Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66697

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Clinical Center of Biotherapy at Zhongshan Hospital, Fudan University, 3Department of Oncology and Bio-therapeutic Center, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology, 4Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół generowania i funkcjonalnej weryfikacji wrażliwych na niedotlenienie komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T. Protokół ten przedstawia generację wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T opartą na lentiwirusie i ich charakterystykę, w tym walidację zależnej od hipoksji ekspresji CAR i selektywnej cytotoksyczności.

Streszczenie

Obszerne badania dowiodły obietnicy terapii komórkami T (Car-T) z chimerycznym receptorem antygenowym w leczeniu nowotworów hematologicznych. Jednak leczenie guzów litych pozostaje wyzwaniem, czego przykładem są obawy dotyczące bezpieczeństwa, które pojawiają się, gdy komórki CAR-T atakują normalne komórki wykazujące ekspresję docelowych antygenów. Naukowcy badali różne podejścia mające na celu zwiększenie selektywności nowotworów w terapii komórkami CAR-T. Jedną z reprezentatywnych strategii w tej linii jest budowa wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, które są zaprojektowane przez fuzję zależnej od tlenu domeny degradacji z ugrupowaniem CAR i są opracowane tak, aby osiągnąć wysoką ekspresję CAR tylko w niedotlenionym środowisku - mikrośrodowisku guza (TME). W pracy przedstawiono protokół generowania takich komórek CAR-T i ich charakterystykę funkcjonalną, w tym metody analizy zmian ekspresji CAR i zdolności zabijania w odpowiedzi na różne poziomy tlenu ustalone przez mobilną komorę inkubatora. Oczekuje się, że skonstruowane komórki CAR-T wykażą ekspresję CAR i cytotoksyczność w sposób wrażliwy na tlen, wspierając w ten sposób ich zdolność do odróżniania niedotlenionych TME od normalnych tkanek normoksyjnych w celu selektywnej aktywacji.

Wprowadzenie

Terapia limfocytami T z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR-T) stanowi znaczący przełom w leczeniu raka. Odkąd Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła pierwszą terapię CAR-T do leczenia zaawansowanego/opornego chłoniaka i ostrej białaczki limfoblastycznej w 2017 roku1,2,3, 10 terapii CAR-T ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA) otrzymało zatwierdzenie na całym świecie4. Jednak pomimo szeroko zakrojonych badań, odtworzenie niezwykłej skuteczności terapii CAR-T w leczeniu nowotworów hematologicznych pozostaje wyzwaniem ze względu na jej zastosowanie w guzach litych5,6,7,8.

Immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do słabej skuteczności CAR-T w leczeniu guzów litych. TME utrudnia aktywność i przetrwanie komórek CAR-T z powodu niewystarczającej ilości składników odżywczych, niedotlenienia, kwaśnego pH i nagromadzenia odpadów metabolicznych9,10,11,12. Dalsza wrogość wynika z infiltracji komórek immunosupresyjnych, takich jak limfocyty T regulatorowe (Treg), komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM), które wraz z komórkami nowotworowymi wydzielają cytokiny immunosupresyjne, które powodują dodatkowe hamowanie komórek CAR-T po wejściu do guza13,14.

Oprócz niezadowalającej skuteczności terapeutycznej, kwestie bezpieczeństwa są kolejną piętą achillesową komórek CAR-T w przypadku guzów litych15,16. Obawy dotyczące bezpieczeństwa wynikają z faktu, że żaden z dotychczas zidentyfikowanych antygenów specyficznych dla nowotworu (TSA) nie jest ściśle ograniczony do komórek nowotworowych. Innymi słowy, antygeny związane z nowotworem (TAA) wybrane jako cel CAR, chociaż wykazują wyższą ekspresję w komórkach nowotworowych, często są również wyrażane przez normalne tkanki17. Nieoczekiwana aktywacja komórek CAR-T po skutecznym rozpoznawaniu normalnych tkanek przez CAR może zatem powodować efekty pozanowotworowe, co prowadzi do zespołu uwalniania cytokin (CRS), zespołu encefalopatii związanej z CAR-T (CRES)18 i innych niekorzystnych wyników19.

Rozważano wiele strategii unikania takich efektów, w tym zmniejszenie powinowactwa CAR, aby umożliwić komórkom CAR-T odróżnianie komórek nowotworowych od normalnych komórek na podstawie poziomów ekspresji docelowego TAA; wyposażenie komórek CAR-T w wyłącznik, taki jak gen samobójczy lub marker eliminacji, aby promować ich eliminację po nieoczekiwanej aktywacji; podział sygnałów CD3ζ i sygnałów kostymulujących na dwie grupy CAR, których równoczesne zaangażowanie jest w związku z tym wymagane do skutecznej aktywacji komórek CAR-T; wykorzystując syntetyczny obwód oparty na Notch (synNotch), który ogranicza aktywność komórek CAR-T do komórek docelowych wykazujących współekspresję dwóch różnych TAA; oraz inżynieria komórek CAR-T w celu osiągnięcia czułości TME poprzez implementację mechanizmu dostrajania ekspresji CAR do zmieniających się sygnałów środowiskowych20,21,22,23,24,25,26.

Kluczowym czynnikiem w opcji czułości TME opisanej powyżej jest niski poziom tlenu w TME spowodowany szybką proliferacją komórek nowotworowych. Akomodacja komórek nowotworowych do niedotlenienia zależy od aktywacji czynnika indukowanego hipoksją-1 (HIF-1), heterodimerycznego czynnika transkrypcyjnego składającego się z indukowalnej podjednostki, HIF-1α i konstytutywnie wyrażonej podjednostki, HIF-1β27. W warunkach normoksyjnych białko HIF-1α ulega ubikwitynacji i szybkiej degradacji proteasomalnej, w zależności od jego zależnej od tlenu domeny degradacji (ODD)28. Kiedy komórkowy dopływ tlenu staje się ograniczony, HIF-1 jest stabilizowany i aktywuje transkrypcję swoich dalszych genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami odpowiedzi na niedotlenienie (HRE)29. Biorąc pod uwagę naturę ODD i HRE jako elementów wrażliwych na tlen, zbadano je w celu realizacji warunkowej ekspresji CAR w hipoksyjnym TME30. W tym miejscu przedstawiamy protokół skupiający się na metodach charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, poprzedzony krótkim opisem konstrukcji CAR i procedur przygotowania tych komórek. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do wykorzystania CAR reagującego na niedotlenienie do generowania komórek CAR-T o ograniczonej toksyczności poza guzem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym badaniu HER2-BBz-ODD, wrażliwy na hipoksję CAR nakierowany na HER2 (Gene ID: 2064), został porównany z jego standardowym odpowiednikiem, HER2-BBz. Schematy obu CAR przedstawiono na Rysunku 1A, który pokazuje, że HER2-BBz-ODD pochodzi z HER2-BBz poprzez dodanie sekwencji ODD do końca C-terminalnego CD3ξ. Konstrukcja wektorów lentiwirusowych ekspresujących oba CAR oraz generowanie odpowiedniego lentiwirusa poprzez transfekcję komórek 293T zostały opisane wcześniej31.

1. Generowanie komórek CAR-T wrażliwych na hipoksję poprzez infekcję lentiwirusową

  1. Szybko rozmroź kriokonserwowane ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś rozmrożone PBMCs do probówki 15 mL zawierającej 9 mL bezserwatkowej pożywki do hodowli limfocytów uzupełnionej o 400 IU IL-2, 5 ng/mL IL-7 oraz 10 ng/mL IL-15 (pożywka do wzrostu ludzkich limfocytów T, w dalszej części określana jako TGM).
  2. Po pobraniu alikwotu do policzenia komórek, odwiruj probówkę przy 300 × g przez 5 min. Resuspenduj osad PBMCs w TGM do gęstości 4 × 106 komórek/mL i przenieś zawiesinę do płytki 6-dołkowej.
  3. Przygotuj immunikule powlekane przeciwciałami anty-hCD3/hCD28.
    1. Przenieś 100 µL magnetycznych kulek z IgG mysim do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przemyj je 2 razy przy użyciu statywu magnetycznego w PBS.
    2. Resuspenduj kulki w 100 µL PBS i dodaj 0,2 µg przeciwciała mysiego anty-Human CD3 oraz 2 µg przeciwciała mysiego anty-Human CD28. Delikatnie wymieszaj zawiesinę pipetą i inkubuj na wytrząsac revealingu przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Przemyj kulki 2 razy przy użyciu statywu magnetycznego w PBS i resuspenduj je w 100 µL PBS.
  4. Dodaj immunikule powlekane anty-hCD3/hCD28 do płytki z kroku 1.2 w stosunku kulek do komórek 1:1. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Po 48 h inkubacji, delikatnie wymieszaj komórki pipetą i przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Umieść probówkę na statywie magnetycznym przez 3 min, a następnie ostrożnie przenieś nadsącz do nowej probówki 15 mL, aby oddzielić immunikule od PBMCs.
  6. Pobierz alikwot do policzenia komórek, a następnie wysiej PBMCs w gęstości 5 × 105 komórek/dołek w 300 µL TGM do płaskiej płytki 48-dołkowej. Do odpowiednich dołków dodaj 200 µL zapasu lentiwirusa oraz siarczan protaminy do stężenia końcowego 10 µg/mL.
  7. Odwiruj płytkę przy 1 000 × g w temperaturze 32 °C przez 1,5 h, a następnie ostrożnie usuń pipetą 300 µL nadsączu z każdego dołka. Następnie dodaj 1 mL świeżej TGM za pomocą pipety i umieść płytkę w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  8. Co 2-3 dni dodawaj świeżą TGM, aby dostosować gęstość komórek do poziomu 0,5-2 × 106 komórek/mL. Zacznij od przeniesienia komórek najpierw do płytki 12-dołkowej, a następnie do płytki 6-dołkowej. Kontynuuj hodowlę komórek, aż całkowita liczba osiągnie 6 × 106 w objętości 4 mL.
    UWAGA: Równolegle przeprowadź transdukcję CAR limfocytów T Jurkat zgodnie z opisanymi powyżej procedurami, z wyjątkiem tego, że TGM zastępuje się pożywką RPMI1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).

2. Ocena ekspresji CAR zależnej od tlenu w komórkach CAR-T przy użyciu cytometrii przepływowej

  1. Przenieś CAR-transdukowane limfocyty T z kroku 1.8 do dwóch płytek 12-dołkowych w gęstości 2,5 × 106 komórek/dołek w 2 mL TGM. Jedną płytkę umieść bezpośrednio w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C (warunki normoksji, ponieważ standardowe warunki hodowli komórek obejmują 21% O2), a drugą płytkę umieść w mobilnej komorze inkubacyjnej CO2/O2/N2 z ustawionym poziomem O2 na 1% (warunki hipoksji), a następnie umieść komorę w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO2/94% N2 w temperaturze 37 °C.
  2. Co 24 h zbieraj 5 × 105 komórek z płytek w warunkach hipoksji lub normoksji do probótek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Wirować probótki przy 500 × g przez 5 min, usunąć nadosad i delikatnie resuspendować komórki w 1 mL PBS poprzez pipetowanie. Powtórz płukanie w PBS jeszcze raz.
  3. Resuspenduj osad komórkowy w 50 µL buforu FACS (PBS uzupełniony o 2% FBS) w każdej probótce. Dodaj 50 µL rozcieńczenia 1:100 przeciwciała anty-Flag sprzężonego z PE (0,2 µg/mL) i dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie. Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min.
  4. Po zakończeniu inkubacji dodaj 1 mL buforu FACS do każdej probótki. Dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie, a następnie wiruj przy 500 × g przez 5 min.
  5. Ostrożnie usuń i odrzuć nadosad za pomocą pipety i powtórz krok 2.4 jeszcze raz.
  6. Ostrożnie usuń i odrzuć nadosad za pomocą pipety. Resuspenduj komórki w 200 µL buforu FACS, a następnie przenieś otrzymaną zawiesinę komórkową do probótek przepływowych o pojemności 5 mL.
  7. Wykonaj cytometrię przepływową zawiesiny komórkowej z kroku 2.6 w celu oznaczenia ekspresji CAR na powierzchni. Jako kontrolę negatywną wykorzystaj nietransdukowane limfocyty T.
    1. Użyj bram FSC/SSC oraz FSC-A/FSC-H do selekcji żywych pojedynczych komórek. Zbierz 1 × 104 żywych pojedynczych zdarzeń dla każdej próbki. Wyznacz bramkę dla komórek pozytywnych pod kątem EGFP (konstytutywnego markera zawartego w wektorze lentiwirusowym jako wskaźnika pomyślnie transdukowanych limfocytów T), a następnie dla komórek pozytywnych pod kątem fikoerytryny (PE) (komórek wykazujących ekspresję CAR), aby zmierzyć pozytywność PE oraz medianę intensywności fluorescencji (MFI).

3. Analiza zależności ekspresji CAR od tlenu w zmodyfikowanych komórkach T Jurkat z CAR metodą western blot

  1. Przenieś CAR-transdukowane komórki T Jurkat z sekcji 1 do dwóch płytek 48-dołkowych z gęstością 5 × 105 komórek na dołek (objętość hodowli 500 µL) w pożywce RPMI1640 z dodatkiem 10% FBS.
  2. Do jednej płytki dodaj CoCl2 do dołków eksperymentalnych do końcowego stężenia 0 µM, 50 µM lub 200 µM. Następnie umieść płytkę w inkubatorze z wilgotną komorą, 5% CO2 w temperaturze 37 °C (warunki normoksji). Do drugiej płytki nie dodawaj CoCl2 i umieść ją w mobilnej komorze inkubatora CO2/O2/N2 z poziomem O2 ustawionym na 1% (warunki hipoksji) przed przeniesieniem jej do tego samego inkubatora.
  3. Po 24 h inkubacji przenieś zawiesiny komórkowe do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Centryfuguj probówki przy 500 × g przez 5 min. Całkowicie usuń i odrzuć nadsączniki, najpierw używając pipety 1-mL, a następnie pipety 100 µL, i resuspenduj osady komórkowe w 50 µL 1x buforu do próbek SDS-PAGE.
  4. Ogrzewaj próbki w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 10 min. Natychmiast umieść probówkę na lodzie na 30 s, a następnie centryfuguj przy 16 000 × g przez 30 s.
  5. Nanieś 30 µL oczyszczonych próbek do każdego otworu 10% żelu SDS PAGE z 10 dołkami i grubością 1,5 mm. Prowadź elektroforezę przy 80 V przez 30 min, a następnie zwiększ napięcie do 100 V i prowadź przez 1,5 h.
  6. Po zakończeniu elektroforezy przenieś białka z żelu na membranę PVDF, stosując standardową metodę transferu mokrego, przy natężeniu prądu 400 mA i czasie transferu 1 h.
  7. Blokuj membranę w buforze blokującym (5% mleka (w/v) w PBST (PBS + 0,05% Tween-20)) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij fragment między 30 kD a 40 kD do detekcji kontroli ładowania GAPDH oraz fragment między 50 kD a 70 kD do detekcji cząsteczek CAR.
  8. Inkubuj fragmenty 30-40 kD i 50-70 kD odpowiednio z mysim przeciwciałem anty-GAPDH (rozcieńczenie 1:2 000) i mysim przeciwciałem anty-Flag (rozcieńczenie 1:2 000) w 3 mL buforu blokującego, albo w temperaturze pokojowej przez 2 h, albo w 4 °C przez noc.
  9. Przemywaj membrany PBST w temperaturze pokojowej na wstrząsarce platformowej 3 x 5 min.
  10. Inkubuj membrany z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w 3 mL buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 h; następnie przemyj membranę PBST 5 x 10 min.
  11. Wywołaj membrany, inkubując je z substratem HRP, a następnie zwizualizuj wykryte prążki białkowe za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu.

4. Ocena in vitro zależności cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki CAR-T wrażliwe na hipoksję od poziomu tlenu

  1. W dniu 0 wysiać 1 × 104 komórek docelowych (komórki SKOV3-Luc) na studzienkę eksperymentalną w 200 µL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS w dwóch czarnych 96-dołkowych płytkach hodowlanych z płaskim dnem.
  2. W dniu 1 ostrożnie usunąć 100 µL supernatantu z górnej części każdej studzienki. Dodać komórki CAR-T lub nieprzetransformowane komórki T w stosunkach efektor do celu 1:1, 2:1 i 4:1 w 100 µL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS.
  3. Jedną płytkę umieścić w atmosferze 21% O2 , a drugą w atmosferze 1% O2  przy użyciu mobilnej komory inkubacyjnej CO2/O2/N2, zgodnie z opisem w kroku 2.1.
    UWAGA: W przypadku braku mobilnej komory inkubacyjnej CO2/O2/N2, w celu symulacji warunków hipoksji można zastosować dodatek CoCl2 do pożywki hodowlanej.
  4. W dniu 2, po 24 h kokultury, ostrożnie przenieść cały supernatant (około 150-200 µL) do nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U za pomocą pipety. Przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej detekcji cytokin, zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 5.
  5. Do każdej studzienki eksperymentalnej czarnych 96-dołkowych płytek z płaskim dnem z kroku 4.4 dodać 60 µL 1x buforu do lizy pasywnej. Następnie umieścić płytki na wytrząsarce i inkubować przez 30 min w celu zapewnienia efektywnej lizy komórek.
  6. Do każdej studzienki eksperymentalnej dodać 60 µL substratu lucyferazy świetlikowej i natychmiast zmierzyć aktywność lucyferazy za pomocą czytnika mikropłytek.
  7. Obliczyć znormalizowaną cytotoksyczność (%) korzystając z równania (1):
    Znormalizowana cytotoksyczność (%) = 100 - figure-protocol-1 ×100    (1)

5. Wykrywanie sekrecji IL-2 i IFN-γ przez komórki CAR-T wrażliwe na hipoksję

  1. W dniu 0 przygotować rozcieńczenie 1:250 przeciwciała wychwytującego IL-2 lub IFN-γ w buforze do powlekania. Do każdej studni płytki ELISA do 96 próbek dodać 100 µL rozcieńczonego przeciwciała i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Bufor do powlekania przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 7,13 g NaHCO3 i 1,59 g Na2CO3 w 1 L wody destylowanej i dostrojenie pH do 9,5.
  2. W dniu 1 usunąć niezaabsorbowane przeciwciało wychwytujące poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 3x za pomocą 200 µL buforu do mycia (PBS zawierający 0,05% Tween 20).
  3. Do każdej studni dodać 200 µL rozcieńczalnika do analizy (PBS zawierający 10% FBS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  4. Usunąć roztwór poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 3x za pomocą 200 µL buforu do mycia.
  5. Rozmrozić w temperaturze pokojowej mrożone próbki supernatantu/płytkę z kroku 4.4. Po całkowitym rozmrożeniu rozcieńczyć próbki i standardy rozcieńczalnikiem do analizy. Do każdej studni powlekanej płytki ELISA dodać 100 µL rozcieńczonych próbek lub standardów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 h.
    UWAGA: W przypadku detekcji IL-2 zaleca się 10-krotne rozcieńczenie, natomiast dla detekcji IFN-γ preferowane jest 50-krotne rozcieńczenie.
  6. Usunąć próbki i standardy poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 5x za pomocą 200 µL buforu do mycia na studnię.
  7. Przygotować roboczy roztwór detekcyjny, rozcieńczając przeciwciało detekcyjne IL-2 lub przeciwciało detekcyjne IFN-γ/streptawidynę-HRP (SAv-HRP) w stosunku 1:250 w rozcieńczalniku do analizy. Do każdej studni dodać 100 µL roboczego roztworu detekcyjnego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 h przy łagodnym wstrząsaniu.
  8. Usunąć roztwór i przemyć studnie 7x za pomocą 200 µL buforu do mycia.
  9. Do każdej studni dodać 100 µL odczynnika substratowego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemności.
  10. Do każdej studni dodać 50 µL roztworu zatrzymującego (1 M H2SO4). Bezzwłocznie zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikroplatek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Połączenie domeny ODD białka HIF-1α z częścią CAR stanowi główną strategię generowania CAR wrażliwego na hipoksję. Analizowany w niniejszym badaniu CAR skierowany przeciwko HER2, wrażliwy na hipoksję i nazwany HER2-BBz-ODD, został skonstruowany przy użyciu tej strategii poprzez zintegrowanie sekwencji ODD z konwencjonalnym HER2-BBz (Rysunek 1A). W badaniu tym zastosowano transdukcję lentiwirusową w celu ekspresji CAR HER2-BBz-ODD lub CAR HER2-BBz, a następnie zbadano ich wrażliwość na tlen w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obawy dotyczące bezpieczeństwa są istotnymi kwestiami, które należy rozwiązać, aby jakakolwiek terapia komórkami CAR-T mogła przejść do użytku klinicznego. Wykorzystanie unikalnych właściwości komórek nowotworowych lub TME stało się głównym kierunkiem badań koncentrujących się na rozwoju komórek CAR-T, które selektywnie atakują tkanki nowotworowe. Zaprojektowanie wrażliwego na niedotlenienie CAR-T jest atrakcyjną strategią w tym kierunku, z kilkoma badanymi podejściami, w tym tym tym przedstawionym w tym badaniu - fuzją ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2016YFC1303402), Narodowego Megaprojektu Kluczowych Chorób Zakaźnych (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) oraz Programu Ogólnego Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (201740194).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml Probówka wirówkowaQSP509-GRD-QSupernatanty i cellekcja komórek
Protokół Krok 2,3,4
10% ExpressCast STRONANCM biotechP2012Protokół immunoblotting
Krok 3
10x PBSNCM biotech20220812Hodowla komórkowa
Protokół Krok 4
Pipeta 10 mlYueyibioYB-25HPipetowanie
Protokół Krok 1
10xTRIS-Glycine-SDS bufor do elektroforezyEpizyme3673020Immunoblotting
Protokół Krok 3
15 ml Probówka wirówkowaThermo Scientific339650Supernatanty i cellekcja komórek
Protokół Krok 1
25 cm2 EasYFlaskThermo Scientific156367Hodowla komórkowa
Protokół Krok 3,4
4x Białko SDS PAGE Bufor ładującyTakara9173Protokół immunoblottingu
Krok 3
6-dołkowe płytki do hodowli tkanek płaskodennychThermo Scientific140675T Cell Culture
Protokół Krok 1
96-dołkowe czarne płaskodenne płytki do hodowli tkankowychGreiner655090Test cytotoksyczności
Protokół Krok 4
96-dołkowe płytki ELISACorning3590Protokół ELISA
Krok 5
96-dołkowa wytrząsarka do płytekQILINBEIERMH-2Shake
Protokół Krok 4
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z dnem w kształcie litery UThermo Scientific268200Supernatants cellection
Protokół Krok 4,5
anty-FLAGSigmaF1804-50UGImmunoblotting
Protokół Krok 3
KarbinolProtokół Sinopharm10010061Immunoblotting
Krok 3
Inkubator dwutlenku węglaThermo Scientific360Hodowla komórkowa
Protokół Krok 1,2,3,4
Płytka do liczenia komórekHausser scientific1492Zliczanie komórek
Protokół Krok 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG KitThermo Scientific11531DKoraliki magnetyczne Mouse IgG
Protokół Krok 1
WirówkaThermo Scientific75002432Hodowla komórkowa
Protokół Krok 1,3,4
System obrazowania żelem chemiluminescencyjnymBIO-RAD12003154Protokół immunoblotting
Krok 3
Roztwór chlorku kobaltu (0,5 M)bioleaperBR4000203Stan niedotlenienia
Protokół Krok 2,3,4
DMEMCorning10-103- CVHodowla komórkowa
Protokół Krok 4
Waga elektronicznaSartoriusPRACTUM612-1CNważenie
Protokół Krok 5
FBSBI04-001-1ACSHodowla komórkowa
Protokół Krok 3,4
GAPDH MAb myszyABklonalnyAC002Protokół immunoblotting
Krok 3
Aparatura do elektroforezy żelowejBIO-RAD1645070Protokół immunoblottingu
Krok 3
Czytniki mikropłytek GloMaxPromegaGM3000
Protokół Krok 4
Kozia anty-mysia IgG (H+L)YeasenP1126151Immunoblotting
Krok 3
Wirówka do mikrozamrażania o dużej prędkościeppendorf5810  RHodowla komórkowa
Protokół Krok 1
Ludzki IFN-γ Zestaw ELISABD555142ELISA
Protokół Krok 5
Pozycje: Rekombinowany ludzki IFN-γ Liofilizowany standardowy, wykrywający przeciwciało biotyny anty-ludzkiej IFN-γ , Oczyszczony anty-ludzki IFN-&gamma odczynnik do wychwytywania przeciwciał, koniugat enzymatyczny Streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)
Ludzki zestaw testów ELISA IL-2BD555190ELISA
Krok protokołu 5
Elementy: Rekombinowany ludzki liofilizowany wzorzec IL-2, przeciwciało wykrywające biotyna anty-ludzka IL-2, przeciwciało wychwytujące oczyszczone anty-ludzkie IL-2, odczynnik enzymatyczny koniugat streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)
IL-15R& Systemy DP40933Hodowla limfocytów T
Protokół Krok 1
IL-21NovoproteinGMP-CC45Hodowla limfocytów T
Protokół Krok 1
IL-7R& Systemy DP13232Hodowla limfocytów T
Protokół Krok 1
Mikroskop odwróconyOlympusCKX41Hodowla komórkowa
Protokół Krok 1,3,4
JurkatATCCTIB-152CAR-Jurkat construction
Protokół Krok 3
LSRFortessaBDLSRFortessaCytometria przepływowa
Protokół Krok 2
Systemoznaczania lucyferazyTest reporterowy lucyferazy PromegaE1501
Protokół Krok 4
Przedmioty: Pasywny bufor do lizyzy, substrat lucyferazy świetlika
Czytnik mikropłytekProtokół BioTekHTXELISA
Krok 5
mobilny CO2/O2/N2 Komora inkubatoraInnovation Instrument Co., Ltd.Smartor118Stan niedotlenienia
Protokół Krok 2, 3, 4
Mysz Anti-Hexa Histidine tagSigmaSAB2702218Protokół immunoblotting
Krok 3
Bufor szybkiego transferu NcmBlotNCM biotechWB4600Immunoblotting
NcmECL UltraNCM biotechP10300Protokół immunoblottingu
Krok 3
Elementy: Odczynnik NcmECL Ultra Luminol/Enhancer (A), Ultra stabilizowany odczynnik nadtlenkowy NcmECL (B) 
Powlekane NovoNectin 48-dołkowe płaskie płytkiNovoproteinGMP-CH38Budowa komórek CAR-T
Protokół Krok 1
Zestaw tabletek OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy)SigmaP9187Odczynnik substratowy
Protokół Krok 5
Przedmioty: Tabletka OPD (srebrna folia), tabletka nadtlenku wodoru mocznika (złota folia)
Anty-DYKDDDDK anty-sprzężony z PEBiolegend637310Cytometria przepływowa
Protokół Krok 2
Siarczan protaminySigmaP3369-1OGZakażenie lentiwirusem
Protokół Krok 1
Marker białkowy 10 Kda-250 KDaEpizymeWJ102Immunoblotting
Protokół Krok 3
  Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD3BD566685limfocytów T
Krok 1
Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD28BD555725Protokół
Krok 1
Membrana PVDFMillipore168627Protokół immunoblotting
Krok 3
RPMI 1640Corning10-040-CVRCHodowla komórkowa
Protokół Krok 3
Odtłuszczone mleko w proszkuYeasenS9129060Protokół immunoblottingu
Krok 3
SKOV3-LucATCCHTB-77
Protokół Krok 4
Trypsyna-EDTANCM biotechC125C1Hodowla komórkowa
Protokół Krok 4
Animacja 20Sinopharm30189328Protokół immunoblotting
Krok 3 Łaźnia
wodnakeelreinNB014467Heating
Protokół Krok 1
X-VIVO 15 LONZA04-418QPożywka do hodowli limfocytów bez surowicy
Protokół Krok 1
przeciwciało Pomiar aktywności lucyferazy China Protokół hodowli Test cytotoksyczności

Bibliografia

  1. Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
  2. Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
  3. Barsan, V., et al. Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns. eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).
  4. Liu, Y., et al. Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy. Front Oncol. 12, 1037934(2022).
  5. Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response. Front Immunol. 12, 748768(2021).
  6. Li, N., et al. Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway. Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).
  7. Derenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218(2019).
  8. Fu, R., et al. Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors. Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).
  9. Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors. Cells. 11 (22), 3626(2022).
  10. Liu, Z., et al. Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy. Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).
  11. Luo, Z., et al. Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).
  12. Martinez, M., Moon, E. K. CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment. Front Immunol. 10, 128(2019).
  13. Zhang, X., et al. The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma. Front Immunol. 13, 1003651(2022).
  14. Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets. J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).
  15. Wu, Y., et al. Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety. APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).
  16. Al-Haideri, M., et al. cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment. Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).
  17. Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  18. Neelapu, S. S., et al. Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).
  19. Mi, J., Ye, Q., Min, Y. Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors. Front Immunol. 13, 849759(2022).
  20. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  21. Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity. Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).
  22. Dana, H., et al. CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors. Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).
  23. Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment. Front Oncol. 10, 1362(2020).
  24. Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management. Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).
  25. Flugel, C. L., et al. Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).
  26. Rababah, F., et al. Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors. Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).
  27. Masoud, G. N., Li, W. Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).
  28. Semenza, G. L. Targeting hif-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).
  29. Harris, A. L. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
  30. Juillerat, A., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci Rep. 7, 39833(2017).
  31. Liao, Q., et al. Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing. Biomark Res. 8 (1), 56(2020).
  32. Ivan, M., et al. Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing. Science. 292 (5516), 464-468 (2001).
  33. Wang, G. L., Semenza, G. L. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).
  34. D'alonzo, R. A., et al. In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review. Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).
  35. He, H., et al. Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy. J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).
  36. Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).
  37. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel. Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Komórki CAR TCAR wrażliwy na hipoksjęmikrośrodowisko guzaguzy liteimmunoterapia nowotworówdegradacja zależna od tlenuekspresja CARtest cytotoksycznościmodel hipoksjiselektywność nowotworowa
Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.