Artykuł metodologiczny

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

DOI:

10.3791/66665

⸱

1 marca 2024

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rzadko stosowana metoda zapisu elektrofizjologicznego, zapis podstawowy, pozwala na analizę cech kodowania smaku, które nie mogą być zbadane konwencjonalnymi metodami zapisu. Zapis bazowy pozwala również na analizę reakcji smakowych na bodźce hydrofobowe, których nie można zbadać tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Owady smakują świat zewnętrzny poprzez włoski smakowe, czyli sensillę, które mają pory na końcach. Kiedy sensillum wchodzi w kontakt z potencjalnym źródłem pożywienia, związki ze źródła pożywienia dostają się przez pory i aktywują neurony w środku. Przez ponad 50 lat odpowiedzi te były rejestrowane przy użyciu techniki zwanej nagrywaniem końcówek. Metoda ta ma jednak poważne ograniczenia, w tym brak możliwości pomiaru aktywności neuronalnej przed lub po kontakcie z bodźcem oraz wymóg, aby degustatory były rozpuszczalne w roztworach wodnych. Opisujemy tutaj technikę, którą nazywamy nagrywaniem podstawowym, która pokonuje te ograniczenia. Zapis podstawowy umożliwia pomiar aktywności neuronów smakowych przed, w trakcie i po bodźcu. W ten sposób pozwala na obszerną analizę reakcji OFF, które występują po bodźcu smakowym. Może być stosowany do badania związków hydrofobowych, takich jak feromony długołańcuchowe, które mają bardzo niską rozpuszczalność w wodzie. Podsumowując, zapis podstawowy oferuje zalety elektrofizjologii jednozmysłowej jako sposobu pomiaru aktywności neuronalnej - wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa, bez potrzeby stosowania narzędzi genetycznych - i pokonuje kluczowe ograniczenia tradycyjnej techniki zapisu końcówek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Owady, w tym muchy drozofilne, są wyposażone w wyrafinowany system smakowy, który pozwala im wydobywać skomplikowane informacje chemiczne z otoczenia. System ten pozwala im rozpoznać skład chemiczny różnych substancji, rozróżniając te, które są odżywcze, i te, które są szkodliwe1,2.

Rdzeniem tego systemu są wyspecjalizowane struktury znane jako włosy smakowe lub sensilla, strategicznie rozmieszczone na różnych częściach ciała. U muszek drosophilidae sensilla ta znajduje się na labellum, który jest głównym narządem smakowym głowy muchy1,2,3,4, a także na nogach i skrzydłach1,2,5,6. Labellum znajduje się na końcu trąbki i zawiera dwa płaty4,7,8. Każdy płat pokryty jest 31 sensylami smakowymi sklasyfikowanymi jako krótkie, długie i pośrednie4,7,8. Każdy z tych sensilli zawiera 2-4 neurony smaku1,2,9,10. Te neurony smakowe wyrażają członków co najmniej czterech różnych rodzin genów, a mianowicie genów receptora smakowego (Gr), receptora jonotropowego (Ir), kieszonkowca (Ppk) i genów potencjału receptora przejściowego (Trp)1,2,11,12,13. Ta różnorodność receptorów i kanałów wyposaża owady w zdolność rozpoznawania szerokiej gamy związków chemicznych, w tym zarówno nieulotnych, jak i lotnych wskazówek1,2,14.

Przez ponad 50 lat naukowcy określali ilościowo reakcję neuronów smaku i ich receptorów za pomocą techniki zwanej nagrywaniem końcówek3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Ta metoda ma jednak poważne ograniczenia. Po pierwsze, aktywność neuronalną można mierzyć tylko podczas kontaktu z bodźcem, a nie przed lub po kontakcie. To ograniczenie wyklucza pomiar spontanicznej aktywności impulsowej i uniemożliwia pomiar odpowiedzi OFF. Po drugie, badane mogą być tylko degustaty, które są rozpuszczalne w roztworach wodnych.

Te ograniczenia mogą być pokonane przez rzadko stosowaną alternatywną technikę elektrofizjologiczną zwaną "zapisem podstawowym". Tutaj opisujemy tę technikę, którą zaadaptowaliśmy z metody używanej przez Marion-Poll i współpracowników24, i pokazujemy kluczowe cechy kodowania smaku, które teraz może wygodnie mierzyć14.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi Uniwersytetu Yale dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Muchy

  1. Umieść 10-15 nowo wynurzonych much w świeżych standardowych fiolkach z kulturami w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 60% w cyklu 12:12 godzin jasno-ciemnym.
  2. Używaj much w wieku 3-7 dni.

2. Bodźce chemosensoryczne

  1. Pozyskaj bodźce chemosensoryczne o najwyższej dostępnej czystości. Przechowuj je zgodnie z zaleceniami sprzedawcy do czasu użycia.
  2. Rozpuść bodźce chemosensoryczne i rozcieńcz do pożądanych stężeń w wodzie lub innym pożądanym, nietoksycznym rozpuszczalniku, takim jak olej parafinowy. Przygotowane roztwory mieszać przez minimum 1 godzinę w przypadku rozpuszczonych związków stałych.

3. Kapilara stymulująca szkło

  1. Pociągnij szklaną kapilarę, aby zatrzymać bodziec z kapilary ze szkła borokrzemianowego (100 mm długości, 1 mm średnicy zewnętrznej, 0.58 mm średnicy wewnętrznej) za pomocą ściągacza do pipet. Dążyć do osiągnięcia średnicy końcówki od 3 μm do 10 μm.
  2. Napełnij szklaną kapilarę preferowanym roztworem stymulacyjnym za pomocą końcówki do pipet z mikroładowarką. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków, które można usunąć poprzez delikatne stukanie.
  3. Jeśli bodziec krystalizuje na końcu, wyczyść lub wymień szklaną kapilarnę bodźca.

4. Elektrody referencyjne i rejestrujące

  1. Użyj prętów wolframowych (o średnicy 127 μm i długości 76,2 mm) zarówno jako elektrody referencyjnej, jak i rejestrującej. Naostrzyć elektrody odniesienia i rejestrującą do średnicy około 1 μm na końcówce (kształty tych elektrod przedstawiono w Delventhal i wsp.36), zanurzając je wielokrotnie przez kilka sekund w roztworze 10% KNO3 (~1 M) lub 10% roztworze KOH (1,8 M).
    UWAGA: To rozwiązanie wymaga prądu (0,3-3 mA), aby ułatwić ten proces.

5. Przygotowanie muchy do podstawowego nagrania

  1. Narysuj pojedynczą muchę z fiolki do aspiratora. Wyjmij aspirator i złap zwierzę w pułapkę, kładąc palec na końcu.
  2. Wyrzuć muchę do plastikowej końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Trzymając koniec aspiratora w końcówce pipety, użyj końca, aby popchnąć rozporek do przodu, głową do przodu, w kierunku wąskiego końca końcówki pipety.
  3. Przytnij końcówkę pipety na każdym końcu (tj. z przodu i z tyłu zwierzęcia) za pomocą żyletki.
  4. Użyj gliny lub małego kawałka bawełny, aby popchnąć muchę dalej do przodu, aż połowa głowy będzie wystawać z końca przyciętej końcówki pipety. Użyj kleszczy, aby delikatnie popchnąć, aż labellum z przodu głowy zostanie odsłonięte.
  5. Przymocuj przyciętą końcówkę pipety do szklanego szkiełka mikroskopowego za pomocą glinki (Rysunek 1).
  6. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść labellum bocznie na szkiełku nakrywkowym, tak aby jeden płat, wraz z jego 31 czułymi zmysłami smakowymi, był odsłonięty (Rysunek 1). Szkiełko nakrywkowe utrzymuje etykietę na miejscu.

6. Stanowisko do elektrofizjologii

  1. Wybierz pomieszczenie do konfiguracji platformy, które ma stabilną temperaturę i wilgotność względną (<70%) i jest odizolowane od źródeł hałasu elektrycznego i mechanicznego, takich jak lodówki i wirówki.
  2. Umieść mikroskop na środku stołu antywibracyjnego.
  3. Przymocuj ręczny mikromanipulator do stołu antywibracyjnego (Rysunek 2).
  4. Przymocuj wałek ze stali nierdzewnej, który utrzymuje wolframową elektrodę referencyjną do ręcznego mikromanipulatora (Rysunek 2).
  5. Podłącz zmotoryzowane manipulatory - jeden z uchwytem na sondę elektrody rejestrującej, a drugi z uchwytem połączonym z trzonkiem ze stali nierdzewnej do szklanej kapilary stymulacyjnej - do tego samego stołu za pomocą podstawek (Rysunek 2).
  6. Podłącz sondę elektrody rejestrującej do systemu inteligentnego kontrolera akwizycji danych (IDAC) lub innego systemu wzmacniacza/digitizera.
  7. Połącz ten system IDAC z komputerem na stacji roboczej.
  8. Uziemić manipulatory ręczne i zmotoryzowane w tym samym miejscu na platformie.
  9. Zainstaluj na komputerze odpowiednie oprogramowanie do akwizycji dla systemu IDAC. Upewnij się, że sterowniki akwizycji cyfrowej są zgodne z systemem operacyjnym (np. Windows XP-7, -8 lub -10) na komputerze.

7. Nagrywanie z Taste Sensilla

  1. Umieść szkiełko przygotowawcze na stoliku mikroskopu z obiektywem o małym powiększeniu (np. 10x) w odpowiedniej pozycji. Przesuwaj stolik, aż etykieta będzie ostra w środku pola widzenia zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu (np. 50x).
  2. Włóż elektrodę referencyjną do oka za pomocą obiektywu o małym powiększeniu. Aby włożyć elektrodę odniesienia, skieruj oko po stronie muchy po przeciwnej stronie do strony z elektrodą rejestrującą, na przykładample, jeśli elektroda rejestrująca zbliża się z prawej strony, umieść elektrodę odniesienia w lewym oku. Wykorzystaj ręczny mikromanipulator do precyzyjnego wprowadzania.
  3. Ustaw ostrość końcówki szklanej kapilary stymulacyjnej w środku pola widzenia zarówno obiektywów o małym, jak i dużym powiększeniu za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora (Rysunek 3).
  4. W małym powiększeniu zbliż elektrodę rejestrującą do labellum za pomocą drugiego mikromanipulatora z napędem.
  5. Pod dużym powiększeniem włóż elektrodę rejestrującą do podstawy czujnika smaku za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora, aż usłyszysz dźwięk aktywności odpalania neuronów z wyjścia audio systemu IDAC.
  6. Po ustaleniu stabilnego sygnału rozpocznij nagrywanie sygnału za pomocą oprogramowania dołączonego do systemu IDAC (Rysunek 4A-D). Aby rozpocząć nagrywanie, naciśnij przycisk Rozpocznij nagrywanie.
  7. Przyłóż końcówkę szklanej kapilary bodźcowej do zakrycia końcówki czujnika smaku za pomocą zmotoryzowanego manipulatora.
  8. Aby zakończyć bodziec, usuń szklaną kapilarę bodźca z sensillum za pomocą zmotoryzowanego manipulatora.
  9. Zaznacz początek i koniec stymulacji ręcznie za pomocą pedału. Pedał jest podłączony do IDAC, a jego komunikacja z oprogramowaniem jest ułatwiona przez IDAC w celu oznaczenia początku/końca bodźca.

8. Analiza

  1. Korzystaj z różnych funkcji oprogramowania dołączonego do systemu IDAC, aby sortować populacje szczytów według amplitudy (jeśli to możliwe) i analizować dynamikę odpowiedzi.
    1. Aby policzyć skoki, kliknij lewym przyciskiem myszy interesujące Cię nagranie, wyświetlając okno do wyboru. Wybierz opcję Do skoków, inicjując kolejne okno o nazwie Konwertuj fale na kolce. Wprowadź nazwę w polu Nowy i naciśnij przycisk OK.
    2. Wprowadzenie nazwy w polu Nowy w kroku 8.1.1 prowadzi do wyświetlenia widoku Histogram amplitudy. Wybierz amplitudę do zliczenia, a następnie zamknij ten widok. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby dodać licznik.
    3. Zbadaj skoki ręcznie, aby potwierdzić wnioski na podstawie analizy za pomocą oprogramowania.
      UWAGA: Oprogramowanie umożliwia również eksport danych w różnych formatach w celu dalszej analizy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4A pokazuje spontaniczne skoki, które powstają w wyniku sensillum. Dzielą się na dwie klasy w zależności od amplitudy, przy czym większe kolce pochodzą z neuronu, który jest wrażliwy na gorzkie związki, a mniejsze z neuronu, który reaguje na cukry. Związek między amplitudą skoku a swoistością funkcjonalną został potwierdzony przez eksperymenty genetyczne4,14,37,38,39 .

Rysunek 4B pokazuje reakcję wrażliwego na gorycz neuronu S5 sensillum na zapach DEET; ta odpowiedź nastąpiła bez żadnego kontaktu między roztworem DEET a sensillum. Jeden skok wydaje się mieć średnią amplitudę i może wynikać z nałożenia się dwóch mniejszych kolców, jednego z neuronu cukrowego i jednego z neuronu mechanosensorycznego.

Rysunek 4C pokazuje reakcję ON, która następuje po kontakcie między bodźcem gorzkim a sensillum I1, po której następuje odpowiedź OFF, która następuje po zakończeniu kontaktu. Nie oznacza to, że wielkość odpowiedzi OFF, mierzona w skokach/s, jest większa niż odpowiedź ON.

Rysunek 4D pokazuje reakcję ON i OFF na gorzki związek berberyny z I1 sensillum innego gatunku muchy, Drosophila virilis. Jedną z zalet tej techniki jest to, że można ją wykonywać na innych gatunkach, w tym na komarach, bez konieczności wprowadzania do nich jakichkolwiek transgenów.

Rysunek 4E ilustruje dwa problemy, które mogą wystąpić podczas nagrywania. Po pierwsze, jeśli labellum nie jest odpowiednio zabezpieczone, może się poruszać, wytwarzając kolce z neuronu mechanosensorycznego sensillum. Po drugie, elektroda rejestrująca może zostać oderwana od czułki, często w wyniku ruchu labellum. W takim przypadku kontakt zostanie utracony i elektroda musi zostać ponownie włożona, aby zarejestrować skoki.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie do podstawowego nagrania w locie. Przycięta końcówka pipety zawierająca samicę muchy z etykietą bezpiecznie umieszczoną na szklanym szkiełku nakrywkowym. (A) Zarówno końcówka pipety, jak i szkiełko nakrywkowe są bezpiecznie trzymane na kopcach gliny. (B) Większe powiększenie labellum spoczywającego na szkiełku nakrywkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja stanowiska do elektrofizjologii. (A) Przegląd pokazujący pozycje ręcznego mikromanipulatora dla elektrody referencyjnej, zmotoryzowanego mikromanipulatora dla szklanej kapilary stymulacyjnej oraz zmotoryzowanego mikromanipulatora dla elektrody rejestrującej. (B) Przegląd przedstawiający uchwyty elektrody odniesienia, szklanej kapilary bodźcowej i elektrody rejestrującej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Labellum i sensilla. (A) Labellum pod odwróconym mikroskopem. Zbliżenie na labellum ukazujące zmysłowość smakową jednego płata labellum. Pokazuje również szklaną kapilę bodźca w pobliżu jednej z dużych sensilli znanych jako L2 (Duży typ 2) i elektrodę rejestrującą w podstawie tego czujnika. (B) Dostępność labellar sensilla. Labellum przedstawiające sensillę, które są łatwo dostępne dla podstawowego nagrania i sensilla, które są mniej dostępne ze względu na ich pozycję w preparacie, którego zwykle używamy. Skróty: A = przedni; M = przyśrodkowy; P = tylny; L = boczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykładowe ślady spontanicznych skoków, gorzkich reakcji neuronów i nieoptymalnego nagrania. (A) Przykładowy ślad spontanicznych skoków. Kolce pochodzą z neuronu wrażliwego na gorycz (czerwone kropki) i neuronu wrażliwego na cukier (zielone kropki) w czubku I1. Na rysunku sensillum neurony gorzkie, cukrowe i mechanosensoryczne są odpowiednio pokolorowane na czerwono, zielono i czarno. (B) Przykładowy ślad odpowiedzi gorzkiego neuronu (czerwone kropki) w czułości S5 na parę 1 mM DEET. Zauważ, że małe skoki amplitudy pochodzą z neuronu cukrowego i neuronów mechanosensorycznych, które w tym przykładzie są trudne do odróżnienia na podstawie amplitudy. Skrót: DEET = N,N-dietylo-meta-toluamid. (C) Przykładowy ślad reakcji ON i OFF z gorzkiego neuronu w czulu I1 na 1 mM benzoesan denatonium. Skoki obserwuje się przed (spontaniczne odpalenie), w trakcie (odpowiedź ON) i po (odpowiedź OFF) kontakcie z bodźcem. Skrót: DEN = benzoesan denatonium. (D) Przykładowy ślad reakcji ON i OFF z gorzkiego neuronu w I1 sensilla D. virilis na 0,5 mM chlorku berberyny. Skoki obserwuje się przed, w trakcie i po kontakcie. Skrót: BER = chlorek berberyny. (E) Przykładowy ślad nieoptymalnego nagrania. Kontakt został utracony w trakcie eksperymentu z powodu ruchu labellum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W nagraniach z niektórych typów sensilli rozróżnienie kolców różnych neuronów może być trudne. Na przykład neurony cukrowe i neurony mechanosensoryczne sensilli S i I wytwarzają kolce o podobnych amplitudach, co utrudnia ich rozróżnienie 4,14. Odkryliśmy, że użycie bardzo ostrej wolframowej elektrody rejestrującej zmniejsza odpalanie neuronu mechanosensorycznego, podobnie jak rozsądne umieszczenie elektrody rejestrującej. Wprowadzenie elektrody rejestrującej do kołnierza zębodołu sensillum (tj. do podstawy, ale nie głęboko) często powoduje zmniejszenie stymulacji mechanosensorycznej. Ponadto stwierdzamy, że jeśli nagranie ma wysoki poziom wystrzeliwania neuronu mechanosensorycznego, wycofanie elektrody rejestrującej i umieszczenie jej w innej pozycji względem zmysłu często prowadzi do niższego poziomu wypalania.

Kolejną krytyczną kwestią jest zapewnienie stabilności elektrody rejestrującej podczas eksperymentów (patrz rysunek 4E). Zakłócenia mechaniczne lub przesunięcia w położeniu elektrod mogą niekorzystnie wpłynąć na jakość nagrań. Zainwestowanie czasu i wysiłku w dokładne przygotowanie, jak określono w opisanym powyżej protokole, jest kluczem do zapobiegania frustracji, która może wynikać z ruchu labellum.

Zwracamy uwagę na jeszcze jeden problem, który zaobserwowaliśmy w przypadku niektórych związków, które wywołują zarówno odpowiedzi ON, jak i OFF z I sensilla klasyI-a 14. Czasami druga dostawa bodźca wywołuje reakcję OFF, ale nie ON. Przyczyna tego zmniejszenia odpowiedzi ON nie jest znana.

Innym wyzwaniem napotkanym podczas nagrywania podstawowego jest to, że nie wszystkie sensille są łatwo dostępne do nagrywania ze względu na ich położenie na labellum. Spośród 31 sensilli labellar tylko 26 jest wygodnych do nagrywania, co stanowi ograniczenie dla tej techniki, jak pokazano na rysunku 3B. Jednak w zasadzie te sensille (I8, I9, I10, L9 i S10) mogą być dostępne poprzez obracanie mechanicznego stolika XY mikroskopu Olympus.

Na koniec podkreślamy, jak ważne jest inwestowanie wysiłku w przygotowanie much. Dobrze przygotowana mucha ma znacznie większe szanse na uzyskanie wiarygodnych i wysokiej jakości nagrań w trakcie trwania eksperymentu. Dodatkowo sacharoza może być stosowana jako kontrola pozytywna w celu zapewnienia jakości zapisu; Wywołuje to reakcję wszystkich Labellar Sensilla.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Zinie Berman za wsparcie, Lisie Baik za komentarze do manuskryptu i innym członkom laboratorium Carlson za dyskusję. Praca ta była wspierana przez NIH grant K01 DC020145 dla H.K.M.D; a NIH przyznaje R01 DC02174, R01 DC04729 i R01 DC011697 dla JRC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MikroskopOlympusBX51WIwyposażony w obiektyw 50X (LMPLFLN 50X, Olympus) i okulary 10X.
Stół antywibracyjnyTMC63-7590E
zmotoryzowane mikromanipulatoryAparatura Harvarda i Mä RZH&AUML; użytkownikMikromanipulatory Mikromanipulator PM 10 Mikromanipulator
ręczny MikromanipulatoryMä RZH&AUML; użytkownik MikromanipulatoryMM33 Mikromanipulator
Stojaki magnetyczneENCOModel #625-0930
Odniesienie  i nagrywanie Uchwyt elektrodyOckenfels Syntech GmbH
Uchwyt kapilary szklanej stymulacyjnejOckenfels Syntech GmbH
Uniwersalna sonda jednostronnaOckenfels Syntech GmbH
4-KANAŁOWY KONTROLER AKWIZYCJI USB, IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Kontrolery bodźcówOckenfels Syntech GmbHKontroler stymulacyjny CS 55
Komputer osobistyDellVostroSprawdź kompatybilność z cyfrowym systemem akwizycji i oprogramowaniem
Pręt wolframowySystemy AMCat#716000
Folia aluminiowa i/lub klatka FaradayaEkranowanie przed szumami elektromagnetycznymi
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoŚwiat Instrumenty precyzyjne1B100F-4
Ściągacz do pipetInstrument Sutter Model firmyP-97 Flaming/Brown Ściągacz
Mikroskop stereoskopowyOlympusVMZ 1x-4xDo przygotowania muchy
p200 KońcówkiOgólny
Wskazówki dotyczące mikroładowarek EppendorfE5242956003
1 ml StrzykawkaOgólne
Zaciski
Transformatory mocySTACO PRODUKTY ENERGETYCZNESTACO 3PN221BSkłada się z końcówek do pipet P1000, elastycznej rurki z tworzywa sztucznego i siatki
PlastelinaOgólne
KleszczeOgólne
Rurki plastikoweSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standardowe fiolki hodowlaneArchon ScientificWąskie 1-uncjowe polistyrenowe pochwy, każda z 10 ml pożywki glukozowej, wstępnie załadowane zatyczkami z octanu celulozy
Chlorek berberyny (BER)Sigma-AldrichCat # Y0001149
Benzoesan denatonium (DEN)Sigma-AldrichCat # D5765
N,N-dietylo-m-toluamid (DEET)Sigma-AldrichCat # Numer katalogowy: 36542
piezoelektrycznydo mikropipet do pipet krokodylkowe do modelowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619(2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252(2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 2 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181(2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661(2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867(2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119(2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355(2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sensilla Drosophilaelektrofizjologia pojedynczego sensillarejestracja z wierzcho kapomiar aktywno ci neuronalnejzwi zki hydrofobowedetekcja feromon wszklana elektroda kapilarnaneuron wra liwy na substancje gorzkie

Powiązane artykuły