Artykuł metodologiczny

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

DOI:

10.3791/66677

⸱

29 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People’s Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Department of Laboratory Medicine, Shengli Oilfield Central Hospital, 3Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People’s Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 4Dermatology Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje dróg oddechowych (RTI) są jednymi z najczęstszych problemów w warunkach klinicznych. Szybka i dokładna identyfikacja patogenów bakteryjnych dostarczy praktycznych wskazówek dotyczących postępowania i leczenia infekcji dróg oddechowych. W badaniu opisano metodę szybkiego wykrywania patogenów bakteryjnych, które powodują infekcje dróg oddechowych, za pomocą wielokanałowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). LAMP to czułe i specyficzne narzędzie diagnostyczne, które szybko wykrywa bakteryjne kwasy nukleinowe z dużą dokładnością i niezawodnością. Proponowana metoda ma znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami hodowli bakteryjnej, które są czasochłonne i często wymagają większej czułości w wykrywaniu niskich poziomów bakteryjnych kwasów nukleinowych. W artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad zakażeniem K. pneumoniae i jego wielorakimi koinfekcjami przy użyciu LAMP do wykrywania próbek (plwociny, płynu z płukania oskrzeli i płynu z płukania pęcherzyków płucnych) z dolnych dróg oddechowych. Podsumowując, wielokanałowa metoda LAMP zapewnia szybki i skuteczny sposób identyfikacji pojedynczych i wielu patogenów bakteryjnych w próbkach klinicznych, co może pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się patogenów bakteryjnych i pomóc w odpowiednim leczeniu infekcji dróg oddechowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje dróg oddechowych (RTI) wywołane przez patogeny bakteryjne przede wszystkim przyczyniają się do zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Definiuje się ją jako wszelkie objawy ze strony górnych lub dolnych dróg oddechowych, którym towarzyszy gorączka trwająca 2-3 dni. Podczas gdy infekcje górnych dróg oddechowych są częstsze niż infekcje dolnych dróg oddechowych, przewlekłe i nawracające infekcje dróg oddechowych są również częstymi stanami klinicznymi, stanowiąc duże ryzyko dla osób i stanowiąc znaczne obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej2. Typowe patogeny bakteryjne RTI to między innymi Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia. Te chorobotwórcze bakterie zwykle kolonizują powierzchnie błony śluzowej nosogardzieli i górnych dróg oddechowych gospodarza, powodując typowe objawy RTI, takie jak ból gardła i zapalenie oskrzeli. Powodują zapalenie płuc, gdy rozprzestrzeniają się z górnych dróg oddechowych do sterylnych obszarów dolnych dróg oddechowych i mogą przenosić się z osoby na osobę przez drogi oddechowe5. W ciężkich przypadkach mogą również prowadzić do inwazyjnych chorób bakteryjnych, zwłaszcza bakteriemicznego zapalenia płuc, zapalenia opon mózgowych i sepsy, które są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności u osób w każdym wieku na całym świecie.

Tradycyjne testy na RTI obejmują hodowlę mikrobiologiczną przy użyciu wymazów z gardła i próbek oddechowych plwociny6. Ponadto testy serologiczne, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA), wykrywają przeciwciała lub antygeny w surowicy, podczas gdy testy aglutynacyjne obserwują reakcję aglutynacji przeciwciał i antygenów w celu wykrycia infekcji7. Hodowla drobnoustrojów jest uważana za złoty standard w diagnozowaniu RTI, ale jej niski wskaźnik dodatnich wyników hodowli, słaba niezawodność i długi cykl wykrywania ograniczają skuteczność diagnostyczną8. W rzeczywistości szybka i dokładna diagnoza infekcji dróg oddechowych ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnego wyeliminowania patogenu bakteryjnego. Szybkie i skuteczne metody wykrywania mogą pomóc w zmniejszeniu szybkości przenoszenia patogenów, skróceniu czasu trwania infekcji i zmniejszeniu niepotrzebnego stosowania antybiotyków9,10. Metody oparte na biologii molekularnej, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która amplifikuje sekwencję DNA docelowego genu w celu wykrycia patogenów, znacznie przyspieszają wykrywanie. Jednak tradycyjny PCR wymaga skomplikowanego sprzętu do cyklicznych zmian temperatury, co jest kłopotliwe i czasochłonne. Co więcej, każda amplifikacja DNA za pomocą PCR (z wyjątkiem PCR w czasie rzeczywistym) kończy się elektroforetycznym oddzieleniem produktu, co również wymaga czasu. Wizualizacja produktu wymaga barwników, z których wiele jest mutagennych lub rakotwórczych. Dlatego konieczne jest ciągłe opracowywanie nowych metod i technologii diagnozowania patogenów bakteryjnych RTI.

Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) to nowatorska i rozwijająca się technologia molekularna, początkowo opracowana przez Notomi et al. w 200011. LAMP może amplifikować DNA w stabilnych warunkach izotermicznych bez skomplikowanego sprzętu do cyklicznych zmian temperatury, co czyni go odpowiednim do szybkiego wykrywania i zmniejsza złożoność sprzętu oraz koszty12. LAMP może wykrywać niskie stężenia docelowego DNA z wysoką czułością13. Wykorzystuje wiele specyficznych starterów, aby poprawić selektywność sekwencji docelowych i zmniejszyć prawdopodobieństwo wyników fałszywie dodatnich14. LAMP jest stopniowo szeroko stosowany w laboratoriach klinicznych ze względu na swoją łatwość, szybkość i intuicyjną obsługę, nawet do wykrywania infekcji dróg oddechowych. W tym badaniu zbadaliśmy skuteczność LAMP w wykrywaniu niższych RTI w próbkach klinicznych (plwocina, płyn z płukania oskrzeli i płyn z płukania pęcherzyków płucnych), jak pokazano na Rysunek 1. Oczywiste jest, że LAMP oferuje zalety, takie jak szybkość, czułość i łatwość użycia w porównaniu z tradycyjnymi testami w zakresie wykrywania niższych zakłóceń ruchu optycznego, co czyni go obiecującym zastosowaniem.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja metody wykrywania LAMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki do tego badania zostały ocenione i zatwierdzone przez Komisję ds. Oceny Etyki Szpitala Ludowego Prowincji Guangdong (numer zatwierdzenia: KY2023-1114-01). Wszyscy uczestnicy podpisali pisemną świadomą zgodę przed eksperymentami. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów. Skróty użyte w protokole wymieniono w tabeli uzupełniającej 1.

1. Pobieranie próbek klinicznych z dolnych dróg oddechowych

  1. Pobieranie plwociny
    1. Oczyść jamę ustną i zęby czystą wodą, zapewniając usunięcie protezy, jeśli ma to zastosowanie. Kaszleć mocno, aby wydalić plwocinę z głębokich dróg oddechowych do pojemnika na plwocinę (minimum 0,6 ml).
    2. Unikaj zanieczyszczenia śliną lub wydzieliną z nosa. Jeśli kaszel jest utrudniony, należy zastosować inhalację roztworu NaCl o stężeniu 100 g/l w temperaturze 45 °C, aby ułatwić odkrztuszanie. Przenieść próbkę do sterylnego, zamykanego pojemnika.
      UWAGA: Upewnij się, że próbki plwociny są pobierane rano i przed użyciem jakichkolwiek leków przeciwbakteryjnych.
  2. Płyn do płukania oskrzeli (BLF)
    1. Włóż głowicę kolektora do tchawicy z miejsca nozdrza lub tracheostomii (na głębokość około 30 cm). Wstrzyknij 5 ml soli fizjologicznej, ustal podciśnienie, obróć głowicę kolektora i powoli wycofaj.
    2. Zebrać wyekstrahowany śluz i przepłukać kolektor roztworem do pobierania próbek (sól fizjologiczna lub jałowa woda do wstrzykiwań). Alternatywnie można podłączyć dziecięcy cewnik moczowy do strzykawki o pojemności 50 ml jako substytut pobrania.
  3. Płyn z płukania pęcherzyków płucnych (ALF)
    1. Zidentyfikuj lokalizację zmiany za pomocą badań obrazowych klatki piersiowej. Wybierz najbardziej znaczący lub szybko postępujący obszar do płukania.
    2. Wstrzyknąć 1-2 ml 2% lidokainy do segmentu oskrzelowego przez kanał biopsyjny podczas płukania, zapewniając znieczulenie miejscowe dla podpływającego segmentu płuc 15. W przypadku pacjentów w dożylnym znieczuleniu ogólnym, którzy nadal wykazują silne reakcje ze strony dróg oddechowych, należy wstrzyknąć 1-2 ml 2% lidokainy.
    3. Po znieczuleniu miejscowym wprowadzić bronchoskop światłowodowy przez usta lub nos, przechodząc przez gardło do oskrzeli prawego środkowego płata lub lingwalnego odcinka lewego płuca. Umieść jego końcówkę w otworze gałęzi oskrzelowej i powoli wprowadzaj sterylną sól fizjologiczną.
    4. Podawać 30-50 ml soli fizjologicznej na sesję, o objętości 100-250 ml (maks. 300 ml). Zebrać wyekstrahowany śluz w szczelnie zamkniętym sterylnym pojemniku.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Na podstawie lepkości próbek dolnych dróg oddechowych dodać odpowiednią ilość 10% NaOH. W przypadku próbek o niskiej lepkości dodać 2-3 razy objętość próbki roztworu skraplającego. W przypadku próbek o umiarkowanej lepkości dodać 5-6 razy większą objętość próbki roztworu skraplającego. W przypadku próbek o wysokiej lepkości dodać 8-10 razy objętość próbki roztworu skraplającego.
    1. Dostosuj objętość 10% NaOH do lepkości próbki. Rozproszyć próbki możliwie jak najbardziej równomiernie za pomocą mieszalnika wirowego przez 15 s i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu skraplania.
      UWAGA: W przypadku grubszych próbek należy zwiększyć objętość NaOH lub wydłużyć czas skraplania. Jakość skraplania próbek ma bezpośredni wpływ na późniejszą wydajność ekstrakcji. Idealnie byłoby, gdyby upłynnione próbki wykazywały stałą, nieklejącą się konsystencję.
  2. Odpipetować 1 ml skroplonej próbki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 15 777 × g przez 5 minut w temperaturze 2-6 °C, a następnie za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Podczas zasysania próbki należy unikać pobierania zanieczyszczeń z dna probówki; Jeżeli zanieczyszczeń jest dużo, próbkę można odwirować w temperaturze 1,753-2,739 × g przez 1 minutę przed aspiracją.
  3. Dodać 1 ml roztworu płuczącego do probówki wirówkowej i odwirować, aby podnieść osad z dna probówki. Nie ma potrzeby jego całkowitego rozproszenia.
    1. Odwirować roztwór o stężeniu 15 777 × g przez 5 minut, odrzucić supernatant i starać się nie dotykać osadu.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwór myjący został dokładnie usunięty, aby uniknąć wpływu na późniejsze amplifikacja.
  4. Dodać 100 μl roztworu do ekstrakcji kwasów nukleinowych do probówki wirówkowej. Za pomocą pipety odessać i dokładnie wymieszać osad. Przenieś ciecz i osad razem do probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Skład roztworu do ekstrakcji kwasów nukleinowych przedstawiono w tabeli 1.
  5. Umieść probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych w mieszalniku wirowym i wiruj ze średnią prędkością przez co najmniej 5 minut. Po wirowaniu przenieść probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych do metalowej łaźni o stałej temperaturze i podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
  6. Odwirować w temperaturze 15 777 × g w temperaturze 2-6 °C przez 5 minut i odstawić.
    UWAGA: Jeśli reakcja amplifikacji PCR zostanie przeprowadzona w ciągu 24 godzin, kwas nukleinowy można przechowywać w temperaturze 4 °C. Po amplifikacji przechowywać kwas nukleinowy w temperaturze -20 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania (powyżej 24 godzin) kwas nukleinowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Gdy próbka będzie gotowa do ponownego użycia, rozmrozić ją w sposób naturalny, wymieszać, ogrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 5 minut, odwirować przy 10 956 × g przez 1 minutę i użyć supernatantu do amplifikacji PCR.
rozwiązanieSkładnikinumerspecyfikacja
Roztwór do mycia10 mM EDTA1 butelka24 ml/butelkę
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowych10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, Konserwanty kwasów nukleinowych2 rurki1,2 ml/butelkę
Rurka do ekstrakcji kwasów nukleinowychKoraliki szklane1 torba24 butelki / worek

Tabela 1: Skład odczynnika do ekstrakcji kwasów nukleinowych.

3. Wzmacniacz izotermiczny za pośrednictwem pętli i układ mikropłynowy

  1. Odczynnik i chip mikroprzepływowy
    1. Przeprowadzić reakcje amplifikacji izotermicznej na mikroprzepływowym chipie w kształcie dysku (patrz tabela materiałów). Przeprowadzić amplifikację w stałej temperaturze w temperaturze 65 °C.
    2. Przeprowadź analizę fluorescencji w czasie rzeczywistym przy użyciu metody wprowadzania barwnika fluorescencyjnego14 na mikroprzepływowym analizatorze kwasów nukleinowych z amplifikacją w stałej temperaturze. Obserwuj krzywą amplifikacji w kształcie litery S dla próbek dodatnich przy użyciu polimerazy z funkcją przemieszczenia nici.
  2. Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli
    1. Celuj w sześć regionów sekwencji za pomocą czterech specyficznych starterów, w tym dwóch wewnętrznych starterów i dwóch zewnętrznych starterów (dostarczonych z zestawem LAMP).
      UWAGA: DNA jest w sposób ciągły replikowany i amplifikowany w stałej temperaturze przy użyciu polimerazy DNA z funkcją przemieszczenia nici. Proces reakcji obejmuje etap syntezy szablonu w kształcie hantli, etap amplifikacji cyklicznej, etap wydłużania i recyklingu, ostatecznie tworząc mieszaninę fragmentów DNA o strukturach przypominających pętlę łodygi i kalafior. Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcji zestawu (Plik uzupełniający 1).
    2. Dodaj startery dwupętlowe do układu reakcyjnego, aby zwiększyć wydajność reakcji, która wiąże się ze strukturami pnia-pętli, inicjując syntezę przemieszczenia nici i replikację cykliczną. Skład zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych dla patogenów dróg oddechowych przedstawiono w tabeli 2.
      UWAGA: Zestaw odczynników wykorzystuje metodę LAMP. Zasada opiera się na dynamicznej równowadze DNA w temperaturze około 65 °C, gdzie każdy starter rozciągający się przez parowanie zasad w komplementarnym miejscu dwuniciowego DNA powoduje dysocjację drugiej nici, tworząc pojedynczą nić.
  3. Chip mikroprzepływowy
    UWAGA: Każdy chip mikroprzepływowy (patrz tabela materiałów) jest wyposażony w 24 dołki reakcyjne ponumerowane w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, przy czym wlot i wylot dla studzienki 1 odpowiadają studzience reakcyjnej 1 (Rysunek 2). Określony zestaw starterów do amplifikacji i wykrywania określonej sekwencji docelowej kwasu nukleinowego jest osadzony i utrwalony w każdym dołku reakcyjnym.
    1. Zmieszać DNA próbki z odczynnikiem do amplifikacji. Wstrzyknąć mieszaninę do chipa i rozprowadzić ją do każdej studzienki reakcyjnej, odwirować przy 1 000 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Niezależne reakcje amplifikacji izotermicznej i detekcja fluorescencji w czasie rzeczywistym współwystępują w każdym dołku reakcyjnym na chipie. Jeśli krzywa amplifikacji w kształcie litery S zostanie wykryta w określonej studzience reakcyjnej, odpowiedni wskaźnik wykrywalności dla tego dołka jest dodatni.
Składnikikompozycjanumer
ChipPodkłady12 miejsc
Folia uszczelniająca/1 arkusz
Odczynnik do amplifikacji izotermicznejBarwnik fluorescencyjny, enzym270 μl/rurkę
Kontrola pozytywnaEscherichia coli Genomowe DNA160 μl/rurkę

Tabela 2: Skład zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych dla patogenów dróg oddechowych.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat struktury chipa dysku. Studzienki reakcyjne są kolejno ponumerowane w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, gdzie port wlotowy/wylotowy 1 odpowiada studzience reakcyjnej numer 1. Studzienki reakcyjne 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 i 24 są kontrolami ujemnymi. Basenik reakcyjny 6 to kontrola pozytywna (E. coli). Basenik reakcyjny 12 jest wewnętrzną kontrolą pozytywną, a studzienka reakcyjna 23 jest zewnętrzną kontrolą pozytywną. Studzienka reakcyjna 2 wykrywa spn. Studnia reakcji 3 wykrywa sau. Studzienka reakcyjna 5 wykrywa MRSA. Studzienka reakcyjna 8 wykrywa kpn. Studzienka reakcyjna 9 wykrywa pae. Studzienka reakcyjna 11 wykrywa aba. Studzienka reakcyjna 14 wykrywa sma. Studzienka reakcyjna 15 wykrywa hin. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie próbki i wykrywanie bakterii

  1. Przygotować układ reakcji amplifikacji izotermicznej
    1. Weź odczynnik do amplifikacji izotermicznej z zestawu i pozwól mu całkowicie rozmrozić się w temperaturze pokojowej. Delikatnie wstrząśnij, aby dokładnie wymieszać i krótko odwirować, aby zebrać się na dnie probówki.
    2. W obszarze przechowywania i przygotowania odczynnika odpipetować 20 μl odczynnika do amplifikacji izotermicznej do przygotowanej probówki wirówkowej o pojemności 200 μl. Przykryj probówkę i przenieś ją do obszaru przygotowania próbki za pomocą jednej probówki wirówkowej na próbkę.
    3. W obszarze przygotowania próbki dodać 34,5 μl docelowej próbki kwasu nukleinowego. Delikatnie wstrząśnij, aby dokładnie wymieszać i krótko odwirować, aby zebrać się na dnie probówki. Całkowita objętość każdego układu reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego wynosi 54,5 μl (tabela 3).
  2. Procedura ładowania wiórów
    1. Na opakowaniu chipa oznacz numer próbki. Otwórz chip mikroprzepływowy etykietą na opakowaniu skierowaną do góry.
    2. Umieść chip tak, aby porty wlotowe i wylotowe były skierowane do góry. Za pomocą pipety pobrać 50 μl przygotowanego systemu do reakcji amplifikacji i dodać go do głównego kanału chipa przez port wlotowy. Przerwij dodawanie, gdy główny kanał jest napełniony, i szybko zetrzyj nadmiar płynu wokół portów wlotowych i wylotowych niestrzępiącą się chusteczką.
    3. Użyj pęsety, aby podnieść jedną folię uszczelniającą i przykryć ją portami wlotowymi i wylotowymi. Dociśnij czystą końcówkę pipety do folii uszczelniającej w jednym kierunku. Upewnij się, że jest szczelnie zamknięty.
  3. Reakcja qPCR
    1. Po zakończeniu wstępnego podgrzewania źródła światła analizatora kwasów nukleinowych kliknij przycisk Otwórz tacę. Umieść wiór przednią stroną do góry na tacy, upewniając się, że mały cylinder ustalający wyłania się ze środkowej szczeliny wióra, aby go zabezpieczyć. Dopasuj środkowe urządzenie pozycjonujące w tacy do dużego środkowego otworu w chipie.
    2. Kliknij przycisk Zamknij tacę, aby włożyć chip do analizatora kwasów nukleinowych.
    3. W obszarze Informacje o próbce w interfejsie wykrywania wprowadź informacje dotyczące testowania próbki. Numer próbki, numer chipa i typ próbki są obowiązkowe; inne są opcjonalne.
    4. Kliknij przycisk Rozpocznij wykrywanie w obszarze operacyjnym, aby zainicjować wykrywanie próbki. Przyrząd przeprowadzi testowanie próbki zgodnie z ustalonym programem.
      UWAGA: Po zakończeniu wykrywania oprogramowanie dołączone do urządzenia automatycznie przeprowadzi analizę danych. Jednocześnie analizator kwasów nukleinowych zainicjuje automatyczny proces chłodzenia. Gdy temperatura spadnie do 37 °C, urządzenie automatycznie otworzy tackę i wysunie chip w celu pobrania. Wyniki zostaną automatycznie zinterpretowane przez system (Tabela 4).
  4. Standardy kontroli jakości
    1. Jedna pozytywna kontrola jakości i dziewięć negatywnych kontroli jakości są zawarte w każdym chipie w tym zestawie odczynników. Upewnij się, że wyniki wykrywania dla pozytywnej kontroli jakości są pozytywne, a jednocześnie wyniki dla wszystkich dziewięciu negatywnych kontroli jakości są negatywne.
      UWAGA: Wyniki są wyświetlane po prawej stronie obrazu z napisem "Wyniki kontroli jakości: Eksperyment normalny (dodatni normalny, ujemny normalny)", co oznacza, że wyniki testu są ważne. Ponowny test jest wymagany, jeśli którykolwiek z wyników jest nieprawidłowy, a przykładowy wynik testu zostanie uznany za nieważny. W chipie zamknięta jest jedna pozytywna kontrola wewnętrzna przy użyciu starterów specyficznych dla człowieka, której wynik jest pozytywny dla badania próbki klinicznej, a negatywny, jeśli próbka ma niską zawartość ludzkiego genomowego DNA, co wskazuje na niższą liczbę komórek. W takich przypadkach należy pobrać i ponownie przetestować próbki.
  5. Analiza wyników
    1. Po zakończeniu detekcji należy wykorzystać metodę maksimum drugiej pochodnej w połączeniu z komercyjnie chronionymi algorytmami w oprogramowaniu, aby obliczyć pierwszy punkt przegięcia krzywej wzmocnienia w kształcie litery S podczas fazy szybkiej amplifikacji. Szczegóły są opisane w części "Zasady testu" w Instrukcji zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych patogenów układu oddechowego (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Wartość TP to różnica czasu między punktem przegięcia a początkiem układu współrzędnych. Wynik jest interpretowany na podstawie wartości TP i pozytywnej oceny. Jeśli wartość TP dla indeksu wykrywania jest mniejsza lub równa wartości pozytywnej oceny dla tego indeksu, jest interpretowana jako pozytywna. Jeśli wartość TP przekracza wartość pozytywnej oceny, jest interpretowana jako negatywna, zgodnie z kryteriami "pozytywnej wartości decyzyjnej" w instrukcjach. "Obszar krzywej fluorescencji" wyświetla znormalizowaną krzywą, a obszar "Wynik wykrywania" pokazuje wyniki kontroli jakości i wykrywania dla każdego parametru (Tabela 5).
pkt.
ReagentObjętość (μl)
Odczynnik do amplifikacji izotermicznej20
Matrycowy DNA34,5

Tabela 3: Izotermiczny system reakcji amplifikacji.

Rozdział
krokJedenDwa
Temperatura (°C)3765
Czas (min)3Rozdział 47

Tabela 4: Program reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego.

Nazwa wskaźnikaWartość kontroli dodatniej
Streptococcus pneumoniae (sp)Rozdział 30
Staphylococcus aureus (sau)Rozdział 34
Oporny na metycylinę Staphylococcus aureus (mrsa)22 Rozdział 22
Klebsiella pneumoniae (kpn)29
Pseudomonas aeruginosa (pae)36
Acinetobacter baumannii (aba)36
Stenotrophomonas maltophilia (sma)27 Rozdział 27
Haemophilus influenzae (hin)36

Tabela 5: Wartość kontroli dodatniej dla wskaźnika infekcji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eksperyment wykorzystuje technologię amplifikacji izotermicznej, przeprowadzając reakcje na mikroprzepływowym chipie dyskowym. Reakcja zachodzi na mikroprzepływowym analizatorze kwasów nukleinowych z chipem, wykorzystującym metodę wprowadzania barwnika fluorescencyjnego. Reakcja izotermiczna odbywa się w stałej temperaturze 65 °C, a jednocześnie przeprowadzana jest analiza fluorescencji w czasie rzeczywistym. Próbki dodatnie poddawane są amplifikacji pod wpływem polimerazy z funkcją przemieszczenia łańcucha, w wyniku czego uzyskuje się krzywą amplifikacji w kształcie litery S. Ten jednoetapowy proces kończy amplifikację i wykrywanie genu docelowego. W badaniu wybrano 7 próbek o różnych wynikach eksperymentalnych, aby wykazać wiarygodność projektu eksperymentalnego. Wielka litera S oznacza próbkę. S1 to próbka zakażona pojedynczym szczepem K. pneumoniae. S2 do S7 to próbki z infekcjami wielodrobnoustrojowymi, wszystkie zakażone K. pneumoniae. Aby uzyskać skuteczne wyniki detekcji, interpretacja może być dokonana za pomocą znormalizowanych krzywych fluorescencji wyświetlanych na obrazach. Wskaźnik dodatni jest reprezentowany przez krzywą amplifikacji w kształcie litery S, podczas gdy linia pozioma reprezentuje wskaźnik ujemny (Rysunek 3).

figure-results-1
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki amplifikacji kwasów nukleinowych za pomocą LAMP. Wielka litera S oznacza próbkę. S1 to próbka zakażona pojedynczym szczepem kpn. S2 do S7 to próbki z infekcjami wielodrobnoustrojowymi, wszystkie zakażone kpn. S2 reprezentuje próbkę zainfekowaną kpn i sma. S3 oznacza próbkę jednocześnie zakażoną kpn, sau i MRSA. S4 oznacza próbkę jednocześnie zakażoną kpn, sau, MRSA i aba. S5 oznacza próbkę jednocześnie zakażoną kpn, sma, sau, MRSA i aba. S6 oznacza próbkę jednocześnie zakażoną kpn, sma, pae, sau, MRSA i aba. S7 reprezentuje próbkę jednocześnie zakażoną kpn, sma, pae, sau, MRSA, aba i E. coli. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten zestaw odczynników wykorzystuje metodę ROC do obliczania dodatnich wartości progowych dla ośmiu wskaźników testowych. Gdy wartość TP wskaźnika wykrywalności jest mniejsza lub równa odpowiadającej mu dodatniej wartości progowej, jest interpretowana jako dodatnia. I odwrotnie, gdy wartość TP wskaźnika wykrywalności jest większa niż jego dodatnia wartość progowa, jest interpretowana jako ujemna. Dodatnie wartości progowe dla każdego wskaźnika wyszczególniono w tabeli 5. Prawdziwie dodatnie wartości TP, które wykryliśmy dla 7 próbek o różnych wynikach eksperymentalnych, przedstawiono w tabeli 6.

PRÓBKAWskaźnik KPNSmapae (pae)SauStępienie MRSAHinAbaeko
TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)
S119,68 (+)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)
S217,73 (+)godz. 18.30 (+)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)
S316,73 (+)U (-)U (-)godz. 18.05 (+)12,18 (+)U (-)U (-)U (-)
Odcinek S421,66 (+)U (-)U (-)27.07 (+)19,61 (+)U (-)18,29 (+)U (-)
S516,16 (+)20,85 (+)U (-)23,80 (+)17,13 (+)U (-)15,22 (+)U (-)
S6godz. 11.20 (+)16,79(+)17,18(+)23,09 (+)16,14 (+)U (-)14,28 (+)U (-)
Trasa S714,69 (+)24.84(+)19.70(+)24.07(+)14,16 (+)- (+)15,23 (+)20,12 (+)
Każda próbka+/-, wynik jakościowy;
+, wynik pozytywny; -, wynik negatywny.

Tabela 6: Tabela wartości TP do wykrywania po infekcji.

Tabela uzupełniająca 1: Lista skrótów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Instrukcje zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych patogenów układu oddechowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje dróg oddechowych są powszechnymi infekcjami szpitalnymi, powodującymi poważne konsekwencje dla pacjentów i zwiększającymi śmiertelność16. Terminowa i dokładna identyfikacja potencjalnych patogenów, a następnie skuteczne antybiotyki jest kluczem do skutecznego leczenia i poprawy rokowania, szczególnie biorąc pod uwagę ograniczenia związane z tradycyjnymi metodami hodowli17. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę opartą na LAMP do określenia pojedynczych lub wielokrotnych infekcji w celu szybkiego i precyzyjnego wykrywania infekcji dróg oddechowych. Ten szybki system detekcji powstał dzięki połączeniu technologii LAMP z technologią mikroprzepływową. Kwas nukleinowy z próbek klinicznych, takich jak plwocina, BLF i ALF, można szybko wyekstrahować. Ten wyekstrahowany materiał ułatwia szybkie i precyzyjne wykrywanie patogenów bakteryjnych, ukierunkowując praktyki kliniczne na poprawę kontroli i leczenia infekcji dróg oddechowych.

Wcześniejsze badania wykazały, że w porównaniu z metodami opartymi na kulturach i reakcji łańcuchowej polimerazy, wyniki LAMP osiągnęły 100% czułość, swoistość i brak reakcji krzyżowej z innymi bakteriami w czystych kulturach i próbkach krwi18. Testy LAMP mogą również wykrywać patogeny bezpośrednio z płynów biologicznych, takich jak krew, płyn opłucnowy i otrzewnowy oraz płyn mózgowo-rdzeniowy19. Wcześniej wykazano, że egzogenne DNA i inhibitory mogą znacznie zmniejszać czułość PCR, a w przypadku testów LAMP oczyszczanie DNA z próbek klinicznych nie jest wymagane20. Technika ta wykorzystuje geny drożdży i startery podczas procesu amplifikacji do oceny normalności amplifikacji, określając w ten sposób kwalifikację kontroli jakości kontroli zewnętrznej. Kontrole wewnętrzne, wykorzystujące startery z ludzkich genów, określają normalność procesów pobierania próbek, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji. Jednoczesne wykorzystanie kontroli wewnętrznych i zewnętrznych zapewnia wiarygodność wyników. W tym samym czasie ustawianych jest również wiele studni kontroli dodatniej i ujemnej, co znacznie zapewnia dokładność testu. Chip mikroprzepływowy LAMP ma możliwości podobne do qPCR w wykrywaniu próbek klinicznych. Charakteryzuje się wysoką czułością i silną zdolnością wykrywania, zapewniając niezawodną podstawę do szybkiego wykrywania klinicznego i precyzyjnego leczenia21. Hodowla drobnoustrojów trwa 3-5 dni lub nawet dłużej, a niektóre patogeny, takie jak Chlamydia pneumoniae i Legionella pneumophila, nie mogą być hodowane. W przeciwieństwie do tego, LAMP wykrywa wiele patogenów bakteryjnych, nawet tych, których nie da się wyhodować, w czasie krótszym niż 3 godziny, co znacznie zwiększa szybkość wykrywania.

Może również wykonywać wiele detekcji. Chip mikroprzepływowy LAMP jest podzielony na różne jednostki reakcyjne, które wykrywają wiele patogenów równolegle, zapewniając niezależność każdej reakcji i dokładność wyników 22,23. Dane z China Network Antibacterial Surveillance Center wykazały, że rozpowszechnienie K. pneumoniae zajęło pierwsze miejsce wśród izolatów bakteryjnych z próbek oddechowych w 2022 r.15. Wśród próbek oddechowych pobranych przez Prowincjonalny Szpital Ludowy w Guangdong w 2022 r. dodatni wskaźnik K. pneumoniae przebadany przez LAMP wyniósł 18,6%, co jest również jedną z bakterii o największej częstości występowania. We wszystkich próbkach dodatnich pod względem K. pneumoniae 30,6% stanowiły zakażenia wywołane wyłącznie przez K. pneumoniae, a 29,7% to infekcje, w których K. pneumoniae współistniała z innymi gatunkami bakterii. Dodatkowo odnotowano potrójne (23,9%) i poczwórne zakażenia (10,5%) związane z zakażeniem K. pneumoniae, które stanowiły większość w próbkach KP-dodatnich, około 95%. Odnotowano bardzo niewiele przypadków zakażeń pięciokrotnych i sześciokrotnych, a do tej pory nie wykryto zakażeń powyżej sześciokrotki. Wyniki przedstawiają sześć reprezentatywnych scenariuszy, z których każdy reprezentuje wyniki wykrywania infekcji wywołanych przez K. pneumoniae samodzielnie lub współistniejących z 1-5 innymi gatunkami bakterii.

Ponadto technologia chipów LAMP zastosowana w tym badaniu może również wykrywać oporność bakterii. Wykrywa MRSA oporny na metycylinę za pośrednictwem genu mecA . Gdy studzienki reprezentujące Staphylococcus aureus i studzienki dla genu mecA są dodatnie, reprezentują one zakażenie metycyliną-MRSA. Naukowcy nieustannie poszukują metod jednoczesnego szybkiego wykrywania patogenów i cech oporności na antybiotyki. Na przykład szybka metoda diagnostyczna zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki opiera się na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR)24. Inne podejście polega na szybkim przewidywaniu wielolekoopornych K. pneumoniae poprzez analizę widm25 wspomaganego rozpraszania Ramana (SERS) w głębokim uczeniu oraz metodę wykrywania genów K. pneumoniae i karbapenemazy przy użyciu widm SERS26. Ponadto istnieje metoda klasyfikacji i przewidywania dla różnych profili typowania sekwencji wielolocus (MLST) szczepów K. pneumoniae w oparciu o analizę widm SERS27. Następnie opracujemy również czułe i dokładne wykrywanie genów K. pneumoniae i karbapenemazy, z wydajnością porównywalną ze złotymi standardami metod klinicznych, które są czasochłonne lub opierają się na drogich specjalistycznych instrumentach. Co więcej, idealne podejście diagnostyczne jest szybkie, dokładne, ekonomiczne i przyjazne dla użytkownika18. Badanie szacujące koszt odczynników do obecnych technologii diagnostycznych wykazało, że badanie próbek w oparciu o technologię PCR kosztuje do 6,4-7,7 USD, w porównaniu z zaledwie 0,71-2 USD w przypadku technologii LAMP28.

Metoda wielokanałowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), oferując znaczące korzyści w zakresie szybkiego wykrywania patogenów bakteryjnych w infekcjach dróg oddechowych, ma swoje ograniczenia. Wysoka czułość LAMP stwarza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, w którym minimalne zanieczyszczenie DNA może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich29; W związku z tym konieczne jest rygorystyczne postępowanie z próbkami i protokoły proceduralne, aby ograniczyć to ryzyko. Pomimo prostoty metody, interpretacja wyników wymaga specjalistycznej wiedzy i doświadczenia, aby uniknąć błędnej interpretacji lub błędów diagnostycznych, co podkreśla potrzebę dobrze wyszkolonego personelu. Rozpoznanie tych ograniczeń jest niezbędne do skutecznego zastosowania i dalszego rozwoju metody LAMP w dziedzinie diagnostyki klinicznej. Podsumowując, metoda LAMP w połączeniu z chipem mikroprzepływowym może szybko wykrywać różne patogeny bakteryjne równolegle. Ma zalety wysokiej czułości i silnej specyficzności oraz cech niskiego kosztu, szybkości i wygody. Ma ona duże znaczenie praktyczne w zapobieganiu i kontrolowaniu infekcji dróg oddechowych spowodowanych infekcjami patogennymi w warunkach klinicznych. Istotną cechą testu LAMP zaproponowanego w tym badaniu jest to, że jest on łatwy do opanowania przez personel laboratoryjny, co jest bardzo pomocne dla szpitali podstawowych, zapobiegania chorobom, centrów kontroli oraz oddziałów inspekcji i kwarantanny. Podsumowując, mikroprzepływowy system chipowy LAMP jest potężnym narzędziem do wykrywania w laboratoriach klinicznych, które może rozwiązać problemy związane z wysokimi wydatkami i krótkim czasem realizacji w klinicznej diagnostyce zakażeń i ma znaczące wartości zastosowania w warunkach klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bardzo doceniamy wsparcie finansowe udzielone przez Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (Grant nr 2022A1515220023) oraz Fundację Badawczą na rzecz Zaawansowanych Talentów Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Guandong (Grant No. KY012023293).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator kąpielowy (MK2000-2)ALLSHENGZapewnij środowisko o stałej temperaturze
Głowica kolektora płynu z płukania oskrzeliTIANPINGHUACHANGSEDA 20172081375Zbieranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
Bronchoskop światłowodowyOLYMPUSSEDA 20153062703Elastyczny bronchoskop wyposażony w światłowodowe źródło światła i kamerę, do wizualnego badania dróg oddechowych i struktur w płucach. Pomoc w zbieraniu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
HR1500-figure-materials-1B2Szafa bezpieczeństwa biologicznegoHaierSEDA 20183541642
NAOHMACKLINS817977Upłynnić lepką próbkę dolnych dróg oddechowych
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla patogenów dróg oddechowychCapitalbio TechnologySEDA 20173401346Testy na infekcję bakteryjną
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowychCapitalbio TechnologySEDA 20160034Dla DNA ekstrakcja
RTisochip-WCapitalbio TechnologySEDA 20193220539Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli
THERMO ST16RThermo Fisher ScientificSEDA 20180585Odwiruj pozostałą ciecz ze ścianki probówki.
Mieszalnik wirowy VM-5005JOANLABDo mieszania odczynnika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
  2. Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150(2022).
  3. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
  4. Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
  5. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  6. Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
  7. Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216(2010).
  8. Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37(2019).
  9. Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
  10. Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068(2022).
  11. T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63(2000).
  12. Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931(2021).
  13. Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
  14. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  15. Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
  16. Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57(2015).
  17. Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
  18. Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
  19. Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572(2012).
  20. Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
  21. Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39(2018).
  22. Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  23. Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
  24. Liang Wang, J. -X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689(2023).
  25. Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622(2023).
  26. Wei Liu, J. -W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921(2022).
  27. Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161(2023).
  28. Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
  29. Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Respiratory Tract InfectionsBacterial Pathogen DetectionLoop Mediated Isothermal AmplificationMicrofluidic ChipNucleic Acid ExtractionRapid Pathogen DetectionKlebsiella PneumoniaePolymicrobial InfectionsPoint Care TestingNucleic Acid Analyzer

Powiązane artykuły