Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

21 czerwca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Streszczenie

Trzustka jest ważnym organem do utrzymania równowagi metabolicznej w organizmie, częściowo ze względu na produkcję hormonów metabolicznych, takich jak insulina i glukagon, a także enzymów trawiennych. Trzustka jest również silnie unaczynionym narządem, co ułatwia skomplikowana sieć naczyń włosowatych trzustki. Ta rozległa sieć naczyń włosowatych składa się z wysoce fenestrowanych komórek śródbłonka (EC), ważnych dla rozwoju i funkcji trzustki. W związku z tym dysfunkcja EC może przyczyniać się do dysfunkcji trzustki w chorobach takich jak cukrzyca i rak. W związku z tym badania nad funkcją EC trzustki (pEC) są ważne nie tylko dla zrozumienia biologii trzustki, ale także dla rozwoju jej patologii. Modele mysie są cennymi narzędziami do badania chorób metabolicznych i sercowo-naczyniowych. Nie ustalono jednak protokołu, który opisywałby wystarczająco szczegółowo izolację mysich PEC ze względu na stosunkowo małą populację EC i obfitość enzymów trawiennych potencjalnie uwalnianych z tkanki groniastej, które mogą prowadzić do uszkodzenia komórek, a tym samym do niskiej wydajności. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy protokół wzbogacania i odzyskiwania mysich pEC, łączący delikatną dysocjację fizyczną i chemiczną oraz selekcję za pośrednictwem przeciwciał. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia solidną metodę ekstrakcji nienaruszonych i żywotnych EC z całej trzustki myszy. Protokół ten jest odpowiedni dla wielu dalszych testów i może być stosowany do różnych modeli myszy.

Wprowadzenie

Trzustka, klucz do kontroli metabolicznej i homeostazy, jest wysoce unaczynionym organem. Trzustka pełni zarówno funkcje hormonalne, jak i zewnątrzwydzielnicze, kontrolując odpowiednio regulację poziomu glukozy we krwi i enzymów trawiennych. Te dwa przedziały są połączone ze sobą rozległą siecią naczyń krwionośnych trzustki, ułatwiając wymianę i transport tlenu, hormonów i enzymów. Co najważniejsze, ta gęsta sieć naczyń włosowatych przenika do wysepki Langerhansa, skupiska komórek regulujących hormony w trzustce odpowiedzialnych za jej funkcję endokrynną, składającej się z komórek alfa (α) wydzielających glukagon, komórek beta (β) wydzielających insulinę i komórek delta (δ) wydzielających somatostatynę1,2. Chociaż wysepki stanowią tylko 1-2% masy trzustki, otrzymują 20% całkowitego przepływu krwi3, co podkreśla znaczenie unaczynienia wysp trzustkowych. Naczynia włosowate trzustki składają się głównie z wysoce fenestrowanych komórek śródbłonka (EC), które są otoczone perycytami ściennymi. Te kapilarne EC odgrywają istotną rolę w rozwoju, dojrzewaniu i (dys)funkcji wysp trzustkowych oraz tworzą intymne połączenia z różnymi komórkami endo- i zewnątrzwydzielniczymi4 (Rysunek 1).

Dysfunkcję śródbłonka zaobserwowano zarówno w cukrzycy typu 1, jak i typu 2, najczęstszych stanach spowodowanych dysfunkcją wysp trzustkowych5,6. Zarówno gęstość mikronaczyniowa wysp trzustkowych, jak i morfologia mogą być zmienione w diabetes7. Co więcej, rak trzustki, wysoce agresywny nowotwór, który może również objawiać się cukrzycą, charakteryzuje się dużą gęstością mikronaczyniową ze słabą perfuzją8. Biorąc pod uwagę kluczowe strukturalne i funkcjonalne role EC zarówno w normalnej, jak i chorej tkance trzustki, istnieje istotna potrzeba zbadania PEC w rozwoju, fizjologii i patologii, aby odkryć mechanizmy, które napędzają zdrowie lub choroby.

Opracowano liczne protokoły do izolacji EC z różnych mysich (np. brain9,10, lung11, heart12, wątroba13, mięśnie szkieletowe14, oraz tkanki tłuszczowe15) i ludzkie (np. brain16, trzewna tkanka tłuszczowa17,18, nerwy obwodowe19, lung20,21,22, oraz tkanki tętnicy krezkowej23). Protokoły te zazwyczaj obejmują stosowanie trawienia enzymatycznego (np. przez kolagenazę, trypsinę24, dispase24,25 i liberase26), po którym następuje etap wzbogacania oparty na przeciwciałach. Co więcej, protokoły te zwykle opierają się na wydłużonym czasie trawienia w wysokich stężeniach enzymów z energicznym mieszaniem w temperaturze 37 °C (Tabela 1). Ze względu na unikalne cechy trzustki, w tym to, że znajduje się w niej mnóstwo endogennych enzymów trawiennych, te istniejące protokoły nie mogą być bezpośrednio stosowane do izolowania pEC. Po pierwsze, skład macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) trzustki różni się od składu innych tkanek. Chociaż kolagenaza jest powszechnie stosowana do izolacji EC, istnieje wiele podtypów o różnych zdolnościach dysocjacji specyficznych dla tkanki, co wymaga optymalizacji. Po drugie, co ma kluczowe znaczenie dla izolacji pEC, uwalnianie i aktywacja endogennych enzymów trzustkowych może znacznie utrudnić proces izolacji. W tym celu należy zachować ostrożność, aby zminimalizować pękanie zewnątrzwydzielniczych komórek groniastych (główne źródło zymogenów, proteaz i RNazy27), które mogą wywołać dalsze uszkodzenia komórek i skutkować niską żywotnością komórek oraz ogólnie wpływać na regenerację27,28,29.

Aby sprostać tym wyzwaniom, dostosowaliśmy metody z istniejących protokołów izolacji EC i stworzyliśmy nowy protokół odpowiedni do izolacji EC od trzustki myszy. W szczególności opisujemy tutaj przepływ pracy (Rysunek 2) z wykorzystaniem kolagenazy typu I (zwykle wdrażanej do izolacji EC płuc), niższych temperatur trawienia i braku pobudzenia (w celu zapobiegania aktywacji zymogenów trzustkowych) oraz DNase30,31,32 (w celu zapobiegania apoptozie wywołanej przez DNA i poprawie żywotności komórek oraz przeciwciała dla CD3133 (PECAM1, marker pan-EC). Opisany protokół tworzy populacje EC wyizolowane z trzustki myszy, które można wykorzystać do profilowania ekspresji genów i testów białek.

Protokół

Izolacja tkanek została przeprowadzona zgodnie z zatwierdzonym protokołem badania #17010 przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Badawczego Beckman, City of Hope (Duarte, Kalifornia, USA). Tutaj używamy Tie-2CreERT2; Linia myszy Rosa26-TdTomato w tle C57BL/6 w wieku 8 - 12 tygodni. W tej linii, EC są oznaczone TdTomato po indukcji tamoksyfenem, jak opisano wcześniej34. Jednak protokół ten można dostosować do wszystkich grup wiekowych dorosłych myszy o różnych genotypach i pochodzeniu genetycznym.

1. Pobranie tkanek (szacowany czas: 1-2 h)

UWAGA: Szacowany czas to 15 minut/zwierzę, zalecane maksymalnie 3 zwierzęta w grupie na próbki dysocjacji.

  1. Eutanazja zwierząt przez przedawkowanie dwutlenku węgla (CO2 ), a następnie wtórne potwierdzenie śmierci. Przed sekcją należy spryskać całe ciało 70% etanolem (EtOH), całkowicie dezynfekując obszar operacyjny.
  2. Rozciągnij i zabezpiecz kończyny za pomocą szpilek. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj małe nacięcie w linii środkowej przez skórę i otrzewną, zaczynając od dolnej części brzucha i rozciągając się w kierunku klatki piersiowej.
  3. Odsłoń klatkę piersiową, przecinając przeponę i podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
  4. Wprowadzić igłę (25G-30G) połączoną ze strzykawką zawierającą lodowato sterylny PBS do lewej komory serca.
  5. Perfuzję należy rozpocząć od wstrzyknięcia PBS przez serce z szybkością 5 - 10 ml/min. Przerwać po wstrzyknięciu 10 ml lub do momentu, gdy wątroba i nerki ulegną odbarwieniu.
  6. Po perfuzji zlokalizuj trzustkę (poniżej żołądka i przyczepioną do dwunastnicy)35 (Ryc. 3A) i ostrożnie usuń ją za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy.
  7. Po wyizolowaniu przenieś trzustkę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego PBS + 0,2 mg/ml inhibitora trypsyny, trzymaj na lodzie (Rysunek 3B).
    UWAGA: Na tym etapie trzustkę od maksymalnie 3 myszy można połączyć i przenieść do 1 probówki. Próbki można przechowywać na lodzie przez maksymalny czas 2 godzin.

2. Przygotowanie kolagenazy (szacowany czas: 15-30 min)

  1. Przygotuj roztwory i zgodnie z poniższym opisem.
    1. Roztwór dysocjacyjny: Dodaj kolagenazę typu I do probówki o pojemności 50 ml do końcowego stężenia 1 mg / ml w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; patrz tabela materiałów) i 0,001 U / ml DNazy I + 0,2 mg / ml inhibitora trypsyny.
    2. Roztwór zatrzymujący dysocjację: Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS 1x, bez Ca2+, Mg2+; to samo dla wszystkich pozostałych PBS w tym protokole; patrz Tabela materiałów), 5% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,001 U/ml DNazy I lub DMEM + 10% FBS + 0,001 MU/ml DNazy I.
    3. Bufor do przemywania : Dodaj PBS 1x, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,001 U/ml DNazy I + 0,05 mg/ml inhibitora trypsyny.
  2. Całkowicie rozpuść i przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Odłóż na bok i trzymaj na lodzie.

3. Trawienie (szacowany czas: 40 min-1 h)

  1. Wyjmij trzustkę z lodowatego PBS i umieść na szalce Petriego na wierzchu lodu. Ostrożnie usuń nadmiar tkanki (np. śledzionę, tłuszcz, zanieczyszczenia) za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety (Rysunek 3C).
    UWAGA: Bardzo ważne jest usunięcie tłuszczu, ponieważ nadmiar lipidów może zakłócać trawienie tkanek.
  2. Przenieś przyciętą trzustkę myszy do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 1 ml roztworu dysocjacyjnego.
  3. Trzymaj probówkę na lodzie i zmiel tkanki trzustki nożyczkami do preparowania na drobne kawałki nadające się do pipetowania, np. 0,5 mm lub 1 mm. Przenieś lizat do probówki o pojemności 50 ml i trzymaj na lodzie.
  4. Dodaj dodatkową trzustkę do probówki o pojemności 5 ml używanej do wstępnego mielenia tkanki trzustki i dodaj dodatkowy 1 ml kolagenazy. Powtórz w razie potrzeby dla wielu preparatów trzustkowych.
  5. Dodać 2 ml roztworu kolagenazy do probówki o pojemności 5 ml w celu usunięcia resztek tkanki trzustki i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Całkowita objętość kolagenazy powinna wynosić 5 ml dla 3 trzustki lub 3 ml dla pojedynczej trzustki.
  6. Gdy wszystkie próbki zostaną poddane mechanicznej dysocjacji, przenieść probówki o pojemności 50 ml zawierające homogenizowane lizaty tkankowe do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut
    UWAGA: Podczas tego procesu nie należy energicznie mieszać ani wirować mieszaniny tkankowej, ponieważ może to spowodować pęknięcie tkanek groniastych i uwolnienie obfitych endogennych enzymów i DNA.
  7. Wyjmij probówki z łaźni wodnej i delikatnie zamieszaj, aby dobrze wymieszać, a następnie pozostaw w łaźni wodnej na kolejne 10 minut. (Całkowity czas: 20 min).
    UWAGA: Nie przekraczać 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby uniknąć nadmiernego trawienia.
  8. Umieść probówki na lodzie i pozwól homogenatowi osiąść grawitacyjnie. Po ustabilizowaniu przenieść supernatant przez filtr 70 μm i dodać 5 ml roztworu zatrzymującego dysocjację.
  9. Dodać dodatkowy 1 ml roztworu dysocjacyjnego do pozostałego osadu i rozcierać za pomocą igły 18G.
  10. Przepuścić pozostały homogenat przez filtr i przemyć dodatkowymi 5 ml roztworu zatrzymującego dysocjację.
  11. Zawiesinę komórek wirować w temperaturze 300 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant przez aspirację i utrzymać osad komórkowy na lodzie.
  12. Zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu płuczącego i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  13. Pobrać małą porcję z zawieszonego osadu komórkowego (10 μl) i wymieszać z błękitem trypanowym w stosunku 1:1, aby policzyć komórki za pomocą licznika komórek i zmierzyć żywotność.

4. Wzbogacanie komórek śródbłonka (EC) (szacowany czas: 2-3 godziny)

  1. Dodać 1 μl przeciwciała anty-CD31-biotyny na każde 1 x 107 zliczonych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze (około 5 μl na 3 trzustki).
  2. Dodać 20 μl mikrogranulek antybiotyny i inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym.
  3. Ustaw stojak magnetyczny z uchwytem separatora kolumn i przyłóż kolumnę. Wyrównać kolumnę z 3 ml buforu do przemywania się.
  4. Dodać próbkę do kolumny i przepłukać łącznie 9 ml buforu do przemywania .
    UWAGA: Jeśli stężenie komórek jest wysokie, rozcieńczyć komórki dodatkowymi 2 ml buforu do przemywania w osobnej probówce. Dodawać jednorazowo 1 ml próbki do kolumny, aby zapobiec jej zatkaniu.
  5. Wyjmij kolumnę z uchwytu kolumny i umieść w probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml buforu do przemywania do kolumny. Za pomocą tłoka wepchnąć komórki w kolumnie i zebrać elucję (która zawiera wzbogacone EC).
  6. Odwirować frakcję przepływową i elucję/EC przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Policz komórki i zmierz żywotność, jak w kroku 3.13.
  7. Walidacja wzbogacenia EC za pomocą qPCR frakcji przepływowych i EC. Użyj NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) jako ogólnego markera dla komórek endokrynnych oraz cząsteczki adhezji płytek krwi i komórek śródbłonka (Pecam1) jako markera dla EC33. Użyj 36B4 (Rplp0, kwaśna fosfoproteina rybosomalna p0) jako wewnętrzna kontrola normalizacji ekspresji genów.
    UWAGA: Na tym etapie pobrane próbki można wykorzystać do analiz białek lub RNA.

5. Hodowla PEC

  1. Przygotować podłoże M199. Suplement M199 o średnim do końcowego stężeniu 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Pokryj 60 mm płytkę do hodowli komórkowej kolagenem typu I (1 mg/ml w 0,1 M kwasie octowym) i pozostaw na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń kolagen typu I i dwukrotnie przepłucz płytkę 1X PBS. Dodać 2 ml przygotowanej pożywki M199 i umieścić płytkę do hodowli komórkowych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C) na 5 minut.
  4. Po wyizolowaniu komórek dodaj izolowane komórki do wstępnie podgrzanej płytki do hodowli komórkowej M199. Utrzymuj komórki w warunkach hodowlanych przez około 14 dni i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.

Wyniki

Postępując zgodnie z tym protokołem, otrzymuje się około 2 x 106 żywe komórki można uzyskać poprzez połączenie tkanek z 3 trzustek mysich, a z pojedynczej trzustki mysiej uzyskuje się 750 000 komórek. Aby potwierdzić wzbogacenie frakcji komórek śródbłonka (EC), przeprowadzono następujące analizy: 1) ilościową PCR: w porównaniu z próbkami z przelywu (FT) (tj. frakcjami niezmieszanymi z przeciwciałami anty-CD31), frakcje EC wykazywały znacznie wyższe poziomy Pecam1 (kodujące CD31) i Kdr (kodujące VEGFR2), dwa geny markerowe EC33, a niższy poziom homeoboksu NK6.1 (Nkx6.1), czynnik transkrypcyjny w komórkach endokrynnych trzustki (Rysunek 4A); 2) western blotting: próbki wzbogacone w EC z trzech preparacji (pEC-1-3) wykazały silne sygnały CD31 o oczekiwanej wielkości (~130 kDa). W porównaniu z nimi, próbki wejściowe (input) oraz frakcje przepływowe (FT) wykazały minimalny sygnał CD31. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano lizaty komórek MS1, linii komórkowej pEC, które również wykazały silny sygnał CD31 (Rycina 4B); 3) barwienie błękitem trypanu: stwierdziliśmy, że żywotność wyizolowanych komórek wynosiła około 50% (Rysunek 4C); 4) cytometria przepływowa zgodnie z opublikowanym protokołem15 poprzez bramkowanie populacji żywych komórek (Rycina 4D), stwierdzono, że odsetek komórek CD31+ wynosił 88%, a odsetek komórek TdTomato+ wynosił 76%. Należy zauważyć, że większość wyizolowanych komórek wykazuje koekspresję CD31 i TdTomato (Rycina 4E). Jako kontrole negatywne, niebarwione komórki MS1 oraz komórki MS1 inkubowane z IgG nie wykazały obecności żywych komórek znakowanych CD31. Jako kontrola pozytywna, tj. komórki MS1 barwione pod kątem CD31, wykazały blisko 100% żywych komórek CD31+ (Rycina 4F). Hodowaliśmy również wyizolowane komórki, a następnie przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne białka PECAM1 zgodnie z opublikowanym protokołem36i obrazowano TdTomato, co wykazało silne sygnały obu markerów w wyizolowanych komórkach, sugerując obecność komórek śródbłonka (Rycina 4G).

Schemat komórek śródbłonka trzustki przedstawiający strukturę i połączenia komórek śródbłonka wewnątrz wysepek.
Rysunek 1: Ilustracja unaczynienia trzustki i wysepek trzustkowych. Przedstawienie graficzne komórek śródbłonka (ECs) trzustki oraz komórek śródbłonka wewnątrz wysepek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat przygotowania próbek z trzustki do analizy pojedynczych komórek; wirowanie, CD31-biotyna, liczenie komórek, analiza RNA.
Rysunek 2: Przegląd schematu postępowania. 1) Wycięcie trzustki, 2) trawienie mechaniczne, 3) inkubacja z enzymem, 4) wirowanie, 5a) usunięcie nadsączu i 5b) wtórne trawienie osadu komórkowego kolagenazą z tryturacją w celu filtracji w punkcie 6), 7) i 8) resuspensja osadu i wiązanie przeciwciał, 9) inkubacja z mikrokulkami, 10) wzbogacanie na kolumnie MACS, 11) liczenie komórek w celu oceny żywotności oraz 12) analiza końcowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces pobierania i izolacji trzustki; przygotowanie tkanki do badań, krok po kroku wyniki eksperymentu.
Rycina 3: Etapy obróbki tkanki. Obrazy (A) jamy brzusznej, (B) wyizolowanej trzustki myszy oraz (C) przyciętej trzustki myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów, cytometria przepływowa i detekcja białek w komórkach śródbłonka; wykresy i mikroskopia.
Rycina 4: Walidacja wyizolowanych frakcji EC z trzustki myszy. (A) qPCR próbek FT i wzbogaconej frakcji EC z CD31 w celu oceny stopnia wzbogacenia. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) oraz Nkx6.1 (czynnik transkrypcyjny specyficzny dla komórek β trzustki)33. * oznacza p <0.05 w porównaniu do FT na podstawie testów t . n = 3-4 połączone próbki, każda składająca się z 3 myszy. (B) Western blotting CD31. pEC-1-3 oznaczają wzbogacone EC z 3 oddzielnych połączonych próbek mysich. Na każdą ścieżkę naniesiono lizaty komórkowe o masie 30 mg, a następnie wykonano barwienie Ponceau S. (C) Liczenie komórek i barwienie błękitem trypanu wzbogaconych pEC w celu oceny żywotności. (D) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej dla mysich pEC barwionych 4', 6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i przeciwciałem CD31. (E) Histogramy cytometrii przepływowej dla niebarwionych MS1 (lewa góra), MS1 barwionych wtórnym przeciwciałem AlexaFluor-488 (kontrola IgG; prawa góra), MS1 barwionych CD31 (lewa dół) oraz wyizolowanych mysich pEC barwionych CD31 (prawa dół). (F) Procent żywych komórek określony za pomocą cytometrii przepływowej. (G) Immunofluorescencja ekspresji CD31 (zielony) z przeciwbarwieniem DAPI (niebieski) i endogennym fluorescencyjnym reporterem TdTomato (czerwony). Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Immunofluorescencja komórek wykazujących CD31, CD144, DAPI; wykresy UMAP dla analizy Cdh5, Pecam1.
Rycina 5: Specyficzność CD31 i CD144 w trzustce myszy. (A) Immunofluorescencja trzustki myszy z CD31 (magenta) i CD144 (cyjan) oraz przeciwbarwieniem DAPI. Obraz zarejestrowany przy użyciu obiektywu 10x pod szerokopolowym odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Pasek skali = 100 µm. Linie przerywane wyznaczają obszar wysepki. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) przedstawiający ekspresję Cdh5 i Pecam1 w komórkach śródbłonka (EC) wysepek myszy C57BL6 wykrytą za pomocą scRNA-seq (GSE128565)37. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

EnzymZastosowanieTemperatura i czasBibliografia
Kolagenaza IDysocjacja pojedynczych komórek, wzbogacanie frakcji komórek śródbłonkowych całej trzustki37 °C, 20 minNiniejszy protokół
Kollagenaza IVIzolacja wysepek oraz dysocjacja nieenzymatyczna37 °C, 20 min46
Kolagenaza + trypsynaBadanie komórek przewodowych w trzustce myszy37 °C, 30 min47
Kolagenaza BZawiesina pojedynczych komórek trzustki37 °C, 30 min48
Kolagenaza NBIIzolacja wysepek trzustkowych37 °C, 30 min49
Kollagenaza PŻywa zawiesina komórek acynarnych37 °C, 15 min45
Kolagenaza XIIzolacja wysepek trzustkowych37 °C, 15 min35
Dyspazazawiesina pojedynczych komórek37 °C, 45 min24
Liberasezawiesina pojedynczych komórek37 °C, 10 min25, 48
TrypsynaDysocjacja pojedynczych komórek, cała trzustka4 °C, przez noc28

Tabela 1: Podsumowanie różnych protokołów stosowanych do obróbki próbek trzustki myszy.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiono protokół wzbogacania i izolacji pEC. Podobnie jak poprzednie protokoły izolacji EC z innych tkanek lub narządów, protokół ten składa się z trzech głównych procesów, a mianowicie dysocjacji fizycznej, trawienia enzymatycznego i wzbogacania EC w oparciu o przeciwciała. Aby sprostać wyjątkowym wyzwaniom związanym z przetwarzaniem trzustki, wprowadziliśmy kilka kluczowych adaptacji i krytycznych kroków w naszym protokole: 1) delikatne jednoetapowe trawienie kolagenazy z krótkim czasem inkubacji, 2) suplementacja wyższym stężeniem DNazy i inhibitora trypsyny w celu zminimalizowania zanieczyszczenia DNA i trawienia enzymów endogennych, które mogą zakłócać wiązanie przeciwciał, a tym samym zmniejszać wzbogacenie i żywotność EC oraz 3) zliczanie komórek po etapie trawienia w celu dostosowania do próbki dodaje się dużo przeciwciał w celu optymalizacji wzbogacenia EC. W procesie optymalizacji tego protokołu przetestowaliśmy inne enzymy stosowane w poprzednich badaniach, np. trypsynę28, kolagenazę typu IV31 oraz inne temperatury trawienia, np. 4°C, a także różne czasy inkubacji (tab. 1). Stwierdziliśmy, że kolagenaza typu I, 20 minut, w temperaturze 37 °C jest optymalnym warunkiem izolacji pEC myszy i użyliśmy jej tutaj. Podczas gdy dodanie antykoagulantu podczas perfuzji może poprawić ogólną żywotność komórek, typowy środek przeciwzakrzepowy, np. EDTA lub heparyna, może zakłócać aktywność niektórych enzymów, np. kolagenazy do dysocjacji komórek i odwrotnej transkryptazy stosowanej w qPCR. Aby zapobiec nieoczekiwanemu/niepożądanemu działaniu tych antykoagulantów, stosuje się PBS (bez Ca2+ i Mg2 +) do perfuzji.

Skupiliśmy się na opracowaniu protokołu wzbogacania populacji EC z całej trzustki myszy, który obejmowałby zarówno EC wewnątrz wysp trzustkowych, jak i EC w tkankach zewnątrzwydzielniczych, co skutkowałoby wyższą wydajnością. W obecnym protokole połączyliśmy razem 3 zwierzęta na etapie dysocjacji i średnio uzyskaliśmy zawiesinę jednokomórkową z około 2,0 x 106 żywotnymi komórkami. Przetestowaliśmy również próbki z pojedynczej trzustki myszy i udało nam się uzyskać około 750 000 komórek. Warto zauważyć, że przy dostosowywaniu się do przetwarzania pojedynczego zwierzęcia należy użyć mniej roztworu dysocjacyjnego (3 ml dysocjacji na trzustkę). Kluczowym krokiem w protokole jest całkowite przycięcie i usunięcie wszelkich resztek tłuszczu, które są przyczepione do trzustki (ryc. 3B). Zanieczyszczenie tkanki tłuszczowej podczas trawienia kolagenazy będzie zakłócać etap dysocjacji pojedynczej komórki trzustki, zmniejszając żywotność komórek w kolejnych etapach wzbogacania38. Ponadto, aby wzbogacić pEC, użyliśmy markera powierzchniowego pan-EC, PECAM1/CD31. Stosując przeciwciało PECAM1/CD31, byliśmy w stanie znacznie wzbogacić frakcje EC, co widać w analizie ekspresji genów. Opracowując ten protokół, przetestowaliśmy również użyteczność przeciwciała CD144, które jest również powszechnie stosowane do izolowania EC13. Nie udało nam się jednak wzbogacić wskaźników pEC (dane nie pokazane). Co ciekawe, barwienie immunofluorescencyjne ujawniło, że podczas gdy CD31 ulega ekspresji we wszystkich EC w tkance trzustki, przeciwciało CD144 wydaje się barwić tylko EC wewnątrz wysp trzustkowych (Figura 5A). Ponadto przeanalizowaliśmy publicznie dostępne dane sekwencyjne RNA pojedynczej komórki z wysepek wyizolowanych od myszy C57BL / 6 (GSE128565)37 i stwierdziliśmy, że około 50% EC wysepek wykazuje ekspresję zarówno Cdh5 (VE-Cad), jak i Pecam1, ale reszta EC wysepek wyraża tylko Cdh5 lub Pecam1 (Figura 5B). W związku z tym spekulujemy, że przeciwciała CD31 są bardziej odpowiednie do izolacji pEC, a użyteczność przeciwciała CD144 w tym celu uzasadnia przyszłe badania. Ponadto dostępne na rynku są anty-CD31 sprzężone z kulkami magnetycznymi, które mogą uprościć dwuetapowy etap wiązania przeciwciała do pojedynczego etapu.

Jak wykazano, przeprowadziliśmy qPCR, immunoblotting, cytometrię przepływową i barwienie immunofluorescencyjne w celu walidacji wyizolowanej frakcji EC. Można sobie wyobrazić, że frakcje te można poddać innym testom, takim jak sekwencja (sc)RNA i spektrometria mas. Ograniczeniem tego protokołu jest to, że nie byliśmy w stanie osiągnąć solidnej subkultury i przeprowadzić testów funkcjonalnych. Biorąc pod uwagę, że subkultura izolowanych EC myszy okazała się wyzwaniem, jest to obszar wymagający przyszłych wysiłków. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu może być wprowadzenie dużego antygenu T, który został wykorzystany do unieśmiertelnienia komórek pierwotnych39.

Ostatnie postępy i zastosowanie sekwencjonowania scRNA umożliwiły profilowanie komórek trzustki w wysokiej rozdzielczości40 , a zwłaszcza komórek wysp trzustkowych41. Jednak większość istniejących badań koncentrowała się na populacjach komórek endokrynnych i wykorzystywała protokoły dysocjacji tkanek, które nie zatrzymują skutecznie EC. W rezultacie frakcje EC często stają się rzadkie, stanowiąc zaledwie 3%-5% w całych przechwyconych populacjach komórek 42,43,44. Niedawny protokół wykorzystuje dwuetapowe trawienie i dezaktywację enzymatyczną oraz etap sortowania komórek aktywowany fluorescencyjnie i pobiera EC u 12% całej populacji komórek trzustki45. Uzupełnienie tego protokołu, nasz protokół zapewnia uproszczony przepływ pracy, który może być bardziej opłacalny i mniej wymagający technicznie, jeśli ECs są przedmiotem badania. Chociaż protokół ten został przetestowany tylko na trzustce myszy, można go zwiększyć i dostosować do izolowania EC od innych organizmów, w tym trzustki ludzkiej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Brianowi Armstrongowi z City of Hope i Mindy Rodriguez z University of California, Riverside za pomoc techniczną. Badanie to zostało częściowo sfinansowane z grantów NIH (R01 HL145170 do ZBC), Fundacji Elli Fitzgerald (do ZBC), City of Hope (Nagroda za Metabolizm Cukrzycy i Instytut Badawczy im. Arthura Riggsa) oraz grantu Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej EDU4-12772 (dla AT). Badania opisane w tej publikacji obejmowały prace wykonane w mikroskopii świetlnej i obrazowaniu cyfrowym wspierane przez National Cancer Institute of the NIH w ramach nagrody numer P30CA033572. Rysunek 1 i rysunek 2 zostały wykonane za pomocą BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm naczynieGenesee Scientific25-202
25G igłyBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 
Płytka 6-dołkowaGreiner Bio-One07-000-208
70 µ m sitkoFisher22-363-548
Anty-CD31-biotynaMiltenyi BiotechREA784
Surowica bydlęca albumina poddawana szokowi cieplnemuFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
WirówkaEppendorf
Kolagen typu 1, ze skóry cielęcejSigma Aldrich& nbsp;C9791Odczynnik przyłączeniowy w protokole
Kolagenaza Typ 1 Worthington BioLS004197
Countess Automatyczny licznik komórekThermo Fisher 
DAPIThermo Fisher D1306immunofluorescencyjne
jednorazowe bezpieczne skalpeleMyco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher 
EtanolFisherBP2818-4
Surowica bydlęcapłodu Inkubator
C 5% CO2
LS KolumnyMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand z separatorem QuadroMACS Miltenyi Biotech130-042-303
Średni 199Sigma Aldrich M2520-10X
Mikrogranulki anty-biotynaMiltenyi Biotech130-090-485
MikroskopLeicaDo oceny morfologii komórek
Woda klasy molekularnejCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Wytrząsarka orbitalna Przeciwciało Eppendorf
PECAM1 (CD31)Abcamab56299immunofluorescencja
PECAM1 (CD31)Przeciwciało R& D SystemsAF3628
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X) (bez Ca2+, bez Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Mysz do przoduIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Mysz Revese IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Mysz do przodu IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Odwrócona myszIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Odwrócona mysz IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Mysz do przoduIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Mysz do przoduIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Mysz odwrócona IDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
Woda wolna od RNazTakaraRR036B
Sterylne 12" długie kleszczeFST91100-16
Sterylne drobne kleszczykiFST11050-10
Sterylne drobne nożyczkiFST14061-11
Naczynia do hodowli tkankowych 2cmGenesee Scientific25-260
Odczynnik TRIzolFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
Inhibitor trypsyny Roche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin PrzeciwciałoAbcamab33168immunofluorescencja
wodna
1428230014080055 Fisher 10437028 utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza;Kąpiel

Bibliografia

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trzustka mysiaizolacja komórek śródbłonkamagnetyczna separacja komórekłagodna dysocjacjamarkery powierzchniowe komóreksekwencjonowanie pojedynczych komóreknaczynia trzustkiprzeciwciało anty-CD31Western blotting
Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.