu i harmonizacji danych, a następnie analiza MOFA, jest użytecznym i szybkim narzędziem do eksploracji danych i wyodrębniania istotnych programów immunologicznych. Każda kombinacja punktu czasowego i pacjenta jest traktowana jako niezależna próbka w analizie MOFA. Każdy typ danych i typ komórek jest traktowany jako osobny widok (view) w analizie MOFA.

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące przygotowania danych wejściowych do przepływu pracy, wykonywania poszczególnych etapów przepływu pracy, dostosowywania konfiguracji, interpretacji wynikowych rycin oraz iteracyjnego korygowania konfiguracji na podstawie przeprowadzonych interpretacji. Przegląd poszczególnych etapów protokołu, wymaganych zbiorów danych wejściowych na każdym etapie oraz wynikowych rycin i zbiorów danych przedstawiono w technicznym schemacie przepływu pracy (Rycina 2).

Rysunek 2: Przegląd technicznego przepływu pracy. Schemat przepływu pracy dla analizy zestawu danych multiomicznych. Różne elementy są wyróżnione różnymi kolorami i symbolami. Notatniki Jupyter należące do etapu Wstępnego Przetwarzania i Harmonizacji Danych (1) są zaznaczone na niebiesko. Notatniki Jupyter należące do etapu „Model MOFA” (2) są zaznaczone na pomarańczowo. Notatniki Jupyter należące do etapu „Analiza Downstream” (3) są zaznaczone na zielono. Jeden notatnik Jupyter służący do porównania wyników jest zaznaczony na żółto. Pliki konfiguracyjne, w których można modyfikować parametry wykonania przepływu pracy, są wyróżnione na fioletowo. Zestawy danych wejściowych wymagane do uruchomienia przepływu pracy są oznaczone symbolem zestawu danych i wyróżnione na szaro. Wszystkie wyniki w formie rysunków generowane podczas wykonywania przepływu pracy są oznaczone symbolem lupy. Zestawy danych generowane podczas wykonywania przepływu pracy są przedstawione jako tabele. Ogólnie przepływ pracy jest wykonywany sekwencyjnie: (1) Wstępne Przetwarzanie i Harmonizacja Danych składa się z dwóch kroków: najpierw generowania tabeli pseudobulk na podstawie danych wejściowych scRNA-seq (01_Prepare_Pseudobulk), a następnie integracji i normalizacji tych danych wraz ze wszystkimi pozostałymi danymi wejściowymi na poziomie próbek (bulk) (02_Integrate_and_Normalize_Data). W ramach tego etapu, za pomocą plików konfiguracyjnych, możliwe jest osobne skonfigurowanie dla każdego zestawu danych, które z indicated kroków wstępnego przetwarzania i normalizacji (np. Sample Filter) powinny zostać zastosowane. (2) „Model MOFA”: uruchamia model MOFA na danych wejściowych wygenerowanych w pierwszym etapie, zgodnie z konfiguracjami określonymi w pliku konfiguracyjnym (03_MOFA_configs.csv). (3) „Analiza Downstream”: składa się z trzech różnych notatników, które mogą być uruchamiane niezależnie od siebie w celu uzyskania informacji na temat wygenerowanych wyników MOFA i powiązania ich z metadanymi próbek (kowariantami) dostarczonymi jako dane wejściowe za pomocą pliku „Sample Meta Data.csv”. (4) „Porównanie Modeli”: jest to niewielki, oddzielny etap, który może być wykorzystany do porównania różnych modeli wygenerowanych w kroku 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Przebieg pracy składa się z kilku notatników Jupyter napisanych w językach R i Python (znajomość języków R i Python nie jest wymagana do uruchomienia procesu, lecz może być pomocna w przypadku wystąpienia błędów). Na różnych etapach protokołu parametry są zmieniane za pomocą plików konfiguracyjnych (plików '.csv' zawierających w nazwie przyrostek '_Configs'). W ramach protokołu opisujemy jedynie parametry, które należy zmienić w stosunku do konfiguracji domyślnej.

Można zmienić również kilka innych parametrów, na przykład w celu dostosowania wstępnego przetwarzania. Dokumentacja tych parametrów wraz z wyjaśnieniami znajduje się w pliku „Documentation_Config_Parameter”, który jest zawarty w pobranym repozytorium.

Protokół

1. Przygotowania: Konfiguracja techniczna i instalacja

UWAGA: Aby uruchomić ten program, należy mieć wcześniej zainstalowane narzędzia wget, git oraz Apptainer na urządzeniu. Instrukcja instalacji Apptainer na różnych systemach (Linux, Windows, Mac) znajduje się tutaj: https://apptainer.org/docs/admin/main/installation.html. Informacje dotyczące instalacji git można znaleźć tutaj: https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git. W zależności od rozmiaru poszczególnych zestawów danych wejściowych zaleca się uruchomienie przepływu pracy na odpowiedniej maszynie (16 CPU, 64GB Memory). Test dymny (smoke test) z wykorzystaniem dostarczonych przykładowych danych można przeprowadzić na maszynie lokalnej. Instrukcje oraz oczekiwane wyniki uruchomienia protokołu na przykładowych danych podano w Supplementary File 1. Kluczowe etapy protokołu, które są wykonywane na opisanym powyżej zestawie danych, przedstawiono w Supplementary Video File 1.

1. Otwórz konsolę i wybierz lub utwórz folder, w którym przechowywany będzie cały kod analizy oraz wyniki. Przejdź do folderu, wpisując w terminalu komendę: cd path_to_folder .
2. Pobierz lub sklonuj repozytorium kodu z Github (https://github.com/heiniglab/mofa_workflow), wpisując w oknie terminala: git clone https://github.com/heiniglab/mofa_workflow.git.
3. Pobierz obraz zawierający wszystkie wymagane instalacje z Zenodo, wpisując w oknie terminala: wget https://zenodo.org/records/11192947/files/mofa_image.sif .
4. Utwórz folder, w którym przechowywane będą wszystkie dane wynikowe, wpisując w oknie terminala: mkdir results.
5. Utwórz folder, do którego zostaną dodane wszystkie dane wejściowe wykorzystywane w analizie, wpisując w oknie terminala: mkdir input_data.
6. Uruchom kontener, który rozpocznie sesję JupyterLab, wpisując w terminalu następującą komendę: apptainer run mofa_image.sif. Skopiuj zwrócony przez komendę adres URL do przeglądarki, co otworzy sesję Jupyter-lab (więcej informacji na temat Jupyter-lab znajduje się w dokumentacji oprogramowania¹⁶).
   UWAGA: W przypadku uruchamiania przepływu pracy lokalnie na laptopie zaleca się zamiast tego użycie komendy apptainer exec mofa_image.sif jupyter-lab, która bezpośrednio zwróci adres hosta lokalnego. Jeśli kontener jest uruchamiany w klastrowym środowisku obliczeniowym, może być konieczne skonfigurowanie przekierowania portów, co można zrobić za pomocą ssh.

2. Inicjalizacja i przygotowanie danych

1. W sesji Jupyter-Lab skorzystaj z menu nawigacyjnego po lewej stronie. Przejdź do folderu input_data, dwukrotnie klikając input_data.
2. Skopiuj wszystkie zbiory danych, które będą służyć jako dane wejściowe do analizy, do katalogu input_data za pomocą funkcji Drag&Drop (przeciągnij i upuść). Przeciągnij plik z folderu, w którym się obecnie znajduje, i upuść go w sesji Jupyter-lab w obszarze poniżej folderu input_data.
   UWAGA: Wszystkie zbiory danych muszą być w formacie .csv lub .h5ad (w przypadku danych z pojedynczych komórek). Wszystkie pliki .csv muszą zawierać zgodną kolumnę sample_id (w całych zbiorach danych należy używać identycznych identyfikatorów). Wszystkie pozostałe kolumny zostaną wykorzystane jako cechy. W pliku h5ad adnotacja komórki musi zawierać dwa identyfikatory określające sample_id oraz cluster_id. Będą one wykorzystywane do agregacji i dopasowania. Zbiory danych omicznych w innych formatach muszą zostać przekonwertowane do określonego formatu .csv przed użyciem (Rysunek 3). Zbiory danych scRNA-seq dostarczone w formacie .h5seurat można przekonwertować na .h5ad, uruchamiając notatnik Jupyter: 00_Data_Conversion.ipynb.
3. Przejdź do folderu configurations, klikając symbol folderu, a następnie dwukrotnie klikając foldery mofa_workflow, scripts oraz configurations. W folderze otwórz plik Data_configs.csv, dwukrotnie go klikając.
4. W kolumnie value dodaj ścieżki do folderów input_data (data_path) i results (result_path). W kolumnie value dla configuration_name dodaj nazwę, która zostanie dopisana jako rozszerzenie pliku do wszystkich zapisanych plików (w niniejszym protokole użyto MI_v1 [Myocardial Infarction version1]) (Rysunek 4).
5. Zapisz zmiany, klikając File > Save CSV File w menu na górze.
6. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu ze skryptami, klikając scripts. Otwórz notatnik inicjalizacyjny, dwukrotnie klikając 00_Configuration_Update.ipynb. Uruchom skrypt, klikając przycisk Restart kernel and run all cells na górze, a następnie klikając Restart w wyskakującym oknie (Rysunek 5).

Rycina 3: Wprowadzanie i konfiguracja danych. Do wykonania schematu analizy wszystkie dane muszą zostać zapisane w określonym folderze input_data. Dla każdego zestawu danych wejściowych należy przygotować oddzielny plik. Dane jednokomórkowe powinny być dostarczone w formacie .h5ad, zawierającym adnotacje komórek w kolumnie cluster_id (wynikające np. z wcześniejszych etapów adnotacji typów komórek) oraz kolumnę sample_id (jednoznacznie identyfikującą każdą oddzielną próbkę poddaną analizie). Wszystkie pozostałe zestawy danych wejściowych powinny być dostarczone w formacie „.csv”, zawierając jedną kolumnę określającą sample_id (odpowiadającą kolumnie w danych jednokomórkowych) oraz cechy wykorzystane w analizie MOFA we wszystkich pozostałych kolumnach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Pliki konfiguracyjne Jupyter-lab. Podczas wykonywania przepływu pracy zmiany parametrów (np. dostosowywanie opcji filtrowania itp.) są określane za pomocą plików konfiguracyjnych '.csv'. W sklonowanym repozytorium zawarto domyślne pliki konfiguracyjne dla każdego kroku. Można je edytować bezpośrednio w konsoli jupyter-lab, w sposób podobny do arkusza kalkulacyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Skrypty Jupyter Notebook. Pełny przepływ pracy składa się z serii notatników Jupyter, które zostaną wykonane sekwencyjnie po zmodyfikowaniu odpowiednich plików konfiguracyjnych. Po dwukrotnym kliknięciu w notatnik Jupyter po lewej stronie, odpowiedni plik zostanie otwarty po prawej stronie. Pełne wykonanie pliku można rozpocząć za pomocą podświetlonego przycisku na górze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Wstępne przetwarzanie i harmonizacja danych

1. Wstępne przetwarzanie – konwersja danych sc do pseudobulk.
   UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko w przypadku użycia danych z pojedynczych komórek (single-cell) w analizie.
   1. Używając menu nawigacyjnego po lewej stronie, przejdź do folderu konfiguracji, klikając dwukrotnie w configuration. Otwórz plik 01_Preprocessing_SC_Data.csv, klikając go dwukrotnie. Sprawdź automatycznie uzupełnione wartości w pliku i, jeśli to konieczne, dostosuj wartości w kolumnie data_name , aby odpowiadały nazwom plików zestawów danych single-cell w folderze input_data , które zostaną wykorzystane w analizie.
      UWAGA: Domyślnie wszystkie nazwy plików .h5ad w folderze danych wejściowych zostaną dodane do pliku konfiguracyjnego w skrypcie inicjalizującym. Jeśli niektóre z zestawów danych nie powinny być użyte w analizie, można je tutaj usunąć.
   2. Zapisz wprowadzone zmiany, klikając w menu na górze File > Save CSV File.
   3. Używając menu nawigacyjnego po lewej stronie, przejdź do folderu scripts , klikając scripts. Otwórz notatnik 01_Prepare_Pseudobulk.ipynb , klikając go dwukrotnie. Uruchom skrypt, klikając przycisk Restart kernel and run all cells na górze, a następnie klikając Restart w wyskakującym oknie.
   4. Używając menu nawigacyjnego po lewej stronie, przejdź do folderu z rysunkami, klikając dwukrotnie najpierw w figures , a następnie w 01_figures. Otwórz nowo wygenerowany wykres FIG01_Amount_of_Cells_overview, klikając go dwukrotnie.
      UWAGA: Wykonanie notatnika może potrwać kilka minut. Po pomyślnym wykonaniu notatnika pojawi się okno pop-up, a plik FIG01_Amount_of_Cells_Overview zostanie zaktualizowany przez notatnik lub wygenerowany na nowo. Kolumna Last Modified może wskazywać czas wygenerowania pliku, co pozwala ocenić, czy jest to plik nowy, czy stary.
   5. Przeanalizuj wykres, aby zidentyfikować klastry typów komórek z bardzo niską liczbą komórek na próbkę. Zanotuj nazwy tych cluster_id, aby wykluczyć je w kolejnych krokach (Rysunek 6).
   6. Używając menu nawigacyjnego po lewej stronie, wróć do folderu konfiguracji, klikając „…” a następnie klikając dwukrotnie w configurations. Otwórz plik 02_Preprocessing_Configs_SC.csv, klikając go dwukrotnie.
   7. Sprawdź wartości w kolumnach configuration_name i data_name oraz dostosuj je w razie potrzeby.
      UWAGA: W skrypcie inicjalizującym wartości te są wstępnie wypełnione wszystkimi nazwami plików .h5ad w folderze danych wejściowych, a wartość configuration_name jest ustawiona zgodnie z wcześniej zdefiniowanym plikiem Data_Configs.csv. W przypadku konieczności wykluczenia plików z analizy lub użycia innego rozszerzenia nazw plików, można to tutaj skorygować.
   8. Dostosuj wartość w kolumnie cell_type_exclusion i dodaj wszystkie cluster_id zidentyfikowane do wykluczenia w poprzednim kroku, oddzielając je znakiem ','.
   9. Zapisz zmiany, klikając File > Save CSV File na pasku nawigacyjnym na górze.
2. Wstępne przetwarzanie – harmonizacja i integracja innych źródeł danych omicznych.
   1. Otwórz plik 02_Preprocessing_Configs.csv, klikając go dwukrotnie, i dostosuj konfigurację wstępnego przetwarzania dla każdego z zestawów danych, które zostaną uwzględnione i są przechowywane w folderze data_input (jeden wiersz na zestaw danych).
   2. Sprawdź wartości w kolumnach configuration_name i data_name oraz dostosuj je w razie potrzeby.
   3. Odpowiednio dostosuj pozostałe parametry w kolumnach, w zależności od tego, które kroki wstępnego przetwarzania powinny zostać zastosowane.
      UWAGA: Dla każdego zestawu danych znalezionego w folderze input_dataset dodano wartości domyślne, które nie są specyficzne dla konkretnych typów danych. W związku z tym konieczne będą korekty. Szczegółowa dokumentacja parametrów znajduje się w pliku Documentation_Config_Parameter.doc.
   4. Zapisz zmiany, klikając File > Save CSV File.
   5. Używając menu nawigacyjnego po lewej stronie, przejdź do folderu scripts , klikając scripts. Otwórz notatnik 02_Integrate_and_Normalized_Data_Sources.ipynb, klikając go dwukrotnie. Uruchom skrypt, klikając przycisk Restart kernel and run all cells na górze, a następnie klikając Restart w wyskakującym oknie.
   6. Używając menu nawigacyjnego po lewej stronie, przejdź do wygenerowanego folderu 02_results , klikając symbol folder , a następnie klikając dwukrotnie w results i 02_results. Sprawdź, czy znajduje się w nim plik 02_Combined_data_'configuration_name'_Integrated.csv zawierający połączony plik wejściowy z wstępnie przetworzonymi danymi.

Rycina 6: Wstępne przetwarzanie i harmonizacja danych. Jednym z wyników etapu „01_Prepare_Pseudobulk” jest wykres „Fig01_Amount_of_Cells_Overview”. Przedstawiono na nim liczbę komórek na próbkę („sample_id”) dla każdego cluster_id (oś y wskazuje typ komórki określony w poprzednich etapach adnotacji typów komórek). W prezentowanych wynikach typy komórek o niskiej liczbie komórek na próbkę zostały wykluczone z dalszej analizy (oznaczone przekreśleniem). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Uruchamianie MOFA

1. W Jupyter-Lab użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu z konfiguracjami, klikając symbol folderu, a następnie dwukrotnie klikając mofa_workflow, a potem dwukrotnie klikając scripts i configurations. Otwórz plik 03_MOFA_Configs.csv, dwukrotnie go klikając.
2. Sprawdź wpisy w kolumnach configuration_name i mofa_result_name i dostosuj je, jeśli należy użyć alternatywnych nazw.
   UWAGA: Wartość mofa_result_name zostanie dodana jako rozszerzenie pliku do wszystkich plików z wynikami wygenerowanych na podstawie MOFA. Może być ona inna niż wartość configuration_name, ponieważ dla tych samych danych wejściowych można uruchomić różne ustawienia MOFA (w niniejszym protokole zastosowano MI_v1_MOFA).
3. Wprowadź liczbę czynników, które mają zostać oszacowane w modelu MOFA (kolumna amount_of_factors) i określ, czy należy zastosować ważenie i skalowanie (kolumny weighting_of_views i scale_views), dostosowując wartości w pliku.
4. Zapisz zmiany, klikając File > Save CSV File.
5. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu scripts, klikając 'scripts'. Otwórz notebook 03_Run_MOFA.ipynb, dwukrotnie klikając plik. Uruchom skrypt, klikając przycisk Restart kernel and run all cells u góry, a następnie klikając Restart w wyskakującym oknie.
6. Przejdź do folderu 03_figures, dwukrotnie klikając figures, a następnie 03_figures. Otwórz wygenerowany wykres FIG03_Overview_Variance_Decomposition_'mofa_result_name i przeanalizuj wynik modelu (Rysunek 7A).
7. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do wygenerowanego folderu 03_results, klikając symbol folderu, a następnie dwukrotnie klikając results i 03_results. Sprawdź, czy zawiera on plik z wartościami czynników próbek 03_Factor_Data_'mofa_result_name'.csv oraz plik z wagami czynników cech 03_Weight_Data_'mofa_result_name'.csv.

5. Analiza końcowa

1. Interpretacja czynników.
   1. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. folder, klikając w folder symbol, a następnie dwukrotne kliknięcie w Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia..
   2. Przygotuj .csv plik (Metadane_Przygotowanych_Próbek.csv) zawierającego wszystkie metadane (kowarianty) próbek, które zostaną poddane analizie w powiązaniu z wygenerowanymi czynnikami. Skopiuj plik do Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. folder za pomocą Opór aerodynamiczny&Kropla umieszczenie pliku w folderze z przeglądem Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. folder
      UWAGA: Musi zawierać identyfikator_próbki kolumnę służącą do dopasowania do wcześniej użytych danych oraz kolejne kolumny dla każdej cechy, która powinna zostać przeanalizowana.
   3. W programie Jupyter-Lab należy użyć menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby powrócić do folderu konfiguracji, klikając w folder symbol, a następnie dwukrotne kliknięcie w przepływ_pracy_mofa, a następnie skrypty i konfiguracjaOtwórz plik 04_Analiza_czynnikowa.csv poprzez dwukrotne kliknięcie.
   4. Sprawdź wpisy dla nazwa_konfiguracji i nazwa_wyniku_mofa zawierają nazwy konfiguracji oraz wyników MOFA, które zostaną przeanalizowane w skrypcie; należy je dostosować w razie potrzeby.
   5. W kowarianty numeryczne kolumna, dodaj nazwy wszystkich kolumn numerycznych w Metadane_Przygotowanych_Próbek.csv plik, który zostanie poddany analizie w odniesieniu do czynników MOFA, rozdzielonych przecinkami (niniejszy protokół wykorzystuje CRP, CK).
   6. W kowarianty kategorycznekolumnie dodaj nazwy wszystkich kolumn kategorycznych w Metadane_Przygotowanych_Próbek.csv plik, który zostanie zbadany w odniesieniu do czynników MOFA, oddzielonych przecinkami (Niniejszy protokół wykorzystuje pomiar).
   7. Zapisz zmiany, klikając w Plik > Zapisywanie pliku CSV.
   8. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu „scripts”, klikając w skryptyOtwórz notatnik 04_Analiza_czynników_downstream.ipynb poprzez dwukrotne kliknięcie. Uruchom skrypt, klikając w Zrestartuj jądro i uruchom wszystkie komórki przycisk u góry i kliknięcie restartu w wyskakującym oknie.
   9. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do 04_ryciny folder poprzez dwukrotne kliknięcie ryciny a następnie 04_rysunkiOtwórz wygenerowane wykresy poprzez dwukrotne kliknięcie na nie i przeanalizuj czynniki odpowiedzialne za interesujące wzorce oraz powiązania: RYC04_Związek_czynników_z_cechami_numerycznymi_
      mofa_result_name.pdf (Rycina 7B). RYS04_Powiązania_czynników_
      z_cechami_kategorycznymi_'mofa_result_name.pdf (Rysunek 7C). FIG04_Przegląd_głównych_cech_na_czynnik _'mofa_result_name.pdf (Rysunek 8A).
2. Analiza cech
   1. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby powrócić do folderu konfiguracji, klikając w … a następnie dwukrotnym kliknięciem w konfiguracjeOtwórz plik 05_Konfiguracje_Analizy_Cech.csv poprzez dwukrotne kliknięcie.
   2. Sprawdź, czy wpisy dotyczące nazwa_konfiguracji i nazwa_wyniku_mofa kolumny odpowiadają nazwom konfiguracji oraz wygenerowanemu wynikowi MOFA, który zostanie wykorzystany w dalszej analizie; w razie potrzeby należy je skorygować.
   3. W czynnik kolumny, dodaj czynnik, dla którego najważniejsze cechy zostaną wykreślone w kolejnym skrypcie.
   4. W kolumnie zmienna facetowania, dodaj nazwę kolumny kolumny kategorycznej w Metadane_przygotowanych_próbekplik .csv, który zostanie wykorzystany do grupowania próbek na wykresie (niniejszy protokół wykorzystuje pomiar)
   5. Zapisz zmiany, klikając w Plik > Zapisz plik CSV.
   6. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do skrypty folder, klikając w skryptyOtwórz notatnik. 05_Analiza_dalsza_Badanie_cech_Mapa_ciepła.ipynb poprzez dwukrotne kliknięcie. Uruchom skrypt, klikając w Zrestartuj jądro i uruchom wszystkie komórki przycisk na górze i kliknięcie Restart w oknie wyskakującym.
   7. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do 05_ryciny folder, dwukrotnie klikając najpierw na ryciny a następnie 05_rycinyOtwórz i przeanalizuj wygenerowany wykres RYS05_Mapa_ciepła_Przegląd_cech__ 'nazwa_wyniku_mofa'.pdf poprzez dwukrotne kliknięcie pliku (Rysunek 8B).
      UWAGA: W zależności od liczby cech przedstawionych na wykresie może być konieczne dostosowanie parametrów szerokość_wykresu i wysokość_wykresu w obrębie 05_Konfiguracje_Analizy_Cech.csv i ponownie uruchom skrypt, aby upewnić się, że wszystkie elementy mieszczą się na wykresie.
3. Analiza ścieżek sygnałowych
   1. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. folder, klikając w folder symbol, a następnie dwukrotnym kliknięciem w Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia..
   2. Przygotuj .csv plik (Przygotowane_Dane_Scieżek.csv) zawierający listę szlaków, które zostaną poddane analizie wzbogacenia. Skopiuj plik do Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. folder za pomocą Opór aerodynamiczny&Kropla umieszczenie pliku w folderze z przeglądem Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. folder
      UWAGA: Musi zawierać trzy kolumny: Identyfikator (unikalny identyfikator ścieżki), gen (geny podane za pomocą nazw genów (SYMBOL) należące do szlaku, jeden wiersz na gen), nazwa_szlaku (nazwa/opis tekstowy szlaków).
   3. W sesji Jupyter-Lab należy użyć menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu konfiguracji, klikając na …, a następnie dwukrotnie klikając na konfiguracjeOtwórz plik 06_Konfiguracje_Scieżek.csv poprzez dwukrotne kliknięcie.
   4. Sprawdź wpis dla nazwa_wyniku_mofa kolumny i upewnij się, że odpowiada ona nazwie wygenerowanego wyniku MOFA, który zostanie wykorzystany do obliczeń wzbogacenia ścieżek.
   5. Sprawdź wpis w typów kolumnę i usuń wpisy w obrębie tej rodzaje kolumna, która nie zawiera cech odpowiadających gen kolumna w Przygotowane_Dane_Scieżek.csv Plik.
      UWAGA: Domyślnie wszystkie różne widoki wykorzystane w modelu MOFA są dodawane do tego pliku podczas wykonywania przepływu pracy. W przypadku wystąpienia widoków, które nie zawierają cech odpowiadających co najmniej jednej ścieżce, należy je usunąć; w przeciwnym razie proces zostanie przerwany. Przykładem może być sytuacja, w której plik ścieżek zawiera jedynie adnotacje ścieżek dla genów, ale istnieje widok zawierający nazwy białek.
   6. Zapisz zmiany, klikając w Plik > Zapisz plik CSV.
   7. Użyj menu nawigacyjnego, aby przejść do skrypty folder, klikając w skryptyOtwórz notatnik 06_Ścieżki_downstream.ipynb poprzez dwukrotne kliknięcie. Uruchom skrypt, klikając w Zrestartuj jądro i uruchom wszystkie komórki przycisk u góry i kliknięcie Restartuj w oknie wyskakującym.
   8. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do 06_ryciny folder, dwukrotnie klikając w ryciny a następnie 06_rycinyOtwórz wygenerowany wykres RYS06_Ścieżki_i_geny_ nazwa_wyniku_mofa poprzez dwukrotne kliknięcie na nim i przeanalizowanie zwizualizowanych szlaków (Rycina 8C).
      UWAGA: Sposób wyboru wizualizowanych ścieżek można skonfigurować w pliku konfiguracyjnym. Więcej szczegółów znajduje się w dokumentacji parametrów.
   9. Użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do wygenerowanych 06_wyniki folder, klikając w folder symbol, a następnie dwukrotnym kliknięciem w wyniki i 06_wynikiSprawdź, czy zawiera on plik z wzbogaconymi szlakami. 06_Wzbogacenie_szlaków__'mofa_result_name'.

6. Porównanie różnych konfiguracji i wersji (Rycina uzupełniająca 1, Rycina uzupełniająca 2, Rycina uzupełniająca 3, Rycina uzupełniająca 4)

1. Aby porównać wpływ zastosowania różnych parametrów/konfiguracji w całym przepływie pracy, należy ponownie uruchomić sekcje 3-5, modyfikując parametry w plikach konfiguracyjnych i używając różnych identyfikatorów configuration_name oraz mofa_result_name .
   UWAGA: Nowe wyniki zostaną zapisane pod tymi nazwami w celu porównania różnych uruchomień.
2. W Jupyter-Lab należy użyć menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu configurations . Otwórz plik 07_Comparison_Configs.csv, klikając go dwukrotnie.
3. W kolumnie mofa_result_name dodaj nazwy wszystkich poprzednich uruchomień MOFA, które mają zostać porównane (jeden wiersz na nazwę/konfigurację, np. MI_v1_MOFA, MI_v2_MOFA).
4. W kolumnie compare_factors dodaj czynniki, które zostaną porównane między modelami. Domyślnie są to Factor1,Factor2,Factor3. (Rycina uzupełniająca 2A).
   UWAGA: W tym skrypcie wartości cech i czynników różnych modeli zostaną porównane poprzez ich korelację. Działa to tylko w przypadku modeli opartych na tych samych próbkach (wskazanych przez sample_id) i tym samym zestawie cech. Jeśli próbki lub cechy nie będą zgodne między porównywanymi wersjami, zostaną one wykluczone z porównania.
5. Zapisz zmiany, klikając File > Save CSV File.
6. Użyj menu po lewej stronie, aby przejść do folderu scripts , klikając scripts. Otwórz notebook 07_Compare_Models.ipynb, klikając go dwukrotnie. Uruchom skrypt, klikając przycisk Restart kernel and run all cells, a następnie klikając Restart w wyskakującym oknie.
7. Użyj menu po lewej stronie, aby przejść do folderu 06_figures, klikając dwukrotnie najpierw w figures , a następnie w 06_figures. Otwórz wygenerowane wykresy, klikając dwukrotnie w pliki, aby przeanalizować podobieństwo różnych wersji:
   FIG07_Variance_Model_Comparison.pdf (Rycina uzupełniająca 2B)
   FIG07_Factor_Correlations.pdf
   (Rycina uzupełniająca 2C)
   FIG07_Feature_Correlations.pdf
   (Rycina uzupełniająca 3C)

7. Rozszerzanie przepływu pracy: Dodawanie innych parametrów i konfiguracji

UWAGA: Oprócz parametrów, które są obecnie konfigurowalne w plikach konfiguracyjnych, mogą być zawarte inne dostosowania w kodzie lub inne parametry. Na przykład sam model MOFA oferuje kilka innych parametrów uczenia¹⁷, które można zmodyfikować bezpośrednio w kodzie lub uczynić konfigurowalnymi za pomocą plików konfiguracyjnych. Kolejna sekcja protokołu przedstawi przykład, jak zrobić to w przypadku dodatkowych parametrów uczenia modelu MOFA. Do tej części wymagana jest znajomość programowania w języku R.

1. W Jupyter-Lab użyj menu nawigacyjnego po lewej stronie, aby przejść do folderu scripts . Otwórz notebook 03_Run_MOFA.ipynb , klikając go dwukrotnie.
2. Kliknij kartę Table of Contents po lewej stronie, a następnie przejdź do podrozdziału 4.3 Set MOFA Training Options and run the Model Training , klikając go. Przewiń w dół, aby zobaczyć wyświetlone w notebooku dane wyjściowe modelu MOFA dotyczące konfigurowalnych parametrów.
3. W pętli R for w kodzie poniżej nagłówka ustawione są wszystkie dane MOFA, model oraz opcje treningu. Poniżej linii model_opts$num_factors = mofa_configs$amount_of_factors[i] dodaj kolejną linię z poniższym kodem:
   model_opts$likelihoods['data_type'] = 'poisson'.
   UWAGA: Zmieni to rozkład, który model przyjmuje jako wejście dla widoku określonego nazwą data_type we wszystkich uruchomieniach MOFA. Przy określeniu rozkładu poisson dla danego typu danych, model zostanie uruchomiony tylko wtedy, gdy cechy dla tego typu danych będą liczbami całkowitymi (np. liczba odczytów z RNA-seq). Aby uzyskać więcej informacji na temat danych MOFA, treningu i opcji modelu, można odwołać się do samouczków i dokumentacji MOFA¹⁷.
4. Zapisz zmiany w notebooku, klikając przycisk Save na górze.
5. Aby przekazać nowe parametry za pomocą plików konfiguracyjnych .csv, użyj nawigacji po lewej stronie, aby przejść do folderu z konfiguracjami, klikając dwukrotnie configurations , a następnie otwórz plik 03_MOFA_Configs.csv, klikając go dwukrotnie.
   1. Dodaj nową kolumnę określającą nazwę parametru, np. number_iterations i wprowadź wartość, np. 1000. Zapisz zmiany, klikając File > Save CSV File.
   2. Użyj menu nawigacyjnego, aby przejść do folderu ze skryptami, klikając scripts. Otwórz notebook 03_Run_Mofa.ipynb, klikając go dwukrotnie. Kliknij kartę Table of Contents po lewej stronie, a następnie przejdź do podrozdziału 4.3 Set MOFA Training Options and run the Model Training , klikając go.
   3. Zastąp linię train_opts$maxiter = 50000 kodem train_opts$maxiter = mofa_configs$column_name[i] (jeśli nazwa dodanej kolumny to number_of_iterations , będzie to train_opts$maxiter = mofa_configs$number_of_iterations[i]).
      UWAGA: Plik konfiguracyjny 03_MOFA_Configs.csv w tym notebooku jest odczytywany na początku notebooku (podrozdział: Prerequisites Configurations & Parameters) jako mofa_config data.frame w sesji, dlatego w tej linii kodu odwołano się do tego obiektu i odpowiadającej mu nowo wygenerowanej kolumny. Ponieważ jednocześnie można uruchomić wiele konfiguracji, i identyfikuje wiersz w data.frame, ponieważ szacowanie modelu jest uruchamiane w pętli for dla wszystkich różnych wierszy w pliku .csv . Zasada odczytywania pliku konfiguracyjnego na początku notebooku w sekcji „Prerequisites Configurations & Parameters” jest taka sama dla wszystkich notebooków i w ten sposób można wprowadzać dalsze modyfikacje.
   4. Zapisz zmiany w notebooku, klikając przycisk Save .

Wyniki

Po pomyślnym wykonaniu schematu pracy generowanych jest kilka tabel i rycin, co przedstawiono na Ryc. 2. Ryciny są umieszczane w folderze /figures (Ryc. 6, Ryc. 7, Ryc. 8, Rycina dodatkowa 1, Rycina dodatkowa 2, Rycina dodatkowa 3, Rycina dodatkowa 4), a tabele zostaną zapisane w określonym folderze /results

Dyskusja

Dzięki przedstawionemu protokołowi przedstawiono modułowy i rozszerzalny przepływ pracy oparty na Jupyter-notebook, którego można użyć do szybkiego eksplorowania złożonego zestawu danych multiomicznych. Główne części przepływu pracy składają się ze wstępnego przetwarzania i harmonizacji danych (oferującej różne standardowe kroki filtrowania i normalizacji danych), estymacji modelu MOFA⁹ oraz przykładowej analizy końcowej. Jednym z głównych kluczowych etapów jest wstępne przetworzenie, integracja i...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Apptainer	NA	NA https://apptainer.org/docs/admin/main/installation.html
Serwer obliczeniowy lub stacja robocza lub chmura  (Środowisko Linux, Mac lub Windows). W zależności od rozmiaru różnych wejściowych zestawów danych zalecamy uruchomienie przepływu pracy na odpowiedniej maszynie (w naszych ustawieniach używamy: 16 CPU, 64 GB pamięci)	Dowolny producent	16 procesorów, 64 GB pamięci	Duża pamięć jest wymagana tylko do przetwarzania surowych danych z pojedynczej komórki. Po wstępnym przetworzeniu późniejsze kroki analizy można również wykonać na zwykłych komputerach stacjonarnych lub laptopach
git	NA	NA	https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git
GitHub	GitHub	NA	, https://github.com/heiniglab/mofa_workflow

: ,