Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66679

⸱

7 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Streszczenie

Transgeneza u Drosophila jest podstawowym podejściem do badania funkcji genów na poziomie organizmu. Mikroiniekcja zarodka jest kluczowym krokiem w budowie muszek transgenicznych. Mikroiniekcja wymaga niektórych rodzajów sprzętu, w tym mikroiniektora, mikromanipulatora, mikroskopu odwróconego i mikroskopu stereoskopowego. Plazmidy wyizolowane za pomocą zestawu minipreparacyjnego plazmidu kwalifikują się do mikroiniekcji. Zarodki w stadium preblastodermy lub blastodermy syncytialnej, w których jądra mają wspólną cytoplazmę, poddaje się mikroiniekcji. Sitko komórkowe ułatwia proces dekorionacji zarodków. Optymalny czas dechorionacji i wysuszenia zarodków musi zostać określony doświadczalnie. Aby zwiększyć skuteczność mikroiniekcji zarodków, igły przygotowane za pomocą ściągacza muszą być ukosowane za pomocą młynka do igieł. W procesie mielenia igieł wykorzystujemy nożną pompę powietrza z manometrem, aby uniknąć efektu kapilarnego końcówki igły. Rutynowo wstrzykujemy 120-140 zarodków do każdego plazmidu i uzyskujemy co najmniej jedną linię transgeniczną dla około 85% plazmidów. W artykule tym wzięto za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u Drosophila.

Wprowadzenie

Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest niezwykle podatna na manipulacje genetyczne i analizę genetyczną. Transgeniczne muszki owocowe są szeroko stosowane w badaniach biologicznych. Od czasu opracowania na początku lat 80., transgeneza za pośrednictwem transpozonu elementu P była niezbędna do badań nad Drosophila1. W niektórych scenariuszach inne transpozony, takie jak piggyBac i Minos, były również używane do transgenezy u Drosophila2. Transgeny za pośrednictwem transpozonu są losowo wstawiane do genomu Drosophila, a poziomy ekspresji transgenów w różnych loci genomu mogą się różnić ze względu na efekty pozycji, a zatem nie można ich porównać2. Wady te zostały przezwyciężone przez transgenezę specyficzną dla miejsca, w której pośredniczy phiC313. Gen phiC31 bakteriofaga koduje integrazę, która pośredniczy w specyficznej dla sekwencji rekombinacji między miejscami attB i attP w Drosophila3. Wiele miejsc dokowania attP zostało scharakteryzowanych i jest dostępnych w Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.

System transgenezy phiC31 dla Drosophila jest szeroko stosowany przez społeczność much. Wśród miejsc dokowania attP, attP18 na chromosomie X, attP40 na drugim chromosomie i attP2 na trzecim chromosomie są zwykle preferowanymi miejscami integracji transgenu na każdym chromosomie, ponieważ transgeny w tych trzech miejscach wykazują wysoki poziom indukowanej ekspresji, mając jednocześnie niski poziom ekspresji podstawowej5. Ostatnio jednak van der Graaf i współpracownicy odkryli, że miejsce attP40, blisko locus genu Msp300, i transgeny zintegrowane z attP40 powodują grupowanie się jąder mięśni larwalnych u Drosophila10. W innym niedawnym badaniu Duan i współpracownicy odkryli, że homozygotyczny chromosom attP40 zakłóca normalną organizację kłębuszków nerkowych klasy neuronów receptora węchowego Or47b u Drosophila11. Wyniki te sugerują, że podczas projektowania eksperymentów i interpretacji danych należy uwzględnić rygorystyczne kontrole.

Drosophila jest idealnym organizmem modelowym do badania in vivo funkcji genów ze względu na krótki cykl życia, niski koszt i łatwość utrzymania. Genetyczne badania przesiewowe całego genomu opierają się na budowie bibliotek transgenicznych całego genomu w Drosophila12,13,14,15. Wcześniej wygenerowaliśmy 5551 konstruktów UAS-cDNA/ORF opartych na binarnym systemie GAL4/sekwencja aktywująca (GAL4/UAS), obejmujących 83% genów Drosophila konserwatywnych u ludzi w Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. Plazmidy UAS-cDNA/ORF mogą być wykorzystane do stworzenia transgenicznej biblioteki UAS-cDNA/ORF u Drosophila. Wydajna technologia mikroiniekcji zarodków może przyspieszyć tworzenie bibliotek muszek transgenicznych.

W przypadku mikroiniekcji zarodkowej, końcówka igły jest zwykle złamana na szkiełku nakrywkowym17. W związku z tym igły często się zapychają lub powodują wyciek dużych ilości cytoplazmy, a gdy pojawiają się te problemy, należy zastosować nowe igły. Chociaż igły do ukosowania mogą zwiększyć wydajność mikroiniekcji, roztwór do mielenia dostaje się do ukosowanej końcówki podczas procesu mielenia. Roztwór mielący w skośnej końcówce nie odparowuje szybko w sposób naturalny; Dlatego igły nie mogą być używane do mikroiniekcji bezpośrednio po ukosowaniu. Czynniki te obniżają skuteczność zabiegów mikroiniekcji zarodków. Tutaj, używając jako przykładu transgenezy specyficznej dla miejsca za pośrednictwem phiC31, przedstawiamy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u Drosophila. Aby zapobiec przedostawaniu się roztworu do mielenia do igły, wykorzystujemy pompę powietrza do wywierania ciśnienia powietrza w igle, zapobiegając w ten sposób przedostawaniu się roztworu mielącego do skośnej końcówki. Igły skośne są gotowe do załadowania próbki i mikroiniekcji bezpośrednio po ukosowaniu.

Protokół

1. Przygotowanie plazmidów

  1. Wyizoluj plazmidy z 4 ml nocnych kultur bakteryjnych za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu. Eluować za pomocą 40 μl buforu elucyjnego.
    UWAGA: Izolacja plazmidów za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu midi-prep nie jest konieczna. Zestaw do minipreparacji plazmidu może w pełni spełnić wymagania eksperymentalne dotyczące mikroiniekcji zarodka. W tym protokole przygotowane plazmidy UAS-cDNA / ORF zawierają dziesięć kopii UAS, minimalny promotor Hsp70, miejsce attB, mini-biały gen i gen będący przedmiotem zainteresowania.
  2. Oznaczyć stężenie plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać w temperaturze -80 °C zamrażarki.
    UWAGA: Stężenie plazmidu nie ma krytycznego znaczenia dla udanej mikroiniekcji zarodka, ponieważ stężenia plazmidu w zakresie od 20 ng/μL do 1683 ng/μL dobrze sprawdzają się w transgenezie u Drosophila (Tabela uzupełniająca 1).
  3. Tuż przed mikroiniekcją rozmrozić plazmidy i odwirować przy 13000 x g przez 5 min.
  4. Przenieś 10 μl każdego plazmidu z górnej warstwy cieczy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

2. Ciągnięcie igieł

  1. Włącz ściągacz igłowy z wybranymi ustawieniami (Ciepło: 500, Ciągnięcie: 50, Vel: 60, Opóźnienie: 90, Ciśnienie: 200, Test rampy: 510).
  2. Włóż kapilę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm, długość 10 cm) do ściągacza igieł i zamknij pokrywę.
  3. Naciśnij przycisk ciągnięcia. Każda szklana kapilara tworzy dwie igły.

3. Igły do mielenia (Rysunek 1)

  1. Użyj szlifierki igłowej zamontowanej z odpowiednią płytką ścierną (dla rozmiarów końcówek 0,7-2,0 μm) szlifierki igłowej.
  2. Zwilż szmatkę (drut odniesienia) roztworem do mielenia (100 ml wody destylowanej z 0,9 g NaCl, 1 ml środka zwilżającego) i zamocuj szmatkę.
  3. Włącz szlifierkę igłową i utrzymuj tarczę szlifierską w ruchu.
  4. Podłącz igłę do nożnej pompki powietrznej z manometrem za pomocą silikonowej rurki kapilarnej, a następnie zamontuj igłę na uchwycie igły młynka igłowego. Dostosuj kąt igły względem płyty szlifierskiej do 35° (Rysunek 1A, B).
  5. Wyreguluj położenie końcówki igły tuż nad powierzchnią płyty szlifierskiej za pomocą pokrętła zgrubnego pod mikroskopem (Rysunek 1C).
    UWAGA: Ciągnięte igły uzyskane w sekcji 2 mają stożek 6-8 mm i końcówkę mniejszą niż 1 μm (Rysunek 1D), zgodnie z opisem w instrukcji obsługi ściągacza.
  6. Utrzymuj ciśnienie wewnętrzne igły na poziomie 40 psi za pomocą nożnej pompki powietrznej. Wyreguluj położenie końcówki igły za pomocą precyzyjnego pokrętła sterującego pod mikroskopem i spraw, aby końcówka igły dotykała płytki szlifierskiej.
  7. Miel przez 3-5 s. Gdy z końcówki igły wydostaną się drobne pęcherzyki powietrza, rozładuj igłę (Rysunek 1E).
    UWAGA: W procesie mielenia użycie pompy powietrza zapobiega zasysaniu roztworu mielącego.
  8. Włóż zmielone igły do pojemnika do przechowywania.
    UWAGA: Używaj świeżo zmielonych igieł tak często, jak to możliwe, chociaż zmielone igły można przechowywać w etui do przechowywania przez co najmniej kilka tygodni przed mikrowstrzyknięciem.

4. Przygotowanie pipet do ładowania plazmidów

  1. Podgrzej pipetę o pojemności 200 μl z zewnętrznym płomieniem palnika alkoholowego.
  2. Gdy zacznie się topić, rozciągnij pipetę.
  3. Odetnij zapieczętowany koniec rozciągniętej pipety nożyczkami, a rozciągnięta pipeta jest gotowa do załadowania DNA do zmielonej igły.
    UWAGA: Alternatywnie, w handlu dostępne są bardzo długie i cienkie końcówki do napełniania igieł mielonych.
  4. Umieść te pipety w autoklawizowanym plastikowym pudełku.

5. Pobieranie zarodków

  1. Zebrać muchy (vas-phiC31; + ; attP2) wykazujące ekspresję integrazy phiC31 i niosące miejsce dokowania attP2 3 dni po ich wykluciu z 50 fiolek i przenieść je do klatki (φ 90 mm x 150 mm). Dodaj trochę świeżej pasty drożdżowej na środek każdego talerza z agarem winogronowym18.
  2. Przygotuj 2-4 klatki much. Klatki i talerze należy przechowywać w temperaturze 25 °C i wymieniać je codziennie przez 2-4 dni.
    UWAGA: W tym badaniu połączono transgen vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) na pierwszym chromosomie i transgen attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) na trzecim chromosomie. Wynikowy zapas (vas-phiC31; + ; attP2) jest używany w tym protokole. Pastę drożdżową należy przygotowywać codziennie, a muchy należy podawać świeżą pastę drożdżową. Wymienione klatki muszą zostać oczyszczone i wysuszone, aby pozbyć się pozostałych zarodków w klatkach.
  3. W dniu mikroiniekcji należy rano wymienić klatki i płytki. Następnie należy wymieniać płytki co 30 minut i pobierać z nich zarodki. Wymień wszystkie klatki i talerze w temperaturze pokojowej (RT), a następnie utrzymuj klatki i płytki w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Niektóre protokoły preferują inkubację klatek i płytek w temperaturze 18 °C w celu złożenia jaj. Zależy to od liczby zarodków potrzebnych do mikroiniekcji.

6. Zarodki dechorionujące

  1. Przygotuj 30% wybielacz, mieszając 60 ml wybielacza (o zawartości aktywnego chloru 34-46 g/l) i 140 ml podwójnie destylowanej wody.
  2. Usuń pozostałe muchy z talerzy agarowych z sokiem winogronowym za pomocą pędzla lub kleszczy i spłucz zarodki do sitka komórkowego wodą podwójnie destylowaną.
  3. Osuszyć sitko zawierające zarodki bibułą.
  4. Umieść go na szalce Petriego zawierającej 30% wybielacza i obracaj sitko do komórek ręcznie lub w wytrząsarce poziomej przez 1,5 minuty przy 60 obr./min.
    UWAGA: Płukanie jest krytycznym krokiem. Jeśli czas płukania nie jest wystarczająco długi, skorupa zarodka nie odpadnie całkowicie. Jeśli czas płukania jest zbyt długi, spowoduje to, że zarodek stanie się miękki i łatwo pęknie. Sitko do komórek powinno być całkowicie zanurzone w 30% wybielaczu. Noś parę gumowych rękawiczek i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć obrażeń spowodowanych wybielaczem.
  5. Płucz zarodki przez 2 minuty podwójnie destylowaną wodą przechowywaną w laboratoryjnej plastikowej butelce do mycia, aby usunąć resztki wybielacza. Wybierz pływające zarodki do składu.

7. Ustawianie zarodków w kolejce

  1. Pokrój stały agar z sokiem winogronowym w długie paski za pomocą ostrza.
    UWAGA: Użyj fioletowego soku winogronowego, aby ułatwić ułożenie białych zarodków.
  2. Przenieś zarodki na długi pasek za pomocą pędzla.
  3. Ustaw około 60 zarodków za pomocą igły preparacyjnej wzdłuż krawędzi długiego paska, tak aby ich tyły były skierowane na zewnątrz paska. Ułóż około 60 zarodków w ciągu 5 minut
    UWAGA: Mikropyl to występ w kształcie stożka na przednim biegunie zarodka, przez który plemniki wchodzą w celu zapłodnienia oocytu (Ryc. 2A). Dlatego, na podstawie występu w kształcie stożka na przednim biegunie zarodka, łatwo jest określić tylną część zarodka pozbawionego naskórków.
  4. Umieść taśmę dwustronną o grubości 18 mm wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego (18 mm x 18 mm) i usuń papierowy podkład. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do wyrównanych zarodków. Upewnij się, że zarodki są przyklejone do środka taśmy.

8. Wysuszanie zarodków

  1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z ułożonymi w szeregu zarodkami w pudełku zawierającym środek osuszający. Czas schnięcia różni się w zależności od temperatury i wilgotności.
    UWAGA: Czas schnięcia ma kluczowe znaczenie dla mikroiniekcji i musi być określony eksperymentalnie. Czas schnięcia wynosi zwykle 9-10 min latem i 17-18 min zimą.
  2. Przykryj zarodki olejem halowęglowym.
    UWAGA: Nie upuszczaj zbyt dużej ilości oleju na zarodki, ponieważ dodatkowy olej może przelać się przez klej. Stosunek objętości oleju halowęglowego 700 i oleju halowęglowego 27 wynosi 1:3.

9. Mikroiniekcja zarodków

  1. Załaduj 2 μl DNA do igły za pomocą rozciągniętej pipety. Upewnij się, że w igle nie ma pęcherzyków powietrza. Umieścić igłę w uchwycie igły mikromanipulatora.
  2. Umieść wyrównane zarodki pokryte olejem halowęglowym pod odwróconym mikroskopem. Upewnij się, że tylne końce zarodków są skierowane w stronę igły.
  3. Użyj mikromanipulatora, aby zbliżyć igłę do zarodków. Oczyścić igłę. Upewnij się, że widoczna jest kropla płynu wypływająca z igły. Zaczynając od ciśnienia wtrysku 300 hPa i ciśnienia równowagi 20 hPa, dostosuj ciśnienie wtrysku i ciśnienie równowagi, aby zapewnić optymalną wielkość kropli cieczy.
  4. Użyj mikromanipulatora, aby wprowadzić igłę do tylnych końców zarodków i użyj sterownika nożnego podłączonego do mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć DNA (Rysunek 2). Jeśli widoczna jest mała aureola, DNA jest z powodzeniem wstrzykiwane do zarodka.
    UWAGA: Wybierz zarodki wielojądrowe do wstrzyknięcia i zabij starsze zarodki za pomocą przycisku "wyczyść". Jeśli po wstrzyknięciu wycieknie duża ilość cytoplazmy, zarodki są niedostatecznie wysuszone. Jeśli po wstrzyknięciu wycieka tylko niewielka ilość cytoplazmy lub jej brak, zastrzyki uważa się za udane. Jeśli po wstrzyknięciu z więcej niż jednej trzeciej zarodków wycieka cytoplazma, należy wydłużyć czas schnięcia o 1-2 minuty. Jeśli więcej niż jedna trzecia zarodków jest przesuszona, skróć czas schnięcia o 1-2 minuty.
  5. Wyjąć igłę z zarodka. Przesunąć igłę do tylnego końca następnego zarodka. Powtórz powyższe kroki.
  6. Umieść wstrzyknięte zarodki na płytce agarowej. Umieść talerz w pomieszczeniu o temperaturze 18-20 °C. Następnego dnia przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%-60% i inkubować przez 1 dzień.
    UWAGA: Po wstrzyknięciu należy przechowywać zarodki w temperaturze 18-20 °C, aby spowolnić ich rozwój, ułatwić integrację plazmidowego DNA z genomem Drosophila i zwiększyć przeżywalność wstrzykniętych zarodków.

10. Zbieranie larw

  1. Użyj igły do preparowania, aby zeskrobać i poluzować pokarm w fiolce. Zaopatrz żywność w kilka kropel wody destylowanej.
    UWAGA: Pozwól, aby woda destylowana została wchłonięta przez żywność, aby zapobiec utonięciu larw.
  2. Wyjmij płytki z inkubatora.
  3. Zebrać wyklute larwy za pomocą pędzla pod mikroskopem stereoskopowym i przenieść je do fiolki.
  4. Umieścić fiolkę w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%-60%.

11. Pozyskiwanie transgenicznych much

  1. Wyklute muchy należy zebrać po inkubacji fiolki w temperaturze 25 °C przez 10 dni.
  2. Skrzyżuj pojedynczego samca muchy z trzema dziewiczymi samicami much z balanserów TM2/TM6C Sb1 Tb1 i skrzyżuj pojedynczą samicę muchy z trzema samcami much z balanserów TM2/TM6C Sb1 Tb1.
  3. Umieść krzyże w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%-60%.
  4. Przesiewaj potomstwo pod kątem much o pomarańczowych oczach. Są to muchy transgeniczne (Rysunek 3A-C).
    UWAGA: Muchy noszące kopię transgenu w miejscu dokowania attP2 mają pomarańczowe oczy.
  5. Skrzyżuj pojedynczego pomarańczowookiego samca muchy z trzema dziewiczymi samicami much z balanserów TM2/TM6C Sb1 Tb1, aby założyć stado.
    UWAGA: Konieczne jest ustawienie więcej niż jednego pokolenia krzyżówek, aby wyciąć transgen phiC31 na pierwszym chromosomie.

Wyniki

Końcówka igły iniekcyjnej jest ścięta przez szlifierkę igłową (Rysunek 1). W ciągu godziny można ukośować 50-60 igieł. DNA jest mikrowstrzykiwane do tylnej części zarodka w stadium przed blastodermą lub blastodermą syncytialną, gdzie jądra mają wspólną cytoplazmę (Figura 2A). Tylna część zarodka może być łatwo zlokalizowana na podstawie mikropylu z przodu zarodka (Rysunek 2A). Zarodki w stadium blastodermy komórkowej i gastrulacji nie mogą być używane do wstrzykiwań, ponieważ każde jądro jest otoczone błoną komórkową na tych etapach, a zatem szansa na uzyskanie muszek transgenicznych jest prawie zerowa (Ryc. 2B). Przesuszone zarodki są zdeformowane po nakłuciu i nie mogą być używane do mikroiniekcji (Rysunek 2C). Niedosuszone zarodki mogą wytłaczać dużą ilość cytoplazmy po szturchnięciu igłą (Ryc. 2D), co skutkuje niższym wskaźnikiem przeżycia zarodków. Zarodki, które są odpowiednio wysuszone, mogą, ale nie muszą, wydzielać niewielką ilość cytoplazmy po wstrzyknięciu (Ryc. 2E).

Linia Drosophila wyrażająca integrazę phiC31 i posiadająca miejsce dokowania attP2, która jest używana do mikroiniekcji zarodków w tym protokole, ma białe oczy (Rysunek 3A), a stare muszki tego genotypu mają różowe oczy wynikające z nagromadzonego czerwonego białka fluorescencyjnego wyrażonego specyficznie w oku (Rysunek 3B). Używamy genu mini-white jako selektywnego markera transgenezy u Drosophila, a transgeniczne muchy są identyfikowane na podstawie koloru oczu od jasnożółtego do czerwonego. Transgeniczne muchy noszące transgen w miejscu dokowania attP2 mają pomarańczowe oczy (Ryc. 3C), które można łatwo odróżnić od much bez transgenów.

figure-results-1
Rysunek 1: Mielenie igieł. (A) Pompka nożna z manometrem służy do przykładania ciśnienia powietrza do igły. (B) Igła jest zamontowana na szlifierce igłowej pod kątem 35° do powierzchni płyty szlifierskiej. (C) Użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby ustawić końcówkę igły tuż nad powierzchnią płyty szlifierskiej, a następnie użyj pokrętła precyzyjnej regulacji, aby rozpocząć ukosowanie końcówki. (D) Końcówka wyciągniętej igły znajduje się pod mikroskopem. Podziałka = 10 μm. (E) Skośna igła znajduje się pod mikroskopem. Skośna końcówka igły jest oznaczona strzałką. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zarodki Drosophila nadające się do mikroiniekcji. (A) Zarodek Drosophila w stadium preblastodermy lub syncytialnej blastodermy może zostać wstrzyknięty w tylny biegun zarodka, oznaczony czerwoną elipsą. Mikropyl na przednim biegunie zarodka jest oznaczony strzałką. (B) Zarodek Drosophila w stadium blastodermy komórkowej nie może być wykorzystany do mikroiniekcji. (C) Zarodek, który jest nadmiernie wysuszony, wygląda na zdeformowany. (D) Niewystarczające wysuszenie zarodka prowadzi do dużej ilości wycieku cytoplazmatycznego po wstrzyknięciu. (E) Aby wstrzyknięcie zakończyło się sukcesem, może dojść do wycieku niewielkiej ilości cytoplazmy. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Kolor oczu transgenicznej Drosophila posiadającej transgen w miejscu dokowania attP2. (A) Linia iniekcyjna attP2 wyrażająca integrazę phiC31 (vas-phiC31; + ; attP2) ma białe oko. RFP specyficznie wyrażany w oku jest używany jako selektywny marker transgenu phiC31. (B) Starzejąca się linia iniekcyjna attP2 eksprymująca integrazę phiC31 ma różowe oko wynikające z nagromadzonego białka RFP w oku. (C) Muchy z transgenem zintegrowanym z miejscem dokowania attP2 mają pomarańczowe oko. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Transgeneza u Drosophila wynikająca z mikroiniekcji zarodka 100 różnych plazmidów. W sumie 100 różnych plazmidów o różnych stężeniach w zakresie od 20 ng/μL do 1683 ng/μl wstrzyknięto do zarodków, a dla 85 ze 100 plazmidów uzyskano muszki transgeniczne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Skuteczność mikroiniekcji zarodka w transgenezie u Drosophila. W sumie 120 różnych plazmidów wstrzyknięto do zarodków, a dla 101 ze 120 plazmidów uzyskano transgeniczne muchy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u Drosophila. W przypadku transgenezy specyficznej dla miejsca za pośrednictwem phiC31 wstrzyknęliśmy 120-140 zarodków dla każdego plazmidu i uzyskaliśmy co najmniej jedną linię transgeniczną dla około 85% plazmidów (Tabela uzupełniająca 2). Z naszego doświadczenia wynika, że plazmidowe DNA wyizolowane za pomocą zestawu do minipreparacji plazmidu wystarcza do transgenezy u Drosophila. Stężenia plazmidowego DNA w zakresie od 20 ng/μL do 1683 ng/μL mogą nie mieć widocznego wpływu na wskaźnik powodzenia transgenezy, ponieważ większość z nich może wytwarzać muchy transgeniczne (Tabela uzupełniająca 1).

Przygotowanie igieł iniekcyjnych ma kluczowe znaczenie dla skutecznego mikroiniekcji zarodków. Igła do wstrzykiwań jest zamykana po pociągnięciu jej przez ściągacz igły. W przypadku rutynowej transgenezy za pośrednictwem phiC31 u Drosophila, końcówka igły jest zwykle łamana przez szkiełko nakrywkowe17. Jednak losowo złamane igły często nie nadają się do mikroiniekcji zarodków, ponieważ mogą zostać zablokowane lub spowodować wyciek dużej ilości cytoplazmy, a tym samym muszą zostać zastąpione nową podczas wstrzyknięcia. Igły iniekcyjne, których końcówki są ścięte przez młynek, zwykle nie blokują się ani nie powodują dużego wycieku cytoplazmatycznego, co zmniejsza częstotliwość wymiany igły. Zauważyliśmy, że roztwór do mielenia może dostać się do skośnej końcówki igły, gdy końcówka jest otwarta podczas szlifowania. Po wejściu do igły roztwór do mielenia nie wyschnie szybko w naturalny sposób. Aby zapobiec zasysaniu roztworu mielącego, podłączamy igłę do wstrzykiwania do nożnej pompy powietrza z manometrem. Podczas szlifowania końcówki igły używamy pompy powietrza do wywierania ciśnienia powietrza na igłę, dzięki czemu roztwór mielący nie dostaje się do skośnej końcówki, co umożliwia natychmiastowe użycie skośnej igły. Razem nożna pompa powietrzna z manometrem powinna pomóc w przyspieszeniu transgenezy u Drosophila, szczególnie w przypadku dużej liczby plazmidów.

Identyfikacja zarodków w stadium preblastodermy lub blastodermy syncytialnej ma kluczowe znaczenie dla mikroiniekcji19,20, ponieważ wstrzykiwanie zarodków w późniejszych stadiach prawie nie powoduje powstania muszek transgenicznych. Muchy w wieku poniżej 10 dni są używane do składania jaj, ponieważ mają tendencję do składania większej liczby jaj niż starsze. W procesie dekorionacji zarodków stosuje się sitko do komórek, aby uprościć wybielanie i płukanie zarodków wodą podwójnie destylowaną. Po wypłukaniu zarodków unoszące się w powietrzu zarodki wskazują, że skorupki jaj zostały dobrze potraktowane i mogą być wykorzystane do późniejszego mikroiniekcji. Zarówno czas dechorionacji, jak i schnięcia zarodków mają kluczowe znaczenie dla mikroiniekcji i powinny być optymalizowane eksperymentalnie, ponieważ przedłużony czas dechorionacji lub suszenia może zabić zarodki. Na czas dechorionacji i suszenia ma wpływ temperatura i wilgotność, które zmieniają się w zależności od miejsca i od czasu do czasu i powinny być odpowiednio dostosowane w oparciu o szybkość wylęgu zarodka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca była wspierana przez Fundusz Badań Naukowych dla Talentów Wysokiego Poziomu, Uniwersytet Południowych Chin.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 μ m Sitko do komórekNEST258367
Dwustronny klej 3M3M415
Szkło borokrzemoweSUTTERB100-75-10
Diamentowa płyta ściernaSUTTER104E
PŁONĄCY/BRĄZOWY Ściągacz do mikropipetSUTTERP-1000
Nożna pompa powietrza z manometremShenfengSF8705D
Olej halowęglowy 27SigmaH8773
Olej halowęglowy 700SigmaH8898
Mikroskop odwróconyNikonECLIPSE Ts2R
Pompa mikroiniekcyjnaeppendorfFemtoJet 4i
MikromanipulatoreppendorfTransferMan 4r
Mikropipeta BevelerSUTTERBV-10
Okulary nakrywkowe do mikroskopu (18 mm x 18 mm)CITOLAS10211818C
Szkiełka mikroskopowe (25 mm x 75 mm)CITOLAS188105W
szalka Petriego (90 mm x 15 mm)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Zestaw do miniprepuQiagen27106
Stereo MikroskopNikonSMZ745

Bibliografia

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
  3. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  4. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  5. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
  6. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  7. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  8. Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
  9. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
  10. Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
  11. Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
  12. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  13. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  14. Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  15. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
  16. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  17. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
  18. Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
  19. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  20. Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transgeneza Drosophilaintegraz PhiC31muchy transgeniczneig y do mikroiniekcjiszlifowanie igieprotok dechorionacjiolej halokarbonowymikroskop odwr conymikromanipulator

Powiązane artykuły