Artykuł metodologiczny

Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami

DOI:

10.3791/66703

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  , 
1School of Biomolecular Science and Engineering, Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie premiksowanej, liofilizowanej amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i reakcji opartych na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), które mogą być wykorzystane do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych patogenów chorób zakaźnych lub innych markerów genetycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagnostyka molekularna oparta na wykrywaniu Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) ma wysoką dokładność diagnostyczną i atrybuty, które są odpowiednie do stosowania w miejscach opieki nad pacjentem, takie jak szybki czas oczekiwania na wyniki, wygodne proste odczyty i brak konieczności stosowania skomplikowanych instrumentów. Jednak reakcje te mogą być kłopotliwe do przeprowadzenia w miejscu opieki nad pacjentem ze względu na wiele elementów i etapy ręcznej obsługi. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku, zoptymalizowany protokół do niezawodnego wykrywania patogenów chorobotwórczych i markerów genetycznych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i odczynników na bazie CRISPR, które są wstępnie mieszane, a następnie liofilizowane w łatwych do przechowywania i gotowych do użycia formatach. Wstępnie wymieszane, liofilizowane odczynniki mogą być ponownie uwodnione do natychmiastowego użycia i zachowują wysoką skuteczność amplifikacji i wykrywania. Udostępniamy również przewodnik rozwiązywania często występujących problemów związanych z przygotowywaniem i używaniem premiksowanych, liofilizowanych odczynników do diagnostyki opartej na CRISPR, aby platforma wykrywania była bardziej dostępna dla szerszych społeczności diagnostycznych/genetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagnostyka oparta na CRISPR do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych została po raz pierwszy opisana w 2017 roku1,2,3,4, i od tego czasu została sprawdzona jako diagnostyka nowej generacji z testami zatwierdzonymi przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA), szczególnie do wykrywania RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) w wielu countries5,6,7,8. Poza chorobą koronawirusową 2019 (COVID-19) technologie te okazały się skuteczne w wykrywaniu różnych wirusów i bakterii9,10,11,12,13, mutacje i delecje chorób genetycznych, i mogą być zaprojektowane do wykrywania biomarkerów białkowych i małocząsteczkowych2,12. Diagnostyka oparta na CRISPR często łączy metody amplifikacji izotermicznej - takie jak amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) lub amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) 14,15 - z detekcją opartą na CRISPR przy użyciu enzymów związanych z CRISPR (Cas) kierowanych RNA z "dodatkową" aktywnością endonukleazy po rozpoznaniu celu3. Podwójne zastosowanie amplifikacji izotermicznej i detekcji opartej na CRISPR nadaje tym technologiom kilka pożądanych cech, w szczególności wysoką dokładność diagnostyczną zbliżoną do złotego standardu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz zdolność do multipleksowania i wykrywania niewielkich różnic w sekwencji, w tym polimorfizmów pojedynczego nukleotydu1,9.

Najdokładniejsze wersje diagnostyki opartej na CRISPR, jednak zawierają wiele komponentów i kroków, a ich wykonanie może być skomplikowane dla laików lub w miejscu opieki nad pacjentem (POC). Aby sprostać temu wyzwaniu, jakim jest rozszerzenie zastosowania bardzo dokładnej diagnostyki opartej na CRISPR na ustawienia POC, opracowaliśmy protokoły przygotowania premiksowanych, liofilizowanych, opartych na rekombinazie amplifikacji izotermicznej i reakcji detekcji opartych na CRISPR, które są łatwe w użyciu i przechowywane7. Protokoły te powinny uzupełniać istniejące doskonałe protokoły diagnostyki opartej na CRISPR14, które zawierają dodatkowe informacje na temat produkcji składników biochemicznych potrzebnych do diagnostyki opartej na CRISPR7, wytyczne projektowe1, oraz formuły wykorzystujące alternatywne techniki amplifikacji izotermicznej2,14,15,16 oraz enzymy Cas12. Ostatecznie mamy nadzieję, że diagnostyka oparta na CRISPR może pomóc w szybkim, niedrogim i czułym wykrywaniu nukleinów w warunkach, w których wymagane są przenośne i bezinstrumentalne analizy1,9,17.

W naszych protokołach używamy przede wszystkim kombinacji wykrywania opartego na RPA i Cas13. RPA działa w temperaturach zbliżonych do otoczenia (37-42 °C), a zatem ma niskie zapotrzebowanie na energię i sprzęt. Inne reakcje amplifikacji izotermicznej wymagają wyższych temperatur (LAMP, 60-65 °C; amplifikacja przemieszczenia nici (SDA), 60 °C; reakcja amplifikacji wykładniczej (EXPAR), 55 °C; i amplifikacja zależna od helikazy (HDA), 65 °C)2. Konstrukcja starterów RPA również nie jest skomplikowana, w przeciwieństwie do starterów LAMP, i może być rozszerzona o multipleksowane amplifikacje7,9,14. Mimo że multipleksowanie poza dwoma celami za pomocą RPA jest w praktyce trudne, istnieją jasne wytyczne dotyczące projektowania multipleksowanych starterów RPA, aby zminimalizować zakłócenia18.

Podczas gdy zanieczyszczenie przenoszone pozostaje dużym problemem w dwuetapowym przepływie pracy, generowane amplikony RPA są małe i mniej prawdopodobne, że spowodują zanieczyszczenie przenoszone w porównaniu do dużych amplikonów konkategorycznych z LAMP14. Startery RPA mogą być zaprojektowane zgodnie ze standardowymi wytycznymi14: zazwyczaj mają długość 25-35 nukleotydów i temperaturę topnienia od 54 do 67 °C. Rozmiar amplikonu powinien być mniejszy niż 200 par zasad. Enzym odwrotnej transkryptazy (RT) można dodać do RPA, aby umożliwić amplifikację z RNA, a w przypadku odwrotnej transkrypcji-RPA (RT-RPA), inny enzym rybonukleaza H (RNaza H) jest zwykle dodawany w małych ilościach, aby pomóc w rozwiązaniu powstałego RNA: hybryda DNA i promować reakcję amplifikacji5,19. Aby umożliwić transkrypcję T7 w celu wykrycia opartego na Cas13, promotor polimerazy RNA T7 można umieścić na końcu 5' startera RPA do przodu.

Po wygenerowaniu amplikonów z RPA, mogą one być wykrywane za pomocą enzymów Cas zaprogramowanych przez crRNA. Spośród różnych enzymów Cas, które mogą być używane do wykrywania amplikonów, preferujemy warianty Cas13 ukierunkowane na RNA ze względu na ich wysoką aktywność rozszczepienia1 i dobrze scharakteryzowane preferencje rozszczepienia polinukleotydów7,9, z których ten ostatni może być używany do detekcji multipleksowej. Sekwencja crRNA dla Cas13 jest zaprojektowana tak, aby była komplementarna (odwrócona dopełniczka) do miejsca docelowego w wyprodukowanym RNA z sekwencjami dystansowymi i bezpośrednimi powtórzeniami (DR). Sekwencja crRNA i startery RPA nie powinny na siebie nakładać się, aby uniknąć niepożądanego wykrywania produktów amplifikacji poza celem na podstawie Cas, co zwiększa liczbę wyników w tle i wyników fałszywie dodatnich14.

Wykrywanie oparte na Cas opiera się na różnych metodach wykrywania do monitorowania rozszczepienia cząsteczek reporterowych kwasów nukleinowych (reporterów RNA dla reakcji opartych na Cas13)1,2,14. Różne metody wykrywania obejmują kolorymetrię, odczyty elektrochemiczne, fluorescencję, odczyty sekwencjonowania i paski przepływu bocznego2. Skupiamy się na odczycie fluorescencji, biorąc pod uwagę różne fluorofory i reportery, takie jak cyjanina 5 (Cy5), rodamina X (ROX) i karboksyfluoresceina (FAM), które można skutecznie wzbudzić za pomocą pojedynczego źródła niebieskiego światła LED, a ich fluorescencja jest analizowana przez czytnik mikropłytek lub termocykler w czasie rzeczywistym7,14. Ponadto odczyt fluorescencji jest łatwy w konfiguracji i umożliwia ciągłe monitorowanie, co umożliwia ocenę ilościową w czasie rzeczywistym. Multipleksowana preamplifikacja RPA i multipleksowana detekcja oparta na Cas13 przy użyciu enzymów Cas mogą być połączone z wielokolorowymi odczytami fluorescencji w celu jednoczesnego wykrywania wielu celów genetycznych2,7.

W naszych protokołach najpierw izotermicznie wzmacniamy RNA za pomocą RT-RPA, dodając próbkę RNA do liofilizowanej formy odczynnika RT-RPA (Rysunek 1). Podczas RT-RPA promotor T7 jest dodawany do wygenerowanego dwuniciowego amplikonu DNA. Następnie produkty RPA są przenoszone do liofilizowanej detekcji opartej na Cas13, która zawiera również polimerazę T7 RNA. Ta reakcja detekcji przekształci amplikony DNA w RNA (poprzez polimerazę RNA T7), które można łatwo wykryć za pomocą Cas13 zaprogramowanego przez crRNA. Cas13 aktywowany przez cel rozszczepi cząsteczki reporterowe, aby wytworzyć wykrywalny sygnał fluorescencyjny2,7,14. Chociaż przedstawione tutaj protokoły odnoszą się do wykrywania przez Leptotrichia wadei (LwaCas13a), można je rozszerzyć do jednoczesnego, multipleksowanego wykrywania do czterech celów przy użyciu ortogonalnych enzymów Cas13 i Cas127,9. Reakcje detekcji oparte na RPA i Cas mogą być również łączone w jedną probówkę, aczkolwiek przy utracie czułości14.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Proces wykrywania oparty na CRISPR. Przepływ pracy ilustruje wykrywanie dwóch docelowych genów. Po pierwsze, obszary zainteresowania w obrębie celu DNA są amplifikowane izotermicznie za pomocą RPA; reakcja może być przeprowadzona z odwrotną transkrypcją (RT-RPA) podczas wykrywania celów RNA. Następnie transkrypcja T7 przekształca amplikony dsDNA w RNA, które z kolei są rozpoznawane przez kompleksy Cas13-crRNA zdolne do wywoływania dodatkowej aktywności RNazy po związaniu celu. Rozszczepienie wygaszonych reporterów fluorescencyjnych wytwarza sygnały fluorescencyjne, które mogą być monitorowane za pomocą czytnika mikropłytek, wizualizowane przez transiluminator LED lub używane z termocyklerem w czasie rzeczywistym. Skróty: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = odwrotna transkrypcja; RPA = amplifikacja polimerazy rekombinazy; Cas = białko związane z CRISPR; LED = dioda elektroluminescencyjna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kluczowymi cechami przedstawionych tutaj protokołów są preparaty do wstępnego mieszania liofilizacji. Wstępne mieszanie upraszcza stosowanie reakcji i zwiększa odtwarzalność, ale wiele składników detekcji opartej na RPA i Cas - w szczególności odwrotna transkrypcja i niektóre labilne kofaktory, takie jak ATP, nie są stabilne w roztworze. W związku z tym formułujemy wstępnie zmieszane roztwory w taki sposób, aby można je było liofilizować w celu długotrwałego przechowywania oraz łatwego transportu i wdrażania1,9,20. Wstępnie wymieszane, liofilizowane odczynniki również pomagają poprawić czułość wykrywania, ponieważ można dodać większą objętość próbki (a tym samym wyższy wkład DNA/RNA) w celu odtworzenia reakcji10. W naszych preparatach używamy przede wszystkim trehalozy21 jako krioprotektantu w liofilizowanych reakcjach wykrywania opartych na RPA i Cas7. Oprócz zachowania odczynników, trehaloza wspomaga również reakcje poprzez zwiększenie stabilizacji enzymu16,22,23,24 i obniżanie temperatur topnienia dsDNA23. Eksploracje innych stabilizatorów5,7,21,25,26 poza trehalozą może dostarczyć jeszcze bardziej optymalnych formuł dla różnych scenariuszy zastosowań.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie liofilizowanych wstępnie zmieszanych odczynników RT-RPA

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Przygotuj dewara lub tacę z ciekłym azotem do błyskawicznego zamrażania reakcji. Napełnij dewara lub tacę ciekłym azotem.
    2. Liofilizator
      1. Sprawdź, czy w rurkach odpływowych i we wnętrzu komory nie ma skroplonej wody; w razie potrzeby usuń wodę.
      2. Wyczyść wnętrze komory i metalowy stojak na probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml roztworem do odkażania RNazy, a następnie 70% etanolem.
      3. Zamknij drzwiczki komory i zawór spustowy podciśnienia.
      4. Włącz liofilizator.
      5. Ręcznie ustaw temperaturę półki na -30 °C.
    3. Aparatura do biologii molekularnej
      1. Roztworem do odkażania RNazy należy oczyścić następujące elementy: pipety, stojaki na końcówki do pipet, mieszalnik wirowy, miniwirówkę wirującą i marker permanentny.
      2. Umyj wodą z kranu, a następnie przetrzyj papierem do wycierania do czyszczenia: plastikowe stojaki na probówki do mikrowirówek i piankowe pudełko na lód.
      3. Przygotuj blok grzewczy (używany do rozpuszczania/rozpuszczania roztworu triglicyny), czyszcząc go roztworem do dekontaminacji RNazy i 70% etanolem. Następnie włącz go i ustaw temperaturę na 60 °C.
  2. Przygotowanie wstępnie zmieszanych reakcji RPA
    UWAGA: Ten preparat jest przeznaczony na 10 reakcji (przy użyciu trzech granulek RPA).
    1. Przed użyciem sprawdź, czy w roztworze triglicyny nie ma osadu. Jeśli występują osady, należy je rozpuścić w inkubacji w temperaturze 60 °C i dokładnie wymieszać przed użyciem. Schłodzić roztwór triglicyny przed dodaniem innych odczynników wrażliwych na ciepło.
      UWAGA: Osady mogą łatwo się tworzyć, jeśli probówka jest pozostawiona w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas.
    2. Wyjmij trzy probówki z granulkami RPA z zamrażarki; postukaj w probówki, delikatnie uderzając nimi o stół laboratoryjny, aby usunąć białe granulki.
    3. Przenieś wszystkie trzy granulki do probówki mikrowirówkowej A o pojemności 1,5 ml.
    4. Odpipetować 25 μl wody wolnej od nukleaz, aby wypłukać pozostały proszek RPA w probówkach z paskami i przenieść roztwór płuczący do nowej probówki do mikrowirówki B o pojemności 1,5 ml.
    5. Dodać 10 μl 0,57 M roztworu triglicyny i 10 μl mieszanki starterów (po 10 μM każdy) do probówki B mastermix.
    6. Wymieszaj rurkę B z wirem, a następnie odwiruj i umieść probówkę na lodzie.
    7. Dodać 28,4 μl 5x buforu RPA (przygotowanego z 500 μl 50% (w/v) PEG20000, 250 μl 1 M Tris pH 7,4 i 100 μL 100 mM ditiotreitolu (DTT)) do probówki B mastermix i dokładnie wymieszać, wielokrotnie mocno stukając lub wstrząsając.
      UWAGA: Wytwarzamy roztwór w ten sposób, aby pomóc rozcieńczyć/zmniejszyć lepkość PEG w tubie mastermix, przed dodaniem wszystkiego w celu rozpuszczenia granulek RPA.
    8. Przenieś granulki zebrane w probówce A z kroku 1.2.3 do probówki Mastermix B, a następnie odwróć probówkę mastermix kilka razy, aby wymieszać. Obserwuj, czy roztwór wydaje się jednorodny i jednofazowy (będzie również wyglądał na lekko nieprzezroczysty), a następnie umieść probówkę na lodzie.
      UWAGA: Jeśli mieszanie nie jest dokładne, PEG może spowodować separację fazową roztworu/zawiesiny.
    9. Dodać 0,71 μl z 200 jednostek/μl RT i 2,84 μl z 5 jednostek/μl RNazy H do probówki mastermix. Delikatnie postukaj lub odwróć rurkę mastermix wiele razy w górę iw dół. Zakręć i umieść rurkę na lodzie.
      UWAGA: Dodajemy te enzymy po ciężkim wymieszaniu wcześniejszych etapów, ponieważ RT i RNaza H są wrażliwe na ścinanie w wyniku mieszania; koniec z wirowaniem po dodaniu RT/RNazy H.
    10. Porcję 8,4 μl roztworu mastermix rozprowadzić do 10 wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml i umieścić probówki na lodzie. W tym celu zanurz końcówkę pipety w roztworze mastermix i powoli i równomiernie wciągaj roztwór mastermix do końcówki, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza i zapewnić dokładny pomiar objętości. Dozować roztwór mastermix do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że przy podaniu 8,4 μl w probówce mastermix pozostanie ~1-2 μl zawiesiny. Eksperymentator może nieznacznie zmniejszyć objętość porcjowania, aby zapewnić wystarczającą ilość odczynników dla wszystkich 10 reakcji. Podczas pracy z lepkimi roztworami należy stosować odpowiednie techniki pipetowania.
    11. Po zakończeniu porcjowania umieść probówki w metalowym stojaku zanurzonym w ciekłym azocie, aby przygotować je do liofilizacji. Pozwól rurkom zanurzyć się w ciekłym azocie na 5 minut.
      UWAGA: Ponieważ liofilizacja usuwa nadmiar roztworu, pozwala nam dodać więcej danych wejściowych DNA/RNA, co pomaga zwiększyć czułość. Liofilizowane, wstępnie zmieszane reakcje RPA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 8 miesięcy. Liofilizacja pomaga w odtwarzalności, jeśli dany eksperyment jest wykonywany przy użyciu mastermixów RPA przygotowanych w tej samej partii, więc wykonanie większej partii również pomaga.
  3. Liofilizacja
    1. W liofilizatorze sprawdź temperaturę kolektora i półki. W razie potrzeby poczekaj, aż temperatura kolektora osiągnie -75 ± 5 °C, a temperatura półki osiągnie -30 ± 1 °C.
    2. Przykryj otwarte probówki w metalowym stojaku arkuszem papieru do czyszczenia, umieść metalowy stojak wraz z otwartymi probówkami na półce liofilizatora i zamknij drzwiczki półki.
    3. Wybierz program pokazany w Tabeli 1 i naciśnij start. Po 30 minutach drugiego etapu suszenia (20 °C, <0,1 mbar; temperatura jest utrzymywana w nieskończoność, ustawiając czas kroku na "nieskończoność"), naciśnij przycisk zatrzymaj program.
      UWAGA: Pozwalamy rurkom rozgrzać się w liofilizatorze, aby zapobiec kondensacji wody.
    4. Zwolnij ciśnienie, otwierając zawór spustowy podciśnienia, a następnie wyjmij stojak z półki. Natychmiast zakryć probówki i przechowywać liofilizowane reakcje w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Liofilizowane RPA i CRISPR-Cas13a wstępnie zmieszane reakcje można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 8 miesięcy.

2. Przygotowanie liofilizowanych wstępnie zmieszanych odczynników detekcyjnych CRISPR-Cas13a

UWAGA: Postępuj zgodnie z krokiem 1.1, aby przygotować sprzęt.

  1. Wstępnie zmieszany preparat reakcyjny CRISPR-Cas13a (10 reakcji)
    1. Wyjmij następujące przedmioty z magazynu i umieść je na lodzie: 10 μL LwaCas13a (wyprodukowanego we własnym zakresie7,8,14) (2 mg/mL), bufor do przechowywania Cas, 10 ng/μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 jednostek/μL polimerazy RNA T7, 2 μM reportera fluorescencji FAM.
    2. Przygotować roztwór roboczy LwaCas13a o stężeniu 126 μg/ml (900 nM), dodając 148,8 μl buforu do przechowywania Cas (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M NaCl, 5% glicerolu, 2 mM DTT) do 10 μl 2 mg/ml LwaCas13a.
    3. Przygotuj reakcję mastermix CRISPR-Cas13a w następujący sposób: 71 μL wody wolnej od RNaz, 20 μL 400 mM Tris pH 7,4, 20 μL 60% (w/v) trehalozy, 10 μL 10 ng/μL (225 nM) crRNA (w tym przypadku ukierunkowanie na geny s i n SARS-CoV-2), 8 μL 100 mM mieszanki rNTP (po 25 mM), 6 μl 50 jednostek/μl polimerazy T7 RNA, 25 μl 2 μM reportera fluorescencyjnego FAM i 10 μl 126 μg/ml (900 nM) LwaCas13a. Dobrze wymieszaj, odwracając rurkę mastermix; Następnie odkręć w dół.
    4. Podzielić 17 μl mastermixu na 10 probówek o pojemności 1,5 ml umieszczonych na lodzie. Umieść probówki w stojaku zanurzonym w ciekłym azocie i pozwól im zanurzyć się w ciekłym azocie na 5 minut.
  2. Liofilizacja
    1. W liofilizatorze sprawdzić temperaturę kolektora i półki i poczekać, aż temperatura kolektora osiągnie -75 ± 5 °C, a temperatura półki osiągnie -30 ± 1 °C.
    2. Umieść probówki w liofilizatorze. Wybierz program pokazany w Tabeli 1 i naciśnij start. Po 30 minutach etapu suszenia wtórnego (25 °C, <0,1 mbar; temperatura jest utrzymywana w nieskończoność, ustawiając czas kroku na "nieskończoność"), zatrzymaj program.
    3. Zwolnij ciśnienie, otwierając zawór spustowy podciśnienia i wyjmij stojak z półki. Natychmiast zakryć probówki i przechowywać liofilizowane reakcje w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Liofilizowane wstępnie zmieszane odczynniki RPA i CRISPR-Cas13a można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 8 miesięcy.

3. Amplifikacja kwasu nukleinowego RT-RPA

UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, miejsca pracy i pipetory powinny być oddzielone do wstępnego amplifikacji, dodania próbki i po amplifikacji. Zalecamy używanie końcówek do pipet z filtrem.

  1. Podgrzej inkubator z wytrząsaniem termicznym w temperaturze 42 °C.
  2. Dodać 1 μl mieszaniny roztworu octanu magnezu (Mg(OAc)2) i octanu potasu (KOAc) (składającego się z 196 mM Mg(OAc)2 i 1,5 M KOAc) na bok probówki zawierającej liofilizowany, wstępnie zmieszany osad RT-RPA (z sekcji 1).
    UWAGA: Sztuczka polegająca na dodaniu mieszanki Mg(OAc)2 i KOAc: kroplę należy umieścić w pobliżu oznaczenia objętości 1 ml na probówce. W tym przypadku kropla będzie wyraźnie widoczna i prawdopodobnie nie zostanie utracona w wyniku zamknięcia rurki lub innych działań. Wzmocnienie rozpocznie się po odkręceniu w dół, aby zebrać kroplę na dnie lampy. W przypadku przetwarzania więcej niż jednej reakcji na raz, amplifikacja może być zainicjowana jednocześnie.
  3. Zawiesić osad RT-RPA, dodając 12,4 μl próbki RNA (lub próbek kontrolnych).
    UWAGA: Sekwencja dodawania to próbka ujemna/kontrola ujemna, RNA/DNA do testowania, próbka dodatnia/kontrola pozytywna.
  4. Aby zainicjować reakcję RT-RPA, należy na krótko odwirować dodany roztwór z kroków 3.2 i 3.3 za pomocą miniwirówki z odwirowaniem w temperaturze pokojowej przez 3 sekundy.
  5. Wymieszaj, ostrożnie stukając w rurkę, a następnie wykonaj kolejne krótkie wirowanie przez 3 sekundy.
  6. Inkubować reakcję w temperaturze 42 °C przez 60 minut, umieszczając ją w podgrzanym bloku grzewczym lub inkubatorze z wytrząsaniem termicznym.
  7. Po zakończeniu reakcji wyjmij probówki reakcyjne i umieść je na lodzie przed przejściem do etapu wykrywania CRISPR-Cas (sekcja 4).
    UWAGA: Produkt wzmocniony RPA może być stosowany w reakcji detekcji natychmiast lub może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

4. Wykrywanie kwasów nukleinowych CRISPR-Cas13

  1. Włączyć czytnik mikropłytek fluorescencyjnych, ustawić i podgrzać temperaturę ogrzewania do 37 °C, a następnie wybrać program pokazany w Tabeli 2.
  2. Umieść 384-dołkową płytkę na lodzie.
  3. Ponownie zawiesić liofilizowaną reakcję wykrywania wstępnie zmieszaną CRISPR-Cas (z sekcji 2), dodając 17 μl 8 mM roztworu chlorku magnezu. Wymieszaj, ostrożnie stukając w rurkę; Następnie krótko odkręć w dół przez 3 sekundy i umieść rurkę na lodzie.
  4. Przenieść 18 μl ponownie zawieszonej mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka wstępnie schłodzonej 384-dołkowej płytki na lodzie.
  5. Dodać 2 μl produktu RPA przygotowanego w sekcji 3 do każdej studzienki reakcyjnej.
  6. Wyjmij płytkę z lodu, szybko umieść ją w nagrzanym czytniku mikropłytek fluorescencyjnych i naciśnij start.
    UWAGA: Płytkę 384-dołkową umieszczono na lodzie, aby umożliwić synchronizację inicjacji reakcji, gdy płytka 384-dołkowa jest przenoszona do podgrzanego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwracamy uwagę na kinetykę generowania sygnału fluorescencji FAM z połączonego wykrywania genów s i n SARS-CoV-2 oraz na to, jak informacje te zostały wykorzystane do określenia optymalnych warunków dla liofilizowanych, wstępnie zmieszanych preparatów reakcyjnych. We wszystkich przypadkach uwzględniliśmy próbki o wartościach Ct mieszczących się w wyznaczonej granicy wykrywalności (LoD) (Ct ~31-33), a także te z Ct w LoD (Ct ~35-37)7, aby umożliwić różnicowanie protokołów o lepszej czułości.

Dla liofilizowanych, wstępnie zmieszanych RT-RPA, stwierdziliśmy, że włączenie KOAc do wstępnie zmieszanej reakcji negatywnie wpłynęło na czułość reakcji (Rysunek 2A). Dlatego pominęliśmy KOAc z wstępnie zmieszanej reakcji i dodaliśmy go za pomocą inicjatora reakcji, Mg(OAc)2, po dodaniu próbki RNA. Użyliśmy również podobnych testów, aby określić optymalne stężenie trehalozy krioprotekcyjnej ( Rysunek 2B) oraz wpływ triglicyny < sup class = "xref">7 w liofilizowanej reakcji RT-RPA (Rysunek 2C). W związku z tym przygotowano optymalne liofilizowane, wstępnie zmieszane reakcje RT-RPA z 6% trehalozą, bez KOAc (ale dodawano go później po próbce RNA) i uzupełniano trójglicyną, jak opisano w sekcji 1 protokołu.

figure-results-1
Rysunek 2: Optymalizacja liofilizowanych, wstępnie zmieszanych reakcji RT-RPA. Reakcję RT-RPA przygotowano przy użyciu starterów ukierunkowanych na gen n SAR-CoV-2. Mg(OAc)2 wykluczono ze wszystkich wstępnie zmieszanych reakcji. Oceniano wpływ (A) KOAc, (B) trehalozy i (C) triglicyny dodanych do wstępnie zmieszanych reakcji. Monitorowanie reakcji za pomocą wygenerowanej fluorescencji FAM przeprowadzono przy użyciu termocyklera w czasie rzeczywistym lub czytnika mikropłytek fluorescencyjnych. Pokazane są indywidualne dane z trzech pomiarów. Skróty: RT = odwrotna transkrypcja; RPA = amplifikacja polimerazy rekombinazy; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = białko związane z CRISPR; SAR-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2; Ct = próg cyklu; FAM = karboksyfluoresceina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dla liofilizowanych, wstępnie zmieszanych reakcji na bazie Cas13a, sprawdziliśmy, jak ważne jest posiadanie odpowiedniego krioprotektorantu: albo 6% trehalozy, albo 2% sacharozy19 działało dobrze, podczas gdy niższa sacharoza przy 1% lub 5% w/v PEG20000 nie zachowywała efektywności reakcji po liofilizacji (Rysunek 3). MgCl2 został pominięty we wszystkich reakcjach i został dodany na etapie hydratacji. Optymalna liofilizowana reakcja detekcji oparta na Cas13 została przygotowana z 6% trehalozą, jak pokazano w sekcji 2 protokołu.

figure-results-2
Rysunek 3: Optymalizacja liofilizowanych, wstępnie zmieszanych reakcji detekcji opartych na Cas13. Reakcję detekcji przeprowadzono w temperaturze 37 °C przy użyciu produktu RPA z genu SARS-CoV-2 n. Badania wykonano przed i po liofilizacji. MgCl2 został wykluczony ze wszystkich wstępnie zmieszanych reakcji. Oceniono zdolności (A) trehalozy, (B) PEG20000 i (C) sacharozy w zachowaniu efektywności reakcji po liofilizacji. Monitorowanie reakcji za pomocą wygenerowanej fluorescencji FAM przeprowadzono przy użyciu termocyklera w czasie rzeczywistym. Pokazano indywidualne dane z potrójnych pomiarów dla warunków "po liofilizacji" i jednej powtórzonej z warunków "przed liofilizacją". Rysunek 3A,B został zaczerpnięty z Patchsung et al.7. Skróty: RPA = amplifikacja polimerazy rekombinazy; SAR-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2; FAM = karboksyfluoresceina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Liofilizowane, wstępnie zmieszane odczynniki do reakcji opartych na RT-RPA i Cas13 są stabilne w temperaturze -20 °C przez co najmniej 8 miesięcy [Rysunek 4].

figure-results-3
Rysunek 4: Testy stabilności liofilizowanych, wstępnie zmieszanych odczynników RPA i CRISPR-Cas13a w temperaturze -20 °C. Test stabilności po (A) 30 dniach, (B) 45 dniach, (C) 3 miesiącach, (D) 5 miesiącach, (E) 8 miesiącach. Pokazane są indywidualne dane z trzech pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

LoD liofilizowanych reakcji opartych na RT-RPA i Cas13 do wykrywania genów s i n SARS-CoV-2 jest pokazane w Rysunek 5. Kinetyka generowania sygnału może ulec poprawie po wykryciu podwójnego genu w porównaniu z wykryciem tylko jednego genu.

figure-results-4
Rysunek 5: Analityczna czułość wykrywania pojedynczego genu w porównaniu z dwoma genami. (A) LoD liofilizowanego pojedynczego typu RT-RPA i detekcji opartej na Cas ukierunkowanej na gen s SAR-CoV-2. (B) LoD liofilizowanego pojedynczego RT-RPA i detekcji opartej na Cas ukierunkowanej na gen n SAR-CoV-2. (C) LoD liofilizowanego multipleksu RT-RPA i podwójnej detekcji opartej na Cas ukierunkowanej na geny s i n. LoD określono przy użyciu seryjnie rozcieńczonych RNA SARS-CoV-2, których wartości Ct określono za pomocą testu RT-qPCR ukierunkowanego na gen n. Wyświetlane są indywidualne dane z 3-6 powtórzonych pomiarów. Skróty: LoD = granica wykrywalności; RT = odwrotna transkrypcja; RPA = amplifikacja polimerazy rekombinazy; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = białko związane z CRISPR; SAR-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2; Ct = próg cyklu; qPCR = ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Poza wykrywaniem wirusów, prezentujemy prototyp narzędzia do genotypowania POC opartego na diagnostyce CRISPR, aby pomóc zidentyfikować gatunki jadowitych węży endemiczne dla Tajlandii (Rysunek 6). Szybsza i dokładniejsza identyfikacja gatunków węży za pomocą próbek DNA pobranych z ran po ugryzieniu może pomóc w szybkim podawaniu środków przeciwjadowych, zwiększając szanse pacjenta na przeżycie. Skupiliśmy się na regionach w obrębie mitochondrialnego genu cytochromu b (cytb) ośmiu gatunków węży, w tym Ophiophagus hannah (kobra królewska) (Figura 6A) i wykazaliśmy, że wykrywanie syntetycznych substytutów DNA genu O. hannah cytb może osiągnąć attomolowy poziom czułości (Figura 6B, C).

figure-results-5
Rysunek 6: Prototyp do wykrywania opartego na CRISPR w celu identyfikacji gatunków węży na podstawie ukąszeń węży. (A) Startery RPA i projekt crRNA LwaCas13a do wykrywania genu cytb w Ophiophagus hannah. Promotor T7 (zwis T7) umieszczono na końcu 5' przedniego spłonki RPA. (B) Kinetyka generowania sygnału FAM w ciągu 60 minut i (C) punkt końcowy fluorescencji FAM z wykrywania za pośrednictwem LwaCas13a syntetycznych wejść dsDNA odpowiadających segmentom genu cytb z O. hannah. Zastosowano różne stężenia wejściowe (0, 10-9, 10-12, 10-15 i 10-18 M). Dane są średnimi ± s.d. z trzech pomiarów. Skróty: RPA = amplifikacja polimerazy rekombinazy; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = białko związane z CRISPR; FAM = karboksyfluoresceina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.
Liofilizacja wstępnie zmieszanych odczynników do wykrywania CRISPR-Cas13a
KrokSzybkość narastaniaTemperatura półkiCzas (gg:mm)Próżnia
(°C/min)(°C)(mbar)
Zamrożenie 13-30od-
Suchy 13-30od0
Suchy 234godz. 01:000
Suchy 3320∞0

Tabela 1: Ustawienia liofilizatora wstępnie zmieszanych odczynników do wykrywania RT-RPA i CRISPR-Cas13a. Skróty: RT = odwrotna transkrypcja; RPA = amplifikacja polimerazy rekombinazy; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = białko związane z CRISPR.

Parametrustawienie
Temperatura37 °C
Cykl kinetycznyCzas trwania02:00 (mm:ss)
Czas interwału02:30 (mm:ss)
PotrząsanieCzas trwania1 sekund
trybliniowy
amplituda1 mm
Intensywność fluorescencjiDługość fali wzbudzenia488 nm
Długość fali emisji520 nm
trybDo góry
Pozycja ZNumer katalogowy: 24470
korzyść71 Rozdział 71
Czas integracji20 μs
Liczba błysków25

Tabela 2: Program czytnika mikropłytek fluorescencyjnych do wykrywania kwasów nukleinowych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole znajdują się krytyczne kroki. Do segregacji obszarów zaleca się stosowanie oddzielnych przestrzeni do ekstrakcji kwasów nukleinowych, przygotowania mastermixu (obszar przed amplifikacją), dodawania próbki i wykrywania amplikonów (obszar po amplifikacji). Każdy obszar powinien być ustawiony za pomocą osobnego zestawu narzędzi i sprzętu. Nie przenoś narzędzi z jednego obszaru do drugiego, zwłaszcza z obszaru po amplifikacji do obszaru przed amplifikacja. Konieczne jest czyszczenie obszarów roboczych: należy czyścić obszary robocze, pipety, wirowniki i markery permanentne roztworem do dekontaminacji RNazy/DNazy/3% Cloroxem, a następnie 70% etanolem lub autoklawowaną wodą dejonizowaną. Wymagane jest mycie podstawowych przyborów laboratoryjnych i wyjmowanych części instrumentów, takich jak plastikowe stojaki na probówki o pojemności 1,5 ml i adapter wirnika miniwirówki. Woda wolna od nukleaz jest używana jako kontrola ujemna i składnik reakcji, a zatem jest wrażliwym odczynnikiem, który może zostać zanieczyszczony, jeśli nie będzie się z nim obchodzić ostrożnie. Dlatego zalecamy przygotowanie małych porcji wody, które można użyć tylko raz.

Zawsze przeprowadzaj reakcję kontroli ujemnej przy użyciu starterów testowych w celu sprawdzenia zanieczyszczenia. Dodatkowo, aby uniknąć problemów z zanieczyszczeniem, zalecamy przygotowanie reakcji kontroli ujemnej poprzez dodanie wody wolnej od nukleaz w obszarze wstępnej amplifikacji zamiast w pomieszczeniu dodawania próbki. Mieszanina octanu magnezu i octanu potasu powinna być podawana w małych objętościach (~ 20 μl / probówka), które są używane tylko raz, aby uniknąć zanieczyszczenia odczynnikiem przeniesionymi amplikonami. W przypadku dodawania mieszaniny octanu magnezu i potasu do liofilizowanych reakcji RPA premiksu zalecamy każdorazową wymianę końcówki pipety. W przypadku przepływu pracy eksperymentów należy zachować jednokierunkowy przepływ pracy, od eksperymentów przed wzmocnieniem do eksperymentów po wzmocnieniu. Przejdź od "czystszych" (przed wzmocnieniem) miejsc pracy do "brudniejszych" (po wzmocnieniu).

W celu modyfikacji i rozwiązywania problemów związanych z metodą w celu uniknięcia przeniesienia zanieczyszczenia amplikonów, zalecamy przestrzenne oddzielenie trzech głównych etapów eksperymentu: przygotowanie reakcji RPA; dodawanie próbek; oraz etapy wzmacniania i wykrywania. Mastermix powinien być przygotowany w obszarze laboratorium wolnym od szablonów. Podczas przebieralni należy również zmienić rękawice i fartuchy laboratoryjne. Pracuj jednokierunkowo od wzmocnienia przed i po. Unikaj używania tej samej pipety do różnych etapów. Najlepiej, jeśli do tych etapów zostaną ustawione różne zestawy pipet: przygotowanie mieszanek głównych; dodanie matrycowego DNA/RNA; oraz transfer amplifikowanego produktu. Używaj końcówek z filtrem, staraj się w jak największym stopniu zapobiegać tworzeniu się aerozolu i unikaj dotykania wnętrza tubki podczas jej otwierania. Jeśli eksperymenty z amplifikacją wykażą zanieczyszczenie, wszystkie odczynniki należy wymienić. Jeśli to możliwe, udaj się do innego laboratorium ze świeżymi odczynnikami i sprawdź, czy zanieczyszczenie utrzymuje się. Oprócz odczynników nie zabieraj ze sobą niczego innego, w tym pipet. Spróbuj sterylizować pipety w autoklawie, jeśli można je sterylizować w autoklawie.

Aby poprawić szybkość amplifikacji (optymalizację testu), najpierw zapoznaj się z instrukcjami producenta, takimi jak instrukcja RPA firmy TwistDx, aby zapewnić optymalne projekty. Następnie wypróbuj empiryczne optymalizacje reakcji, takie jak dodanie dodatków reakcyjnych, o których wiadomo, że wzmacniają reakcje RPA i CRISPR7; wydłużenie czasu reakcji (np. czas reakcji RPA do 60 min); lub różne sekwencje i stężenia starterów. Zalecamy również dodanie jak największej objętości próbki; Użycie odczynników liofilizowanych pozwala na dodanie większej objętości próbki. Aby zmniejszyć fluorescencję tła, można wykonać etap inaktywacji ciepłem (75 °C przez 5 minut) po zakończeniu RPA, przed przejściem do detekcji lub optymalizacji stężenia reportera. Zbyt dużo reportera da wyższe tło. Ponadto dodanie inhibitorów RNazy pomaga zapobiegać niezależnej od Cas degradacji reportera.

Poza optymalizacją warunków reakcji opartych na (RT)-RPA i CRISPR oraz procedurami ich obsługi, należy upewnić się, że stosowane odczynniki są dobrej jakości, a etap ekstrakcji kwasów nukleinowych poprzedzający wszystkie reakcje zakończył się sukcesem. Liofilizowane odczynniki zapewniają wysoką czułość wykrywania, są przenośne, umożliwiają testowanie POC i mogą być stosowane do różnych próbek klinicznych. Co więcej, liofilizowany (RT)-RPA można natychmiast uwodnić, dodając ekstrakt kwasu nukleinowego z próbek klinicznych. Poprzednie badanie wykazało wyższą czułość przy wprowadzaniu większej objętości kwasu nukleinowego bez ograniczonej objętości, skutecznie zwiększając całkowitą ilość docelowego kwasu nukleinowego.

Diagnostyka oparta na CRISPR została przystosowana do wykrywania patogenów poprzez pobieranie próbek klinicznych, takich jak wymazy z nosogardzieli i gardła, mocz i surowica 7,8,11. Zastosowano go również do rozróżniania wariantów pojedynczych nukleotydów, identyfikacji genów oporności na antybiotyki w organizmach opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe oraz wykrywania mutacji związanych z rakiem. Użyteczność tej technologii może być największa w zastosowaniach terenowych, w których zmodyfikowane reakcje biochemiczne do amplifikacji izotermicznej i wykrywania opartego na CRISPR można połączyć z gotowymi do użycia w terenie urządzeniami i odczytami, takimi jak ręczny fluorometr lub boczne paski przepływowe.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.P. i C.U. złożyły w Tajlandii patent na preparaty do multipleksowanego wykrywania RNA SARS-CoV-2. R.K. deklaruje, że nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.U. potwierdza finansowanie z Siam Commercial Bank w ramach VISTEC-Siriraj Frontier Research Center, oraz z Thailand Science Research and Innovation (TSRI), fundusz fundamentalny, rok podatkowy 2024, numer grantu FRB670026/0457. R.K. i M.P. są wspierani odpowiednio przez fundusze stypendialne i asystentury badawczej z VISTEC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
roztwór betainySigma-AldrichB0300-1VL
DEPC-Woda uzdatnionaInvitrogenAM9915G
Dithiothreitol (DTT)Merck3870-25GM
Odwrotna transkryptaza EpiScriptLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly& nbsp;Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aProdukcja własnaNazwa szczepu: Leptotrichia wadei, Skrót: Lwa, Nazwa białka: LwaCas13a
Roztwór chlorku magnezu, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
Polimeraza RNA NxGenT7Lucigen30223-2
Poli(glikol etylenowy)Sigma-Aldrich81300-1KG
Roztwór octanu potasu, 5MSigma-Aldrich95843-100ML-F
Mieszanina roztworów ryobnukleotydówNEBN0466L
RNaza HNEBM0297L
SacharozaTCI TCI-S0111-500G
Trehaloza DihydratSigma-AldrichSIA-90210-50G
Roztwór chlorowodorku trizmy, 1M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194-100ML
Zestaw podstawowy TwistAmpTwistDxTABAS03KIT
Sprzęt
BluPAD Podwójny transiluminator LED światła niebieskiego/białegoBio-HelixBP001CU
Sucha kąpiel Podwójny blokELITE4-2-EL-02-220Model: EL-02
Mikropłytka fluorescencyjna czytnikTecan30050303Model: Liofilizator Infinite 200 Pro
LABCONCO794001030FreeZone Triad Liofilizator stołowy
Microplate 384-wellGreinerGDE0784076F-Bottom, mała objętość, Hibase, Med. Wiążące, czarne
Termocykler czasu rzeczywistego (CFX Connect Real-Time PCR System)Bio-Rad185-5201Model: Moduł
optyki CFX ConnectOligonukleotyd
s-gen forward RPA starter IDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gen reverse RPA primerIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
n-odwrócony starter RPAgenu IDTCAGACATTTTGCTCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA dla genu sSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAC
GAAGGGGACUAAAACGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA dla genu nSynthegoGAUUUAGACUACCAAAAACG
AAGGGGACUAAAAAAAGCAAG
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporterIDT56-FAM/rUrUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F Podkład RPAIDTGAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R Podkład RPAIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  2. Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
  3. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).
  4. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  5. Arizti-Sanz, J., et al. Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants. Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).
  6. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  7. Patchsung, M., et al. A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance. CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).
  8. Patchsung, M., et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  10. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  11. Myhrvold, C., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360 (6387), 444-448 (2018).
  12. Wu, H., et al. Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges. Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).
  13. Yao, R., et al. CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus. Front Vet Sci. 8, 603919(2021).
  14. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  15. Selvam, K., et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods. Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).
  16. Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA. J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).
  17. Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection. Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).
  18. Twistamp. Twistamp® assay design manual. , (2023).
  19. Qian, J., et al. An enhanced isothermal amplification assay for viral detection. Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).
  20. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications. ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  21. Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies. Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).
  22. Fang, X., et al. Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes. Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).
  23. Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction. Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).
  24. Wan, J., et al. Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables. J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).
  25. Curti, L. A., et al. Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 13 (3), 420(2021).
  26. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Diagnostyka CRISPRtesty w punkcie opieki POCTamplifikacja izotermicznadetekcja kwas w nukleinowychamplifikacja rekombinazowa polimerazy RPAdetekcja patogen wdetekcja marker w genetycznychdetekcja Cas13afluorescencyjny czytnik mikrop ytek

Powiązane artykuły