Artykuł metodologiczny

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66677

⸱

29 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People’s Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Department of Laboratory Medicine, Shengli Oilfield Central Hospital, 3Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People’s Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 4Dermatology Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Streszczenie

Infekcje dróg oddechowych (RTI) są jednymi z najczęstszych problemów w warunkach klinicznych. Szybka i dokładna identyfikacja patogenów bakteryjnych dostarczy praktycznych wskazówek dotyczących postępowania i leczenia infekcji dróg oddechowych. W badaniu opisano metodę szybkiego wykrywania patogenów bakteryjnych, które powodują infekcje dróg oddechowych, za pomocą wielokanałowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). LAMP to czułe i specyficzne narzędzie diagnostyczne, które szybko wykrywa bakteryjne kwasy nukleinowe z dużą dokładnością i niezawodnością. Proponowana metoda ma znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami hodowli bakteryjnej, które są czasochłonne i często wymagają większej czułości w wykrywaniu niskich poziomów bakteryjnych kwasów nukleinowych. W artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad zakażeniem K. pneumoniae i jego wielorakimi koinfekcjami przy użyciu LAMP do wykrywania próbek (plwociny, płynu z płukania oskrzeli i płynu z płukania pęcherzyków płucnych) z dolnych dróg oddechowych. Podsumowując, wielokanałowa metoda LAMP zapewnia szybki i skuteczny sposób identyfikacji pojedynczych i wielu patogenów bakteryjnych w próbkach klinicznych, co może pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się patogenów bakteryjnych i pomóc w odpowiednim leczeniu infekcji dróg oddechowych.

Wprowadzenie

Infekcje dróg oddechowych (RTIs) wywołane przez patogeny bakteryjne stanowią główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Definiuje się je jako wszelkie objawy z górnych lub dolnych dróg oddechowych towarzyszące gorączce trwającej od 2 do 3 dni. Choć infekcje górnych dróg oddechowych występują częściej niż infekcje dolnych dróg oddechowych, przewlekłe i nawracające infekcje dróg oddechowych są również częstymi stanami klinicznymi, stanowiąc duże ryzyko dla pacjentów i znaczące obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej2. Do powszechnych bakteryjnych patogenów wywołujących RTIs należą między innymi Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae oraz Stenotrophomonas maltophilia. Bakterie patogenne te zazwyczaj kolonizują powierzchnie śluzówkowe nosogardła i górnych dróg oddechowych gospodarza, wywołując typowe objawy RTIs, takie jak ból gardła i zapalenie oskrzeli. Powodują one zapalenie płuc, gdy rozprzestrzenią się z górnych dróg oddechowych do sterylnych obszarów dolnych dróg oddechowych; mogą być przenoszone z osoby na osobę drogą oddechową5. W ciężkich przypadkach mogą one prowadzić do inwazyjnych chorób bakteryjnych, w szczególności do bakteryjnego zapalenia płuc z bakteriemią, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i sepsy, które są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności osób we wszystkich grupach wiekowych na całym świecie.

Tradycyjne testy w kierunku infekcji dróg oddechowych (RTI) opierają się na hodowlach mikrobiologicznych z wykorzystaniem wymazów z gardła oraz próbek plwociny z dróg oddechowych6. Ponadto testy serologiczne, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), wykrywają przeciwciała lub antygeny w surowicy, natomiast testy aglutynacyjne pozwalają na obserwację reakcji aglutynacji przeciwciał i antygenów w celu wykrycia infekcji7. Hodowlę drobnoustrojów uznaje się za złoty standard w diagnostyce RTI, jednak niski odsetek pozytywnych wyników hodowli, słaba wiarygodność oraz długi cykl detekcji ograniczają efektywność diagnostyczną8. W rzeczywistości szybka i dokładna diagnoza RTI jest kluczowa dla precyzyjnej eradykacji patogenów bakteryjnych. Szybkie i skuteczne metody detekcji mogą pomóc w zmniejszeniu wskaźnika transmisji patogenów, skróceniu czasu trwania infekcji oraz ograniczeniu nieuzasadnionego stosowania antybiotyków9,10. Metody oparte na biologii molekularnej znacząco przyspieszają detekcję, czego przykładem jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która amplifikuje sekwencję DNA genu docelowego w celu wykrycia patogenów. Jednak tradycyjny PCR wymaga złożonego sprzętu do cyklicznej zmiany temperatury, co jest uciążliwe i czasochłonne. Co więcej, każda amplifikacja DNA za pomocą PCR (z wyjątkiem PCR w czasie rzeczywistym) kończy się elektroforetycznym rozdzieleniem produktu, co również zajmuje czas. Wizualizacja produktu wymaga zastosowania barwników, z których wiele ma działanie mutagenne lub kancerogenne. W związku z tym konieczne jest ciągłe opracowywanie nowych metod i technologii diagnostyki bakteryjnych patogenów wywołujących RTI.

Izotermiczna amplifikacja zapętlona (LAMP) to nowoczesna i rozwijająca się technologia molekularna, pierwotnie opracowana przez Notomi i wsp. w 2000 roku11. Metoda LAMP umożliwia amplifikację DNA w stabilnych warunkach izotermicznych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu do cyklicznej zmiany temperatury, co czyni ją odpowiednią do szybkiej detekcji oraz zmniejsza złożoność i koszt aparatury12. LAMP pozwala na wykrywanie niskich stężeń docelowego DNA z wysoką czułością13. Wykorzystuje ona wiele specyficznych starterów w celu zwiększenia selektywności wobec sekwencji docelowych i zmniejszenia prawdopodobieństwa wyników fałszywie dodatnich14. Ze względu na prostotę, szybkość i intuicyjną obsługę, metoda LAMP jest stopniowo szeroko wprowadzana do laboratoriów klinicznych, nawet w diagnostyce infekcji dróg oddechowych (RTIs). W niniejszym badaniu oceniono skuteczność metody LAMP w wykrywaniu dolnych RTIs w próbkach klinicznych (plwocinach, płukankach oskrzelowych i płukankach pęcherzykowych), co przedstawiono na Rysunku 1. Wykazano, że w detekcji dolnych RTIs metoda LAMP oferuje takie zalety jak szybkość, czułość i łatwość użycia w porównaniu z tradycyjnymi testami, co czyni ją obiecującym rozwiązaniem aplikacyjnym.

Proces analizy DNA z pobieraniem próbek, PCR, schemat amplifikacji izotermicznej, wykres wyników.
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja metody detekcji LAMP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie próbki wykorzystane w niniejszym badaniu zostały ocenione i zatwierdzone przez Komitet Przeglądu Etycznego Guangdong Provincial People's Hospital (numer zatwierdzenia: KY2023-1114-01). Wszyscy uczestnicy podpisali pisemną świadomą zgodę przed rozpoczęciem eksperymentów. Odczynniki i sprzęt użyte w badaniu wykazano w Tabeli Materiałów. Skróty użyte w protokole wymieniono w Tabeli Uzupełniającej 1.

1. Pobieranie próbek klinicznych z dolnych dróg oddechowych

  1. Pobieranie plwociny
    1. Oczyścić jamę ustną i zęby czystą wodą, upewniając się, że w razie potrzeby usunięto protezy. Mocno odkasłać, aby wydalić głęboką plwocinę z dróg oddechowych do pojemnika na plwocinę (minimum 0,6 mL).
    2. Unikać zanieczyszczenia śliną lub wydzieliną z nosa. Jeśli odkrztuszanie jest utrudnione, zastosować inhalację roztworu NaCl 100 g/L w temperaturze 45 °C, aby ułatwić odkrztuszanie. Przenieść próbkę do sterylnego, szczelnego pojemnika.
      UWAGA: Należy upewnić się, że próbki plwociny są pobierane rano i przed zastosowaniem jakichkolwiek leków przeciwbakteryjnych.
  2. Płyn z płukania oskrzeli (BLF)
    1. Wprowadzić końcówkę kolektora do tchawicy przez nozdrze lub otwór tracheostomii (na głębokość około 30 cm). Wstrzyknąć 5 mL soli fizjologicznej, wytworzyć podciśnienie, obrócić końcówkę kolektora i powoli wycofać.
    2. Zebrać wyodrębniony śluz i jednokrotnie przepłukać kolektor roztworem do pobierania (solą fizjologiczną lub sterylną wodą do wstrzyknięć). Alternatywnie, jako zamiennik do pobierania, można połączyć pediatryczny cewnik moczowy ze strzykawką 50 mL.
  3. Płyn z płukania pęcherzyków płucnych (ALF)
    1. Zidentyfikować lokalizację zmiany za pomocą obrazowych badań klatki piersiowej. Wybrać obszar najbardziej istotny lub najszybciej rozwijający się do płukania.
    2. Podczas płukania wstrzyknąć 1-2 mL 2% lidokainy do segmentu oskrzela przez kanał biopsyjny, zapewniając znieczulenie miejscowe płukanego segmentu płuca15. W przypadku pacjentów poddanych dożylnej narkozie ogólnej, którzy nadal wykazują silne reakcje dróg oddechowych, wstrzyknąć 1-2 mL 2% lidokainy.
    3. Po znieczuleniu miejscowym wprowadzić światłowodowy bronchoskop przez usta lub nos, przechodząc przez gardło do oskrzela środkowego płata prawego lub segmentu językowego lewego płuca. Umieścić końcówkę w ujściu gałęzi oskrzeli i powoli wprowadzić sterylną sól fizjologiczną.
    4. Podawać 30-50 mL soli fizjologicznej na jedną sesję, przy całkowitej objętości 100-250 mL (maks. 300 mL). Zebrać wyodrębniony śluz do szczelnego, sterylnego pojemnika.

2. Izolacja DNA

  1. W zależności od lepkości próbek z dolnych dróg oddechowych należy dodać odpowiednią ilość 10% NaOH. W przypadku próbek o niskiej lepkości dodać 2-3 objętości próbki roztworu upłynniającego. W przypadku próbek o umiarkowanej lepkości dodać 5-6 objętości próbki roztworu upłynniającego. W przypadku próbek o wysokiej lepkości dodać 8-10 objętości próbki roztworu upłynniającego.
    1. Dostosować objętość 10% NaOH do lepkości próbki. Próbki rozproszyć jak najrównomierniej za pomocą miksera wortex przez 15 s i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min w celu upłynnienia.
      UWAGA: W przypadku gęstszych próbek należy zwiększyć objętość NaOH lub wydłużyć czas upłynniania. Jakość upłynnienia próbek bezpośrednio wpływa na późniejszą wydajność ekstrakcji. W idealnym przypadku upłynnione próbki powinny mieć spójną, nielepką konsystencję.
  2. Pipetować 1 mL upłynnionej próbki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL. Wirować z prędkością 15 777 × g przez 5 min w temperaturze 2-6 °C, a następnie za pomocą pipety usunąć i odrzucić nadsącz.
    UWAGA: Podczas aspiracji próbki należy unikać pobierania zanieczyszczeń z dna probówki; jeśli zanieczyszczeń jest dużo, próbkę można wirować z prędkością 1 753-2 739 × g przez 1 min przed aspiracją.
  3. Dodać 1 mL roztworu piorącego do probówki wirówkowej i wymieszać w wortexie, aby unieść osad z dna probówki. Nie ma potrzeby całkowitego go rozproszenia.
    1. Wirować roztwór z prędkością 15 777 × g przez 5 min, odrzucić nadsącz, starając się nie dotknąć osadu.
      UWAGA: Należy zapewnić dokładne usunięcie roztworu piorącego, aby uniknąć wpływu na późniejszą amplifikację.
  4. Dodać 100 µL roztworu do ekstrakcji kwasów nukleinowych do probówki wirówkowej. Za pomocą pipety aspiracyjnie dokładnie wymieszać osad. Przenieść ciecz wraz z osadem do probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Skład roztworu do ekstrakcji kwasów nukleinowych przedstawiono w Tabeli 1.
  5. Umieścić probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych w mikserze wortex i mieszać z umiarkowaną prędkością przez co najmniej 5 min. Po wortexowaniu przenieść probówki do łaźni metalowej o stałej temperaturze i ogrzewać w 100 °C przez 5 min.
  6. Wirować z prędkością 15 777 × g w temperaturze 2-6 °C przez 5 min i odstawić.
    UWAGA: Jeśli reakcja amplifikacji PCR jest przeprowadzana w ciągu 24 h, kwasy nukleinowe można przechowywać w temperaturze 4 °C. Po amplifikacji kwasy nukleinowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C. W przypadku długoterminowego przechowywania (powyżej 24 h) kwasy nukleinowe przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed ponownym użyciem próbkę rozmrozić naturalnie, wymieszać w wortexie, ogrzewać w łaźni wodnej w 95 °C przez 5 min, wirować z prędkością 10 956 × g przez 1 min i użyć nadsączu do amplifikacji PCR.
RoztwórKomponentyNumerSpecyfikacja
Roztwór do płukania10 mM EDTA1 butelka24 ml/butelka
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowych10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, konserwanty do kwasów nukleinowych2 probówki1,2 ml/buteleczkę
Probówka do ekstrakcji kwasów nukleinowychKuleczki szklane1 worek24 butelki/opakowanie

Tabela 1: Skład odczynnika do ekstrakcji kwasów nukleinowych.

3. Izotermiczna amplifikacja wspomagana pętlami oraz chip mikroprzepływowy

  1. Odczynniki i chip mikroprzepływowy
    1. Przeprowadź izotermiczne reakcje amplifikacji na mikroprzepływowym chipie o kształcie dysku (patrz Tabela Materiałów). Amplifikację w stałej temperaturze prowadź w 65 °C.
    2. Wykonaj analizę fluorescencji w czasie rzeczywistym, stosując metodę inkorporacji barwnika fluorescencyjnego14 na analizatorze kwasów nukleinowych z chipem mikroprzepływowym do amplifikacji w stałej temperaturze. W przypadku próbek dodatnich, przy użyciu polimerazy z funkcjonalnością wypierania nici, zaobserwuj krzywą amplifikacji w kształcie litery S.
  2. Izotermiczna amplifikacja zapętlona (LAMP)
    1. Wyceluj w sześć regionów sekwencji za pomocą czterech specyficznych starterów, w tym dwóch starterów wewnętrznych i dwóch starterów zewnętrznych (załączonych do zestawu LAMP).
      UWAGA: DNA jest nieustannie replikowane i amplifikowane w stałej temperaturze przy użyciu polimerazy DNA z funkcjonalnością wypierania nici. Proces reakcyjny obejmuje etap syntezy matrycy w kształcie hantla, etap amplifikacji cyklicznej, elongację oraz etap recyklingu, co w rezultacie prowadzi do powstania mieszaniny fragmentów DNA o strukturach pętlowych (stem-loop) i przypominających kalafior. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji do zestawu (Plik Uzupełniający 1).
    2. Dodaj do układu reakcyjnego startery pętlowe w celu zwiększenia wydajności reakcji; wiążą się one ze strukturami pętlowymi, inicjując syntezę z wypieraniem nici i replikację cykliczną. Skład zestawu do detekcji kwasów nukleinowych patogenów dróg oddechowych przedstawiono w Tabeli 2.
      UWAGA: Zestaw odczynników wykorzystuje metodę LAMP. Zasada opiera się na dynamicznej równowadze DNA w temperaturze około 65 °C, gdzie każdy starter przedłużający się poprzez parowanie zasad w miejscu komplementarnym dwuniciowego DNA powoduje dysocjację drugiej nici, tworząc nić pojedynczą.
  3. Chip mikroprzepływowy
    UWAGA: Każdy chip mikroprzepływowy (patrz Tabela Materiałów) jest wyposażony w 24 dołki reakcyjne numerowane przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, przy czym wlot i wylot dla dołka 1 odpowiadają dołkowi reakcyjnemu 1 (Rysunek 2). W każdym dołku reakcyjnym osadzony i unieruchomiony jest specyficzny zestaw starterów do amplifikacji i detekcji konkretnej docelowej sekwencji kwasu nukleinowego.
    1. Wymieszaj DNA z próbki z odczynnikiem do amplifikacji. Wstrzyknij mieszaninę do chipa i rozprowadź ją do każdego dołka reakcyjnego, wirując przy 1 000 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W każdym dołku reakcyjnym na chipie równocześnie zachodzą niezależne reakcje izotermicznej amplifikacji oraz detekcja fluorescencyjna w czasie rzeczywistym. Jeśli w konkretnym dołku reakcyjnym zostanie wykryta krzywa amplifikacji w kształcie litery S, odpowiadający temu dołkowi wskaźnik detekcji jest dodatni.
KomponentySkładNumer
Układ scalonyStartery12 miejsc
Folia uszczelniająca/1 arkusz
Odczynnik do amplifikacji izotermicznejBarwnik fluorescencyjny, Enzym270 µL/tube
Kontrola pozytywnaGenomowe DNA Escherichia coli160 µL/tube

Tabela 2: Skład zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych patogenów dróg oddechowych.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego z studniami reakcyjnymi, kanałem głównym oraz portami wlotowymi/wylotowymi do analizy.
Rysunek 2: Schemat struktury chipa dyskowego. Studnie reakcyjne są ponumerowane sekwencyjnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, gdzie port wlotowy/wylotowy 1 odpowiada studni reakcyjnej numer 1. Studnie reakcyjne 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 oraz 24 stanowią kontrole negatywne. Studnia reakcyjna 6 jest kontrolą pozytywną (E. coli). Studnia reakcyjna 12 jest wewnętrzną kontrolą pozytywną, a studnia reakcyjna 23 jest zewnętrzną kontrolą pozytywną. Studnia reakcyjna 2 wykrywa spn. Studnia reakcyjna 3 wykrywa sau. Studnia reakcyjna 5 wykrywa MRSA. Studnia reakcyjna 8 wykrywa kpn. Studnia reakcyjna 9 wykrywa pae. Studnia reakcyjna 11 wykrywa aba. Studnia reakcyjna 14 wykrywa sma. Studnia reakcyjna 15 wykrywa hin. Szczegóły dotyczące próbek znajdują się w Tabeli 5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie próbek i detekcja bakterii

  1. Przygotowanie systemu reakcji amplifikacji izotermicznej
    1. Należy wyjąć odczynnik do amplifikacji izotermicznej z zestawu i pozwolić mu całkowicie rozmrozić się w temperaturze pokojowej. Wstrząsnąć delikatnie w celu dokładnego wymieszania, a następnie krótko odwirować, aby zebrać ciecz na dnie probówki.
    2. W obszarze przechowywania i przygotowania odczynników należy pipetować 20 µL odczynnika do amplifikacji izotermicznej do przygotowanej probówki wirówkowej o pojemności 200 µL. Przykryć probówkę i przenieść ją do obszaru przygotowania próbek, stosując jedną probówkę wirówkową na próbkę.
    3. W obszarze przygotowania próbek należy dodać 34.5 µL próbki docelowego kwasu nukleinowego. Wstrząsnąć delikatnie w celu dokładnego wymieszania i krótko odwirować, aby zebrać ciecz na dnie probówki. Całkowita objętość każdego systemu reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych wynosi 54.5 µL (Tabela 3).
  2. Procedura ładowania chipa
    1. Na opakowaniu chipa należy oznaczyć numer próbki. Otworzyć chip mikroprzepływowy z etykietą opakowania skierowaną do góry.
    2. Umieścić chip portami wlotowym i wylotowym skierowanymi do góry. Za pomocą pipety pobrać 50 µL przygotowanego systemu reakcji amplifikacji i wprowadzić go do głównego kanału chipa przez port wlotowy. Przerwać dodawanie, gdy główny kanał zostanie wypełniony, a następnie szybko wytrzeć nadmiar cieczy wokół portów wlotowego i wylotowego za pomocą tkaniny beztkaninowej.
    3. Za pomocą pęsety pobrać jedną folię uszczelniającą i przykryć nią porty wlotowy i wylotowy. Przycisnąć czysty końcówkę pipety do folii uszczelniającej w jednym kierunku. Upewnić się, że uszczelnienie jest szczelne.
  3. Reakcja qPCR
    1. Po zakończeniu wstępnego podgrzewania źródła światła analizatora kwasów nukleinowych należy kliknąć przycisk Open Tray. Umieścić chip stroną przednią do góry na tacy, upewniając się, że pozycjonujący mały cylinder wystaje przez środkową szczelinę chipa, aby go zabezpieczyć. Wyrównać urządzenie pozycjonujące w centrum tacy z dużym otworem centralnym w chipie.
    2. Kliknąć przycisk Close Tray, aby wprowadzić chip do analizatora kwasów nukleinowych.
    3. W obszarze Sample Information na interfejsie detekcji należy wprowadzić informacje do badania próbki. Numer próbki, numer chipa i typ próbki są obowiązkowe; pozostałe są opcjonalne.
    4. Kliknąć przycisk Start Detection w obszarze operacyjnym, aby rozpocząć detekcję próbki. Przyrząd przeprowadzi badanie próbki zgodnie z zaprogramowanym programem.
      UWAGA: Po zakończeniu detekcji oprogramowanie towarzyszące urządzeniu automatycznie przeprowadzi analizę danych. Jednocześnie analizator kwasów nukleinowych rozpocznie proces automatycznego chłodzenia. Po spadku temperatury do 37 °C przyrząd automatycznie otworzy tacę i wysunie chip do odbioru. Wyniki zostaną zinterpretowane automatycznie przez system (Tabela 4).
  4. Standardy kontroli jakości
    1. W każdym chipie w tym zestawie odczynników znajduje się jedna pozytywna kontrola jakości i dziewięć negatywnych kontroli jakości. Należy upewnić się, że wynik detekcji dla pozytywnej kontroli jakości jest pozytywny, a jednocześnie wyniki dla wszystkich dziewięciu negatywnych kontroli jakości są negatywne.
      UWAGA: Po prawej stronie obrazu wyświetlają się wyniki stwierdzające „Quality Control Results: Experiment Normal (Positive Normal, Negative Normal)”, co wskazuje, że wyniki testu są ważne. W przypadku błędnego wyniku dowolnej kontroli ponowne badanie jest wymagane, a wynik testu próbki uznaje się za nieważny. W chipie znajduje się jedna pozytywna kontrola wewnętrzna z wykorzystaniem starterów specyficznych dla człowieka, której wynik jest pozytywny podczas badania próbek klinicznych, a negatywny, jeśli próbka ma niską zawartość ludzkiego genomowego DNA, co wskazuje na niską liczbę komórek. W takich przypadkach należy ponownie pobrać i przebadać próbki.
  5. Analiza wyników
    1. Po zakończeniu detekcji należy wykorzystać metodę maksimum drugiej pochodnej w połączeniu z komercyjnie chronionymi algorytmami w oprogramowaniu, aby obliczyć pierwszy punkt przegięcia s-kształtnej krzywej amplifikacji podczas fazy szybkiej amplifikacji. Szczegóły opisano w części „Zasady testu” w instrukcji Zestawu do detekcji kwasów nukleinowych patogenów oddechowych (Plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Wartość TP jest różnicą czasu między punktem przegięcia a początkiem. Wynik interpretuje się na podstawie wartości TP i wartości oceny pozytywnej. Jeśli wartość TP dla indeksu detekcji jest mniejsza lub równa wartości oceny pozytywnej dla tego indeksu, interpretuje się go jako wynik pozytywny. Jeśli wartość TP przekracza wartość oceny pozytywnej, interpretuje się go jako wynik negatywny, zgodnie z kryteriami „wartości decyzji pozytywnej” w instrukcji. Obszar „Fluorescence Curve Area” wyświetla znormalizowaną krzywą, a obszar „Detection Result” pokazuje wyniki kontroli jakości i detekcji dla każdego parametru (Tabela 5).
SubstratObjętość (µl)
Odczynnik do amplifikacji izotermicznej20
Matryca DNA34.5

Tabela 3: System reakcji amplifikacji izotermicznej.

KrokJedenDwa
Temperatura (°C)3765
Czas (min)347

Tabela 4: Program reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych.

Nazwa wskaźnikaWartość kontroli pozytywnej
Streptococcus pneumoniae (sp)30
Staphylococcus aureus (sau)34
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (mrsa)22
Klebsiella pneumoniae (kpn)29
Pseudomonas aeruginosa (pae)36
Acinetobacter baumannii (aba)36
Stenotrophomonas maltophilia (sma)27
Haemophilus influenzae (hin)36

Tabela 5: Wartość kontroli pozytywnej dla wskaźnika infekcji.

Wyniki

W niniejszym eksperymencie zastosowano technologię amplifikacji izotermicznej, przeprowadzając reakcje na mikrofluidycznym chipie dyskowym. Reakcja odbywa się w mikrofluidycznym analizatorze kwasów nukleinowych z wykorzystaniem metody wprowadzania barwnika fluorescencyjnego. Reakcja izotermiczna jest prowadzona w stałej temperaturze 65 °C, a jednocześnie przeprowadzana jest analiza fluorescencji w czasie rzeczywistym. Próbki pozytywne ulegają amplifikacji pod wpływem polimerazy o funkcjonalności wypierania łańcucha, co skutkuje uzyskaniem krzywej amplifikacji w kształcie litery S. Ten jednotapowy proces kończy amplifikację i detekcję genu docelowego. W badaniu wybrano 7 próbek o różnych wynikach eksperymentalnych, aby wykazać niezawodność projektu doświadczalnego. Wielka litera S oznacza próbkę. S1 to próbka zakażona pojedynczym szczepem K. pneumoniae. S2 do S7 to próbki z zakażeniami polimikrobowymi, wszystkie zakażone K. pneumoniae. W celu uzyskania skutecznych wyników detekcji, interpretację można przeprowadzić na podstawie znormalizowanych krzywych fluorescencji przedstawionych na obrazach. Wskaźnikiem pozytywnym jest krzywa amplifikacji o kształcie litery S, natomiast linia pozioma reprezentuje wskaźnik negatywny (Rysunek 3).

Intensywność fluorescencji w czasie w analizie qPCR; wykresy przedstawiają krzywe amplifikacji DNA.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki amplifikacji kwasów nukleinowych za pomocą LAMP. Wielka litera S oznacza próbkę. S1 to próbka zainfekowana pojedynczym szczepem kpn. S2 do S7 to próbki z infekcjami polimikrobowymi, wszystkie zainfekowane kpn. S2 reprezentuje próbkę zainfekowaną kpn oraz sma. S3 oznacza próbkę współzainfekowaną kpn, sau oraz MRSA. S4 oznacza próbkę współzainfekowaną kpn, sau, MRSA oraz aba. S5 wskazuje próbkę współzainfekowaną kpn, sma, sau, MRSA oraz aba. S6 oznacza próbkę współzainfekowaną kpn, sma, pae, sau, MRSA oraz aba. S7 reprezentuje próbkę współzainfekowaną kpn, sma, pae, sau, MRSA, aba oraz E. coli. Szczegóły dotyczące próbek znajdują się w Tabeli 5. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Ten zestaw odczynników wykorzystuje metodę ROC do obliczenia wartości progowych dodatnich dla ośmiu wskaźników testowych. Gdy wartość TP wskaźnika detekcji jest mniejsza lub równa odpowiadającej mu wartości progowej dodatniej, interpretuje się wynik jako dodatni. I odwrotnie, gdy wartość TP wskaźnika detekcji jest większa od jego wartości progowej dodatniej, interpretuje się wynik jako ujemny. Wartości progowe dodatnie dla każdego wskaźnika szczegółowo opisano w Tabeli 5. Prawdziwe dodatnie wartości TP, które wykryto dla 7 próbek o różnych wynikach eksperymentalnych, przedstawiono w Tabeli 6.

PRÓBKAkpnrdzeniowy zanik mięśni (SMA)PAEsauMRSA (gronkowiec złocisty oporny na metycylinę)hinabaekologia
TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)TP (+/-)
S119.68 (+)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)
S217.73 (+)18.30 (+)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)U (-)
S316.73 (+)U (-)U (-)18.05 (+)12.18 (+)U (-)U (-)U (-)
S421.66 (+)U (-)U (-)27.07 (+)19.61 (+)U (-)18.29 (+)U (-)
S516.16 (+)20.85 (+)U (-)23.80 (+)17.13 (+)U (-)15.22 (+)U (-)
S611.20 (+)16.79(+)17.18(+)23.09 (+)16.14 (+)U (-)14.28 (+)U (-)
S714.69 (+)24.84(+)19.70(+)24.07(+)14.16 (+)- (+)15.23 (+)20.12 (+)
Każda próbka +/- wynik jakościowy;
 +, wynik dodatni; -, wynik ujemny. 

Tabela 6: Tabela wartości TP dla detekcji po infekcji.

Tabela uzupełniająca 1: Lista skrótów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Instrukcje zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych patogenów układu oddechowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Infekcje dróg oddechowych są powszechnymi infekcjami szpitalnymi, powodującymi poważne konsekwencje dla pacjentów i zwiększającymi śmiertelność16. Terminowa i dokładna identyfikacja potencjalnych patogenów, a następnie skuteczne antybiotyki jest kluczem do skutecznego leczenia i poprawy rokowania, szczególnie biorąc pod uwagę ograniczenia związane z tradycyjnymi metodami hodowli17. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę opartą na LAMP do określenia pojedynczych lub wielokrotnych infekcji w celu szybkiego i precyzyjnego wykrywania infekcji dróg oddechowych. Ten szybki system detekcji powstał dzięki połączeniu technologii LAMP z technologią mikroprzepływową. Kwas nukleinowy z próbek klinicznych, takich jak plwocina, BLF i ALF, można szybko wyekstrahować. Ten wyekstrahowany materiał ułatwia szybkie i precyzyjne wykrywanie patogenów bakteryjnych, ukierunkowując praktyki kliniczne na poprawę kontroli i leczenia infekcji dróg oddechowych.

Wcześniejsze badania wykazały, że w porównaniu z metodami opartymi na kulturach i reakcji łańcuchowej polimerazy, wyniki LAMP osiągnęły 100% czułość, swoistość i brak reakcji krzyżowej z innymi bakteriami w czystych kulturach i próbkach krwi18. Testy LAMP mogą również wykrywać patogeny bezpośrednio z płynów biologicznych, takich jak krew, płyn opłucnowy i otrzewnowy oraz płyn mózgowo-rdzeniowy19. Wcześniej wykazano, że egzogenne DNA i inhibitory mogą znacznie zmniejszać czułość PCR, a w przypadku testów LAMP oczyszczanie DNA z próbek klinicznych nie jest wymagane20. Technika ta wykorzystuje geny drożdży i startery podczas procesu amplifikacji do oceny normalności amplifikacji, określając w ten sposób kwalifikację kontroli jakości kontroli zewnętrznej. Kontrole wewnętrzne, wykorzystujące startery z ludzkich genów, określają normalność procesów pobierania próbek, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji. Jednoczesne wykorzystanie kontroli wewnętrznych i zewnętrznych zapewnia wiarygodność wyników. W tym samym czasie ustawianych jest również wiele studni kontroli dodatniej i ujemnej, co znacznie zapewnia dokładność testu. Chip mikroprzepływowy LAMP ma możliwości podobne do qPCR w wykrywaniu próbek klinicznych. Charakteryzuje się wysoką czułością i silną zdolnością wykrywania, zapewniając niezawodną podstawę do szybkiego wykrywania klinicznego i precyzyjnego leczenia21. Hodowla drobnoustrojów trwa 3-5 dni lub nawet dłużej, a niektóre patogeny, takie jak Chlamydia pneumoniae i Legionella pneumophila, nie mogą być hodowane. W przeciwieństwie do tego, LAMP wykrywa wiele patogenów bakteryjnych, nawet tych, których nie da się wyhodować, w czasie krótszym niż 3 godziny, co znacznie zwiększa szybkość wykrywania.

Może również wykonywać wiele detekcji. Chip mikroprzepływowy LAMP jest podzielony na różne jednostki reakcyjne, które wykrywają wiele patogenów równolegle, zapewniając niezależność każdej reakcji i dokładność wyników 22,23. Dane z China Network Antibacterial Surveillance Center wykazały, że rozpowszechnienie K. pneumoniae zajęło pierwsze miejsce wśród izolatów bakteryjnych z próbek oddechowych w 2022 r.15. Wśród próbek oddechowych pobranych przez Prowincjonalny Szpital Ludowy w Guangdong w 2022 r. dodatni wskaźnik K. pneumoniae przebadany przez LAMP wyniósł 18,6%, co jest również jedną z bakterii o największej częstości występowania. We wszystkich próbkach dodatnich pod względem K. pneumoniae 30,6% stanowiły zakażenia wywołane wyłącznie przez K. pneumoniae, a 29,7% to infekcje, w których K. pneumoniae współistniała z innymi gatunkami bakterii. Dodatkowo odnotowano potrójne (23,9%) i poczwórne zakażenia (10,5%) związane z zakażeniem K. pneumoniae, które stanowiły większość w próbkach KP-dodatnich, około 95%. Odnotowano bardzo niewiele przypadków zakażeń pięciokrotnych i sześciokrotnych, a do tej pory nie wykryto zakażeń powyżej sześciokrotki. Wyniki przedstawiają sześć reprezentatywnych scenariuszy, z których każdy reprezentuje wyniki wykrywania infekcji wywołanych przez K. pneumoniae samodzielnie lub współistniejących z 1-5 innymi gatunkami bakterii.

Ponadto technologia chipów LAMP zastosowana w tym badaniu może również wykrywać oporność bakterii. Wykrywa MRSA oporny na metycylinę za pośrednictwem genu mecA . Gdy studzienki reprezentujące Staphylococcus aureus i studzienki dla genu mecA są dodatnie, reprezentują one zakażenie metycyliną-MRSA. Naukowcy nieustannie poszukują metod jednoczesnego szybkiego wykrywania patogenów i cech oporności na antybiotyki. Na przykład szybka metoda diagnostyczna zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki opiera się na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR)24. Inne podejście polega na szybkim przewidywaniu wielolekoopornych K. pneumoniae poprzez analizę widm25 wspomaganego rozpraszania Ramana (SERS) w głębokim uczeniu oraz metodę wykrywania genów K. pneumoniae i karbapenemazy przy użyciu widm SERS26. Ponadto istnieje metoda klasyfikacji i przewidywania dla różnych profili typowania sekwencji wielolocus (MLST) szczepów K. pneumoniae w oparciu o analizę widm SERS27. Następnie opracujemy również czułe i dokładne wykrywanie genów K. pneumoniae i karbapenemazy, z wydajnością porównywalną ze złotymi standardami metod klinicznych, które są czasochłonne lub opierają się na drogich specjalistycznych instrumentach. Co więcej, idealne podejście diagnostyczne jest szybkie, dokładne, ekonomiczne i przyjazne dla użytkownika18. Badanie szacujące koszt odczynników do obecnych technologii diagnostycznych wykazało, że badanie próbek w oparciu o technologię PCR kosztuje do 6,4-7,7 USD, w porównaniu z zaledwie 0,71-2 USD w przypadku technologii LAMP28.

Metoda wielokanałowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), oferując znaczące korzyści w zakresie szybkiego wykrywania patogenów bakteryjnych w infekcjach dróg oddechowych, ma swoje ograniczenia. Wysoka czułość LAMP stwarza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, w którym minimalne zanieczyszczenie DNA może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich29; W związku z tym konieczne jest rygorystyczne postępowanie z próbkami i protokoły proceduralne, aby ograniczyć to ryzyko. Pomimo prostoty metody, interpretacja wyników wymaga specjalistycznej wiedzy i doświadczenia, aby uniknąć błędnej interpretacji lub błędów diagnostycznych, co podkreśla potrzebę dobrze wyszkolonego personelu. Rozpoznanie tych ograniczeń jest niezbędne do skutecznego zastosowania i dalszego rozwoju metody LAMP w dziedzinie diagnostyki klinicznej. Podsumowując, metoda LAMP w połączeniu z chipem mikroprzepływowym może szybko wykrywać różne patogeny bakteryjne równolegle. Ma zalety wysokiej czułości i silnej specyficzności oraz cech niskiego kosztu, szybkości i wygody. Ma ona duże znaczenie praktyczne w zapobieganiu i kontrolowaniu infekcji dróg oddechowych spowodowanych infekcjami patogennymi w warunkach klinicznych. Istotną cechą testu LAMP zaproponowanego w tym badaniu jest to, że jest on łatwy do opanowania przez personel laboratoryjny, co jest bardzo pomocne dla szpitali podstawowych, zapobiegania chorobom, centrów kontroli oraz oddziałów inspekcji i kwarantanny. Podsumowując, mikroprzepływowy system chipowy LAMP jest potężnym narzędziem do wykrywania w laboratoriach klinicznych, które może rozwiązać problemy związane z wysokimi wydatkami i krótkim czasem realizacji w klinicznej diagnostyce zakażeń i ma znaczące wartości zastosowania w warunkach klinicznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Bardzo doceniamy wsparcie finansowe udzielone przez Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (Grant nr 2022A1515220023) oraz Fundację Badawczą na rzecz Zaawansowanych Talentów Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Guandong (Grant No. KY012023293).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator kąpielowy (MK2000-2)ALLSHENGZapewnij środowisko o stałej temperaturze
Głowica kolektora płynu z płukania oskrzeliTIANPINGHUACHANGSEDA 20172081375Zbieranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
Bronchoskop światłowodowyOLYMPUSSEDA 20153062703Elastyczny bronchoskop wyposażony w światłowodowe źródło światła i kamerę, do wizualnego badania dróg oddechowych i struktur w płucach. Pomoc w zbieraniu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
HR1500-figure-materials-1B2Szafa bezpieczeństwa biologicznegoHaierSEDA 20183541642
NAOHMACKLINS817977Upłynnić lepką próbkę dolnych dróg oddechowych
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla patogenów dróg oddechowychCapitalbio TechnologySEDA 20173401346Testy na infekcję bakteryjną
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowychCapitalbio TechnologySEDA 20160034Dla DNA ekstrakcja
RTisochip-WCapitalbio TechnologySEDA 20193220539Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli
THERMO ST16RThermo Fisher ScientificSEDA 20180585Odwiruj pozostałą ciecz ze ścianki probówki.
Mieszalnik wirowy VM-5005JOANLABDo mieszania odczynnika

Bibliografia

  1. GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
  2. Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150(2022).
  3. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
  4. Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
  5. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  6. Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
  7. Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216(2010).
  8. Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37(2019).
  9. Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
  10. Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068(2022).
  11. T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63(2000).
  12. Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931(2021).
  13. Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
  14. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  15. Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
  16. Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57(2015).
  17. Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
  18. Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
  19. Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572(2012).
  20. Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
  21. Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39(2018).
  22. Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  23. Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
  24. Liang Wang, J. -X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689(2023).
  25. Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622(2023).
  26. Wei Liu, J. -W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921(2022).
  27. Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161(2023).
  28. Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
  29. Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie patogenów bakteryjnychekstrakcja kwasów nukleinowychszybkie wykrywanie patogenówKlebsiella pneumoniaezakażenia polimikrobowetesty w punkcie opiekianalizator kwasów nukleinowych
Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.