Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek krwi i pomiar hormonów w celu określenia etapu cyklu jajnikowego u marmozet

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66691

⸱

5 lipca 2024

 , 
1National Center for Child Health and Development

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje pobieranie próbek krwi i moczu w celu pomiaru poziomu progesteronu/estradiolu i gonadotropiny kosmówkowej w celu określenia etapu cyklu jajnikowego. Poziomy hormonów są wykorzystywane do przewidywania i określania czasu owulacji, a hormony są wstrzykiwane w celu regulacji cyklu jajnikowego i wzrostu oocytów.

Streszczenie

Pospolite marmozety to małe małpy z Nowego Świata. Ponieważ wiele z ich mechanizmów biologicznych jest podobnych do ludzkich, marmozety są potencjalnie przydatne w badaniach medycznych i biologicznych człowieka w wielu dziedzinach, takich jak neuronauka, medycyna regeneracyjna i rozwój. Brakuje jednak literatury opisującej metody wielu podstawowych eksperymentów i procedur. W tym miejscu opisano szczegółowe metody oznaczania poziomu hormonów płciowych (progesteronu, estradiolu i gonadotropiny kosmówkowej) u marmozet. Pomiar tych hormonów umożliwia przewidzenie etapu cyklu jajnikowego, który zwykle wynosi 26-30 dni u marmozet; Dokładne oznaczanie ma zasadnicze znaczenie dla pozyskania oocytów/zygot we właściwym czasie oraz dla przygotowania samic gospodarza do wytworzenia genetycznie zmodyfikowanych marmozet.

Dodatkowo, pomiar poziomu hormonów płciowych jest przydatny w badaniach endokrynologicznych, etologicznych, wczesnego rozwoju i biologii rozrodu. Protokół ten zawiera szczegółowy opis metod pobierania próbek krwi z żyły udowej, oddzielania osocza w celu pomiaru hormonów, pomiaru poziomu gonadotropin kosmówkowych za pomocą moczu i osocza, resetowania cyklu jajnikowego za pomocą wstrzyknięć prostaglandyny F2α analogu w celu skrócenia i synchronizacji cyklu oraz promowania wzrostu pęcherzyków i owulacji poprzez wstrzyknięcie hormonu folikulotropowego i gonadotropiny kosmówkowej. Korzystając z tych protokołów, można określić etapy cyklu jajnikowego w celu terminowego pobrania oocytów/zygot.

Wprowadzenie

Marmozeta zwyczajna (Callithrix jacchus) to mała małpa z Nowego Świata o wielu cechach podobnych do ludzkich, a czas trwania jej cyklu jajnikowego wynosi 26-30 dni1,2. Badania nad wczesnym rozwojem i powstawaniem genetycznie modyfikowanych marmozet wymagają pobierania oocytów i zygot na określonych etapach cyklu jajnikowego. W związku z tym dokładne określenie stadium ma kluczowe znaczenie i można je oszacować, mierząc poziom hormonów progesteronu (P4) i estradiolu (E2) we krwi2,3. Hormony te wspomagają wzrost endometrium, który jest niezbędny do implantacji. P4 jest wytwarzany z ciałka żółtego, które tworzy się w jajnikach bezpośrednio po owulacji. E2 jest wydzielany przez pęcherzyki jajnikowe w odpowiedzi na hormon folikulotropowy (FSH) z kompleksu podwzgórze-przysadka mózgowa. Poziom E2 wzrasta wraz z dojrzewaniem pęcherzyka, osiągając szczyt przed owulacją3. Wysoki poziom E2 powoduje pulsacyjne uwalnianie hormonu luteinizującego (LH) przez kompleks podwzgórze-przysadka u ludzi; ten wyrzut LH indukuje owulację. Jednak u marmozet gen LH uległ degeneracji podczas ewolucji, a owulacja jest zamiast tego indukowana przez uwalnianie gonadotropiny kosmówkowej (CG), która ma podobną strukturę do LH, z przysadki mózgowej4,5.

Cykl jajnikowy może być kontrolowany przez zastrzyki hormonalne. Zastrzyki FSH u ludzi działają na jajnikowe receptory FSH i są stosowane do promowania syntezy estrogenów i wzrostu pęcherzyków6. Wstrzyknięcie ludzkiego CG (hCG) jako substytutu LH pod koniec fazy folikularnej jest stosowane w celu stymulacji owulacji u ludzi7. Zastrzyki CG są również stosowane w leczeniu niepłodności ludzkiej, ponieważ CG stymuluje ciałko żółte we wczesnej ciąży, co powoduje zwiększoną produkcję P4. Wstrzyknięcia prostaglandyny F2α (PGF2α) resetują cykl jajnikowy8. U bydła domowego wstrzyknięcie PGF2α stosuje się w celu skrócenia fazy lutealnej i synchronizacji cyklu rui w celu zarządzania rozrodem.

Chociaż marmozety i ludzie mają podobne mechanizmy biologiczne, co czyni je idealnymi modelowymi zwierzętami, brakuje literatury opisującej podstawowe metody dla wielu często używanych technik. Pobieranie próbek krwi jest jedną z najczęściej stosowanych technik9,10,11,12. Jednak początkujący czasami mają problem ze znalezieniem żyły. W związku z tym w badaniu przeprowadzono analizy anatomiczne okolicy żyły udowej. Opierając się na obserwacjach anatomicznych, protokół ten wprowadza obszar proksymalny trójkąta udowego jako łatwe miejsce do nakłucia żyły.

Protokół

Wszystkie metody z udziałem marmozet wykorzystywały wysokie standardy etyczne i dobrostanowe i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Narodowym Centrum Zdrowia i Rozwoju Dziecka. Zwierzęta były tu trzymane pojedynczo lub w parach (jedna samica i jeden samiec) z 12 godzinami światła na dobę.

1. Pobieranie próbek krwi z żyły udowej

  1. Przygotuj strzykawkę o pojemności 1 ml (krótki typ jest łatwy w użyciu) z igłą 25 G przymocowaną ostrzem do góry. Aby uniknąć zatkania krwi, należy przeprowadzić heparynizację strzykawki, pobierając do niej 200 μl nierozcieńczonego roztworu heparyny sodu. Pokryć równomiernie wnętrze strzykawki, pociągając ją kilkakrotnie w górę i w dół; Następnie usunąć roztwór heparyny ze strzykawki.
    UWAGA: Ponieważ często konieczna jest zmiana strzykawki na nową, należy przygotować kilka dodatkowych strzykawek z heparyną.
  2. Przygotuj chłonne waciki bawełniane i nasączone alkoholem. Włącz regulowaną lampę, aby oświetlić obszar, w którym marmozeta zostanie umieszczona w celu pobrania krwi.
  3. Przygotuj urządzenie przytrzymujące (420 x 85 x 85 mm, Rysunek 1A), które jest dostępne w handlu (szczegóły w Tabeli Materiałów). Aby umieścić marmozetę w urządzeniu, otwórz część mocującą za pomocą paska z gąbką, który zabezpiecza marmozety. Włóż marmozetę do urządzenia przytrzymującego skierowaną do góry.
    UWAGA: Marmozety są zwykle spokojne w urządzeniach krępujących, które mogą negować potrzebę aklimatyzacji lub treningu krępowania.
  4. Chwyć marmozetę; włóż marmozetę do cylindrycznej części i zabezpiecz ją, naciskając pasek gąbki. Umieść nogę, z której ma być pobrana krew, na drugiej (Rycina 1A). Trzymaj nogi ręką niedominującą; Umieść palce środkowy i serdeczny wewnątrz każdej nogi, aby je zapiąć, a pozostałe palce na zewnątrz każdej nogi, aby je zamocować.
    UWAGA: Podczas chwytania marmozet zalecane są rękawice do gryzienia. Jeśli urządzenie krępujące nie jest obecne, należy pobrać krew w znieczuleniu lub z inną osobą krępującą marmoztę.
  5. Sprawdź, czy żyła udowa jest widoczna w pobliżu podstawy uda. Jeśli nie, zbadaj palpacyjnie, aby znaleźć pulsującą tętnicę i użyj jej jako punktu orientacyjnego, aby sprawdzić, czy żyła biegnie w jej wnętrzu (Rysunek 1B-D).
    UWAGA: Oświetlenie biurka i golenie włosów są zalecane w celu poprawy widoczności. Widoczność można również poprawić, pocierając wacikami nasączonymi alkoholem. Węzły chłonne w trójkącie często znajdują się blisko żyły i mają ciemnoniebieski kolor jako żyła. Sposób ich rozróżniania jest opisany w sekcji Reprezentatywne wyniki.
  6. Zdezynfekuj miejsce wkłucia za pomocą wacika nasączonego alkoholem. Włożyć igłę ostrzem do góry pod kątem 15°-20°. Aby zapobiec wysunięciu się igły z naczynia krwionośnego podczas pobierania krwi, należy ustabilizować rękę trzymającą strzykawkę, na przykład opierając ją na drugiej ręce.
  7. Delikatnie odciągnąć tłok, aby zastosować podciśnienie (Rysunek 1E). Popchnąć końcówkę igły do przodu. Gdy krew dostanie się do strzykawki, należy utrzymać pozycję końcówki igły do momentu zebrania wymaganej objętości (500-700 μl).
    1. Gdy krew nie dostanie się do strzykawki, zmień miejsce nakłucia. Jeśli krew wypłynie podczas wyciągania igły, należy zatamować krwawienie, uciskając miejsce wkłucia na 3 minuty. Po zatamowaniu krwawienia należy wznowić nakłucie dożylne.
    2. Jeśli krew pobierana do strzykawki przestanie płynąć podczas procesu pobierania, powoli popchnij końcówkę igły do przodu, a następnie pociągnij ją do tyłu, aby znaleźć naczynie krwionośne. Może to przywrócić przepływ krwi do strzykawki. Jeśli nie, wyciągnąć igłę i wykonać nakłucie żyły za pomocą nowej strzykawki.
      UWAGA: Użyj uda na drugiej nodze, gdy trudno jest pobrać krew z tej samej strony.
  8. Ostrożnie wyciągnąć igłę, lekko naciskając na miejsce wkłucia małym palcem. Następnie za pomocą chłonnego wacika należy natychmiast uciskać miejsce nakłucia przez 3 minuty, aby zatamować krwawienie. Odwrócić strzykawkę, aby wymieszać krew i heparynę.
    UWAGA: Uciskaj przez dłuższy czas (5 minut) podczas chłodzenia podczas pobierania krwi tętniczej i ostrożnie potwierdź ustanie krwawienia, aby zapobiec tworzeniu się krwiaka, który czasami może prowadzić do zgonu.
  9. Po stwierdzeniu, że krwawienie ustało, zdejmij pasek z gąbki, przytrzymaj zwierzę w talii jedną ręką i obróć zwierzę tak, aby można było przytrzymać zwierzę pod pachą drugą ręką od tyłu.
  10. Umieść marmozetę z powrotem w klatce. Aby zmniejszyć stres i ułatwić wielokrotne pobieranie krwi, podawaj marmozety jej ulubione jedzenie (np. herbatniki, pianki lub biszkopt). Od czasu do czasu sprawdzaj występowanie krwiaka.
    UWAGA: Gdy krwiak zostanie znaleziony we wczesnym stadium, nałóż bandaż uciskowy, aby zapobiec postępowi krwiaka. Gdy zostanie stwierdzony po długim czasie, może być konieczne chirurgiczne usunięcie krwiaka z podwiązaniem tętnicy udowej i transfuzją krwi9,13.
  11. Odłączyć igłę od strzykawki, aby zapobiec hemolizie. Następnie powoli wydal zebraną krew wzdłuż wewnętrznej ścianki mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Pobraną krew można przechowywać w temperaturze 4 oC do 24 godzin przed separacją osocza w celu pomiaru poziomu P4/E2.

2. Separacja osocza i określenie poziomu hormonów

  1. Odwirować krew w probówce o pojemności 1,5 ml o stężeniu 1 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  2. Przenieść oddzielone osocze (supernatant) z probówki o pojemności 1,5 ml do nowej probówki/kubka, ostrożnie unikając włączenia komórek krwi (osadu).
  3. Zmierz poziomy P4 i E2 za pomocą zestawu ELISA lub analizatora automatycznego. Jeśli ilość osocza jest niewystarczająca dla automatycznego analizatora, należy użyć roztworu do rozcieńczania próbki.
    UWAGA: Do pomiaru za pomocą automatycznego analizatora wymagane jest >175 μl osocza do określenia tylko poziomu P4, a >250 μl osocza jest wymagane do oznaczenia zarówno P4, jak i E2.

3. Pomiar CG moczu w celu wykrycia owulacji i ciąży

UWAGA: Poziomy CG u marmozet mogą być mierzone za pomocą zestawu immunochromatograficznego zarówno dla owulacji, jak i ciąży. W przypadku owulacji pozytywny wynik można uzyskać na 0-2 dni przed owulacją. W przypadku ciąży wynik dodatni wykrywa się od 15-20 dnia do około 100 dnia ciąży. Do wykonania badania wymagana jest niewielka ilość (90 μL) moczu (jedna kropla moczu to ~30 μL).

  1. Metoda tacy: Jeśli w tej samej klatce znajdują się więcej niż dwa zwierzęta, przenieś docelową marmozetę (lub inne zwierzęta) do innej klatki dzień wcześniej. Umieść czystą tacę na dnie klatki na noc przed lub przed oświetleniem. Mocz nie jest odprowadzany z pęcherza w nocy. Dlatego mocz jest zwykle uwalniany z pęcherza wkrótce po zapaleniu.
    UWAGA: Wejście do pokoju rano przed oświetleniem może zakłócić cykl snu kohorty. Mocz można zwykle zebrać w ciągu około 30 minut po zapaleniu.
  2. Metoda wyciskania: Przygotuj umyte tace do zbierania moczu. Po zlokalizowaniu pęcherza marmozety, ostrożnie ściśnij go od przodu i z obu stron używając całej długości palców (Rysunek 1F). Zbierz mocz tuż przed oświetleniem pokoju rano.
    UWAGA: Jeśli zbieranie moczu nie powiedzie się z powodu braku moczu w pęcherzu, odczekaj chwilę i spróbuj ponownie. Uważaj, aby nie używać nadmiernej siły, ponieważ może to zranić zwierzę.
  3. Natychmiast po pobraniu należy umieścić próbkę moczu w studzience zestawu do testów immunochromatograficznych. Odczytaj wynik po 10 minutach zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Kontrola i określanie etapu cyklu jajnikowego dla pobierania oocytów, zygot i zarodków

  1. Pobranie komórek jajowych pęcherzyków rozrodczych (GV) z jajników
    1. Podaj domięśniowo wstrzyknięcie 3 μl 0,263 mg/ml kloprostenolu (syntetyczny analog PGF2α) rozcieńczonego w 150 μl soli fizjologicznej14 (Rysunek 2), aby zresetować cykl jajnikowy pod koniec fazy lutealnej (tj. ≥10 dni po rozpoczęciu fazy lutealnej).
      UWAGA: Przygotowanie rozcieńczonego roztworu w większej objętości może być wygodne, ponieważ rozcieńczony kloprostenol pozostaje stabilny przez co najmniej kilka tygodni w temperaturze +4 °C.
    2. Następnego dnia (dzień 1) potwierdź rozpoczęcie fazy folikularnej, sprawdzając, czy poziom P4 spadł.
      UWAGA: Doniesiono, że wstrzyknięcie kloprostenolu znacznie obniża poziom P4 (zwykle <10 ng / ml) w ciągu 24 h3.
    3. Od 1 dnia wstrzykuj FSH (25 j.m., domięśniowo) raz na 2 dni, w sumie 5 razy (dni 1, 3, 5, 7 i 9). W dniu 10 wstrzyknąć hCG (75 j.m., domięśniowo) po południu.
    4. Pobrać GV z jajników w 11 dniu przez aspirację pęcherzyków w znieczuleniu zgodnie z literaturą15,16.
      UWAGA: Czasami owulacja następuje wcześniej niż oczekiwano. Dlatego zaleca się sprawdzanie poziomu CG od 8 dnia. Jeśli wynik testu CG jest pozytywny, należy tego dnia wykonać pobranie GV.
  2. Pobieranie oocytów metafazy II (MII), zygot i wczesnych zarodków
    1. Zresetuj cykl jajnikowy za pomocą kloprostenolu zgodnie z opisem w kroku 4.1.1.
    2. Następnego dnia (dzień 1) potwierdź rozpoczęcie fazy folikularnej, sprawdzając, czy poziom P4 spadł.
    3. W celu zbierania zygot i zarodków trzymaj samice marmozet razem z samcami marmozet do krycia od 6 dnia.
    4. Od 7 dnia sprawdzaj poziom P4/E2 we krwi i poziom CG w moczu samic. Wykrycie CG wskazuje na owulację w ciągu kilku dni (zwykle następnego dnia). W dniu, w którym poziom P4 wzrasta, a poziom E2 spada w porównaniu z poprzednim dniem, zbierz oocyty MII lub embrionalne zygoty dnia 0 (E0) z jajowodów17,18.
    5. W celu pobrania zarodka, zgodnie z opisem w literaturze, należy przeprowadzić płukanie z jajowodów (E1-E3, 1-8 komórek)17,18 lub macicy (E5-E10, 8 komórek-blastocysta)19,20,21,22 w odpowiednim punkcie czasowym, w zależności od docelowego etapu.

Wyniki

Szczegóły dotyczące zwierząt wykorzystanych w tym badaniu wymieniono w Tabeli 1.

Analizy anatomiczne żyły udowej
Analizy anatomiczne żyły udowej przeprowadzono u 2-letniego samca sajemisty wspólny (I 7713M) poddanego eutanazji. Żyły i tętnice udowe znajdują się w trójkącie udowym. Trójkąt udowy tworzy się na granicach między ścianą brzucha a mięśniami uda (Rycina 1B-D). U podstawy uda duża żyła przebiega przez środek odwróconego trójkąta, a tętnica biegnie równolegle na zewnątrz od żyły. W dolnym regionie żyły i tętnice stają się cieńsze i nakładają się na siebie, przy czym tętnice są położone nad żyłami (Rycina 1D).

Do pobrania krwi należy celować w żyłę, ponieważ uszkodzenie tętnicy może spowodować krwiaka tętnicy udowej, co przy silnym krwotoku może doprowadzić do wstrząsu sercowo-naczyniowego13. Choć krew można pobrać z dowolnego odcinka żyły w obrębie trójkąta udowego i jego obszaru dystalnego, zaleca się nakłucie żyły w proksymalnej części trójkąta udowego ze względu na dużą średnicę naczynia oraz jego niewielkie, pozorne nachodzenie na tętnicę. Dodatkowo żyła w części proksymalnej przebiega powierzchownie, co ułatwia jej lokalizację za pomocą igły. Tętnica w trójkącie udowym, ze względu na tętnienie, jest czasem identyfikowana wzrokowo lub poprzez palpację, a żyła przebiega bezpośrednio przyśrodkowo od niej. Zatem obserwacja tętnienia tętnicy pomaga przewidzieć położenie żyły.

Ponadto pod skórą w górnej części trójkąta zazwyczaj widoczne jest niebieskie zabarwienie wskazujące na żyłę (Rysunek 1B,C). Jednak węzły chłonne w trójkącie często znajdują się blisko żyły i wykazują ciemnoniebieski kolor, przez co ich wygląd jest podobny. Na szczęście można je odróżnić dzięki ich ruchomości: żyła jest nieruchoma, a węzły chłonne są ruchome. Zatem pulsacja tętnicy i niebieski kolor żyły to dwie główne wskazówki służące do zlokalizowania żyły, choć do ich wizualizacji może być konieczne ogolenie włosów.

Określenie etapu cyklu jajnikowego
Poziomy P4 i E2 monitorowano u sześciu samic marmosetek (w wieku od 1 do 3 lat), aby zbadać czas trwania fazy pęcherzykowej i lutealnej. Wyniki wykazały, że średni czas trwania fazy pęcherzykowej wynosił 11,58 dnia (n = 6 od czterech marmosetek), a fazy lutealnej 16,8 dnia (n = 5 od trzech marmosetek) (Tabela 2). Poniżej szczegółowo opisano dynamikę P4 i E2 u jednej z sześciu marmosetek (I6751F, 3-letnia). Pobieranie krwi i pomiary hormonów u tego zwierzęcia przeprowadzano co kilka dni przez okres 38 dni (Tabela 3).

Faza lutealna (dni 1-10)
Pierwszy dzień pomiaru wyznaczono jako dzień 1. Na podstawie poziomu P4 (21 ng/mL) zwierzę prawdopodobnie znajdowało się w fazie lutealnej. Wysoki poziom P4 obserwowano od dnia 1 do 10 (≥21 ng/mL), co sugeruje fazę lutealną. W dniu 12 poziom ten gwałtownie spadł do 4 ng/mL. Ten znaczący spadek wskazywał na przejście z fazy lutealnej do fazy folikularnej. Spadek poziomu E2 z dnia 10 (241 ng/mL) do dnia 12 (189 ng/mL) również potwierdził to przejście.

Faza folikularna (dni 12-22)
Po przejściu w fazę folikularną poziom P4 pozostawał niski (4-6 ng/mL) aż do 19. dnia, a następnie nieznacznie wzrósł od 19. do 24. dnia (dzień 19, 6 ng/mL; dzień 22, 8 ng/mL; dzień 24, 9 ng/mL). W przeciwieństwie do tego, poziom E2 znacznie wzrósł od 19. dnia (94 ng/mL) do 22. dnia (322 ng/mL), a następnie spadł od 22. do 24. dnia (158 ng/mL). Na podstawie wzrostu poziomu P4 i spadku poziomu E2 przewidywano, że owulacja nastąpiła między 22. a 24. dniem, co oznacza przejście z fazy folikularnej w fazę lutealną.

Faza lutealna (dni 24-36)
Po owulacji poziom P4 pozostawał wysoki do 36. dnia, a następnie spadł do 3 ng/mL w 38. dniu. Zatem prawdopodobne jest, że przejście z fazy lutealnej w fazę folikularną nastąpiło między 36. a 38. dniem. Zgodnie z tym przejściem, poziom E2 spadł w tym okresie (dzień 36, 2517 ng/mL; dzień 38, 73 ng/mL).

Przewidywanie i określanie czasu owulacji

Aby zbadać zależność między poziomem CG w moczu a datą owulacji, przygotowano siedem marmoset (nr 1-7). Wstrzyknięto kloprostenol w celu zresetowania cyklu owulacyjnego (dzień 0). Następnie od 7. dnia prowadzono monitorowanie poziomów P4/E2 we krwi oraz poziomów CG w moczu. Mocz pobierano bezpośrednio po zapaleniu światła. Pobieranie krwi odbywało się zasadniczo rano. Przyjęto, że owulacja następuje w momencie znacznego spadku poziomu E2 w porównaniu z dniem poprzednim, zgodnie z doniesieniami17. W tym dniu na powierzchni jajników zaobserwowano pęknięcie pęcherzyków oraz obecność zygot/oocytów w jajowodach (Tabela 4).

CG został po raz pierwszy wykryty między 7. a 11. dniem (dzień 7, N = 1; dzień 8, N = 2; dzień 9, N = 1; dzień 10, N = 2; dzień 11, N = 1) (Tabela 4). Znaczny spadek poziomu E2 (wskaźnik owulacji) zaobserwowano od 0 do 3 dni po pierwszym sygnale CG. Czas od pierwszego wykrycia CG do spadku poziomu E2 wydawał się być dłuższy, gdy pierwsze wykrycie CG nastąpiło wcześniej (Rycina 3A). Na przykład u jednego zwierzęcia (nr 1) spadek sygnału E2 wystąpił 3 dni po pierwszym wykryciu CG w 7. dniu (Tabela 4). Z kolei współwystępowanie pierwszego wykrycia CG i spadku sygnału E2 zaobserwowano u jednego zwierzęcia (nr 2) w 10. dniu. Zatem, choć pierwsze wykrycie CG i owulacja wystąpiły tego samego dnia u jednego z pięciu zwierząt, owulacja następowała w ciągu kilku dni po pierwszym wykryciu CG.

Zestaw do testu immunochromatograficznego na poziom CG u marmoszetek został zaprojektowany do badania moczu. Oznaczanie poziomu CG zazwyczaj towarzyszy wyznaczaniu poziomów P4/E2 z wykorzystaniem osocza krwi. Pomocne byłoby zastosowanie osocza krwi zamiast moczu w teście CG. Aby to sprawdzić, zbadano osocze krwi pozostałe po pomiarze poziomu P4/E2 w powyższych eksperymentach. Osocze krwi oraz mocz pobrano od czterech zwierząt w jednym z dni przeprowadzonych powyżej eksperymentów (dni badania zostały oznaczone podwójnymi gwiazdkami [**] w Tabela 4). W przypadku moczu dwoje z czterech zwierząt wykazało wyniki dodatnie (wyniki 5 i 3), a pozostałe dwa wyniki ujemne (wynik 1). Osocze krwi wykazało w zasadzie takie same wyniki jak mocz (Rysunek 3B). Silniejszy sygnał uzyskano przy użyciu osocza krwi. W związku z tym, w przypadku zastosowania osocza krwi, ocenę należy przeprowadzić przed upływem 10 minut, które są wyznaczone dla moczu.

Schemat procesu flebotomii przedstawiający identyfikację żyły i pobieranie krwi u zwierząt.
Rycina 1: Pobieranie krwi od marmosetów. (A) Do pobrania krwi wykorzystano urządzenie do unieruchomienia. (B) Górna część uda marmosety. (C) Trójkąt udowy i naczynia krwionośne. Tętnica udowa w obrębie trójkąta jest często widoczna i wykazuje pulsację. Niebieski kolor żyły udowej jest czasami widoczny w proksymalnej części trójkąta (wskazanej jako miejsce flebotomii). Węzły chłonne również wykazują niebieski kolor. Jednak węzły chłonne są ruchome, ponieważ są przytwierdzone do skóry. (D) Widok anatomiczny uda ueutanazowanego zwierzęcia. Wskazano tętnicę, żyłę oraz miejsce flebotomii. To samo zwierzę przedstawiono na rysunkach B-D. (E) Pobieranie krwi przy użyciu urządzenia do unieruchomienia. Przedstawiono pozycję trzymania nóg marmosety oraz proces pobierania krwi. (F) Pobieranie moczu od marmosety. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wahań hormonalnych: poziomy progesteronu i estradiolu podczas faz cyklu menstruacyjnego, zdarzenie owulacji.
Rysunek 2: Typowe wzorce poziomów P4, E2 i CG podczas cyklu jajnikowego u marmosetów. Oznaczono punkty czasowe iniekcji FSH, hCG i PGF2α. Linie przerywane przedstawiają oczekiwany wzorzec hormonalny po iniekcji PGF2α. Skróty: P4 = progesteron; E2 = estradiol; CG = gonadotropina kosmórkowa; FSH = hormon folikulostymulujący; hCG = ludzka gonadotropina kosmórkowa; PGF2α = prostaglandyna F2α. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres przedstawiający detekcję CG w czasie (dni); wyniki testów paskowych dla kontroli oraz analizy CG w moczu i krwi.
Rysunek 3: Oznaczenie poziomu CG w celu przewidzenia wystąpienia owulacji. (A) Możliwa zależność między pierwszym dniem detekcji CG (wynik > 1) a czasem do wystąpienia owulacji (spadek E2). (B) Osocze krwi może być wykorzystywane do immunochromatograficznych testów CG. Reprezentatywny wynik dla każdego poziomu oceny (góra). Wynik określono 10 min po naniesieniu próbki. Wynik 2 oznacza brak prążka w ciągu 5 min, ale pojawienie się prążka w ciągu 10 min. Pobranie krwi wykonano krótko po pobraniu moczu. Zbadano cztery marmosety (nr 1, 2, 3, 5 w Tabeli S4). Próbki użyte w tym badaniu są oznaczone podwójnymi gwiazdkami w Tabeli 4. Osocze krwi rozcieńczono do 50% za pomocą buforu rozcieńczającego stosowanego do pomiaru E2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Czas trwania fazy pęcherzykowej i lutealnej. Fazę określono na podstawie poziomu P4 (faza pęcherzykowa P4 ≤ 8, faza lutealna P4 > 8). W przypadku zaobserwowania zmiany fazy pomiędzy pomiarami, punkt zmiany wyznaczono jako punkt środkowy między datami pomiarów. Odstęp czasu między dwoma punktami zmiany uznano za fazę pęcherzykową lub lutealną. Aby zapewnić pomiar czasu trwania pojedynczej fazy, do analiz nie wykorzystano danych z długim interwałem (≥7 dni) lub dwoma interwałami ≥6 dni w tej samej fazie, w tym w przypadku obejmowania dwóch faz. Dane wykorzystano wyłącznie wtedy, gdy wykonano dwa pomiary w tej samej fazie.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Wyniki pomiarów P4 i E2 przez 38 dni u jednego marmoseta.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Wyznaczenie i przewidywanie dni owulacji. Przyjęto, że oznaki owulacji są obecne, jeśli w jajnikach zaobserwowano miejsca krwawienia lub miejsca pęknięcia. Oocyte/zygote wskazuje stadia oocytu/zygoty uzyskane z jajowodów w dniu spadku poziomu E2.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Zlokalizowanie żyły jest najważniejszym krokiem w pobieraniu krwi. Opierając się na obserwacjach anatomicznych, protokół ten wprowadza obszar proksymalny w trójkącie udowym jako łatwe miejsce do pobrania krwi u marmozet. Korzystając z tego obszaru, można łatwo pobrać próbki krwi z dużej żyły. Jednak nawet przy użyciu tego protokołu czasami dochodzi do uszkodzenia tętnicy. W przypadku uszkodzenia tętnicy sugeruje się całkowite zatrzymanie krwawienia poprzez ucisk przez >5 minuty, aby zapobiec krwiakowi. Ponadto, podczas wywierania nacisku, skuteczne jest również chłodzenie punktowego miejsca za pomocą kostki lodu. Krwiaki można leczyć heparyną (np. Tensolvet 5.000 I.E. żel). Większość krwiaków znika po 3-4 kolejnych dniach leczenia heparyną i 0,05 ml meloksykamu (0,5 mg/ml, p.o.). Tętnica biegnie bocznie do żyły w bliższej części uda. W obszarze dystalnym żyła i tętnica wydawały się bliższe sobie i w większym stopniu zachodziły na siebie, przy czym tętnica znajdowała się brzusznie do żyły. Opierając się na tej zależności położenia, pobieranie krwi z bliższego obszaru uda prawdopodobnie zmniejsza ryzyko uszkodzenia tętnic.

Ponadto żyła udowa w okolicy bliższej jest gruba i położona powierzchownie, co pozwala na łatwą lokalizację za pomocą igły. Jednak pobieranie krwi z obszaru dystalnego ma tę zaletę, że pozostawia nienaruszone miejsca proksymalne, co pozwala na natychmiastowe powtórzenie nakłucia żyły z bliższego obszaru tej samej nogi, nawet jeśli żyła zostanie uszkodzona podczas pobierania krwi. Dzieje się tak, ponieważ dystalny obszar uszkodzonego miejsca jest zwykle niedostępny do natychmiastowego nakłucia żyły. Jeśli jednak pobranie krwi nie powiedzie się, można powtórzyć pobieranie próbek z miejsca proksymalnego na drugiej nodze.

Objętość krwi krążącej w marmozetach wynosi ~25 ml (70 ml/kg)23. Marmozeta o wadze 350 g potrzebuje 1 tygodnia, aby dojść do siebie po pobraniu 2 ml krwi, co odpowiada 7,5% całkowitej objętości krwi6. Z żył udowych można bez trudu pobrać 500-700 μl krwi. Gdy konieczne jest powtórzenie pobierania próbek, zaleca się pobranie mniejszych ilości krwi i użycie buforu rozcieńczającego do analizatora automatycznego.

Chociaż znieczulenie na ogół nie jest stosowane do pobierania próbek, dla początkujących pobieranie krwi od znieczulonych zwierząt może być znacznie łatwiejsze niż od zwierząt przytomnych. Należy jednak zachować ostrożność podczas stosowania znieczulenia do pobierania krwi, ponieważ znieczulenie może wpływać na zmierzone wartości składników krwi. W odniesieniu do pomiarów hormonalnych w celu określenia etapu cyklu jajnikowego stwierdzono, że alfakssam powodował nieoczekiwanie wyższe poziomy P424. Było to spowodowane reaktywnością krzyżową przeciwciała anty-P4 wobec alfaksonu, który jest pochodną P4.

Struktury P4 i E2 (hormonów steroidowych) są identyczne u ludzi i marmozet. Dostępne są zatem komercyjne zestawy ELISA dla ludzi P4 i E2 dla marmozet P4 i E2. Dostępne są również usługi outsourcingowe w zakresie pomiaru hormonów krwi ludzkiej. Natomiast istnieją niewielkie różnice w sekwencjach aminokwasów dla hormonów polipeptydowych, takich jak FSH, CG i inhibina. W przypadku tych hormonów polipeptydowych, jeśli zestaw może być używany zarówno dla ludzi, jak i innych ewolucyjnie odległych gatunków, takich jak myszy, będzie działał również dla marmozet. Do pomiaru inhibiny B można użyć zestawu do testowania immunoenzymów inhibiny B u ludzi/myszy/szczurów (podjednostka beta B).

Wzrost poziomu P4 jest cechą charakterystyczną owulacji (przejścia z fazy folikularnej do lutealnej). Chociaż różnice między osobami utrudniają określenie daty owulacji na podstawie samego poziomu P4, poziom P4 wynoszący >8 ng / ml może być używany jako przybliżony wskaźnik występowania owulacji. Bardziej wiarygodnym wskaźnikiem daty owulacji jest spadek poziomu E2 3,17. Owulowane oocyty/zygoty rzeczywiście obserwowano w jajowodach w dniu spadku E2 (Tabela 4). W ten sposób pomiar E2 pozwala nam określić dokładną datę owulacji. Oprócz poziomu hormonów, informacja o liczbie dni po podaniu PGF2α jest predyktorem dnia owulacji (tab. 4). Podobnie, skojarzone stosowanie poziomów P4 i E2 pomaga określić czas przejścia do fazy folikularnej, kiedy poziomy P4 dramatycznie spadają, a poziomy E2 są najniższe.

U marmozet CG, zamiast LH, jest uwalniany z przysadki mózgowej w celu wywołania owulacji. Dodatkowo CG jest wydalany z komórek trofoblastu, gdy zarodki przyczepiają się do endometrium i zagnieżdżają się w nim. Ponieważ marmozety nie mają funkcjonalnego genu LH , CG, zamiast LH, jest uwalniany z przysadki mózgowej w celu stymulacji owulacji5. Badanie wykazało, że szczyty E2 i CG, wskazujące na owulację, obserwuje się tego samego dnia12. Inne badanie wykazało, że średnio szczyty E2 (8,6 dnia po podaniu PGF2α) poprzedzają szczyty CG (9,3 dnia po podaniu PGF2α)25, co wskazuje, że owulacja może wystąpić przed osiągnięciem szczytów CG. CG, w przeciwieństwie do E2, jest uwalniany impulsowo tuż przed swoim szczytem. Impulsowe uwalnianie CG rozpoczyna się średnio ~1 dzień przed szczytem. Zaobserwowano jednak dużą różnicę w czasie trwania od pierwszego wykrycia poziomu CG do spadku poziomu E2 (ryc. 3A i tabela 4). Ponadto CG jest po raz pierwszy wykrywany zarówno w próbkach porannych, jak i popołudniowych25.

O ile nam wiadomo, nie ma doniesień o owulacji u marmozet występującej o określonej porze dnia. Ponadto marmozety zwykle uwalniają dwie lub trzy oocyty jednocześnie, więc może istnieć pewien okres, w którym wszystkie oocyty są uwalniane. Ponieważ podwyższony poziom CG występuje przed owulacją, pomiar CG umożliwia przewidzenie daty owulacji z wyprzedzeniem. Takie informacje są szczególnie przydatne przy pobieraniu oocytów MII lub zarodków dnia 0 w dniu owulacji. Dlatego przydatny jest kombinatoryczny pomiar poziomów P4 / E2 i poziomów CG we krwi (ryc. 3B). U większości gatunków naczelnych, w tym u ludzi, owulacja nie występuje przez jakiś czas po porodzie. Jednak owulacja poporodowa występuje u marmozet ~10 dni po porodzie. W związku z tym następna dostawa jest często obserwowana ~155 dni po poprzedniej dostawie. Ta sekwencyjna ciąża, wraz z urodzeniem bliźniąt, skutkuje wysokim poziomem płodności marmozet.

Wahania hormonalne różnią się u poszczególnych osób, a niektóre nie mają stałego cyklu. Niektóre samice marmozet wykazują stały niski poziom P4/E2, co wskazuje na brak owulacji. Brak cyklu owulacyjnego można przypisać niedojrzałości, problemom zdrowotnym, stresowi lub zahamowaniu owulacji przez dominujące samice reprodukcyjne26,27. Trzy z 21 marmozet (>2-letnie) mierzących poziom hormonów wykazały brak regularnego cyklu owulacyjnego w placówce autora. Zrozumienie przyczyn i opracowanie odpowiednich metod leczenia umożliwi skuteczniejsze wykorzystanie zwierząt w eksperymentach. Obserwowano osoby z przedłużoną fazą lutealną o ~1 miesiąc i związanym z nią wysokim poziomem P42. W placówce autora przedłużona faza lutealna powtarza się u tych samych osób. Dwie z 21 marmozet wykazywały tę nieprawidłowość. Jedno z dwóch zwierząt było trzymane w jednym pomieszczeniu, co wyklucza możliwość, że zwierzę było w ciąży podczas przedłużonej fazy lutealnej. Druga jest sparowana z przypuszczalnie bezpłodnym mężczyzną przez radioterapię, a zatem jest mało prawdopodobne, aby zaszła w ciążę podczas przedłużonej fazy lutealnej. Nawet w przedłużonej fazie lutealnej podanie PGF2α obniża poziom P4 i resetuje cykl jajnikowy. Pomiar hormonów płciowych i zrozumienie stanu cyklu owulacyjnego pomaga w efektywnym wykorzystaniu zwierząt w eksperymentach i hodowli.

Pobieranie próbek krwi od osób jest wykorzystywane nie tylko do oszacowania daty owulacji, ale także do testów serologicznych w celach diagnostycznych. Podobnie pomiar poziomu hormonów służy nie tylko do szacowania dnia owulacji, ale także do badania interakcji społecznych, rozwoju dziecka i chorób. W przyszłości, do produkcji genetycznie modyfikowanych marmozet, oczekuje się, że jajniki i jądra zostaną wyhodowane z komórek iPS. Odpowiedni poziom hormonów powinien być ważny dla prawidłowego rozwoju. Opisany tutaj protokół będzie przydatny do pomiaru i kontroli hormonów płciowych do wytwarzania gonad pochodzących z komórek iPS w marmozetach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto i Mikiko Horigome za ich wsparcie w ustanowieniu tego protokołu i w codziennej opiece nad marmozetami; Takayuki Mineshige za komentarze do manuskryptu; Yukiko Abe i członkom laboratorium Aiba za dzielenie się technikami zbierania zygoty; CIEA za dzielenie się informacjami na temat hodowli marmozet i eksperymentów, które uprawiają przez ponad 40 lat. Badania te były wspierane przez AMED, JST i KAKENHI w ramach grantów nr JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 i JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 i 22K18356 (KAKENHI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AIA-360Tosoh Corporation0019945Pomiar hormonów (P4/E2)
AIA-PACK KONCENTRAT ROZCIEŃCZALNIKATosoh Corporation0020956Pomiar hormonów (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET IITosoh Corporation0020968Pomiar hormonów (P4/E2)
AIA-PACK KONCENTRAT DO PRANIATosoh Corporation0020955Pomiar hormonów (P4/ E2)
CMS-1CLEA JaponiaMarmozeta Żywność
EstrumateMSD ZdrowieAnalog PGF2alpha (kloprostenol)
Gonal-f Wstrzyknięcie podskórne 150Merck Biopharma Co., Ltd.
FSH Gonatropina do wstrzykiwań domięśniowych 1000ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.872413hCG
Heparyna sodowa roztwór do wstrzykiwań 5,000 jednostek/5 mlMochida Pharmaceutical Co., Ltd.224122458Zestaw
testów immunochromatograficznych do pobierania krwi do wykrywania gonadotropiny kosmówkowej marmozety (Dual Checker)CLEA Japan, Inc.Określanie poziomu CG
Niskoprofilowe oświetlenie mikroskopu dwuramiennego LPF-SDSHIOKAZE GIKENLampa biurkowa do pobierania krwi
Urządzenie ograniczające pobieranie krwi MarmozetaJIC JaponiaJM-1006Pobieranie krwi
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
e-mail: vi@jic-japan.jp
Metacam 0,05%Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.Leczenie krwiaków
Kubek na próbkę, 3 mL, PS, do Tosoh 360 i AIA-600 II, 1000/worekGlobe Scientific110913Pomiar hormonów (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2Tosoh Corporation0025224Pomiar hormonów (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 ZESTAW KALIBRATORÓWTosoh Corporation0025324Pomiar hormonów (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 ROZTWÓR DO ROZCIEŃCZANIA PRÓBKITosoh Corporation0025524Pomiar hormonów (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIIITosoh Corporation0025240Pomiar hormonów (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII ZESTAW KALIBRACYJNYTosoh Corporation0025340Pomiar hormonów (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII ROZTWÓR DO ROZCIEŃCZANIA PRÓBKITosoh Corporation  0025540Pomiar hormonów (P4/E2)
Strzykawka z igłą 25 G (0,50 x 25 mm)TERUMOSS-01T2525Pobieranie krwi
Tensolvet 5.000 I.E. żel.Dechra Pharmaceuticals14033492Leczenie krwiaków
TOSOH MULTI-CONTROL SETTosoh Corporation0015965Pomiar hormonów (P4/E2)
zwierząt

Bibliografia

  1. Kholkute, S. D. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). Primates. 25 (1), 123-126 (1984).
  2. Harding, R. D., Hulme, M. J., Lunn, S. F., Henderson, C., Aitken, R. J. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Med Primatol. 11 (1), 43-51 (1982).
  3. Gilchrist, R. B., Wicherek, M., Heistermann, M., Nayudu, P. L., Hodges, J. K. Changes in follicle-stimulating hormone and follicle populations during the ovarian cycle of the common marmoset. Biol Reprod. 64 (1), 127-135 (2001).
  4. Gromoll, J., et al. A new subclass of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor lacking exon 10 messenger RNA in the New World monkey (Platyrrhini) lineage. Biol Reprod. 69 (1), 75-80 (2003).
  5. Müller, T., et al. Chorionic gonadotrophin beta subunit mRNA but not luteinising hormone beta subunit mRNA is expressed in the pituitary of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Mol Endocrinol. 32 (1), 115-128 (2004).
  6. Pacchiarotti, A., et al. Ovarian stimulation protocol in IVF: an up-to-date review of the literature. Curr Pharm Biotechnol. 17 (4), 303-315 (2016).
  7. Ezcurra, D., Humaidan, P. A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology. Reprod Biol Endocrinol. 12, 95(2014).
  8. Lopez-Gatius, F. Ovarian response to prostaglandin F(2alpha) in lactating dairy cows: A clinical update. J Reprod Dev. 68 (2), 104-109 (2022).
  9. Marini, R. P., Wachtman, L. M., Tardif, S. D., Mansfield, K., Fox, J. G. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , Elsevier Science. (2018).
  10. Schultz-Darken, N. J. Sample collection and restraint techniques used for common marmosets (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 360-363 (2003).
  11. Hopper, J. Common marmosets. Handbook of Exotic Pet. Kubik, M. , 27-42 (2020).
  12. Harlow, C. R., Hearn, J. P., Hodges, J. K. Ovulation in the marmoset monkey: endocrinology, prediction and detection. J Endocrinol. 103 (1), 17-24 (1984).
  13. Ludlage, E., Mansfield, K. Clinical care and diseases of the common marmoset (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 369-382 (2003).
  14. Summers, P. M., Wennink, C. J., Hodges, J. K. Cloprostenol-induced luteolysis in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). J Reprod Fertil. 73 (1), 133-138 (1985).
  15. Takahashi, T., et al. Birth of healthy offspring following ICSI in in vitro-matured common marmoset (Callithrix jacchus) oocytes. PLoS One. 9 (4), e95560(2014).
  16. Tomioka, I., Takahashi, T., Shimada, A., Yoshioka, K., Sasaki, E. Birth of common marmoset (Callithrix jacchus) offspring derived from in vitro-matured oocytes in chemically defined medium. Theriogenology. 78 (7), 1487-1493 (2012).
  17. Abe, Y., et al. Efficient marmoset genome engineering by autologous embryo transfer and CRISPR/Cas9 technology. Sci Rep. 11 (1), 20234(2021).
  18. Summers, P. M., Shephard, A. M., Taylor, C. T., Hearn, J. P. The effects of cryopreservation and transfer on embryonic development in the common marmoset monkey, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 79 (1), 241-250 (1987).
  19. Thomson, J. A., Kalishman, J., Hearn, J. P. Nonsurgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset. J Med Primatol. 23 (6), 333-336 (1994).
  20. Hanazawa, K., et al. Minimally invasive transabdominal collection of preimplantation embryos from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Theriogenology. 78 (4), 811-816 (2012).
  21. Ishibashi, H., et al. Efficient embryo transfer in the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) with a reduced transfer volume: a non-surgical approach with cryopreserved late-stage embryos. Biol Reprod. 88 (5), 115(2013).
  22. Kishimoto, K., et al. Establishment of novel common marmoset embryonic stem cell lines under various conditions. Stem Cell Res. 53, 102252(2021).
  23. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  24. Daskalaki, M., Drummer, C., Behr, R., Heistermann, M. The use of alfaxalone for short-term anesthesia can confound serum progesterone measurements in the common marmoset: a case report. Primate Biol. 9 (2), 23-28 (2022).
  25. Hodges, J. K., Cottingham, P. G., Summers, P. M., Liang, Y. N. Controlled ovulation in the marmoset monkey (Callithrix jacchus) with human chorionic gonadotropin following prostaglandin-induced luteal regression. Fertil Steril. 48 (2), 299-305 (1987).
  26. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Extension of reproductive suppression by pheromonal cues in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 90 (2), 411-418 (1990).
  27. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Sensory cues and the suppression of reproduction in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 97 (1), 301-310 (1993).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozr d u tamarynpoziomy hormon w p ciowychpomiar progesteronupomiar estradiolugonadotropina ch oniowapobieranie krwi z y y udowejgenetycznie zmodyfikowane tamaryny
Pobieranie próbek krwi i pomiar hormonów w celu określenia etapu cyklu jajnikowego u marmozet
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.