Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Summary

Tutaj prezentujemy protokół generowania i funkcjonalnej weryfikacji wrażliwych na niedotlenienie komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T. Protokół ten przedstawia generację wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T opartą na lentiwirusie i ich charakterystykę, w tym walidację zależnej od hipoksji ekspresji CAR i selektywnej cytotoksyczności.

Abstract

Obszerne badania dowiodły obietnicy terapii komórkami T (Car-T) z chimerycznym receptorem antygenowym w leczeniu nowotworów hematologicznych. Jednak leczenie guzów litych pozostaje wyzwaniem, czego przykładem są obawy dotyczące bezpieczeństwa, które pojawiają się, gdy komórki CAR-T atakują normalne komórki wykazujące ekspresję docelowych antygenów. Naukowcy badali różne podejścia mające na celu zwiększenie selektywności nowotworów w terapii komórkami CAR-T. Jedną z reprezentatywnych strategii w tej linii jest budowa wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, które są zaprojektowane przez fuzję zależnej od tlenu domeny degradacji z ugrupowaniem CAR i są opracowane tak, aby osiągnąć wysoką ekspresję CAR tylko w niedotlenionym środowisku - mikrośrodowisku guza (TME). W pracy przedstawiono protokół generowania takich komórek CAR-T i ich charakterystykę funkcjonalną, w tym metody analizy zmian ekspresji CAR i zdolności zabijania w odpowiedzi na różne poziomy tlenu ustalone przez mobilną komorę inkubatora. Oczekuje się, że skonstruowane komórki CAR-T wykażą ekspresję CAR i cytotoksyczność w sposób wrażliwy na tlen, wspierając w ten sposób ich zdolność do odróżniania niedotlenionych TME od normalnych tkanek normoksyjnych w celu selektywnej aktywacji.

Introduction

Terapia limfocytami T z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR-T) stanowi znaczący przełom w leczeniu raka. Odkąd Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła pierwszą terapię CAR-T do leczenia zaawansowanego/opornego chłoniaka i ostrej białaczki limfoblastycznej w 2017 roku^1,2,3, 10 terapii CAR-T ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA) otrzymało zatwierdzenie na całym świecie⁴. Jednak pomimo szeroko zakrojonych badań, odtworzenie niezwykłej skuteczności terapii CAR-T w leczeniu nowotworów hematologicznych pozostaje wyzwaniem ze względu na jej zastosowanie w guzach litych^5,6,7,8.

Immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do słabej skuteczności CAR-T w leczeniu guzów litych. TME utrudnia aktywność i przetrwanie komórek CAR-T z powodu niewystarczającej ilości składników odżywczych, niedotlenienia, kwaśnego pH i nagromadzenia odpadów metabolicznych^9,10,11,12. Dalsza wrogość wynika z infiltracji komórek immunosupresyjnych, takich jak limfocyty T regulatorowe (Treg), komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM), które wraz z komórkami nowotworowymi wydzielają cytokiny immunosupresyjne, które powodują dodatkowe hamowanie komórek CAR-T po wejściu do guza^13,14.

Oprócz niezadowalającej skuteczności terapeutycznej, kwestie bezpieczeństwa są kolejną piętą achillesową komórek CAR-T w przypadku guzów litych^15,16. Obawy dotyczące bezpieczeństwa wynikają z faktu, że żaden z dotychczas zidentyfikowanych antygenów specyficznych dla nowotworu (TSA) nie jest ściśle ograniczony do komórek nowotworowych. Innymi słowy, antygeny związane z nowotworem (TAA) wybrane jako cel CAR, chociaż wykazują wyższą ekspresję w komórkach nowotworowych, często są również wyrażane przez normalne tkanki¹⁷. Nieoczekiwana aktywacja komórek CAR-T po skutecznym rozpoznawaniu normalnych tkanek przez CAR może zatem powodować efekty pozanowotworowe, co prowadzi do zespołu uwalniania cytokin (CRS), zespołu encefalopatii związanej z CAR-T (CRES)¹⁸ i innych niekorzystnych wyników¹⁹.

Rozważano wiele strategii unikania takich efektów, w tym zmniejszenie powinowactwa CAR, aby umożliwić komórkom CAR-T odróżnianie komórek nowotworowych od normalnych komórek na podstawie poziomów ekspresji docelowego TAA; wyposażenie komórek CAR-T w wyłącznik, taki jak gen samobójczy lub marker eliminacji, aby promować ich eliminację po nieoczekiwanej aktywacji; podział sygnałów CD3ζ i sygnałów kostymulujących na dwie grupy CAR, których równoczesne zaangażowanie jest w związku z tym wymagane do skutecznej aktywacji komórek CAR-T; wykorzystując syntetyczny obwód oparty na Notch (synNotch), który ogranicza aktywność komórek CAR-T do komórek docelowych wykazujących współekspresję dwóch różnych TAA; oraz inżynieria komórek CAR-T w celu osiągnięcia czułości TME poprzez implementację mechanizmu dostrajania ekspresji CAR do zmieniających się sygnałów środowiskowych^{20,21,22,23,24,25,26}.

Kluczowym czynnikiem w opcji czułości TME opisanej powyżej jest niski poziom tlenu w TME spowodowany szybką proliferacją komórek nowotworowych. Akomodacja komórek nowotworowych do niedotlenienia zależy od aktywacji czynnika indukowanego hipoksją-1 (HIF-1), heterodimerycznego czynnika transkrypcyjnego składającego się z indukowalnej podjednostki, HIF-1α i konstytutywnie wyrażonej podjednostki, HIF-1β²⁷. W warunkach normoksyjnych białko HIF-1α ulega ubikwitynacji i szybkiej degradacji proteasomalnej, w zależności od jego zależnej od tlenu domeny degradacji (ODD)²⁸. Kiedy komórkowy dopływ tlenu staje się ograniczony, HIF-1 jest stabilizowany i aktywuje transkrypcję swoich dalszych genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami odpowiedzi na niedotlenienie (HRE)²⁹. Biorąc pod uwagę naturę ODD i HRE jako elementów wrażliwych na tlen, zbadano je w celu realizacji warunkowej ekspresji CAR w hipoksyjnym TME³⁰. W tym miejscu przedstawiamy protokół skupiający się na metodach charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, poprzedzony krótkim opisem konstrukcji CAR i procedur przygotowania tych komórek. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do wykorzystania CAR reagującego na niedotlenienie do generowania komórek CAR-T o ograniczonej toksyczności poza guzem.

Protocol

W tym badaniu, HER2-BBz-ODD, wrażliwy na niedotlenienie CAR ukierunkowany na HER2 (ID genu: 2064) został porównany ze swoim regularnym odpowiednikiem, HER2-BBz. Schematy obu CAR są zilustrowane w Rysunek 1A, który pokazuje, że HER2-BBz-ODD jest wyprowadzany z HER2-BBz przez dodanie sekwencji ODD do C-terminala CD3ξ. Budowa wektorów lentiwirusowych wykazujących ekspresję dwóch CAR i generowanie odpowiadającego im lentiwirusa przez transfekcję komórek 293T została wcześniej opisana³¹.

1. Wytwarzanie wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T przez zakażenie lentiwirusowe

1. Rozmrozić szybko kriokonserwowane ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Przenieś rozmrożone PBMC do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki do hodowli limfocytów bez surowicy, uzupełnionej 400 j.m. IL-2, 5 ng/ml IL-7 i 10 ng/ml IL-15 (pożywka wzrostu ludzkich limfocytów T, zwana dalej TGM).
2. Po pobraniu podwielokrotności do zliczania komórek, odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulowane PBMC z TGM o gęstości 4 × 10⁶ komórek/ml i przenieść zawiesinę do płytki 6-dołkowej.
3. Przygotować kulki immunologiczne pokryte anty-hCD3/hCD28.
   1. Przenieś 100 μl mysich kulek magnetycznych IgG do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umyj je 2 razy za pomocą podstawki magnetycznej z PBS.
   2. Zawiesić kulki w 100 μl PBS i dodać 0,2 μg mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD3 i 2 μg mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD28. Delikatnie wymieszać mieszaninę za pomocą pipety i rozdrabniać przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Umyj kulki 2 razy za pomocą podstawki magnetycznej z PBS i zawieś je ponownie w 100 μl PBS.
4. Dodać immunogranulki pokryte anty-hCD3/hCD28 do płytki w kroku 1.2 w stosunku kulek do komórek 1:1. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
5. Po 48 godzinach inkubacji przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml po delikatnym wymieszaniu komórek pipetą. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 3 minuty, a następnie ostrożnie przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby usunąć granulki immunologiczne z PBMC.
6. Pobrać podwielokrotność do zliczania komórek, a następnie wysiać PBMC w 5 × 10⁵ komórek/basenik w 300 μl TGM na 48-dołkową płaską płytkę. Dodać 200 μl lentiwirusa do odpowiednich studzienek i dodać siarczan protaminy do końcowego stężenia 10 μg/ml.
7. Odwirować płytkę w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 32 °C przez 1,5 godziny i ostrożnie usunąć i wyrzucić 300 μl supernatantu z każdej studzienki za pomocą pipety. Następnie dodać 1 ml świeżego TGM za pomocą pipety i umieścić płytkę w nawilżanym inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
8. Dodaj świeży TGM, aby dostosować gęstość komórek do 0,5-2 × 10⁶ komórek/ml co 2-3 dni. Zacznij od przeniesienia komórek najpierw na płytkę 12-dołkową, a następnie na płytkę 6-dołkową. Kontynuuj hodowlę komórek, aż całkowita liczba osiągnie 6 × 10⁶ w objętości 4 ml.
   UWAGA: Równolegle należy przeprowadzić transdukcję CAR limfocytów T Jurkat zgodnie z tymi samymi procedurami opisanymi powyżej, z wyjątkiem tego, że TGM RPMI1640 zastępuje się pożywką zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).

2. Ocena ekspresji CAR zależnej od tlenu w komórkach CAR-T za pomocą cytometrii przepływowej

1. Umieść komórki T transdukowane przez CAR z kroku 1,8 na dwie 12-dołkowe płytki o gęstości 2,5 × 10⁶ komórek/basenik w 2 ml TGM. Umieścić jedną płytkę bezpośrednio w nawilżanym inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C (warunki normoksyczne, ponieważ standardowe warunki dla komórek do hodowli mają 21% O_{2 ),} a drugą płytkę umieścić w mobilnej komorze inkubatora CO₂/O₂ / N₂ z poziomem O₂ ustawionym na 1% (stan niedotlenienia), a następnie utrzymywać komorę w nawilżonym miejscu, 5% CO₂ / 94% N₂ inkubator w temperaturze 37 °C.
2. Co 24 godziny należy pobrać od 5 × 10⁵ komórek z płytek w warunkach hipoksyjnych lub normoksyjnych do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówki o stężeniu 500 × g przez 5 minut, usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml PBS przez pipetowanie. Powtórz pranie PBS jeszcze raz.
3. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 50 μl buforu FACS (PBS uzupełniony 2% FBS) w każdej probówce. Dodać 50 μl przeciwciała anty-Flag sprzężonego z PE w stosunku 1:100 (0,2 μg/ml) i dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
4. Pod koniec inkubacji dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki. Dokładnie wymieszać pipetując, a następnie odwirować przy 500 × g przez 5 minut.
5. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety i powtórzyć krok 2.4 jeszcze raz.
6. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS, a następnie przenieść powstałą zawiesinę komórek do probówek przepływowych o pojemności 5 ml.
7. Wykonać cytometrię przepływową na zawiesinie komórek w kroku 2.6, aby określić powierzchniowe wyrażenie CAR. Uwzględnij nietransfekowane limfocyty T jako kontrolę negatywną.
   1. Użyj bramek FSC/SSC i FSC-A/FSC-H do badania pojedynczych komórek na żywo. Zbierz 1 ×^{10 4} pojedyncze wydarzenia na żywo dla każdej próbki. Bramka komórek dodatnich dla EGFP (marker konstytutywny przenoszony w wektorze lentiwirusowym jako wskaźnik pomyślnie transdukowanych limfocytów T), a następnie komórki dodatnie na obecność fikoerytryny (PE) (komórki eksprymujące CAR) w celu zmierzenia dodatniego wyniku PE i mediany intensywności fluorescencji (MFI).

3. Analiza zależności ekspresji CAR od tlenu w zmodyfikowanych przez CAR limfocytach T Jurkata za pomocą western blot

1. Na dwóch 48-dołkowych płytkach o gęstości 5 ×⁵ 5 komórek na basenie (objętość kultury 500 μl) w RPMI1640 pożywce z 10% FBS.
2. Dla jednej płytki dodać CoCl₂ do dołków doświadczalnych do końcowego stężenia 0 μM, 50 μM lub 200 μM. Następnie umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C (warunki normoksyczne). W przypadku drugiej płytki nie dodawać CoCl₂ i umieścić go w mobilnej komorze inkubatora CO₂/O₂ / N₂ z poziomem O₂ ustawionym na 1% (stan niedotlenienia) przed przeniesieniem go do tego samego inkubatora.
3. Po 24 godzinach inkubacji przenieść zawiesiny komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówki o masie 500 × g przez 5 minut. Całkowicie usunąć i wyrzucić supernatanty najpierw za pomocą pipety o pojemności 1 ml, a następnie pipety o pojemności 100 μl, a następnie ponownie zawiesić granulki komórek w 50 μl buforu do próbek 1x SDS-PAGE.
4. Podgrzewać próbki we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 30 s, a następnie odwirować przy 16 000 × g przez 30 s.
5. Załaduj 30 μl oczyszczonych próbek do każdej szczeliny 10-dołkowego, 10% żelu SDS PAGE o grubości 1,5 mm. Uruchom żel pod napięciem 80 V przez 30 minut, następnie zwiększ napięcie do 100 V i pracuj przez 1,5 godziny.
6. Pod koniec elektroforezy przenieś białka z żelu do membrany PVDF przy użyciu standardowej metody transferu na mokro, z prądem i czasem trwania ustawionymi odpowiednio na 400 mA i 1 h.
7. Zablokować membranę w buforze blokującym (5% mleka (w/v) w PBST (PBS + 0,05% Tween-20)) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij kawałek między 30 kD a 40 kD do wykrywania kontroli obciążenia GAPDH i kawałek między 50 kD a 70k D do wykrywania cząsteczek CAR.
8. Inkubować kawałki o masie 30-40 kD i 50-70 kD odpowiednio z mysim przeciwciałem anty-GAPDH (rozcieńczenie 1:2 000) i mysim przeciwciałem anty-Flag (rozcieńczenie 1:2 000) w 3 ml buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
9. Umyj membrany PBST w temperaturze pokojowej na bujaku platformy przez 3 x 5 min.
10. Inkubować błony z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w 3 ml buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przemywać membranę PBST przez 5 x 10 min.
11. Opracuj błony, inkubując je z substratem HRP, a następnie zwizualizuj wykryte prążki białkowe za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu.

4. Ocena in vitro zależności cytotoksyczności od tlenu, w której pośredniczą wrażliwe na niedotlenienie komórki CAR-T

1. W dniu 0 zasiew 1 × 10⁴ komórek docelowych (komórki SKOV3-Luc) na basenik doświadczalny w 200 μl DMEM zawierającego 10% FBS na dwóch czarnych, płaskodennych 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej.
2. W dniu 1 ostrożnie usunąć 100 μl supernatantu z górnej części każdej studzienki. Dodać komórki CAR-T lub nietransdukowane limfocyty T w proporcjach efektorowych do docelowych 1:1, 2:1 i 4:1 w 100 μl pożywki DMEM zawierającej 10% FBS.
3. Umieścić jedną płytkę w atmosferze 21%_O2, a drugą w atmosferze 1%_O2 za pomocą mobilnej komory inkubatora CO₂/O₂/N₂, jak opisano w kroku 2.1.
   UWAGA: Jeśli mobilna komora inkubatora CO₂/O₂/N₂ nie jest dostępna, dodanie CoCl₂ do pożywki hodowlanej może być użyte w celu naśladowania stanu niedotlenienia.
4. W dniu 2, po 24 godzinach kohodowli, ostrożnie przenieś cały supernatant (około 150-200 μl) do nowej 96-dołkowej płytki z dnem U za pomocą pipety. Przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszego wykrycia cytokin, zgodnie z procedurami opisanymi w punkcie 5.
5. Dodać 60 μl 1x pasywnego buforu do lizy do każdego dołka doświadczalnego czarnych płaskodennych 96-dołkowych płytek z kroku 4.4. Następnie umieść płytki na shakerze i potrząsaj przez 30 minut, aby zapewnić skuteczną lizę komórek.
6. Dodaj 60 μl substratu lucyferazy świetlika do każdej studzienki doświadczalnej i natychmiast zmierz aktywność lucyferazy za pomocą czytnika mikropłytek.
7. Obliczyć znormalizowaną cytotoksyczność (%) za pomocą równania (1):
   Znormalizowana cytotoksyczność (%) = 100 - ×100 (1)

5. Wykrywanie wydzielania IL-2 i IFN-γ przez wrażliwe na niedotlenienie komórki CAR-T

1. W dniu 0 należy przygotować rozcieńczenie IL-2 lub IFN-γ przeciwciała wychwytującego w stosunku 1:250 w buforze powlekającym. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ELISA i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: Bufor powlekający wytwarza się przez rozpuszczenie 7,13 g_NaHCO3 i 1,59 g Na₂CO₃ w 1 l wody destylowanej i dostosowanie pH do 9,5.
2. W dniu 1 należy usunąć niezasorbowane przeciwciało wychwytujące, energicznie odwracając płytkę do góry nogami, a następnie przemyć studzienki 3x 200 μl buforu do przemywania (PBS zawierającego 0,05% Tween 20).
3. Dodać 200 μl rozcieńczalnika do oznaczania (PBS zawierający 10% FBS) do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
4. Wyrzuć roztwór, energicznie odwracając płytkę do góry nogami, a następnie przemyj studzienki 3x 200 μl buforu do mycia.
5. Rozmrozić zamrożone próbki/płytkę sklarowanego nad osadem z kroku 4.4 w temperaturze pokojowej. Po całkowitym rozmrożeniu rozcieńczyć próbki i wzorce rozcieńczalnikiem do oznaczania. Dodać 100 μl rozcieńczonych próbek lub wzorców do każdego dołka powlekanej płytki ELISA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
   UWAGA: W przypadku wykrywania IL-2 zaleca się 10-krotne rozcieńczenie, natomiast w przypadku wykrywania IFN-γ preferowane jest 50-krotne rozcieńczenie.
6. Usuń próbki i wzorce, energicznie odwracając płytkę do góry nogami, a następnie umyj studzienki 5 razy 200 μl buforu do płukania na studzienkę.
7. Przygotować roboczy roztwór wykrywający, rozcieńczając przeciwciało wykrywające IL-2 lub przeciwciało wykrywające IFN-γ/Streptawidyna-HRP (SAv-HRP) w stosunku 1:250 w rozcieńczalniku do oznaczania. Dodać 100 μl roboczego roztworu detekcyjnego do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
8. Wyrzucić roztwór i przemyć studzienki 7x 200 μl buforu do mycia.
9. Dodaj 100 μl odczynnika substratowego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
10. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego (1 M H₂SO₄) do każdej studzienki. Natychmiast odczytać absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Results

Fuzja domeny ODD HIF-1α z ugrupowaniem CAR stanowi podstawową strategię generowania wrażliwego na niedotlenienie CAR. Wrażliwy na niedotlenienie CAR ukierunkowany na HER2 analizowany w tym badaniu, nazwany HER2-BBz-ODD, został skonstruowany przy użyciu tej strategii poprzez integrację sekwencji ODD z konwencjonalnym HER2-BBz (Figura 1A). W tym badaniu zastosowaliśmy transdukcję lentiwirusową do ekspresji HER2-BBz-ODD CAR lub HER2-BBz CAR, a następnie zbadaliśmy ich wrażliwość na tlen w dwóch typach komórek: ludzkich PBMC i limfocytach T Jurkat.

Pierwsze badanie to ekspresja CAR w warunkach hipoksyjnych w porównaniu do warunków normoksyjnych, które zostało przeprowadzone zarówno w transdukowanych przez CAR limfocytach T pochodzących z PBMC za pomocą cytometrii przepływowej, jak i w transdukowanych przez CAR limfocytach T Jurkat za pomocą western blot. W warunkach transdukowanych przez CAR limfocytów T pochodzących z PBMC zaobserwowaliśmy, że HER2-BBz-ODD CAR miał znacznie wyższą ekspresję poniżej 1% O₂ niż poniżej 21% O₂ zarówno pod względem odsetka komórek CAR-dodatnich, jak i mediany intensywności fluorescencji (MFI) (Figura 1B). Analiza immunoblottyczna limfocytów T Jurkat transdukowanych przez CAR potwierdziła również zależną od niedotlenienia indukcję HER2-BBz-ODD.

Warto zauważyć, że w tym kontekście, stan niedotlenienia może być wygodnie naśladowany przez dodanie CoCl₂, chemicznego induktora niedotlenienia, do pożywki hodowlanej. Jak pokazano w Rysunek 1C, nasze wyniki immunoblottingu wykazały, że ekspozycja na 50 lub 200 μM CoCl₂ podsumowała efekt ekspozycji na 1% O₂, wyraźnie indukując ekspresję HER2-BBz-ODD CAR, ale nie HER2-BBz CAR. Charakterystykę funkcjonalną wrażliwego na niedotlenienie CAR przeprowadzono za pomocą komórek CAR-T pochodzących z PBMC. W badaniu jako docelową linię komórkową SKOV-3 wykorzystano linię komórkową SKOV-3 przenoszącą lucyferazy świetlika. Ta konfiguracja pozwoliła nam zmierzyć aktywność lucyferazy związanej z komórkami docelowymi jako wskaźnik zastępczy do oceny cytotoksyczności, w której pośredniczą współhodowane komórki CAR-T.

Jak pokazano w Rysunek 1D, pomiary wykazały, że komórki CAR-T HER2-BBz skutecznie zabijają komórki docelowe, niezależnie od tego, czy atmosfera była normoksyjna czy niedotleniona. Natomiast komórki CAR-T HER2-BBz-ODD wykazywały znacznie słabszą cytotoksyczność w warunkach normoksycznych dla wszystkich trzech badanych stosunków E:T. Jednak ich cytotoksyczność była znacznie zwiększona po ekspozycji na warunki niedotlenienia. Poziomy supernatantów IL-2 i IFN-γ mierzono również metodą ELISA po kohodowli komórek CAR-T z komórkami docelowymi przez 24 godziny. W przypadku obu cytokin zaobserwowano większe wydzielanie poniżej 1%_O2 w porównaniu z 21%_O2 dla komórek CAR-T HER2-BBz-ODD, co jest zgodne z danymi cytotoksycznymi. Natomiast komórki CAR-T HER2-BBz wykazywały niższe wydzielanie dwóch cytokin poniżej 1%_O2 w porównaniu do 21%_O2, co wskazuje na niekorzystny wpływ niedotlenienia na aktywność komórkową (Figura 1E). Podsumowując, wyniki te przekonująco potwierdziły wrażliwą na hipoksję naturę HER2-BBz-ODD CAR.

Rysunek 1: Budowa i charakterystyka komórek CAR-T wrażliwych na niedotlenienie. (A) Schematyczne przedstawienie konstrukcji wrażliwego na niedotlenienie CAR, HER2-BBz-ODD, oraz jego konwencjonalnego odpowiednika, HER2-BBz. Oba CAR składają się z N-końcowego peptydu sygnałowego CD8α, znacznika FLAG, ludzkiego scFv ukierunkowanego na HER2, zawiasu CD8 i domeny transbłonowej oraz części wewnątrzkomórkowej składającej się z domeny kostymulującej z 4-1BB, domeny sygnalizacyjnej CD3ξ, IRES i EGFP. HER2-BBz-ODD różni się od HER2-BBz fuzją domeny ODD z C-końcem domeny sygnalizacyjnej CD3ξ, umożliwiając jej ekspresję zależną od hipoksyzacji poprzez promowanie degradacji zależnej od ubikwityny w warunkach normoksyjnych. (B,C) Oceny zależnej od tlenu ekspresji HER2-BBz-ODD CAR. (B) Jedną ocenę przeprowadzono na ludzkich komórkach CAR-T pochodzących z PBMC po hodowli poniżej 1% lub 21%_O2 przez 24, 48 lub 72 godziny przy użyciu cytometrii przepływowej. (C) Druga ocena dotyczyła limfocytów T Jurkat transdukowanych przez CAR, w których lizaty komórkowe zebrano 24 godziny po wyhodowaniu poniżej 21% O_2, 50 lub 200 μM CoCl₂ lub 1% O₂ i analizowano pod kątem ekspresji CAR za pomocą western blotting, z komórkami transdukowanymi CAR HER2-BBz jako kontrolą. (D,E) cytotoksyczność in vitro i wydzielanie cytokin przez komórki CAR-T w różnych warunkach tlenowych. (D) Komórki CAR-T hodowano jednocześnie z komórkami SKOV3 wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlika we wskazanych proporcjach E:T poniżej 1% lub 21%_O2. Po 24 godzinach kohodowli skuteczność zabijania komórek docelowych określono poprzez pomiar zmiany aktywności lucyferazy świetlika związanego z komórkami w stosunku do tej z nietransdukowanymi limfocytami T. (E) Supernatanty pobrano w celu wykrycia wydzielanych IL-2 i IFN-γ. Wyniki są wyświetlane jako średnia ± SEM (n = 3 zdrowych dawców) (****p < 0,0001). Skróty: scFv = zmienna fragmentu pojedynczego łańcucha; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. Panele C i D są zaadaptowane z Liao et al.³¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Obawy dotyczące bezpieczeństwa są istotnymi kwestiami, które należy rozwiązać, aby jakakolwiek terapia komórkami CAR-T mogła przejść do użytku klinicznego. Wykorzystanie unikalnych właściwości komórek nowotworowych lub TME stało się głównym kierunkiem badań koncentrujących się na rozwoju komórek CAR-T, które selektywnie atakują tkanki nowotworowe. Zaprojektowanie wrażliwego na niedotlenienie CAR-T jest atrakcyjną strategią w tym kierunku, z kilkoma badanymi podejściami, w tym tym tym przedstawionym w tym badaniu - fuzją ugrupowania CAR z naturalnie występującą domeną białka ODD wykrywającą hipoksję. Alternatywne podejście polega na zastąpieniu konstytutywnego promotora powszechnie stosowanego do napędzania ekspresji CAR elementem odpowiedzi na hipoksję (HRE), który okazał się obiecujący w poprzednich badaniach. Uważa się, że połączenie elementów HRE i ODD (wersje typu dzikiego lub inżynieryjnego, które oferują ściślejszą kontrolę ekspresji) stanowi optymalną konstrukcję dla CAR indukowanego hipoksją.

Protokół ten przedstawia procedury eksperymentalne generowania i walidacji wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T. Implementacja tego protokołu wiąże się z kilkoma kluczowymi kwestiami. Podstawową kwestią jest stworzenie warunków niedotlenienia. Pomiędzy tymi dwoma podejściami, dodanie CoCl₂ do pożywki hodowlanej było powszechnie stosowane w poprzednich badaniach związanych z hipoksją, głównie dzięki swojej wygodzie^32,33. Niemożliwe jest jednak zmierzenie stopnia niedotlenienia naśladowanego przez to podejście. Natomiast zastosowanie mobilnej komory inkubacyjnej CO₂ / O₂ / N₂ 2 jest korzystne, ponieważ poziomy O₂ można precyzyjnie ustawić, a tym samym nadaje się do dokładnej analizy wrażliwości komórek CAR-T na hipoksję. Pod tym względem poziom niedotlenienia w guzach różni się między różnymi typami guzów litych i różnymi okresami progresji guza³⁴, podczas gdy w protokole przedstawiono zaledwie 1% O₂ . Jest to optymalna praktyka dla badaczy, aby dostosować poziom tlenu do rzeczywistego zapotrzebowania. Jeśli metoda CoCl₂ jest jedynym dostępnym podejściem, zalecamy włączenie do testu zakresu stężeń CoCl₂ w celu symulacji różnych poziomów tlenu.

Kolejną kluczową kwestią jest wybór odpowiedniej metody badania ekspresji CAR zależnej od hipoksji. Podczas gdy analiza immunoblottyczna limfocytów T Jurkat transdukowanych przez CAR jest wygodną opcją podczas optymalizacji konstrukcji CAR, analiza wpływu poziomów tlenu na powierzchniową ekspresję CAR w ludzkich PBMC transdukowanych przez CAR za pomocą cytometrii przepływowej służy jako ostateczna walidacja. Optymalne jest zbadanie dynamiki ekspresji CAR w odpowiedzi na przejście z warunków hipoksyjnych do normoksyjnych, tak jak zrobiliśmy to wcześniej z ulepszoną wersją CAR wrażliwej na hipoksję, a mianowicie HiTA-CAR³⁵. To jeszcze bardziej zademonstrowałoby ekspresję CAR ograniczoną hipoksją.

W celu weryfikacji funkcjonalnej wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T test cytotoksyczności opisany w protokole obejmuje użycie komórek docelowych przenoszących lucyferazy świetlika. Ten test reporterowy można zastąpić innymi metodami oceny zabijania, takimi jak metoda CCK8 i metoda analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA), w której można stosować niezmodyfikowane komórki nowotworowe. Analiza RTCA jest również korzystna dla pomiaru kinetyki zabijania komórek CAR-T w czasie rzeczywistym. W celu zmierzenia swoistej cytotoksyczności powodowanej przez komórki CAR-T, jako grupę kontrolną należy włączyć nietransdukowane PBMC. Wysoka skuteczność transdukcji PBMC jest pożądana, aby uniknąć obaw, że różnice w wykrytej cytotoksyczności między grupami doświadczalnymi i kontrolnymi wynikają z niespecyficznego zabijania, w którym pośredniczą różne ilości dodanych komórek efektorowych.

Istnieje kilka ograniczeń w tym protokole. Warunki niedotlenienia mogą wpływać na żywotność zarówno komórek docelowych, jak i limfocytów T^36,37, co wprowadza obawę, że śmierć komórki niezwiązana z cytotoksycznością za pośrednictwem komórek CAR-T może zakłócić interpretację wyników testu. Sugeruje się, aby upewnić się, że zarówno komórki CAR-T, jak i komórki docelowe mają doskonałą żywotność bezpośrednio przed testem, aby uniknąć lub zminimalizować takie problemy. Należy również zauważyć, że walidacja in vitro nie gwarantuje udanej translacji in vivo. Oceny in vivo są zawsze potrzebne, aby potwierdzić, czy wrażliwy na niedotlenienie kandydat CAR-T może uniknąć celowania w normalne tkanki, które wykazują ekspresję docelowego antygenu

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml Probówka wirówkowa	QSP	509-GRD-Q	Supernatanty i cellekcja komórek Protokół Krok 2,3,4
10% ExpressCast STRONA	NCM biotech	P2012	Protokół immunoblotting Krok 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Hodowla komórkowa Protokół Krok 4
Pipeta 10 ml	Yueyibio	YB-25H	Pipetowanie Protokół Krok 1
10xTRIS-Glycine-SDS bufor do elektroforezy	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protokół Krok 3
15 ml Probówka wirówkowa	Thermo Scientific	339650	Supernatanty i cellekcja komórek Protokół Krok 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Hodowla komórkowa Protokół Krok 3,4
4x Białko SDS PAGE Bufor ładujący	Takara	9173	Protokół immunoblottingu Krok 3
6-dołkowe płytki do hodowli tkanek płaskodennych	Thermo Scientific	140675	T Cell Culture Protokół Krok 1
96-dołkowe czarne płaskodenne płytki do hodowli tkankowych	Greiner	655090	Test cytotoksyczności Protokół Krok 4
96-dołkowe płytki ELISA	Corning	3590	Protokół ELISA Krok 5
96-dołkowa wytrząsarka do płytek	QILINBEIER	MH-2	Shake Protokół Krok 4
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z dnem w kształcie litery U	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protokół Krok 4,5
anty-FLAG	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protokół Krok 3
Karbinol	Protokół Sinopharm	10010061	Immunoblotting Krok 3
Inkubator dwutlenku węgla	Thermo Scientific	360	Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,2,3,4
Płytka do liczenia komórek	Hausser scientific	1492	Zliczanie komórek Protokół Krok 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Koraliki magnetyczne Mouse IgG Protokół Krok 1
Wirówka	Thermo Scientific	75002432	Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,3,4
System obrazowania żelem chemiluminescencyjnym	BIO-RAD	12003154	Protokół immunoblotting Krok 3
Roztwór chlorku kobaltu (0,5 M)	bioleaper	BR4000203	Stan niedotlenienia Protokół Krok 2,3,4
DMEM	Corning	10-103- CV	Hodowla komórkowa Protokół Krok 4
Waga elektroniczna	Sartorius	PRACTUM612-1CN	ważenie Protokół Krok 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Hodowla komórkowa Protokół Krok 3,4
GAPDH MAb myszy	ABklonalny	AC002	Protokół immunoblotting Krok 3
Aparatura do elektroforezy żelowej	BIO-RAD	1645070	Protokół immunoblottingu Krok 3
Czytniki mikropłytek GloMax	Promega	GM3000	Protokół Krok 4
Kozia anty-mysia IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Krok 3
Wirówka do mikrozamrażania o dużej prędkości	eppendorf	5810  R	Hodowla komórkowa Protokół Krok 1
Ludzki IFN-γ Zestaw ELISA	BD	555142	ELISA Protokół Krok 5 Pozycje: Rekombinowany ludzki IFN-γ Liofilizowany standardowy, wykrywający przeciwciało biotyny anty-ludzkiej IFN-γ , Oczyszczony anty-ludzki IFN-&gamma odczynnik do wychwytywania przeciwciał, koniugat enzymatyczny Streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)
Ludzki zestaw testów ELISA IL-2	BD	555190	ELISA Krok protokołu 5 Elementy: Rekombinowany ludzki liofilizowany wzorzec IL-2, przeciwciało wykrywające biotyna anty-ludzka IL-2, przeciwciało wychwytujące oczyszczone anty-ludzkie IL-2, odczynnik enzymatyczny koniugat streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)
IL-15	R& Systemy D	P40933	Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1
IL-7	R& Systemy D	P13232	Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1
Mikroskop odwrócony	Olympus	CKX41	Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protokół Krok 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Cytometria przepływowa Protokół Krok 2
System	oznaczania lucyferazyTest reporterowy lucyferazy Promega	E1501	Protokół Krok 4 Przedmioty: Pasywny bufor do lizyzy, substrat lucyferazy świetlika
Czytnik mikropłytek	Protokół BioTek	HTX	ELISA Krok 5
mobilny CO2/O2/N2 Komora inkubatora	Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Stan niedotlenienia Protokół Krok 2, 3, 4
Mysz Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Protokół immunoblotting Krok 3
Bufor szybkiego transferu NcmBlot	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Protokół immunoblottingu Krok 3 Elementy: Odczynnik NcmECL Ultra Luminol/Enhancer (A), Ultra stabilizowany odczynnik nadtlenkowy NcmECL (B)
Powlekane NovoNectin 48-dołkowe płaskie płytki	Novoprotein	GMP-CH38	Budowa komórek CAR-T Protokół Krok 1
Zestaw tabletek OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy)	Sigma	P9187	Odczynnik substratowy Protokół Krok 5 Przedmioty: Tabletka OPD (srebrna folia), tabletka nadtlenku wodoru mocznika (złota folia)
Anty-DYKDDDDK anty-sprzężony z PE	Biolegend	637310	Cytometria przepływowa Protokół Krok 2
Siarczan protaminy	Sigma	P3369-1OG	Zakażenie lentiwirusem Protokół Krok 1
Marker białkowy 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protokół Krok 3
Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD3	BD	566685	limfocytów T Krok 1
Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD28	BD	555725	Protokół Krok 1
Membrana PVDF	Millipore	168627	Protokół immunoblotting Krok 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Hodowla komórkowa Protokół Krok 3
Odtłuszczone mleko w proszku	Yeasen	S9129060	Protokół immunoblottingu Krok 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Protokół Krok 4
Trypsyna-EDTA	NCM biotech	C125C1	Hodowla komórkowa Protokół Krok 4
Animacja 20	Sinopharm	30189328	Protokół immunoblotting Krok 3 Łaźnia
wodna	keelrein	NB014467	Heating Protokół Krok 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Pożywka do hodowli limfocytów bez surowicy Protokół Krok 1