Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo w celu ilościowego określenia wrażliwości komórkowej na promieniowanie w organoidach nowotworowych pochodzących od pacjenta

DOI:

10.3791/66680

⸱

5 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisujemy proste podejście do obrazowania na żywo do ilościowego określenia wrażliwości organoidów nowotworowych pochodzących od pacjentów na promieniowanie jonizujące.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radioterapia (RT) jest jednym z filarów nowoczesnego klinicznego leczenia raka. Jednak nie wszystkie typy nowotworów są jednakowo wrażliwe na napromienianie, często (ale nie zawsze) z powodu różnic w zdolności komórek nowotworowych do naprawy oksydacyjnych uszkodzeń DNA wywołanych przez promienie jonizujące. Testy klonogenne są stosowane od dziesięcioleci do oceny wrażliwości hodowanych komórek nowotworowych na promieniowanie jonizujące, głównie dlatego, że napromieniowane komórki rakowe często umierają w sposób opóźniony, który jest trudny do określenia ilościowego za pomocą krótkoterminowej cytometrii przepływowej lub technik wspomaganych mikroskopią. Niestety, testy klonogenne nie mogą być stosowane jako takie w przypadku bardziej złożonych modeli nowotworów, takich jak organoidy nowotworowe pochodzące od pacjenta (PDTO). Rzeczywiście, napromienianie ustalonych PDTO niekoniecznie musi zahamować ich wzrost jako jednostek wielokomórkowych, chyba że ich przedział podobny do łodygi zostanie całkowicie wyeliminowany. Co więcej, napromienianie zawiesin jednokomórkowych pochodzących z PDTO może nie odzwierciedlać prawidłowo wrażliwości komórek nowotworowych na RT w kontekście ustalonych PDTO. W tym miejscu szczegółowo opisujemy adaptację konwencjonalnych testów klonogennych, która obejmuje wystawienie ustalonych PDTO na promieniowanie jonizujące, a następnie dysocjację pojedynczych komórek, ponowne posiewanie w odpowiednich warunkach hodowli i obrazowanie na żywo. Nienapromieniowane (kontrolne) komórki macierzyste pochodzące z PDTO reformują rosnące PDTO ze skutecznością specyficzną dla PDTO, na którą napromienianie ma negatywny wpływ w sposób zależny od dawki. W tych warunkach wydajność formowania PDTO i tempo wzrostu można określić ilościowo jako miarę wrażliwości na promieniowanie na obrazach poklatkowych zebranych do momentu, gdy kontrolne PDTO osiągną wcześniej określone zajętość przestrzeni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radioterapia wiązką zewnętrzną (RT) jest jednym z filarów nowoczesnej onkologii, odzwierciedlając nie tylko wyraźną aktywność przeciwnowotworową związaną z dobrze zdefiniowanym spektrum ogólnie możliwych do opanowania skutków ubocznych1, ale także wyjątkowo powszechną dostępność kliniczną (większość ośrodków onkologicznych w krajach rozwiniętych jest wyposażona w nowoczesne akceleratory liniowe dla RT wiązki zewnętrznej)2. Zgodnie z tym pojęciem, RT jest z powodzeniem stosowany na całym świecie zarówno w celach leczniczych, zazwyczaj w kontekście wczesnego stadium choroby3,4, jak i zastosowań paliatywnych, w celu powstrzymania objawów (np. bólu) z guzów przerzutowych5. To powiedziawszy, nie wszystkie nowotwory złośliwe są jednakowo wrażliwe na RT, co odzwierciedla szereg cech wewnętrznych komórek rakowych i mikrośrodowiska6,7,8,9. Jako samodzielny przykład, różne zmiany genetyczne i epigenetyczne związane z rakiem, wpływające na naprawę DNA i homeostazę redoks, zostały powiązane ze zwiększoną lub zmniejszoną wewnętrzną wrażliwością na radiowrażliwość, w dużej mierze odzwierciedlając zdolność RT do zabijania komórek rakowych poprzez powodowanie bezpośrednich i zależnych od reaktywnych form tlenu (ROS) uszkodzeń DNA i innych makrocząsteczek10,11,12,Rozdział 13.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, testy klonogenne były rutynowo stosowane do oceny wrażliwości na promieniowanie hodowanych ludzkich i mysich komórek rakowych14,15,16. Rzeczywiście, podczas gdy chemioterapeutyki i inne czynniki stresogenne często zabijają komórki nowotworowe w dość szybki sposób, RT stosowane w klinicznie istotnych dawkach najczęściej wywołują opóźnioną formę śmierci komórki, której nie można po prostu określić ilościowo za pomocą krótkoterminowej cytometrii przepływowej lub technik wspomaganych mikroskopią, takich jak pomiar wychwytu komórkowego ważnych barwników (które selektywnie barwią martwe komórki) 24-72 godziny po ekspozycji na bodziec cytotoksyczny17. Oprócz tego, że są proste i opierają się na raczej niedrogich odczynnikach, testy klonogenne są szczególnie wygodne, ponieważ pozwalają na implementację tak zwanego "liniowego modelu kwadratowego", który jest dość prostym narzędziem matematycznym do analizy ilościowej odpowiedzi na dawkę RT18,19. W podobny sposób, hodowane komórki nowotworowe (w tym ustalone linie komórkowe, a także pierwotne komórki pochodzące od pacjentów) zapewniły wygodną platformę do testowania różnych aspektów biologii raka, w tym (ale nie tylko) wrażliwości na leczenie w dość prosty, ale uproszczony sposób, przy czym jednym z głównych ograniczeń jest brak ustrukturyzowanego mikrośrodowiska guza (TME)20, 21. Rzeczywiście, dwuwymiarowe hodowle komórek nowotworowych są z natury niezdolne do podsumowania komunikacji komórka-komórka i interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową i tak, jak to zachodzi w raku22,23. Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDTO) pojawiły się jako modele nowotworów, które przynajmniej częściowo obchodzą takie ograniczenie24,25,26.

Niestety, konwencjonalne testy klonogenne nie mogą być stosowane do oceny radiowrażliwości PDTO. Z jednej strony, napromienianie ustalonych PDTO niekoniecznie musi zagrozić ich wzrostowi jako jednostki wielokomórkowej, chyba że ich przedział podobny do łodygi - który jest odpowiedzialny za tworzenie i dojrzewanie PDTO, ale wykazuje zwiększoną odporność na uszkodzenia DNA w porównaniu z bardziej zróżnicowanymi komórkami składającymi się z PDTO27- zostanie całkowicie wyeliminowany. Z drugiej strony, napromienianie zawiesin pojedynczych komórek pochodzących z PDTO może nie odzwierciedlać prawidłowo wrażliwości na promieniowanie komórek tworzących PDTO (w tym komórek macierzystych), jak wykazano w kontekście utworzonych PDTO. W tym miejscu szczegółowo opisujemy technikę, która wykorzystuje obrazowanie na żywo PDTO raka piersi do monitorowania skuteczności tworzenia PDTO i tempa wzrostu komórek pochodzących z PDTO, które wcześniej były narażone na promieniowanie jonizujące w porównaniu z ich nienapromieniowanymi odpowiednikami. Ze względu na wymagane odchylenia w dużej mierze odzwierciedlające zróżnicowaną biologię poszczególnych PDTO (np. wymagania dotyczące pożywek hodowlanych, tempo wzrostu), spodziewamy się, że protokół ten będzie odpowiedni do badania wrażliwości na promieniowanie w szerokim panelu PTDO zarówno pochodzenia sutkowego, jak i niesutkowego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odczynniki i sprzęt użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla organoidów

UWAGA: TNBC#1 PDTO zostały stworzone w naszym laboratorium na podstawie tkanki nowotworowej usuniętej chirurgicznie od pacjentki z potrójnie ujemnym rakiem piersi (TNBC), która wyraziła świadomą zgodę na udział w protokole biobankowania (IRB21-06023682). Po walidacji histologicznej i sekwencjonowaniu RNA (RNAseq), TNBC#1 PDTO są hodowane w 66% kroplach matrigelu (tak zwanych "kopułach") we wzbogaconej pożywce hodowlanej DMEM/F12 (Tabela 1) i pasażowane co 2-3 tygodnie w stosunku 1:2-1:1028.

  1. Wysiewaj PDTO w stosunku 1:2-1:10 na około 2 tygodnie przed napromienianiem w oddzielnych, nieprzylegających 6-dołkowych płytkach, po jednej na każdą badaną dawkę promieniowania (plus kontrole ujemne, które zostaną zapewnione przez PDTO nie narażone na promieniowanie jonizujące).
  2. Dodawaj 3 ml świeżo wzbogaconej pożywki hodowlanej DMEM/F12 do PDTO co 3-4 dni.
    UWAGA: Warunki wysiewu i hodowli mogą wymagać pewnej adaptacji, aby zapobiec uzyskaniu przez PDTO bardzo rozpoznawalnego, pierścieniowatego wyglądu, który wskazuje na nekrozę rdzenia pod mikroskopem i aby zapewnić optymalną żywotność podczas napromieniania.

2. Promieniowanie

  1. PDTO są gotowe do napromieniowania, gdy osiągną średni rozmiar (około 100 μm, zgodnie ze wstępnymi ustaleniami pod mikroskopią w jasnym polu z odniesieniem skali) i zajętość kopuły (około 80%). Na tym etapie należy przejść przez PDTO, aby uniknąć przepełnienia.
  2. Napromieniuj kopuły zawierające PDTO za pomocą napromiennika Small Animal Research Radition Platform (SARRP) (lub alternatywnego napromieniacza do zastosowań in vitro lub in vivo) w trybie otwartego pola (bez kolimatora), podając pojedyncze dawki 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy i 10 Gy. Nienapromieniowane PDTO zapewniają odpowiednie warunki kontroli ujemnej.
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem należy przeprowadzić kalibrację testów dozymetrycznych, aby upewnić się, że PDTO zamknięte w Matrigelu otrzymają planowaną dawkę promieniowania. Dawki te zostały wybrane na podstawie wstępnych ocen wrażliwości na promieniowanie TNBC#1 PDTO i w związku z tym mogą wymagać dostosowania dla innych PDTO.

3. Dysocjacja

  1. Natychmiast po napromienianiu przemyć każdą kopułę matrigelową zawierającą PDTO 2 ml wzbogaconej pożywki hodowlanej DMEM/F12 i ponownie zawiesić ją w 1-3 ml TrypL-E za pomocą mikropipety p1000. Powtórz około 30 razy dla każdego dołka.
  2. Zawiesinę komórkową zebrać w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i inkubować przez ~5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Granulować komórki, odwirowując je przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń nadmiar TrypL-E, aby pozostawić ~1 ml w probówce i dodaj 3x pierwotną objętość enzymu (patrz krok 3.1) wzbogaconej pożywki DMEM/F12 w celu przemycia komórek.
  5. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą filtra siatkowego 40 μm. Ten krok zapewnia, że podczas powlekania nie pozostaną żadne skupiska komórek i że każdy nowy PDTO pochodzi z pojedynczej komórki.
  6. Policz komórki w automatycznym liczniku komórek po zabarwieniu 10% błękitem trypanowym w PBS i ponownie je zawieś, aby uzyskać 800 komórek w 50 μl wzbogaconej pożywki DMEM/F12 plus 66% matrycy w temperaturze 4 °C (warunki dla 1 kopuły).
  7. Płytkę z każdej kopuły w osobnym dołku należy umieścić na 48-dołkowej płytce hodowlanej zgodnej z obrazowaniem na żywo, unikając tworzenia się pęcherzyków. Zaleca się techniczne trzykrotne wykonanie każdej dawki promieniowania.
  8. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) na 30 minut w celu zestalenia matrycy.
  9. Dodać 0,5-1 ml wzbogaconej pożywki DMEM/F12, usunąć potencjalne pęcherzyki i umieścić płytki w systemie obrazowania na żywo w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pozwól płytce wyrównać się do ustawionej temperatury przez około 30 minut przed obrazowaniem.
    UWAGA: Matrigel krzepnie w temperaturze >4 °C, co oznacza, że temperatura ta powinna być utrzymana do momentu, gdy wymagane jest krzepnięcie.

4. Obrazowanie na żywo

  1. W oprogramowaniu Incucyte wybierz opcję Zaplanuj nabycie.
  2. Kliknij znak plus w lewym górnym rogu opcji Launch Add Vessel.
  3. Aby skanować wielokrotnie lub raz, wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem, a następnie kliknij przycisk Dalej.
  4. Aby utworzyć lub przywrócić statek, wybierz Utwórz nowy statek, a następnie kliknij Dalej.
  5. Aby wybrać typ skanowania, wybierz Organoid, a następnie kliknij Dalej.
  6. Ustawienia skanowania: Wybierz QC < ' Faza + Kanały obrazu w jasnym polu. Opcja "4x Objective" jest wybierana automatycznie. Następnie kliknij Dalej.
  7. Wybór zbiornika: Wybierz odpowiednią tabliczkę z walidacją programową zgodnie z numerem katalogowym.
  8. Lokalizacja statku: Wybierz położenie tabliczki na instrumencie zgodnie z układem, a następnie kliknij Dalej.
  9. Wzorzec skanowania: Wybierz studzienki zgodnie z układem płyty, a następnie kliknij Dalej.
  10. Notatnik statku: tabliczka znamionowa (opcjonalnie: imię i nazwisko, typ komórki i przejście). Utwórz mapę tablic, klikając znak plus w prawym górnym rogu układu tablic, "Utwórz mapę tablic".
  11. W Edytorze mapy tablic wskaż typ komórki, klikając ikonę Utwórz nową komórkę w sekcji Komórki, zastosuj do odpowiednich studni, klikając ikonę plusa i wybierz odpowiednie dołki. Opcjonalnie: Można wskazać liczbę zasianych komórek i pasaży. Powtórz te czynności dla każdej linii komórek.
  12. Wskaż zabieg, klikając ikonę Utwórz nową komórkę w sekcji Warunki wzrostu, zastosuj do odpowiednich studzienek, klikając ikonę plusa i wybierz odpowiednie dołki. Powtórz te czynności dla każdego warunku eksperymentalnego. Następnie kliknij OK > Dalej.
  13. Ustawienia analizy: Opcja "Odłóż analizę na później" jest automatycznie wybrana; kliknij przycisk Dalej.
  14. Harmonogram skanowania: Wybierz skanowanie dwa razy dziennie, bez końca. Kliknij Dalej. Monitoruj ciemność kontrolnych PDTO pod kątem idealnego punktu końcowego, ponieważ mają one tendencję do zapadania się, gdy są zarośnięte.
  15. Podsumowanie: Sprawdź podsumowanie i kliknij Dodaj do harmonogramu.
    UWAGA: Właściwości skanowania można wizualizować, a harmonogram można edytować w razie potrzeby, klikając prawym przyciskiem myszy oś czasu skanowania.

5. Analiza

  1. W zgodnym oprogramowaniu wybierz opcję Widok. Można to również obsługiwać z komputera podłączonego do systemu za pośrednictwem intranetu.
  2. Wybierz żądany eksperyment, klikając go dwukrotnie.
  3. Wybierz ikonę Uruchom analizę.
  4. Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy, a następnie kliknij przycisk Dalej.
  5. Typ analizy: Wybierz Organoid i kliknij Dalej.
  6. Kanały obrazu: Domyślnie wybrana jest opcja "Faza + Jasne pole", kliknij "Dalej".
  7. Wybierz zestaw reprezentatywnych obrazów do analizy. Kliknij Dalej. Zaleca się wybór wczesnych i późnych punktów czasowych oraz różnych warunków leczenia, np. kontroli i różnych dawek promieniowania.
  8. Wykonaj definicję analizy dla TNBC#1, wykonując poniższe czynności:
    1. Na obrazie: Wybierz opcję Podgląd bieżącego lub "Podgląd wszystkiego", aby wyświetlić domyślną maskę bieżących lub wybranych obrazów. Powtórz tę czynność po zmianie parametrów analizy, aby zaktualizować maskę.
    2. Segmentacja: Ustaw Promień na 300, Czułość tła na 80, Podział krawędzi na WŁ., a Czułość krawędzi na 70.
    3. Czyszczenie: Ustaw Wypełnienie otworu na 5E+05 μm2 i Dostosuj rozmiar na 0 pikseli.
    4. Filtry: Ustaw brak minimalnego lub maksymalnego obszaru, minimalną mimośród ustawioną na 0,19 i brak maksymalnej mimośrodowości. Kliknij Dalej.
  9. Czasy skanowania i dołki: Wybierz wszystkie żądane punkty czasowe i dołki skanowania. Kliknij Dalej. Opcjonalnie: Wybierz opcję Analizuj przyszłe skanowania.
  10. Zapisz i zastosuj definicję analizy: Wprowadź nazwę definicji i kliknij przycisk Dalej.
  11. Zwizualizuj podsumowanie i kliknij przycisk Zakończ.
  12. Pojawi się wyskakujące okienko informujące użytkownika, że analiza została wprowadzona do kolejki analizy. Kliknij w porządku. Po otwarciu okna Kolejka analizy można wizualizować pozostałe zadania.
  13. W razie potrzeby pobierz zakończoną analizę w widoku Wyświetl, wybierając niebieską strzałkę w kolumnie Analizy obok pola Nazwa statku i klikając prawym przyciskiem myszy nazwę definicji analizy. Następnie zwizualizuj nieprzetworzone dane w oprogramowaniu, klikając pozycję Metryki analizy wykresu, lub wyeksportuj do dalszej analizy, wybierając pozycję Eksportuj definicję analizy.
    UWAGA: Eksport danych pierwotnych można dostosować w oknie Metryki analizy wykresu. Liczba organoidów, Powierzchnia całkowita, Średnia ekscentryczność i Ciemność mogą być oddzielnie eksportowane, a dane organizowane w menu rozwijanym Wybierz grupowanie, klikając opcję Brak, Kolumny, Wiersze lub Repliki mapy płyty. W przypadku TNBC#1, dla eksportu danych pierwotnych, metryk analizy wykresu i dla opcji rozwijanej Wybierz grupowanie wybrano opcję Brak. Te parametry importu zostały wybrane na podstawie wstępnych ocen z wykorzystaniem PDTO TNBC#1. W związku z tym mogą wymagać dostosowania dla innych PDTO, co jest możliwe w oprogramowaniu opartym na funkcjach "Preview". Zalecamy dostosowanie parametrów importu do (1) wczesnych obrazów, które w większości zawierają pojedyncze komórki lub małe PDTO, oraz (2) obrazów zebranych w późnych punktach czasowych, aby zapewnić, że duże PDTO są również pozyskiwane zarówno w warunkach kontrolnych, jak i leczonych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TNBC#1 PDTO byli narażeni na pojedynczą dawkę promieniowania 0 (nienapromieniowane kontrole), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy lub 10 Gy w dniu 0. Bezpośrednio po tym PDTO zostały zdysocjowane, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki dla każdego warunku eksperymentalnego. Komórki pochodzące z PDTO zostały następnie wysiane na 48-dołkowych płytkach w 66% kopułach matrygelowych (50 μl każda) zdeponowanych w środku dołków, w 3 technicznych powtórzeniach na warunki. Płytki umieszczono w systemie obrazowania na żywo i obrazowano co 6 godzin za pomocą obiektywu 4X z modułem organoidowym przez łącznie 30 dni. Napromienianie TNBC#1 PDTO RT w pojedynczej dawce 2 Gy istotnie opóźniało odrost PDTO, podczas gdy dawki promieniowania ≥4 Gy (do 10 Gy) zakończone uniemożliwiały regenerację rosnących PDTO (Rysunek 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Obrazowanie na żywo organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDTO). Organoidy nowotworowe (PDTO) pochodzące od pacjentów z rakiem piersi TNBC#1 pozostawiono nieleczone lub wystawiono na wskazaną dawkę promieniowania, a wkrótce potem nastąpiła dysocjacja, ponowne posiew i obrazowanie za pomocą systemu obrazowania żywych komórek. Podano reprezentatywne obrazy po korekcie kontrastu (A) i ocenie ilościowej (B, średnia ± SEM). Skala obrazu: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Podziałka: 400 μm; wstawki: 200 μm. ****p < 0,001 (dwukierunkowa ANOVA, w porównaniu do 0 Gy); ####p < 0,001 (dwukierunkowa ANOVA, w porównaniu do 2 Gy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

) ) powiedział: powiedział:
składnikkoncentracja
DMEM F/121X
GlutaMax (GlutaMaks1X
Hepes10 mM
PenStrep (ang. PenStrep100 j./ml
B271X
Nac1,25 mM
Nikotynamid10 mM
Inhibitor receptora TGFbeta A83-010,5 μM
Inhibitor p38 MAP p38i SB2021901 μM
Kubek10%
Rspondin Media10%
FGF1020 ng/ml
FGF75 ng/ml
NR (Heregulina)5 nM
Primocin100 μg/ml
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Naskórkowy czynnik wzrostu hEGF5 ng/ml

Tabela 1: Skład podłoża hodowlanego PDTO.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy adaptację konwencjonalnych testów klonogennych, które wykorzystują PDTO raka piersi i obrazowanie na żywo do ilościowego określenia wrażliwości na promieniowanie PDTO w oparciu o (1) trwałość komórek macierzystych tworzących PTDO po napromieniowaniu PDTO in vitro oraz (2) tempo wzrostu PDTO, które te komórki (mogą) wytwarzać. Kluczowe etapy tego protokołu obejmują (1) ustanowienie PDTO dla zajętości kopuły umożliwiającej dobrą żywotność, (2) narażenie PDTO na promieniowanie jonizujące w różnych dawkach, w tym symulowane warunki kontroli napromieniowania; (3) dysocjacja PDTO na pojedyncze komórki; (4) ponowne powlekanie pojedynczych komórek pochodzących z PDTO; oraz (5) obrazowanie na żywo do momentu osiągnięcia predefiniowanego zajętości kopuły w warunkach kontrolnych.

Przy minimalnych modyfikacjach, głównie związanych ze skutecznością formowania PDTO i tempem wzrostu PDTO w warunkach kontrolnych (które prawdopodobnie będą się znacznie różnić w zależności od PDTO), spodziewamy się, że protokół ten będzie można dostosować do wielu dostępnych na rynku platform obrazowania na żywo, a także do wielu PDTO, zarówno o pochodzeniu sutkowym, jak i niesutkowym. Z jednej strony oczekuje się, że wyjściowa wydajność tworzenia PDTO po dyspersji pojedynczej komórki wpłynie na liczbę pojedynczych komórek, które mają zostać ponownie zasiane w celu uzyskania nowych PDTO o gęstości, która umożliwia nie tylko kwantyfikację PDTO na podstawie obrazu, ale także normalny wzrost nietraktowanych PDTO. Z drugiej strony oczekuje się, że tempo wzrostu PDTO będzie miało wpływ na czas trwania testu, ponieważ należy unikać łączenia sąsiednich PDTO, aby zachować optymalne zdolności analityczne. W związku z tym określenie wydajności formowania PDTO i szybkości wzrostu PDTO w warunkach kontrolnych dla każdego pojedynczego PDTO ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego wdrożenia tego protokołu.

Chociaż ta metoda jest dość prosta, ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, zbyt mała liczba komórek tworzących PDTO może upośledzać regenerację normalnie rosnących PDTO po dysocjacji pojedynczej komórki. Rzeczywiście, podczas gdy rutynowe pasażowanie PDTO można osiągnąć przez niepełną dysocjację, oceny ilościowe, oferowane przez ten protokół, opierają się na wytwarzaniu zawiesiny jednokomórkowej (którą można wizualnie potwierdzić podczas liczenia). Po drugie, zbyt wolne tempo wzrostu może znacznie wydłużyć czas trwania testu i potencjalnie skutkować nieprecyzyjnym oszacowaniem wrażliwości na promieniowanie. Rzeczywiście można sobie wyobrazić, że wydłużony czas hodowli, wymagany do osiągnięcia przez wolno rosnące PDTO, aby osiągnąć rozmiar zgodny z punktem końcowym, może dać dodatkowe szanse subletalnie napromieniowanym komórkom tworzącym PDTO na regenerację po stresie i przywrócenie wykrywalnych (choć wolno rosnących) PDTO. Wreszcie, oczekuje się, że dysocjacja PDTO wkrótce po napromieniowaniu wywrze dodatkowy stres na komórki tworzące PDTO, potencjalnie zwiększając wrażliwość na promieniowanie w wyniku zmienionej komunikacji między komórkami we wczesnych fazach regeneracji. Opóźnienie dysocjacji o 24-72 godziny może dostarczyć informacji na temat względnego udziału zachowanej komunikacji między komórkami w zdolności komórek tworzących PDTO do regeneracji po uszkodzeniach makromolekularnych narzuconych przez RT.

Podczas gdy platformy obrazowania na żywo oferują wygodną metodę monitorowania powstawania i wzrostu PDTO w ujęciu wzdłużnym, obrazy z pojedynczych punktów końcowych mogą być również wykorzystywane do tego samego celu. W takim przypadku należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że sąsiednie PDTO nie łączą się przed obrazowaniem, a szybkość wzrostu można ocenić jako funkcję wielkości PDTO znormalizowanej do czasu trwania testu.

W erze spersonalizowanej medycyny onkologicznej ocena wrażliwości poszczególnych nowotworów na leczenie ma ogromne znaczenie, ponieważ dostarcza pewnych wskazówek dotyczących projektowania zindywidualizowanych strategii terapeutycznych o zwiększonej skuteczności29. Opisany w niniejszym dokumencie protokół wpisuje się w to przedsięwzięcie, zapewniając wygodne podejście do szacowania wrażliwości komórkowej poszczególnych PDTO na promieniowanie jonizujące (samodzielnie lub w połączeniu z innymi metodami terapeutycznymi). To powiedziawszy, to, czy pomiar wrażliwości komórek rakowych na promieniowanie za pomocą PDTO dokładnie przewiduje odpowiedź poszczególnych pacjentów z rakiem na ogniskową RT, pozostaje do wykazania. Korelacja wrażliwości radiologicznej różnych PDTO na napromieniowanie z reakcją kliniczną na RT ich dawców dostarczy ważnych informacji na temat tej możliwości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezależnie od tej pracy, SCF posiada umowy badawcze z firmami Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai i Eli-Lilly, a także otrzymał honoraria konsultingowe/doradcze od Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray i Nanobiotix. Niezależnie od tej pracy, SD otrzymało honoraria konsultingowe/doradcze od Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech i Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., a także posiada / posiada kontrakty badawcze z Lytix Biopharma, Nanobiotix i Boehringer-Ingelheim. Niezależnie od tej pracy, LG posiada umowy badawcze z Lytix Biopharma, Promontory i Onxeo, otrzymało honoraria konsultingowe/doradcze od Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom i Luke Heller TECPR2 Foundation oraz posiada opcje na akcje Promontory.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Raymondowi Brionesowi i Wen H. Shenowi (Weill Cornell Medical College, Nowy Jork, NY, USA) za pomoc w opracowaniu tego protokołu. Prace te zostały wsparte grantem Transformative Breast Cancer Consortium z BCRP Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40 i mikro; m filtr siatkowyThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Celometr Auto T4 Licznik komórek Bright FieldNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Naskórkowy czynnik wzrostu hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Cyfrowy mikroskop fluorescencji odwróconej Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 
HepesInvitrogen 15630-080
Oprogramowanie IncuCyte 2021AWersja Sartorius: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodel SX1
Zweryfikowana przez Incucyte 48-dołkowa płytkaCorning 3548
Oprogramowanie laboratoryjneMatrigel354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NikotynamidSigma-AldrichN0636
NogginZakupiony w Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Nieleczona płytka 6-dołkowaCellstar657 185
NR (Heregulina)Peprotech100-03
p38 Inhibitor MAP p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaZakupiony od Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Platforma Badań nad Promieniowaniem Małych Zwierząt (SARRP) Xstrahl Ltd
Inhibitor receptora TGFbeta A83-01Tocris2939
Barwienie błękitem trypanowym (0,4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
35050061 Discovery

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
  3. Harmenberg, U., Hamdy, F. C., Widmark, A., Lennernäs, B., Nilsson, S. Curative radiation therapy in prostate cancer. Acta Oncol. 50, Suppl 1 98-103 (2011).
  4. Nakano, T., Ohno, T., Ishikawa, H., Suzuki, Y., Takahashi, T. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer. J Radiat Res. 51 (1), 1-8 (2010).
  5. Spencer, K., Parrish, R., Barton, R., Henry, A. Palliative radiotherapy. BMJ. 360, k821(2018).
  6. Price, J. M., Prabhakaran, A., West, C. M. L. Predicting tumour radiosensitivity to deliver precision radiotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 20 (2), 83-98 (2023).
  7. McLaughlin, M., et al. Inflammatory microenvironment remodelling by tumour cells after radiotherapy. Nat Rev Cancer. 20 (4), 203-217 (2020).
  8. Rodriguez-Ruiz, M. E., Vitale, I., Harrington, K. J., Melero, I., Galluzzi, L. Immunological impact of cell death signaling driven by radiation on the tumor microenvironment. Nat Immunol. 21 (2), 120-134 (2020).
  9. Cytlak, U. M., et al. Immunomodulation by radiotherapy in tumour control and normal tissue toxicity. Nat Rev Immunol. 22 (2), 124-138 (2022).
  10. Hanahan, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  11. Groelly, F. J., Fawkes, M., Dagg, R. A., Blackford, A. N., Tarsounas, M. Targeting DNA damage response pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 78-94 (2023).
  12. Renaudin, X. Reactive oxygen species and DNA damage response in cancer. Int Rev Cell Mol Biol. 364, 139-161 (2021).
  13. Klapp, V., et al. The DNA damage response and inflammation in cancer. Cancer Discov. 13 (7), 1521-1545 (2023).
  14. Constanzo, J., Garcia-Prada, C. D., Pouget, J. P. Clonogenic assay to measure bystander cytotoxicity of targeted alpha-particle therapy. Methods Cell Biol. 174, 137-149 (2023).
  15. Serrano-Mendioroz, I., Garate-Soraluze, E., Rodriguez-Ruiz, M. E. A simple method to assess clonogenic survival of irradiated cancer cells. Methods Cell Biol. 174, 127-136 (2023).
  16. Petroni, G., et al. Radiotherapy delivered before CDK4/6 inhibitors mediates superior therapeutic effects in ER(+) breast cancer. Clin Cancer Res. 27 (7), 1855-1863 (2021).
  17. Alvarez-Abril, B., et al. Cytofluorometric assessment of acute cell death responses driven by radiation therapy. Methods Cell Biol. 172, 17-36 (2022).
  18. Bodey, R. K., Evans, P. M., Flux, G. D. Application of the linear-quadratic model to combined modality radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (1), 228-241 (2004).
  19. Unkel, S., Belka, C., Lauber, K. On the analysis of clonogenic survival data: Statistical alternatives to the linear-quadratic model. Radiat Oncol. 11, 11(2016).
  20. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  21. Buqué, A., Galluzzi, L. Modeling Tumor immunology and immunotherapy in mice. Trends Cancer. 4 (9), 599-601 (2018).
  22. Lee, S. Y., Bissell, M. J. A Functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture. Bio Protoc. 8 (22), e3083(2018).
  23. Mina, J. Bissell: Context Matters. Trends Cancer. 1 (1), 6-8 (2015).
  24. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  25. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  26. van Renterghem, A. W. J., van de Haar, J., Voest, E. E. Functional precision oncology using patient-derived assays: Bridging genotype and phenotype. Nat Rev Clin Oncol. 20 (5), 305-317 (2023).
  27. Vitale, I., Manic, G., De Maria, R., Kroemer, G., Galluzzi, L. DNA damage in stem cells. Mol Cell. 66 (3), 306-319 (2017).
  28. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  29. Zhou, Z., et al. Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: A step towards improving and creating personalized immunotherapies. Nat Rev Immunol. 24, 18-32 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cellular RadiosensitivityTumor OrganoidsLive ImagingClonogenic AssayRadiation TherapyPatient Derived OrganoidsIonizing IrradiationOrganoid Growth RateStem Like CellsPersonalized Medicine

Powiązane artykuły