Artykuł metodologiczny

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66704

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Pisa

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Streszczenie

Wciąż brakuje leków na urazy rdzenia kręgowego (SCI) ze względu na skomplikowaną patofizjologię. Jedno z najbardziej obiecujących podejść regeneracyjnych opiera się na przeszczepie komórek macierzystych w celu zastąpienia utraconej tkanki i wspomagania powrotu do sprawności. Podejście to powinno być dalej badane pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności in vitro i ex vivo przed przystąpieniem do droższych i bardziej czasochłonnych testów na zwierzętach. W niniejszej pracy pokazujemy stworzenie długoterminowej platformy opartej na organotypowych wycinkach mysiego rdzenia kręgowego (SC) przeszczepionych ludzkimi nerwowymi komórkami macierzystymi w celu przetestowania komórkowych terapii zastępczych w przypadku SCI.

Standardowe kultury organotypowe SC są utrzymywane przez około 2 lub 3 tygodnie in vitro. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół długotrwałej konserwacji (≥30 dni) przez okres do 90 dni. Pożywka stosowana do długoterminowej hodowli plastrów SC została również zoptymalizowana pod kątem przeszczepiania nerwowych komórek macierzystych do modelu organotypowego. Ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z SC (H-SC-NES) niosące reporter z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) przeszczepiono do mysich plastrów SC. Trzydzieści dni po przeszczepie komórki nadal wykazują ekspresję GFP i niski wskaźnik apoptozy, co sugeruje, że zoptymalizowane środowisko utrzymało ich przetrwanie i integrację w tkance. Protokół ten stanowi solidny punkt odniesienia dla skutecznego testowania terapii wymiany komórek w tkance SC. Platforma ta umożliwi naukowcom przeprowadzanie wstępnych badań przesiewowych ex vivo różnych terapii przeszczepiania komórek, pomagając im wybrać najbardziej odpowiednią strategię przed przystąpieniem do eksperymentów in vivo.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) ma druzgocące konsekwencje fizyczne, psychologiczne i ekonomiczne dla pacjentów i opiekunów1. Podjęto wiele prób promowania regeneracji aksonów w SCI przy użyciu różnych podejść2,3,4 i wykazano pewne korzystne efekty poprzez tworzenie przekaźników neuronalnych między neuronami proksymalnymi i dystalnymi w miejscu uszkodzenia za pomocą terapii wymiany komórek. Zainteresowanie terapiami komórkowymi wciąż rośnie5, ponieważ przeszczepione komórki mogą odgrywać wiele ról, w tym zapewniać wsparcie troficzne, modulację immunologiczną, regenerację utraconych obwodów nerwowych poprzez indukcję plastyczności, wymianę komórek i remielinizację aksonów6.

Ostatnio, główny wysiłek w tej dziedzinie skupił się na ludzkich nerwowych komórkach macierzystych/progenitorowych (NSC/NPC)7. Kilka badań sugeruje, że NSC/NPC modulują odpowiedź astrocytów8, promują wydzielanie czynników proregeneracyjnych9,10 i zastępują brakujące komórki neuronalne w SCI11,12. Jednak badania, które wspierają różnicowanie przeszczepionych komórek w funkcjonalne neurony, są nadal słabe. Co więcej, przeżywalność i różnicowanie przeszczepionych komórek w uszkodzonym rdzeniu kręgowym (SC) jest niskie13, prawdopodobnie dlatego, że przeszczepione komórki potrzebują kilku tygodni, a nawet miesięcy, aby różnicować się in vivo. Ponadto obecne badania nie wyjaśniły w pełni wielu biochemicznych, molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych aspektów terapii zastępowania komórek. W tym kontekście potrzebne są proste, szybkie i opłacalne modele do badania mechanizmów wszczepiania komórek, zdolności przeszczepionych komórek do proliferacji, różnicowania się w określone typy lub subpopulacje komórek oraz tworzenia synaps z neuronami rezydentnymi.

Integracja badań histologicznych z zapisem elektrofizjologicznym oraz profilowaniem transkryptomu i proteomu jest niezbędna do pełnego zrozumienia kaskady molekularnej zachodzącej po przeszczepie komórki. Z pewnością przyspieszy to projektowanie i walidację nowych terapii zastępczych komórek w modelach przedklinicznych i badaniach klinicznych. Rzeczywiście, do tej pory wykorzystanie gryzoni, dużych zwierząt i naczelnych było warte zachodu w celu wyjaśnienia wielu procesów komórkowych po przeszczepie14. Jednak ze względu na wysokie koszty, duży wpływ etyczny, a także złożoność organizmu, ich zastosowanie często nie jest proste lub niewystarczające do rozwikłania procesów biochemicznych i molekularnych. Ponadto mogą mieć wiele wad skorelowanych z różnicami biologicznymi, zarówno międzygatunkowymi (metabolizm), jak i zmiennością wewnątrzgatunkową (płeć, wiek). Czynniki te, wraz z czynnikami zewnętrznymi, takimi jak sytuacje stresowe, mogą zmienić wynik eksperymentu i ich przewidywalność pod względem translacji terapeutycznej na ludzi15,16,17.

Dlatego wiele grup stosuje hodowle komórkowe 2D in vitro i organiczne plastry ex vivo (hodowle ex vivo) oprócz modeli zwierzęcych. Hodowla komórkowa 2D jest najczęściej używanym systemem do badania określonych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki i/lub populacji komórek. Niemniej jednak jednowarstwowe hodowle komórkowe nie odzwierciedlają złożoności występującej w całym organizmie. Brak struktur tkankowych i środowiska fizjologicznego nie pozwala systemom hodowli 2D na pełną emulację kluczowych aspektów strukturalnych, morfologicznych i funkcjonalnych badanej tkanki18,19,20. Hodowle organotypowe mogą przezwyciężyć niektóre z tych problemów. Modele organotypowe opierają się na eksplantacji fragmentu tkanki lub narządu i utrzymywaniu go ex vivo przez ograniczony czas21,22. W szczególności generowane są plastry eksplantowanej tkanki o precyzyjnej grubości, która umożliwia składnikom odżywczym łatwe dotarcie do prawie wszystkich komórek w plasterkach. Mogą być generowane z różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego, takich jak hipokamp, podwzgórze, móżdżek, wzgórze, kora mózgowa, istota i prążkowie oraz rdzeń kręgowy23. Kultury organotypowe zachowują architekturę tkankową, rozmieszczenie przestrzenne komórek, różnorodność komórkową i środowisko (tj. skład macierzy zewnątrzkomórkowej) narządu pochodzenia. Ponadto zachowują pierwotną aktywność neuronalną, połączenia między komórkami, a w szczególności krótkie obwody po eksplantacji.

Te aspekty zapewniają pewne korzyści dla kultur ex vivo zarówno w odniesieniu do kultur jednowarstwowych, jak i modeli zwierzęcych. Zachowują kluczowe cechy tkanek znalezione in vivo, ale z redukcją kosztów i możliwością wykonywania różnych typów eksperymentów molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych z dokładną regulacją parametrów środowiskowych hodowli24,25,26,27,28,29. Wycinki organotypowe mogą być również wykorzystywane do opracowywania modeli różnych zaburzeń neurologicznych poprzez upodabnianie kluczowych cech histopatologicznych określonych schorzeń30. Co więcej, zachowanie pierwotnego środowiska tkanek wielokomórkowych sprawia, że są one odpowiednimi platformami do badań przesiewowych leków oraz do testowania cząsteczek i materiałów neuroprotekcyjnych i neuroregeneracyjnych.

W tej pracy proponujemy użycie kultur organotypowych SC jako modelu do optymalizacji przeszczepów NSC. Nie jest to trywialne, ponieważ wymagane są optymalne warunki hodowli, aby zagwarantować przeżycie zarówno gospodarza (tkanka SC), jak i przeszczepu (NSC) przez tygodnie. Różne grupy badawcze wszczepione w kultury organotypowe, pochodzące z mózgu i pochodzące z SC, różne typy komórek. Większość prac dotyczyła przeszczepu mezenchymalnych komórek macierzystych31,32,33, węchowe komórki osłonowe34, lub NSCs35,36,37,38,39,40 i oceniono interakcje przeszczepionych komórek z komórkami gospodarza, przeżywalność całego systemu oraz to, czy przeszczepione komórki różnicowały się w neurony, czy komórki podobne do neuronów w środowisku tkankowym ex vivo32,33,41. Niektórzy z nich oceniali potencjał regeneracyjny komórek po przeszczepie, obserwując ich aksonalny wzrost wewnątrz tkanki37,40,41, zdolność mielinizacyjna wszczepionych prekursorów oligodendrocytów42, migracja przeszczepionych komórek do tkanki gospodarza43oraz czy przeszczepione komórki uwalniały czynniki popychające w kierunku środowiska proregeneracyjnego31. Jednym z ograniczeń obecnych badań jest to, że nie badają one wszczepienia przez długi czas.

Biorąc pod uwagę, że NSC wydają się potrzebować kilku tygodni na rozróżnienie in vivo44,45, to badanie skupia się na tym, jak generować i utrzymywać długoterminowe (≥30 dni) mysie wycinki SC przez okres do 90 dni. Stwierdzono, że plastry zachowują swoją pierwotną strukturę anatomiczną i utrzymują niską i stabilną szybkość apoptozy w czasie oraz wysoką żywotność komórek. Zaobserwowaliśmy rozproszoną ekspresję markerów neuronalnych RNA wiążącego homolog 3 fox-1 (RBFOX3) i łańcucha lekkiego neurofilamentu (NFL), przy czym ten ostatni wykazuje z czasem rosnący trend kiełkowania aksonów wokół plasterków, co świadczy o ich zdrowym stanie. Co więcej, udało nam się przeszczepić do plastrów SC ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z ekspresji GFP (h-SC-NES) na pierwszych etapach różnicowania neuronów. Przeszczep NSC utrzymywano przez 30 dni po przeszczepie, a komórki wykazywały ekspresję GFP przez cały okres hodowli. Stwierdzono również, że szybkość apoptozy komórek w dniu po przeszczepie (DPT) 30 jest zgodna z wartością szybkości apoptozy obserwowaną przy DPT 7 w tych samych komórkach40. Komórki wydawały się wszczepiać w środowisko tkankowe i przeżywały do kilku tygodni.

Podsumowując, nasze dane pokazują, że możliwe jest utrzymanie w kulturze wycinków organotypowych SC przez 3 miesiące bez uszczerbku dla ich pierwotnej cytoarchitektury i środowiska tkankowego. Co najważniejsze, można je wykorzystać do testowania terapii komórkowych przed przystąpieniem do eksperymentu in vivo, zmniejszając w ten sposób koszty i czas eksperymentu. Tutaj szczegółowo ilustrujemy wszystkie fragmenty do generowania mysich plasterków organotypowych SC i jak je utrzymywać przez długi czas (≥30 dni). Ponadto szczegółowo wyjaśniamy, jak przeprowadzić przeszczep NPC do wycinków i jak zachować je do dalszej analizy.

Protokół

Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z protokołami zatwierdzonymi przez włoskie Ministerstwo Zdrowia Publicznego i lokalną Komisję Etyki Uniwersytetu w, zgodnie z Dyrektywą 2010/63/UE (licencja projektu nr 39E1C. N.5Q7 wydany 30.10.2021). Myszy C57BL/6J trzymano w regulowanym środowisku (23 ± 1 °C, 50 ± 5% wilgotności) z 12-godzinnym cyklem jasno-ciemnym z jedzeniem i wodą ad libitum.

Wszystkie prace związane z komórkami h-SC-NES zostały wykonane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi pozyskiwania i dystrybucji tkanek ludzkich do celów badań biomedycznych oraz za zgodą Komitetów Badawczych ds. Badań Naukowych na Ludziach i Instytucjonalnych Komisji Etycznych każdego instytutu, z którego pobrano próbki. Ostateczna akceptacja została uzyskana przez Komitet Bioetyki Uniwersytetu w (przegląd nr 29/2020). Zanonimizowane próbki ludzkie zostały dostarczone w ramach grantu Joint MRC/Wellcome Trust (099175/Z/12/Z), Human Developmental Biology Resource (www.hdbr.org). Uzyskano odpowiednią świadomą zgodę, a wszystkie dostępne informacje nieidentyfikujące zostały zarejestrowane dla każdej próbki. Z tkanką obchodzono się zgodnie z wytycznymi etycznymi i przepisami dotyczącymi badań klinicznych nad ludzką tkanką mózgową, określonymi przez NIH (http://bioethics.od.nih.gov/humantissue. html) i Deklarację WMA z Helsinek (http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html).

1. Przygotowanie roztworów i sprzętu do izolacji rdzenia kręgowego (SC) i hodowli

  1. Rozwiązanie powłokowe do wkładów membranowych
    1. Przygotować roztwór powlekający (Tabela 1): roztwór wodny zawierający 0,1 mg kolagenu mL-1, 0,01 mg mL-1 poli-L-lizyny i 0,01 mg mL-1 lamininy.
    2. Umieść każdą wkładkę membranową w naczyniu o średnicy 35 mm lub płytce 6-dołkowej.
    3. Dodać do górnej części membrany 1 ml roztworu powlekającego: inkubować roztwór przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT); następnie usunąć go i pozostawić wkładkę membranową do wyschnięcia przez noc (ON). Wkłady membranowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich użycia.
      UWAGA: Wszystkie pasaże powinny być wykonywane w warunkach sterylnych. Powłokę membrany należy przechowywać maksymalnie przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C przed użyciem, aby uniknąć degradacji białka i nieoptymalnego przylegania plastrów do membrany.
  2. Przygotowanie podłoża: podłoże organotypowe, podłoże preparacyjne, podłoże do przeszczepu
    1. Przygotować podłoże organotypowe (OM, tabela 1).
    2. Przygotować podłoże do preparacji zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    3. Przygotuj pożywkę do szczepienia (GM, zoptymalizowana na podstawie Onorati et al.46, Tabela 1).
      UWAGA: Roztwory należy przygotować w sterylnych warunkach i tuż przed ich użyciem (1 dzień przed lub tego samego dnia doświadczenia).
  3. Przygotowanie materiału do zabiegu
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy przechowywać w gotowości: mikroskop stereoskopowy do preparacji oraz narzędzia chirurgiczne: dwie pary mikronożyczek, dwie pary prostych pęset i dwie pary zakrzywionych pęset.
    2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj rozdrabniacz, wyposażając go w ostrze do krojenia SC na plasterki. Obróć rozdrabniacza, aby podnieść metalowe ramię, w którym powinno być umieszczone ostrze. Umieść ostrze w wyznaczonym miejscu, opuść metalowe ramię z ostrzem, aż zetknie się z platformą tnącą i zamocuj je, dokręcając zabezpieczającą kluczem imbusowym, aż ostrze zostanie mocno zamocowane. Obrócić mikrometryczną do żądanej grubości plastra (zwykle 350 μm). Sprawdź, czy ostrze jest ustawione dokładnie prostopadle do urządzenia tnącego.
      UWAGA: Precyzyjne ustawienie ostrza prostopadle w stosunku do zespołu tnącego jest niezbędne do prawidłowego wykonania cięcia.
    3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy przygotować: dwie plastikowe pipety Pasteura (niezbędne do przemieszczania wyizolowanego SC i plastrów), co najmniej cztery szalki 35 mm i dwie 60 mm oraz pudełko świeżego lodu.
    4. Wysterylizuj wszystkie narzędzia 70% etanolem i promieniowaniem UV (jeden cykl trwający 20 minut) tuż przed ich użyciem, aby zachować sterylność hodowli.

2. Izolacja myszy SC i generowanie plasterków

  1. Izolacja myszy SC
    1. Poświęć młode myszy w 3 dniu poporodowym (P3) zgodnie z licencją projektu.
    2. Poprzez laparotomię w linii środkowej za pomocą mikronożyczek odizoluj odcinek lędźwiowy kręgosłupa od reszty ciała myszy i umieść go w zimnym podłożu preparacyjnym w naczyniu o średnicy 35 mm.
    3. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i mikronożyczek przeciąć kręgosłup wzdłuż osi strzałkowej i za pomocą prostej pęsety delikatnie usunąć SC z jamy kręgosłupa.
    4. Ostrożnie odklej opony mózgowe z izolowanego odcinka lędźwiowego SC za pomocą prostej pęsety.
    5. Przenieś i inkubuj izolowany obszar lędźwiowy SC w zimnym i świeżym podłożu preparacyjnym przez 10-15 minut przed przystąpieniem do następnego kroku.
  2. Generowanie plasterków
    1. Używając jednej plastikowej pipety Pasteura, weź izolowany odcinek lędźwiowy SC z pożywki preparacyjnej i umieść go na platformie tnącej narzędzia do siekania, prostopadle do ostrza.
      UWAGA: Prawidłowe ustawienie SC w stosunku do ostrza (prostopadle) jest niezbędne do prawidłowego generowania plastrów SC.
    2. Usuń resztki pożywki preparacyjnej z pokładu wokół SC za pomocą pipety Pasteura i sterylnego papieru chłonnego. Kontynuuj automatyczne cięcie SC.
    3. Gdy plastry zostaną wytworzone, umieść trochę świeżego podłoża preparacyjnego za pomocą pipety Pasteura na platformie tnącej z plastrami. Następnie zbierz plastry do naczynia o średnicy 35 mm ze świeżym podłożem do preparowania i inkubuj je przez 15 minut.
    4. Podczas inkubacji plastrów należy przemyć powierzchnię wkładek membranowych 3x za pomocą OM za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Następnie pozostaw 1 ml OM na dnie każdej wkładki membranowej.
    5. Sprawdź plastry pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji. Wysiewaj żądaną liczbę plastrów na kondycjonowanych wkładkach membranowych, przenosząc je plastikową pipetą Pasteura.
    6. Przesuń plastry w preferowanej orientacji i żądanej pozycji na wkładki membranowe za pomocą prostej pęsety. Usuń nadmiar podłoża za pomocą pipety Pasteura, aby plastry lepiej przylegały do powierzchni membrany.
      UWAGA: Przesuwanie i ukierunkowywanie plastrów za pomocą prostej pęsety powinno być wykonywane delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia tkanki lub wkładu membranowego.
    7. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C przenieść wkładkę na nową szalkę Petriego.
      UWAGA: Dotykaj plastikowego pierścienia, ale nie membran podczas wymiany medium.
    8. Dodaj 1 ml świeżego OM uzupełnionego czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych (GDNF) 100 ug mL-1 na dnie wkładki membranowej.
    9. Inkubować plastry w temperaturze 37 °C. Odnosić się do pierwszego dnia hodowli jako dzień ex vivo (DEV) 0.

3. Długotrwała hodowla plastrów organotypowych

  1. Utrzymuj plastry w kulturze w temperaturze 37 °C do pożądanego punktu czasowego.
  2. Zastąp pożywkę świeżym OM w DEV 1 zgodnie z opisem w krokach 2.2.7-2.2.8.
  3. W DEV 3 zmień pożywkę na GMO, aby stworzyć odpowiednie środowisko do przeszczepu komórek macierzystych następnego dnia. Wymieniaj pożywkę na nową GM co 48 godzin (np. DEV 5, DEV 7...).
  4. Dodawać świeży GDNF (stężenie końcowe 100 μg mL-1) do pożywki codziennie aż do DEV 7. Po DEV 7 dodaj go tylko wtedy, gdy nośnik zostanie zmieniony (krok 3.3).

4. Hodowla komórek h-SC-NES

UWAGA: komórki h-SC-NES są utrzymywane w hodowli w obecności czynników wzrostu (pożywka NES, krok 4.1.1). Przed przeszczepem komórki są posiane w stanie przed różnicowaniem przez 7 dni poprzez usunięcie czynników wzrostu z pożywki (pożywka predyferencyjna: pożywka NES bez czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2) i naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), krok 4.1.2). Następnie komórki są posiane w warunkach różnicowania (pożywka różnicująca, krok 4.1.3) przez 2 dni przed przeszczepem. Różnicowanie jest wspierane przez dodanie suplementów neurotroficznych (czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego, BDNF) do podłoża różnicowania. Utrzymanie, podział, wstępne różnicowanie i różnicowanie komórek h-SC-NES12,46są szczegółowo opisane poniżej.

  1. Przygotowanie pożywki: NWW, pożywki do różnicowania i różnicowania
    1. Przygotować pożywkę do konserwacji komórek h-SC-NES (pożywka NES, tabela 1).
    2. Przygotować pożywkę do różnicowania komórek h-SC-NES (pożywka do różnicowania wstępnego, tabela 1).
    3. Przygotować pożywkę do różnicowania komórek h-SC-NES (pożywka różnicująca, tabela 1). Dodać BDNF na świeżo, gdy pożywka jest zmieniana lub gdy komórki są posiane po raz pierwszy w stanie różnicowania.
      UWAGA: Wszystkie podłoża powinny być przygotowane w sterylnych warunkach i powinny być przefiltrowane filtrami 0,22 μm.
  2. Roztwór do powlekania ogniw h-SC-NES
    UWAGA: komórki h-SC-NES są utrzymywane w podłożach hodowlanych pokrytych POLFN (POLFN = Poli-L-Ornityna, Laminina, Fibronektyna).
    1. Przygotować roztwór powlekający w probówce: roztwór poli-L-ornityny z lamininą (5 μg mL−1) i fibronektyną (1 μg mL−1).
    2. Przenieś przygotowany roztwór powlekający do podłoża hodowli komórkowej, uważając, aby dodać tyle, aby pokryć całą powierzchnię podłoża hodowli komórkowej. Inkubować powłokę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć roztwór powlekający z podpór kultur komórkowych.
      UWAGA: Roztwór POLFN można poddać recyklingowi jeszcze dwa razy, ale Laminina i Fibronektyna powinny być za każdym razem dodawane na świeżo.
    4. Umyj powłokę 3x sterylną wodą klasy do hodowli komórkowych. Powłoki należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub używać.
      UWAGA: Powłoki należy zużyć w ciągu 1 tygodnia. Następnie powłoki uważa się za wygasłe z powodu procesów degradacji dodanych białek.
  3. Konserwacja ogniw h-SC-NES
    1. Utrzymuj komórki h-SC-NES w hodowli w pożywce NES. Codziennie sprawdzaj komórki pod mikroskopem, aby monitorować, kiedy dotrą do zbiegu.
    2. Zmieniaj połowę podłoża co 2 dni: usuń połowę kondycjonowanej pożywki i dodaj świeżą (weź pod uwagę 20% szybkość parowania).
    3. Jeśli komórki dojdą do konfluencji, kontynuuj dzielenie, jak opisano w kroku 4.4.
  4. Pasaż komórkowy h-SC-NES
    UWAGA: Komórki są podzielone w następujący sposób12:
    1. Usunąć kondycjonowaną pożywkę i raz przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco bez Ca2+/Mg2+.
    2. Usuń DPBS i dodaj roztwór trypsyny/EDTA do komórek, aby przeprowadzić enzymatyczne oderwanie. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 30 s do 1 minuty.
    3. Po inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem: jeśli nie są odłączone, lekko postukać w podłoże hodowli komórkowej, aby wykonać mechaniczne oderwanie i inkubować je w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 sekund.
    4. Po inkubacji dezaktywować trypsynę/EDTA, dodając 4 objętości roztworu DPBS/płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (10% obj./obj.) do nośnika hodowli komórkowej z komórkami i trypsyną/EDTA. Delikatnie pipetuj roztwór na powierzchni podpory hodowli komórkowej w górę iw dół, aby pomóc wszystkim komórkom się odłączyć. Zebrać zawiesinę komórek do probówki.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 200 × g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad na świeżym podłożu NES.
    6. Policz komórki i umieść je na każdym nowym podłożu hodowlanym pokrytym POLFN o gęstości ̴0,5-1 × 105 komórek/cm2.
    7. Dodać Y-27632 (10 μM) i umieścić ogniwa w temperaturze 37 °C. Sprawdzaj je codziennie aż do zbiegu, a następnie podziel je ponownie w celu konserwacji/rozbudowy lub bankowania komórek.
  5. Wstępne różnicowanie komórek h-SC-NES
    1. Podziel komórki zgodnie z opisem w kroku 4.4.
    2. Płytki komórek na podporach hodowlanych pokrytych POLFN o gęstości ̴0,5-1 × 105 komórek/cm2 w podłożu predyferencjacyjnym. Dodaj Y-27632 (10 μM) po podzieleniu. Zadzwoń do pierwszego dnia w dniu preróżnicowania in vitro (DIV) 0.
    3. Zmieniaj połowę podłoża co 2-3 dni (patrz krok 4.3.2).
    4. Utrzymuj komórki w stanie przed różnicowaniem do DIV 7, a następnie przejdź do kroku 4.6.
  6. Różnicowanie komórek h-SC-NES
    1. W DIV 7 predyferencjacji podziel komórki zgodnie z opisem w kroku 4.4.
    2. Płytki komórek na podłożach hodowlanych pokrytych POLFN o gęstości ̴1-1,5 × 105komórek/cm2w pożywce różnicowej. Dodaj Y-27632 (10 μM) i BDNF (30 ng mL−1) po rozdzieleniu.
    3. Po 2 dniach różnicowania (DIV 10) podziel komórki do przeszczepu na plasterki.

5. Transdukcja komórek h-SC-NES za pomocą wektorów lentiwirusowych przenoszących GFP

UWAGA: Transdukcja komórek odbywa się podczas fazy konserwacji komórek h-SC-NES. Gdy komórki są prawidłowo transdukowane, mogą one zostać rozszerzone i stosowane są opisane wcześniej protokoły preróżnicowania i różnicowania (kroki 4.5 i 4.6).

  1. Przygotowanie pożywki transdukcyjnej komórkowej
    UWAGA: Pożywkę do transdukcji komórek przygotowuje się przez zmieszanie określonej objętości pożywki NES i precyzyjnej objętości preparatu wektora lentiwirusowego (LVS) zgodnie z różnymi parametrami: pożądanym MOI (wielokrotność infekcji = stosunek liczby cząstek wirusa do liczby komórek gospodarza w danej pożywce infekcyjnej); liczba posianych komórek; początkowe stężenie preparatu LVS (=LVS PFU, jednostka tworząca płytkę nazębną); powierzchni używanego naczynia hodowlanego.
    1. Obliczyć prawidłową objętość preparatu LVS, który należy dodać do podłoża NES, zgodnie z wybranym MOI, korzystając z równań (1) i (2).
      (n komórek do płytki/cm2) × cm2 nośnika hodowli komórkowej × MOI = LVS PFU dla wybranego MOI (1)
      LVS PFU: Tot Początkowy LVS Vol (μL) = LVS PFU dla MOI : LVS Vol do dodania do podłoża (μL)(2)
      UWAGA: LVS PFU (początkowy PFU LVS) i całkowita początkowa objętość LVS są podane przez producenta. LVS PFU dla wybranego MOI oblicza się zgodnie z opisem w równaniu (1). W ten sposób możemy uzyskać objętość preparatu LVS, którą należy dodać do całkowitej objętości pożywki NES (w oparciu o nośnik do hodowli komórkowych) dla wybranego MOI, jak opisano w równaniu (2).
      Przykład: Użyliśmy MOI 3, w oparciu o wcześniejsze doświadczenia laboratoryjne (MOI może się różnić w zależności od użytej linii komórkowej i preparatu wirusowego). Jeśli pożądany MOI wynosi 3, liczba komórek do posiewu wynosi 0,5 × 105/cm2, a podłożem hodowli jest 1 dołek MW24 (2 cm2), przy założeniu, że początkowa LVS PFU/TU (jednostka tworząca płytkę nazębną/jednostka przetwornikowa) wynosi 25 × 106 PFU w 1 ml (1 000 μL = początkowa objętość LVS), Obliczenia są następujące:
      Ogniwa posiane w 1 dołku-MW24 (2 cm2) = 0,5 × 105 komórek × 2 cm2 = 1 × 105 komórek
      1 × 105 komórek × 3 (MOI) = 3 × 105 PFU = LVS PFU dla MOI 3
      25 × 106 PFU:1 000 μL = 3 × 105 PFU:x μL
      x μL = 12 μL = objętość LVS do dodania do pożywki
      Tak więc, aby transdukować komórki za pomocą pożywki transdukcyjnej komórek z MOI 3 w 1 dołku-MW24, dodaj 12 μl początkowego preparatu LVS do pożywki NES (238 μL) przygotowanej dla 1 dołka MW24. Ostateczna całkowita objętość wynosi 250 μL.
      UWAGA: Pożywka jest zwykle przygotowywana na świeżo w dniu transdukcji w sterylnych warunkach.
  2. Protokół transdukcji h-SC-NES
    1. Komórki h-SC-NES należy rozszczepić w małym pasażu na 24-dołkowej płytce powlekanej POLFN (lub w innym podłożu do hodowli) o gęstości 0,5 ×10 5/cm2 w podłożu NES.
    2. Następnego dnia zbierz kondycjonowaną pożywkę NES ze studzienek, w których komórki zostały platerowane. W zależności od wybranego podłoża do hodowli, dodać do komórek najmniejszą objętość pożywki do transdukcji świeżych komórek niezbędną do równomiernego pokrycia powierzchni wysiewu (np. 250 μl/dołek z 24-dołkowej płytki).
    3. Następnie inkubować komórki h-SC-NES przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie dodać wcześniej zebraną kondycjonowaną pożywkę do komórek (200 μl/basenik z 24-dołkowej płytki) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
    4. Następnego dnia przemyj komórki h-SC-NES raz DPBS i wykonaj całkowitą wymianę pożywki (pożywka NES).
    5. W następnych dniach sprawdź komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zaobserwować ekspresję GFP.
    6. Rozszerz komórki h-SC-NES do bankowania i przeszczepiania komórek.

6. Przeszczep komórek do wycinków SC i współhodowla

  1. Przygotowanie mikroigieł szklanych
    1. Użyj ściągacza, aby uzyskać cienkie igły z kapilar ze szkła borokrzemianowego. Ustaw ściągacz w następujący sposób: HEAT 990, PULL 350.
      UWAGA: Z jednej kapilary można uzyskać dwie cienkie igły.
  2. Przygotowanie komórek do przeszczepu
    1. Podziel komórki zgodnie z opisem w kroku 4.4.
      UWAGA: Jeśli komórki nie wykazują ekspresji fluorescencyjnego reportera, oznacz je barwnikiem śledzącym komórki, aby monitorować je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego po przeszczepie i podczas długotrwałej hodowli. Postępuj zgodnie z protokołem wybranego producenta na etapie etykietowania.
    2. Policz komórki po rozdrobnieniu i odwiruj przy 200 × g przez 3 min. Zawiesić otrzymany osad na świeżej pożywce + Y-27632 (10 μM), aby uzyskać pożądane stężenie komórek (zwykle w zakresie 30 000-50 000 komórek μL-1).
    3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 500 μl lub 1,5 ml i umieścić ją na lodzie. Komórki są gotowe do przeszczepu.
  3. Przeszczepianie komórek do plastrów organotypowych
    UWAGA: Wykonaj przeszczepy komórek h-SC-NES do mysich plastrów organotypowych SC za pomocą mikroiniektora powietrznego i szklanych mikroigieł.
    1. Załadować szklaną mikroigłę 4 μl zawiesiny komórek za pomocą mikropipety i końcówek do mikroładowania.
      UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza w igle, ponieważ może to utrudnić proces mikroiniekcji. Jeśli pojawią się pęcherzyki, usuń je za pomocą mikropipety.
    2. Umieść igłę w wyznaczonym wsporniku mikroiniektora i złamij końcówkę igły za pomocą prostej pęsety.
      UWAGA: Rozbij szklaną igłę bliżej końcówki, aby uniknąć tworzenia się dużych otworów.
    3. Przed przesadzeniem do plastrów ustaw parametry mikroiniekcji. Ustaw ciśnienie na 10 psi.
      UWAGA: Wartość ciśnienia może być zmieniana w oparciu o mikrowtryskiwacz i obserwacje operatora: ciśnienie powinno być wystarczające do mikroiniekcji zawiesiny komórek, unikając uszkodzenia tkanek.
    4. Na skalibrowanym szkiełku podstawowym nanieś kroplę oleju mineralnego za pomocą pipety Pasteura i wstrzyknij do niej zawiesinę komórkową. Średnica uzyskanej kuli zawiesiny komórkowej w kropli oleju koreluje z określoną objętością mikroiniekcji. W razie potrzeby należy zmienić parametry mikroiniekcji, aby osiągnąć średnicę kuli zawiesiny komórek wynoszącą 0,2 mm do wstrzyknięcia 4nL.
    5. Po ustawieniu prawidłowej objętości należy szybko wstrzyknąć zawiesinę komórkową do plastrów. Sprawdź pod stereoskopem fluorescencyjnym obecność komórek w plasterkach, aby upewnić się, że mikrowstrzyknięcie/przeszczep powiodło się.
      UWAGA: Zawiesina komórek może czasami zatykać igłę: w takim przypadku należy spróbować usunąć zator zawiesiny komórkowej poprzez modyfikację parametrów iniekcji lub załadować nową igłę zawiesiną świeżych komórek.
    6. Po przesadzeniu umieścić plastry w temperaturze 37 °C i 5% CO2do pożądanego punktu czasowego i co drugi dzień zmieniać podłoże, jak opisano w krokach 2.2.7-2.2.8.

7. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Dzień 1
    1. Usuń podłoże z dolnej części membrany wkładu i umyj plastry 3x podgrzanym DPBS.
    2. Przymocuj plastry za pomocą podgrzanego 4% formaldehydu (FA): usuń DPBS i dodaj 1,5 ml 4% FA na dnie wkładki membranowej z plastrami. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 1 ml więcej 4% FA na górną powierzchnię wkładki membranowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Całkowity czas utrwalania: 30 minut w temperaturze pokojowej
    3. Usuń 4% FA i myj plastry przez 3 x 10 min z DPBS.
    4. Przeciąć membranę wkładki obwodowo nożem chirurgicznym, oddzielić membranę z plastrami od plastikowego elementu wkładki i postępować zgodnie z etapami immunofluorescencji.
      UWAGA: Po tym kroku membrana z plastrami unosi się w DPBS w naczyniu.
    5. Przepuszczać z 1 ml/membranę roztworu z 0,7% trytonem w DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć roztwór permeabilizacyjny i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z 1 ml/membranę roztworu blokującego składającego się z 0,5% Trytonu i 10% FBS w DPBS.
    7. Usunąć roztwór blokujący i dodać do plasterków przeciwciała pierwszorzędowe w ich roboczym rozcieńczeniu, np. mysie przeciwciało anty-neurofilamentowe (NFL), 1:500; królicze przeciwciało anty-NFL, 1:500; królicze przeciwciało anty-RBFOX3 (NeuN), 1:400; królicza anty-aktywna kaspaza-3 (aCASP3), 1:400; mysie jądra anty-ludzkie, (Hu-Nu), 1:400; królicze anty-Hu-Nu, 1:400; mysie anty-GFP, 1:400 (jak podano w Tabeli 1) w 1 ml roztworu przeciwciała złożonego z 0,5% Tritonu, 1% FBS w DPBS. Inkubować w temperaturze 4 °C.
  2. Dzień 2
    1. Myć membrany przez 3 x 10 minut 1-2 ml DPBS.
    2. Inkubować błonę z przeciwciałami drugorzędowymi (np. Przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L) Koza, Alexa Fluor 488, 1:500; Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, Alexa Fluor 568, 1:500; Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor 647, 1:500; Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królicze IgG (H+L), Alexa Fluor 647, 1:500, jak podano w tabeli 1) i Hoechst/DAPI dla jąder rozcieńczonych w 1 ml / membranę roztworu przeciwciała (Triton 0,5% + FBS 1% w DPBS) przez 3 godziny w RT.
      UWAGA: Ostrożnie chroń próbki przed światłem, aby uniknąć wtórnego bielenia przeciwciał podczas inkubacji i w kolejnych krokach.
    3. Usuń roztwór przeciwciał i myj przez 3 x 10 minut DPBS (1-2 ml).
    4. Wymień DPBS na nowy DPBS i przechowuj w temperaturze 4 °C w warunkach ochrony przed światłem.
    5. Pod koniec protokołu immunofluorescencji zamontuj membrany na szkiełkach podstawowych. Umieść kroplę 200 μl roztworu montażowego na szklanym szkiełku. Za pomocą prostej pęsety przenieś pływającą membranę z czaszy 35 mm na szkiełko nakrywkowe, a następnie przenieś membranę na szkiełko za pomocą roztworu montażowego.
    6. Umieść kroplę 100 μl roztworu montażowego na nowym szkiełku nakrywkowym i przykryj nim membranę, mocując ją na szkiełku podstawowym. Pozostaw do wyschnięcia na noc pod kapturem chemicznym w warunkach chronionych przed światłem.
    7. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C w ciemności lub przeprowadzić analizę obrazową.

8. Test żywy/martwy

  1. Przygotować roztwór roboczy, porcjując 700 μl na naczynie świeżej pożywki i dodać w odpowiednim rozcieńczeniu roboczym Sytox (np. składnik B, 1:2 000) i Calcein AM (np. składnik A, 1:2 000).
    UWAGA: Ponieważ odczynniki są wrażliwe na światło, należy chronić roztwór roboczy przed światłem.
  2. Ocenić objętość podłoża na dnie membrany i dodać Sytox i Calcein AM w tym samym rozcieńczeniu roboczym opisanym w kroku 8.1.
  3. Dodać 2 krople po 30 μl każda na wierzch każdej kropelki roztworu roboczego przygotowanego w kroku 8.1.
    UWAGA: Chroń naczynie przed światłem, umieszczając je w ciemnych warunkach.
  4. Inkubować plastry przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Po inkubacji wyciąć membranę obwodowo z wkładki za pomocą noża chirurgicznego: następnie membrana z plastrami unosi się w roztworze roboczym.
  6. Umieść membranę bez roztworu montażowego do góry nogami na szkiełku nakrywkowym za pomocą prostej pęsety i dodaj 100 μl DPBS na membrany, aby utrzymać ich nawilżenie.
  7. Uzyskuj obrazy na żywo za pomocą mikroskopu konfokalnego tak szybko, jak to możliwe.
    UWAGA: Dodawaj 2 krople po 40 μl DPBS na wierzch membrany co 30 minut podczas akwizycji obrazu, aby zapobiec wysychaniu membrany.

9. Obrazowanie

  1. Obrazowanie konfokalne utrwalonych próbek
    1. Do analizy jakościowej należy pozyskać obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego o następujących parametrach akwizycji: ustaw opcję dużego obrazu (wybierz: 4 x 4), użyj obiektywu 10 x, bez stosów i rozdzielczości 3 634 x 3 634 pikseli.
    2. W przypadku analizy ilościowej (aCASP3, Calcein i Sytox dla plasterków i aCASP3 dla komórek) należy uzyskać obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego o następujących parametrach akwizycji: obiektyw 20x, rozdzielczość 1,024 x 1,024 pikseli z krokiem Z wynoszącym 3 μm.
  2. Obrazowanie na żywo przeszczepionych plastrów za pomocą stereomikroskopu
    UWAGA: Rób obrazy za pomocą mikroskopu stereoskopowego w trybach jasnego pola i epifluorescencji.
    1. Korzystając z ustawienia jasnego pola, uzyskaj obrazy plasterków (zastosowano tutaj obiektyw 1 x z 3-krotnym zoomem).
      UWAGA: Modyfikuj światło w zależności od używanego mikroskopu i w razie potrzeby użyj światłowodów.
    2. Korzystając z ustawienia fluorescencji, uzyskaj obrazy przeszczepionych komórek za pomocą tego samego obiektywu i powiększenia, które są używane dla plasterków (patrz krok 9.2.1). Do akwizycji należy użyć następujących parametrów: wzmocnienie 1, ekspozycja 200-500 ms, przesunięcie -10.
  3. Obrazowanie na żywo po teście żywym/martwym przy użyciu mikroskopu konfokalnego
    1. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego o następujących parametrach akwizycji: obiektyw 20x, rozdzielczość 1,024 x 1,024 pikseli z krokiem Z 3 μm.

10. Analiza obrazu przez ImageJ

  1. Analiza obszaru NFL, RBFOX3 i DAPI
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/).
    2. Otwórz obraz pliku, klikając Plik | otwórz | wybierz plik | otwórz.
    3. W wyskakującym okienku wybierz pozycję Wyświetlanie stosu | Hyperstack i tryb kolorów | Domyślne (z autoskalowaniem).
    4. Na pasku narzędzi wybierz opcję Obraz | Kolor | Podziel kanały.
    5. Wybierz żądane kanały do analizy: zielony kanał dla NFL (marker aksonalny), czerwony kanał dla RBFOX 3 (marker neuronalny) i niebieski kanał dla DAPI (barwienie jądrowe).
    6. W przypadku analizy NFL wykonaj następujące czynności: na pasku narzędzi wybierz Obraz | Dostosuj | Próg | Wybierz parametry (ciemne tło, algorytm, np. domyślny) i przesuń kursor na pasku wartości (poniżej/powyżej), aby pokryć i opisać cały obszar neurytów (neuryty są podświetlone na biało na ciemnym tle) | Zestaw | Złóż wniosek.
    7. Wybierz z paska narzędzi narzędzie do śledzenia Różdżka i użyj go, aby automatycznie zdefiniować biały obszar pokryty NFL. Naciśnij przycisk Analizuj | Środek | Wartość powierzchni w μm2.
    8. W przypadku analizy DAPI i RBFOX3 wykonaj następujące czynności: na pasku narzędzi wybierz Obraz | Dostosuj | Próg | Wybierz parametry (białe tło, algorytm, np. domyślny) i przesuń kursor na pasku wartości (pod/nad), aby pokryć i opisać cały obszar RBFOX3 lub DAPI | Zestaw | Złóż wniosek.
    9. Na pasku narzędzi wybierz pozycję Proces | Spółka FFT | Filtr pasmowoprzepustowy. Użyj paska wartości progowej, aby dostosować biały obszar pokryty przez RBFOX3 lub DAPI, odpowiadający ich sygnałowi fluorescencji.
    10. Z paska narzędzi wybierz narzędzie do śledzenia Różdżka i użyj go, aby automatycznie zdefiniować obszar pokryty przez RBFOX3 lub DAPI. Naciśnij przycisk Analizuj | Środek | Wartość powierzchni w μm2.
  2. Analiza apoptozy metodą ImageJ
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/).
    2. Otwórz obraz pliku stosu Z, klikając Plik | otwórz | wybierz plik | otwórz.
    3. W wyskakującym okienku wybierz pozycję Wyświetlanie stosu | Hyperstack i tryb kolorów | Domyślne (z autoskalowaniem).
    4. Na pasku narzędzi wybierz opcję Obraz | Kolor | Podziel kanały.
    5. Wybierz żądane kanały: czerwony kanał dla aCASP3 (marker apoptozy do analizy) i niebieski lub cyjan dla DAPI lub Hu-Nu dla jąder. Następnie nałóż kanały, wybierając na pasku narzędzi Obraz | Kolor | Scalanie kanałów | Utwórz kompozyt.
    6. Przeciągnij pasek Z u dołu obrazu, aby przeglądać stos Z obrazu i zidentyfikować stosy w środkowej części wycinków z dodatnim wynikiem CASP3.
    7. Na pasku narzędzi wybierz Wtyczki | Analizowanie | Licznik komórek.
    8. W otwartym oknie pop-up wybierz opcję Zainicjuj, aby przygotować obraz do zliczania, a następnie wybierz typ licznika (np. Typ 1) i zmień jego nazwę na obiekt do zliczania (np. komórki CASP3+). Zmień nazwy innych typów liczników zgodnie z powyższym opisem, aby zliczyć inne obiekty (np. komórki DAPI+ lub Hu-Nu+ w celu uzyskania całkowitej liczby komórek).
    9. W wyskakującym okienku wybierz typ licznika odpowiadający obiektowi do zliczenia (np. komórki aCASP3+), a następnie wybierz narzędzie Punkt na pasku narzędzi i zacznij ręcznie liczyć liczbę komórek apoptotycznych, dodatnich dla aCASP3, klikając każdą dodatnią na otwartym obrazie.
    10. Wybierz inny typ licznika w oknie licznika komórek i rozpocznij zliczanie całkowitej liczby komórek (komórki DAPI+, dla wycinków; Komórki Hu-Nu+, dla przeszczepionych komórek).
  3. Analiza testu żywych/martwych za pomocą ImageJ
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/).
    2. Otwórz obraz pliku Z-stack, klikając Plik | otwórz | wybierz plik | otwórz.
    3. W oknie podręcznym wybierz pozycję Wyświetlanie stosu | Hyperstack i tryb kolorów | Domyślne (z autoskalowaniem).
    4. Na paskach narzędzi wybierz opcję Obraz | Kolor | Podziel kanały.
    5. Wybierz żądane kanały: zielony kanał dla Calceiny (marker witalności do analizy) i kanał cyjanowy dla Sytox (martwy znacznik). Następnie nałóż kanały, wybierając na pasku narzędzi Obraz | Kolor | Scalanie kanałów | Wybierz opcję Utwórz kompozyt.
    6. Przeciągnij pasek Z u dołu obrazu, aby przeglądać stos Z obrazu i zidentyfikować stosy w środkowej części plasterków z dodatnim wynikiem Calcein i Sytox.
    7. Na pasku narzędzi wybierz Wtyczki | Analizowanie | Licznik komórek.
    8. W otwartym oknie pop-up wybierz opcję Zainicjuj, aby przygotować obraz do liczenia, a następnie wybierz typ licznika (np. Typ 1) i zmień jego nazwę na obiekt do zliczania (np. Calcein+ komórki). Zmień nazwy innych typów liczników zgodnie z powyższym opisem, jeśli konieczne jest zliczenie innego obiektu (np. komórek Sytox+).
    9. W wyskakującym okienku wybierz typ licznika odpowiadający obiektowi, który chcesz policzyć, a następnie wybierz narzędzie Punkt na pasku narzędzi i zacznij ręcznie liczyć liczbę komórek Calcein+, klikając każdą dodatnią komórkę na otwartym obrazie.
    10. Wybierz inny typ licznika w oknie licznika komórek i policz komórki Sytox+ zgodnie z opisem dla Calcein.

11. Wykresy i analiza statystyczna

  1. Wykonuj wszystkie analizy statystyczne i rysuj wykresy za pomocą wybranego oprogramowania.

Wyniki

Opisane metody pozwalają na przygotowanie organotypowych skrawków SC z myszy w stadium P3 oraz ich utrzymywanie w kulturze przez dłuższy czas w dobrym stanie. Ponadto przedstawiamy protokół transplantacji komórek do skrawków i ich współhodowli przez okres do 30 dni (Rysunek 1). W pierwszej kolejności prezentujemy optymalizację warunków hodowli oraz protokół odpowiedni do długotrwałego hodowania skrawków SC z transplantowanymi komórkami (Rysunek 2A). Skrawki są generowane i utrzymywane od DEV 0 do DEV 2 w pożywce OM, która została pierwotnie zaproponowana jako optymalne medium do utrzymania skrawków SC47. Jednakże ze względu na obecność białek surowicy, pożywka ta mogła być suboptymalna dla podtrzymania różnicowania i dojrzewania neuronów z transplantowanych komórek prekursorowych linii neuronalnej. W związku z tym w dniu DEV 3 przetestowaliśmy zmianę z pożywki OM na GM — formulację zawierającą Neurobasal oraz B27, która wspiera przeżycie neuronów i nie zawiera surowicy, która hamuje prawidłowe różnicowanie neuronów, promując w zamian los glialny48,49.

Rysunek 2B przedstawia wyniki uzyskane po zmianie medium w DEV 3 z OM na GM, w porównaniu do plastrów SC, w których nie dokonano tej zmiany (plastry kontrolne hodowano w OM). Jako marker integralności neuronalnej wykorzystaliśmy rozkład sygnału NFL wewnątrz plastrów (Rysunek 2B,C). Plastry w DEV 7 były zdrowe w obu warunkach hodowli, wykazując rozproszony rozkład neurofilamentów (NFL, kolor zielony). W DEV 10 plastry hodowane w GM wydawały się być zdrowsze w stosunku do plastrów kontrolnych hodowanych w OM, co potwierdzono rozmieszczeniem barwienia NFL. Oszacowano również obszar NFL+ (% obszaru NFL+/obszaru DAPI+) plastrów przedstawionych na reprezentatywnych obrazach na Rysunku 2B. Oszacowany obszar NFL+ przedstawiono na histogramach na Rysunku 2C, co potwierdza, że sygnał NFL jest rozproszony w plastrach w DEV 7 w obu warunkach. Jednak w DEV 10 oszacowany obszar pokryty barwieniem NFL ulega zmniejszeniu w przypadku warunków hodowli w OM.

Dane te sugerują, że przejście na pożywkę GM w DEV 3 jest dobrze tolerowane podczas przedłużonej hodowli skrawków SC (DEV 10). W następnym kroku przetestowano pożywkę GM w późniejszych punktach czasowych: DEV 30, DEV 60 i DEV 90. Jak pokazano w Rysunek 3A,Bprzekroje zachowywały żywotność w hodowli aż do 90. dnia rozwoju embrionalnego (DEV 90). Stwierdzono szeroką obecność barwienia NFL w przekrojach w każdym punkcie czasowym, z rozproszonymy rozrostem neurytów wychodzących z regionu centralnego wokół przekrojów. Rzeczywiście, oszacowano NFL+ pole powierzchni przekrojów przedstawionych w Rycina 3A i zwiększało się w czasie, co przedstawiono na histogramach Rycina 3BZaobserwowaliśmy również pozytywny wynik w kierunku markera neuronalnego RBFOX3, co stanowiło kolejny dowód na różnicowanie neuronalne skrawków. W każdym punkcie czasowym sprawdzaliśmy również stopień apoptozy, oceniając w różnych skrawkach liczbę komórek pozytywnych pod kątem aCASP3 (Rysunek 4A,B). Analizę przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 10.2 protokołu. Odsetek apoptozy (% aCASP3+ komórki/całkowita liczba DAPI+ komórek) okazał się bardzo niski w każdym punkcie czasowym (odpowiednio 0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27% i 0,66 ± 0,45% dla DEV 30, 60 i 90), bez istotnych różnic między trzema rozważanymi punktami czasowymi (wartość p > 0.05, Rysunek 4B). Dane te sugerują, że tempo apoptozy związane z aCASP3 pozostaje stabilne w czasie i, wraz z szerokim rozkładem NFL w skrawkach (Rycina 4A), potwierdź przeżywalność skrawków w każdym punkcie czasowym.

W celu potwierdzenia poprzednich danych przeprowadziliśmy również test żywotności (live/dead assay), aby ocenić przeżywalność skrawków w trzech różnych punktach czasowych. Do znakowania komórek żywych i metabolicznie aktywnych wykorzystaliśmy kalceinę (barwienie zielone), a do oceny śmierci komórkowej Sytox (barwienie cyjanowe). Jak pokazują histogramy na Rysunku 4C, odsetek komórek metabolicznie aktywnych nieznacznie wzrasta od DEV 30 do DEV 90 (odpowiednio 93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02% i 96,33 ± 3,10% dla DEV 30, 60 i 90), stabilizując się między dwoma ostatnimi punktami czasowymi (DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value = 0,99). Odnotowano niski poziom śmierci komórkowej, który zmniejszał się w czasie (odpowiednio 6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02% i 3,66 ± 3,10% dla DEV 30, 60 i 90), przy czym stwierdzono istotną różnicę między DEV 30 a późniejszymi punktami czasowymi, DEV 60 i DEV 90 (DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value = 0,99). Dane te, w połączeniu ze wskaźnikiem apoptozy, potwierdzają przeżywalność skrawków w czasie i dowodzą skuteczności zastosowanego protokołu długoterminnej hodowli.

Po potwierdzeniu możliwości długotrwałej hodowli skrawków rdzenia kręgowego (SC), poddano system próbie poprzez transplantację komórek h-SC-NES na wczesnych etapach różnicowania neuronalnego. Przetestowano komórki h-SC-NES, ponieważ wykazały one obiecujące wyniki w leczeniu urazów rdzenia kręgowego (SCI)12. Procedura transplantacji komórek h-SC-NES do mysich skrawków SC opisana jest w sekcji 6 protokołu. Skrawki SC oraz transplantowane komórki h-SC-NES utrzymywano do 30. dnia po transplantacji (DPT 30). Komórki przeszczepiono w 10. dniu in vitro (DIV 10) różnicowania (etap prekursorów neuronalnych) do organotypowych skrawków w 4. dniu rozwoju embrionalnego (DEV 4), zgodnie ze schematem protokołu na Rysunku 5A. Ekspresję GFP w transplantowanych komórkach monitorowano w hodowli przez okres do 30 dni. Rysunek 5B przedstawia reprezentatywne obrazy żywych komórek skrawka SC z transplantowanymi komórkami GFP+ w różnych punktach DPT. Stabilna ekspresja GFP w czasie (Rysunek 5B i Rysunek 6A) sugeruje, że komórki przetrwały w tkance SC w wcześniej zoptymalizowanych warunkach hodowli. Sprawdzono również odsetek apoptozy transplantowanych komórek, zgodnie z opisem w sekcji 10.2 protokołu. Odsetek apoptozy (% komórek aCASP3+/całkowita liczba komórek Hu-Nu+) po 30 DPT okazał się bardzo niski (0,44 ± 0,34%) (Rysunek 6B). Ponadto stwierdzono, że odsetek apoptozy w DPT 30 był zgodny z wynikami uzyskanymi dla tego samego typu komórek w DPT 7, co zgłoszono we wcześniejszych doniesieniach40, co dokumentuje stabilizację hodowli w czasie.

Schemat przygotowania skrawka rdzenia kręgowego myszy i transplantacji komórek NES; metoda oceny żywotności.
Rysunek 1: Schemat procedury. Reprezentacyjny schemat przedstawiający ogólny przebieg wykonanego protokołu. (A) Po lewej stronie schemat podsumowujący generowanie skrawków rdzenia kręgowego (SC) myszy z wyizolowanego rdzenia kręgowego młodych myszy w dniu P3 oraz długoterminową hodowlę organotypowych skrawków rdzenia kręgowego. (B) Po prawej stronie schemat podsumowujący transplantację ludzkich komórek NES pochodzących z rdzenia kręgowego (h-SC-NES) wykazujących ekspresję GFP do organotypowych skrawków rdzenia kręgowego myszy. Przeszczepione komórki utrzymywano przez 30 dni po transplantacji. Skróty: h-SC-NES = ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z rdzenia kręgowego; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DEV = dzień ex vivo; DPT = dzień po transplantacji; NFL = lekki łańcuch neurofilamentu; RBFOX3 = homolog 3 białka wiążącego RNA fox-1; aCASP3 = aktywna kaspaza-3; SC = rdzeń kręgowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Proces rozwoju neurytów, obrazy mikroskopowe, wykresy; efekty medium organotypowego i przeszczepowego, DEV 7, 10.
Rycina 2: Optymalizacja warunków długoterminowej hodowli. (A) Reprezentatywny schemat protokołu testowania OM i GM. W grupie kontrolnej OM jest utrzymywane do DEV 7-10. W przypadku opracowanych skrawków medium zmieniono na GM w DEV 3; następnie utrwalono je w DEV 7-10 w celu porównania z grupą kontrolną. (B) Reprezentatywne obrazy porównujące organotypowe skrawki rdzenia kręgowego myszy (SC) w DEV 7 i 10 hodowane w różnych warunkach. Skrawki wybarwiono na marker cytoszkieletowy neurofilament (NFL, zielony). Szeroki rozkład barwienia NFL w skrawkach hodowanych w GM sugeruje ogólne przeżycie i różnicowanie. Jądra komórkowe wybarwiono DAPI. Pasek skali = 500 µm. (C) Reprezentatywne histogramy szacunkowej powierzchni zajmowanej przez NFL w skrawkach pokazanych na Rycina 1B. W DEV 10 powierzchnia NFL zmniejsza się w warunkach hodowli w OM. Skróty: DEV = dzień ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = lekki łańcuch neurofilamentu; OM = medium organotypowe; GM = medium przeszczepowe; SC = rdzeń kręgowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Etapy rozwoju neuronalnego z markerami NFL, RBFOX3; obrazy mikroskopowe, wykresy danych, wzrost neurytów.
Rysunek 3: Długotrwale hodowane organotypowe skrawki rdzenia kręgowego myszy. (A) Skrawki są utrzymywane w kulturze do 90. dnia DEV. Analiza immunofluorescencyjna wykazuje szeroki rozkład markeru cytoszkieletowego neurofilamentu (NFL, zielony) oraz jądrowego markeru neuronalnego RBFOX3 (czerwony), co świadczy o ich dobrym stanie i tożsamości neuronalnej po długoterminowej hodowli. Warto zauważyć, że aksony NFL+ rozrastają się rozproszone wokół skrawków w czasie. Jądra są przeciwbarwione DAPI. Pasek skali = 500 µm. (B) Reprezentatywne histogramy szacowanej powierzchni NFL+ w czasie oraz powierzchni RBFOX3+ skrawków przedstawionych na panelu A. Powierzchnia neurytów NFL+ zwiększa się w czasie. Skróty: DEV = dzień ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; NFL = lekki łańcuch neurofilamentów; SC = rdzeń kręgowy; RBFOX3 = białko RBFOX3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza apoptozy; barwienie aCASP3 i DAPI; obrazy mikroskopowe; komórki neuronalne; kwantyfikacja apoptozy.
Rysunek 4: Ocena żywotności komórek w plastrach rdzenia kręgowego (SC) w czasie. (A) Reprezentatywne obrazy organotypowych plastrów w dniu DEV 60 barwionych na aCASP3 (czerwony) i NFL (zielony). Pasek skali = 100 µm. NFL wykazuje wzorzec rozproszony. Nieliczne komórki są dodatnie pod kątem markera apoptozy aCASP3 (Wstawki: 1-2-3). (B) Analiza poziomu apoptozy w plastrach w różnych punktach czasowych. Średnia ± SD, N (powtórzenia) = 6 plastrów, n (całkowita liczba komórek) > 1 000 dla każdego plastra, test Kruskala-Wallisa, porównania wielokrotne, wartość p > 0,05. Poziom apoptozy pozostaje stabilny w czasie. Na wstawkach 1-2-3 panelu A można zaobserwować szczegóły komórek dodatnich dla aCASP3 (barwienie czerwone, białe strzałki). Małe czerwone kropki oznaczają szczątki komórkowe i jądra pyknotyczne. Pasek skali = 50 µm. (C) Reprezentatywne obrazy testu żywotności (live/dead) wykonanego na plastrach SC w dniu DEV 90: komórki metabolicznie aktywne są znakowane na zielono Kalceiną, natomiast komórki martwe i uszkodzone są znakowane na jasnoniebiesko (cyjanowo) Sytoxem. Dwa histogramy przedstawiają % komórek dodatnich dla Kalceiny (po lewej) i Sytoxu (po prawej) w stosunku do całkowitej liczby komórek. Dla obu: średnia ± SD, N (powtórzenia) = 6 plastrów, n (całkowita liczba komórek) > 1 000 dla każdego plastra, test Kruskala-Wallisa, porównania wielokrotne, DEV 30 vs DEV 60 wartość p = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 wartość p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 wartość p > 0,99. Skróty: DEV = dzień ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; NFL = lekki łańcuch neurofilamentowy; SC = spinal cord (rdzeń kręgowy); aCASP3 = aktywna kaspaza-3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu różnicowania neuronalnego z transdukcją lentiwirusową GFP i wynikami obrazowania.
Rycina 5: Transplantacja komórek h-SC-NES do organotypowych skrawków mysich. (A) Reprezentacyjny schemat protokołu transplantacji. Komórki są transplantowane jako prekursory neuronalne w 10. dniu (DIV 10) różnicowania do organotypowych skrawków w 4. dniu (DEV 4). (B) Reprezentacyjne obrazy organotypowych skrawków mysich po transplantacji komórek h-SC-NES wykazujących ekspresję GFP w czasie do 30. dnia po transplantacji (DPT 30). Komórki zostały poddane transdukcji wektorem lentiwirusowym niosącym gen GFP. Ekspresja GFP w czasie potwierdza ich żywotność i adaptację do środowiska skrawka. Pasek skali = 500 µm. Skróty: DIV = dzień przed różnicowaniem; h-SC-NES = ludzkie macierzyste komórki neuroepithelialne pochodzące z rdzenia kręgowego; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DEV = dzień ex vivo; OM = pożywka organotypowa; GM = pożywka do przeszczepu; DPT = dni po transplantacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Barwienie fluorescencyjne aCASP3, Hu-Nu w neuronach; wykres kołowy procenta komórek aCASP3+.
Rysunek 6: Ocena wskaźnika apoptozy przeszczepionych komórek h-SC-NES 30 dni po transplantacji. (A) Reprezentatywny obraz mysiego skrawka organotypowego z przeszczepionymi komórkami h-SC-NES wykazującymi ekspresję GFP. Komórki zostały przetransdukowane wektorem lentiwirusowym niosącym gen GFP w celu monitorowania ich w skrawkach po transplantacji. Ekspresja GFP w czasie potwierdza ich żywotność i adaptację do środowiska skrawka. Przedstawiony punkt czasowy to 30. dzień po transplantacji (DPT 30); komórki są barwione na jądra ludzkie (cyjan) oraz aCASP3 (czerwony). Pasek skali = 150 µm. (B) Po lewej reprezentatywny wykres kołowy z analizy apoptozy komórek przeszczepionych do skrawków w DPT 30 (N (powtórzenia) = 5 skrawków, n (komórki) = 5 000), a po prawej wstawka z komórkami Hu-Nu+ oraz szczegół komórki pozytywnej pod kątem aCASP3 (biała strzałka). Pasek skali = 75 µm. Małe czerwone kropki oznaczają szczątki komórkowe i jądra pikonotyczne. Skróty: h-SC-NES = ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z rdzenia kręgowego; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DPT = dzień po transplantacji; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; NFL = lekki łańcuch neurofilamentowy; aCASP3 = aktywna kaspaza-3; Hu-Nu = jądra ludzkie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład roztworów użytych w tym protokole. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Nadal nie ma skutecznego leczenia dla pacjentów z SCI. Przetestowano różne podejścia, a jedno z najbardziej obiecujących opiera się na strategii regeneracyjnej polegającej na wymianie komórek. Obecnie postępy w dziedzinie medycyny regeneracyjnej wymagają opracowania nowatorskich platform do testowania skuteczności i bezpieczeństwa przeszczepów komórek, samodzielnie lub w połączeniu z innymi podejściami. Ich walidacja przedkliniczna jest niezbędna do prowadzenia dalszych badań klinicznych. Hodowle organotypowe SC są użyteczną platformą do badania różnych aspektów neurodegeneracji, regeneracji neuronów i rozwoju neurologicznego oraz do badania skuteczności nowych podejść terapeutycznych23. W szczególności specyficzne cechy kultur organotypowych, takie jak utrzymanie pierwotnej histoarchitektury oraz składu komórki i mikrośrodowiska, są korzystne dla rozwikłania dynamiki przeszczepów, takich jak wszczepianie komórek, integracja, różnicowanie i dojrzewanie.

Zgodnie z opublikowanymi protokołami, plastry organotypowe SC mogą być utrzymywane w hodowli przez około 2-3 tygodnie w zdrowych warunkach, co ogranicza ich wykorzystanie do długoterminowych badań i funkcjonalnych badań przesiewowych wymaganych do testowania schematów terapii komórkowej. Badanie ważnych procesów, takich jak różnicowanie i dojrzewanie w kierunku prawidłowego losu przeszczepionych komórek w tkance SC, wymaga długoterminowego monitorowania. Te procesy komórkowe mają kluczowe znaczenie podczas typowych przeszczepów w modelach zwierzęcych. Dostępność systemu ex vivo , który naśladuje wiele cech obecnych in vivo , byłaby pomocna w przedklinicznej fazie badań przesiewowych.

Z tego powodu w niniejszej pracy proponujemy optymalną długoterminową (≥30 dni) metodę hodowli organotypowej SC, która pozwala na utrzymanie żywotnych plastrów SC przez okres do 90 dni, trzykrotnie zwiększając ich zwykłe ramy czasowe. Ponadto wykazujemy stabilne wszczepienie komórek h-SC-NES wewnątrz plastrów SC i utrzymanie kultury przeszczepionej przez okres do 30 dni. Monitorowaliśmy wszczepianie komórek w czasie, obserwując ekspresję GFP w celu zweryfikowania przeżycia komórek do DPT 30. Po 30 DPT oceniliśmy szybkość apoptozy komórek. W piśmiennictwie opisano ocenę apoptozy przeszczepionych komórek h-SC-NES w plastrach SC w temperaturze 7 DPT40. Tutaj rozszerzyliśmy analizę apoptozy komórek w DPT 30, aby porównać szybkość apoptozy w odniesieniu do wcześniejszego punktu czasowego (DPT 7). Okazało się, że nasze dane są zgodne z literaturą, co sugeruje, że przeszczepione komórki h-SC-NES przeżywają również w późniejszym czasie, jeśli są utrzymywane w warunkach hodowli zoptymalizowanych w naszej pracy. Ta ulepszona, długoterminowa platforma ex vivo , dostępna samodzielnie i w konfiguracji do przeszczepów, pomoże naukowcom w przedklinicznych badaniach przesiewowych w kierunku przeszczepów komórek macierzystych w kierunku SCI. Pozwoli im to zidentyfikować najlepszego kandydata na komórkę do dalszych badań in vivo , które przyczynią się do powodzenia przeszczepów. Co więcej, po wstępnym badaniu przesiewowym, plastry organotypowe SC mogą być również stosowane równolegle z badaniami in vivo w celu potwierdzenia i potwierdzenia długoterminowej dynamiki i zachowań komórkowych obserwowanych w modelach zwierzęcych lub w celu wsparcia badań mechanistycznych.

Nasz protokół szczegółowo opisuje, jak wygenerować ten długoterminowy model organotypowy, ale należy również omówić kilka krytycznych kroków. Jeśli chodzi o tworzenie kultur organotypowych SC, istnieją pewne wyzwania podczas operacji i pierwszych etapów posiewu. Dobrze wykonany zabieg chirurgiczny jest niezbędny do wygenerowania wycinków, które zachowują oryginalną histoarchitekturę. Jeśli SC zostanie zniszczony podczas izolacji, plastry mogą stracić swoją typową strukturę anatomiczną, a uszkodzenie tkanek może wywołać nadmierną zniewagę prozapalną, prowadzącą do niezdrowych warunków i śmierci komórek. Najtrudniejszym etapem podczas operacji jest ekstrakcja SC ze szkieletu i usunięcie opon mózgowych z izolowanego SC. Powodzenie tych kroków zależy od doświadczenia operatora; Dlatego zaleca się okres szkolenia przed rozpoczęciem eksperymentów.

Przekrój koronalny SC przez śmigłowiec jest również trudnym etapem. Izolowany SC powinien być umieszczony na platformie tnącej dokładnie prostopadle do ostrza. Operator powinien również ustawić ostrze prostopadle do urządzenia tnącego. Te środki ostrożności są konieczne, aby zapewnić generowanie powtarzalnych wycinków między tymi samymi i różnymi doświadczeniami. Kolejną ważną kwestią jest to, że czas na zabieg jest ograniczony: cała procedura generowania plastrów musi trwać ~30 min. Jeśli operator poświęci więcej czasu na operację i cięcie, ucierpi na tym tkanka SC, co może negatywnie wpłynąć na powodzenie hodowli i kolejnych etapów eksperymentu.

Po umieszczeniu plastrów na błonie hodowlanej ważne jest, aby je prawidłowo karmić. GDNF jest niezbędny do podtrzymania regeneracji tkanek i przeżycia. Cięcie rozdrabniaczem jest traumatyczne dla tkanki i z tego powodu plastry są umieszczane wkrótce po pokrojeniu w lodowatym podłożu preparacyjnym, aby usunąć nadmiar cząsteczek prozapalnych i sprzyjających śmierci. Następnie plastry umieszcza się na błonach hodowlanych (wkładki do hodowli komórkowych) ze świeżą pożywką zmodyfikowaną GDNF, aby przyspieszyć regenerację i przyleganie plastrów do błony. GDNF powinien być dodawany do pożywki codziennie przez pierwszy tydzień w hodowli ze względu na jego krótki okres półtrwania50,51. Zaobserwowaliśmy, że plastry wymagają ciągłej obecności GDNF w pierwszych dniach hodowli, aby wspomóc regenerację i żywotność tkanek. W każdym razie, ponieważ obecność GDNF jest ważna przez cały okres hodowli, zdecydowanie odradza się przerywanie podawania GDNF w dalszych punktach czasowych.

W pierwszym tygodniu hodowli ważne jest również, aby sprawdzić plastry makroskopowo na oko i pod mikroskopem. Przezroczysta tkanka i przezroczystość granic są oznakami prawidłowego przylegania plastrów do błony i żywotnej tkanki. Tkanka martwicza będzie wydawała się niezwykle biała na pierwszy rzut oka, a obszary martwicze będą ciemnoszare pod mikroskopem. Po kilku tygodniach w hodowli morfologia tkanki może się zmienić: ruchy komórek i przyleganie tkanek do błony mogą wpływać na ten proces. Zaobserwowaliśmy na przykład utratę światła centralnego w niektórych wycinkach wypełnionych komórkami oraz utratę morfologii rogu grzbietowego i brzusznego. Dzieje się tak głównie w przypadku mniejszych plastrów, podczas gdy większość z nich zachowa strukturę anatomiczną zbliżoną do oryginalnej. Plastry są zwykle generowane z odcinka lędźwiowego lub piersiowego, ponieważ w ten sposób mogą mieć odpowiedni rozmiar, aby zachować swoją pierwotną histoarchitekturę w czasie: jeśli są zbyt małe, tracą swoją architekturę, a jeśli są zbyt duże, obszar centralny może ulec martwicy. W związku z tym wykorzystaliśmy odcinek lędźwiowy szczeniąt myszy do wygenerowania plastrów o odpowiedniej wielkości dla optymalnej długoterminowej hodowli, ale w zasadzie można wziąć pod uwagę inne segmenty. Co więcej, zdecydowaliśmy się na użycie odcinka lędźwiowego, ponieważ obszary brzuszne i grzbietowe są bardziej odróżnialne od siebie. Ponadto region ten przedstawia obszary tkanek o wyższym odsetku neuronów ruchowych i istoty szarej, które są miejscami zainteresowania dla terapii wymiany komórek w SCI. Jeśli chodzi o przeszczepianie komórek do plastrów, główny problem jest związany z pęknięciem szklanej końcówki mikroigłowej. Jeśli otwór do przejścia komórek jest zbyt duży, może to spowodować uszkodzenie tkanki SC podczas mikroiniekcji. Jeśli jest zbyt mały, układanie komórek może zatkać igłę, utrudniając proces przeszczepu. Procedura przeszczepu powinna zostać zakończona w ciągu 1 godziny, aby zminimalizować cierpienie i śmierć komórek.

Proponowany protokół stanowi optymalne i wszechstronne narzędzie dla różnych rodzajów dochodzeń. W tym przypadku stosujemy naszą długoterminową platformę do walidacji przeszczepu komórek h-SC-NES na pierwszych etapach różnicowania w tkance SC myszy przez 30 dni. Główną nowością proponowanego podejścia jest optymalizacja protokołu kokultury. Składniki GM utrzymują długoterminową przeżycie neuronalną plastrów SC i przeszczepionych komórek h-SC-NES. Rzeczywiście, GMO, będąc pożywką wolną od surowicy, podtrzymuje różnicowanie przeszczepionych komórek w kierunku losu neuronalnego w odniesieniu do pożywki wcześniej używanej do organotypowej hodowli plastrów47.

Jeśli chodzi o proponowane modele SCI, eksperymenty są zwykle przeprowadzane na dorosłych myszach. Jak dotąd, najważniejsze różnice między noworodkowym a dorosłym SC są związane z wyższym potencjałem regeneracyjnym stwierdzonym u noworodków w stosunku do dorosłych myszy52. Jednak takie różnice nie mają wpływu na rodzaj protokołu, który proponujemy, ponieważ tutaj skupiamy się na odpowiedzi przeszczepionych komórek na środowisko tkanki gospodarza, a nie na zdolnościach regeneracyjnych neuronów rezydentnych. Inna różnica między noworodkami a dorosłymi myszami po SCI jest związana z powstawaniem blizny glejowej, która występuje u dorosłych. Aspekt ten nie jest uwzględniany w proponowanym modelu, który nie uwzględnia złożonych procesów fizjopatologicznych wynikających z urazów pierwotnych i wtórnych.

Jeśli chodzi o zastosowania, platforma może być również wykorzystana do zbadania integracji między przeszczepionymi komórkami z obwodami rezydentnymi obecnymi w modelu organotypowym SC. Narzędzia inżynierii genetycznej były już wykorzystywane w OUN do oceny połączeń synaptycznych i mogą być wykorzystane w tym zakresie 53,54,55. W szczególności integracja może zostać zbadana i zwalidowana poprzez ocenę tworzenia się synaps między przeszczepionymi komórkami a tkanką SC ex vivo. Te długoterminowe hodowle organotypowe mogą być również wykorzystywane do testowania środków neuroprotekcyjnych i neuroregeneracyjnych lub nowych cząsteczek/materiałów lub do badania zaburzeń neurodegeneracyjnych, które obejmują SC. Aby zbadać specyficzne zaburzenia neurodegeneracyjne, protokół musi zostać dostosowany do hodowli plastrów SC wygenerowanych z odpowiednich modeli, takich jak myszy transgeniczne noszące określone mutacje związane z patologią, na odpowiednim etapie patologii (tj. noworodek, młodociany, dorosły). Podsumowując, nasz protokół i ogólnie hodowle organotypowe, będące eksplantatami konkretnego narządu, wykazują cechy, które wypełniają lukę między hodowlami komórkowymi 2D a modelami in vivo, potwierdzając, że są one nieocenionym narzędziem zarówno do badań podstawowych, jak i badań przedklinicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Fundację Wings for Life (WFL-IT- 20/21), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności Unii Europejskiej (NRRP)-misja 4 komponent 2, inwestycję nr 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Toskański Ekosystem Zdrowia-THE, Spoke 8) oraz Marina Romoli Onlus. Niniejszy manuskrypt odzwierciedla jedynie poglądy i opinie autorów, ani Unia Europejska, ani Komisja Europejska nie mogą być za nie odpowiedzialne. Dane i metadane są dostępne w Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Obrazy zostały wygenerowane za pomocą programu Biorender https://www.biorender.com/.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciw rozszczepieniu Kaspaza-3,  (Asp175) (5A1E) (Królik)Technologia sygnalizacji komórkowej9661S1:400
anty-GFP (mysz) - monoklonalnaSigma/MerckG65391:400
anty-ludzkie jądra (mysz) - monoklonalna, klon 235-1 Sigma/MerckMAB12811:400
anty-ludzkie jądra (królik)NeoBiotechnologieRBM5-346-P11:400
anty-NeuN (RBFOX3) (Królik) - poliklonalnySigma/MerckABN781:400
anty-NFL (Mysz)Sigma/MerckMAB16151:400
anty-NFL H-Phospho (Królik) -poliklonalnyBiologend8408011:500
Aqua PolymountPoly-sciences18606-20
B-27Gibco17504-044
BDNFGibcoPHC7074
BladesLeica118364227
Hodowla komórkowa z klasyfikowaną wodąSigma/MerckW3500-500ML
Kolagen z ogona szczuraSigma/MerckC7661
Mikroskop konfokalny - Mikroskop konfokalny A1 (Eclipse Ti)Nikon 
D(+)-GlucoseSigma/MerckG7021
Kleszcze preparacyjneWorld Precision Instruments15915
DMEM/F12Gibco31330
EGFSigma/Merckgf144
FBSGibco10270-106
FGF-2Stemgent03-0002
GDNFSigma/MerckSRP3200
Kapilary szklane, 3.5" Drummond Scientific Company3-000-203-G/X
GlutamaxGibco35050-038
Kozio-anty mysz IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11029
Kozioł anty mysz IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherScientific A212361:500
Kozio-anty królik IgG Alexa Fluor 568Thermo FisherScientific A110111:500
Kozioł-anty królik IgG Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA212441:500
Wykres Pad-PrismDotmaticsOprogramowanie do analizy statystycznej
HBSSGibco14025-0501:500
HEPESGibco15630-056
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Koń SurowicaGibco16050-122
InsulinaSigma/MerckI9278
LamininSigma/MerckL2020
Lentiviral prepAddgene17446-LV
L-GlutaminaThermo Fisher Scientific25030024
ŻYWY/MARTWY Zestaw do oznaczania żywotności/cytotoksycznościThermo Fisher ScientificL32250
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
MEMGibco11090-081
Końcówki do mikroładowarekEppendorf5242956003do ładowania komórek w igle do przeszczepu
Szkiełka mikroskopoweVWR631-0909
Membrana do hodowli komórek milikomórkowychSigma/MerckPICM0RG50
Okulary nakrywkowe miskroskopoweVWR ECN 631-1572
N-2Gibco17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
szalka Petriego (35mm)VWR734-2317
PFASigma/MerckP6148-500G
Plastikowa pipeta pasteuraSarstedt86.1171.010
Pneumatyczna pompa PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV830Mikrowtryskiwacz do przeszczepów
Poli-L-lizynaSigma/MerckP4707
Ostrze skalpela nr 10 Sterylna stal nierdzewnaVWR InternationalSWAN3001
Rękojeść skalpela #3World Precision Instruments500236
Wiosna ScissorsWorld Precision Instruments501235
Stereomikroskop do obrazowania i akwizycjiNikon SMZ18
Mikroskop stereoskopowy do chirurgiiVWR
Triton X-100MerckT8787
Pęseta-Dumont #5-inoxWorld Precision Instruments501985
Vannas Nożyczki, 8,5 cmWorld Precision Instruments500086
Pionowy ściągacz do mikropipetPrzyrząd migawkowyP-30
Y-27632R& Systemy D1254/50
DPBS Sigma/Merck D8537

Bibliografia

  1. Ding, W., et al. Spinal cord injury: The global incidence, prevalence, and disability from the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 47 (21), Phila Pa. 1532-1540 (2022).
  2. Yang, B., et al. Strategies and prospects of effective neural circuits reconstruction after spinal cord injury. Cell Death Dis. 11 (6), 439(2020).
  3. Liu, K., et al. PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinal neurons. Nat Neurosci. 13 (9), 1075-1081 (2010).
  4. Anderson, M. A., et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).
  5. de Freria, C. M., Van Niekerk, E., Blesch, A., Lu, P. Neural stem cells: promoting axonal regeneration and spinal cord connectivity. Cells. 10 (12), 3296(2021).
  6. Badner, A., Siddiqui, A. M., Fehlings, M. G. Spinal cord injuries: how could cell therapy help. Expert Opin Biol Ther. 17 (5), 529-541 (2017).
  7. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
  8. Ishii, K., et al. Neutralization of ciliary neurotrophic factor reduces astrocyte production from transplanted neural stem cells and promotes regeneration of corticospinal tract fibers in spinal cord injury. J Neurosci Res. 84 (8), 1669-1681 (2006).
  9. Zhang, Y. W., Denham, J., Thies, R. S. Oligodendrocyte progenitor cells derived from human embryonic stem cells express neurotrophic factors. Stem Cells Dev. 15 (6), 943-952 (2006).
  10. Faulkner, J., Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors for the treatment of spinal cord injury. Transpl Immunol. 15 (2), 131-142 (2005).
  11. Kadoya, K., et al. Spinal cord reconstitution with homologous neural grafts enables robust corticospinal regeneration. Nat Med. 22 (5), 479-487 (2016).
  12. Dell' Anno, M. T., et al. Human neuroepithelial stem cell regional specificity enables spinal cord repair through a relay circuit. Nat Commun. 9 (1), 3419(2018).
  13. Wu, S., FitzGerald, K. T., Giordano, J. On the viability and potential value of stem cells for repair and treatment of central neurotrauma: overview and speculations. Front Neurol. 9, 602(2018).
  14. Nardone, R., et al. Rodent, large animal and non-human primate models of spinal cord injury. Zoology. 123, 101-114 (2017).
  15. Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism Relat Disord. 14, SUPPL.2 (2008).
  16. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, Ethics, and Humanities in Medicine. 4 (1), 2(2009).
  17. Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nat Neurosci. 21 (10), 1370-1379 (2018).
  18. Hayden, P. J., Harbell, J. W. Special review series on 3D organotypic culture models: Introduction and historical perspective. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 95(2021).
  19. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  20. Mirbagheri, M., et al. Advanced cell culture platforms: a growing quest for emulating natural tissues. Materials Horizons. 6 (1), 45-71 (2019).
  21. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  22. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  23. Pandamooz, S., Nabiuni, M., Miyan, J., Ahmadiani, A., Dargahi, L. Organotypic spinal cord culture: a proper platform for the functional screening. Mol Neurobiol. 53 (7), 4659-4674 (2016).
  24. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Gertz, C. C., Lui, J. H., LaMonica, B. E., Wang, X., Kriegstein, A. R. Diverse behaviors of outer radial glia in developing ferret and human cortex. J Neurosci. 34 (7), 2559-2570 (2014).
  26. Ballerini, L., Galante, M. Network bursting by organotypic spinal slice cultures in the presence of bicuculline and/or strychnine is developmentally regulated. Eur J Neurosci. 10 (9), 2871-2879 (1998).
  27. Avossa, D., Rosato-Siri, M. D., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
  28. Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3RS philosophy. Front Vet Sci. 5, 164(2018).
  29. Nogueira, G. O., Garcez, P. P., Bardy, C., Cunningham, M. O., Sebollela, A. Modeling the human brain with ex vivo slices and in vitro organoids for translational neuroscience. Front Neurosci. 16, 838594(2022).
  30. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: a useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neurosci Bull. 35 (2), 244(2019).
  31. Park, H. W., et al. Human mesenchymal stem cell-derived Schwann cell-like cells exhibit neurotrophic effects, via distinct growth factor production, in a model of spinal cord injury. Glia. 58 (9), 1118-1132 (2010).
  32. Charrière, K., Risold, P. Y., Fellmann, D. In vitro interactions between bone marrow stromal cells and hippocampal slice cultures. C R Biol. 333 (8), 582-590 (2010).
  33. Jeong, D. K., Taghavi, C. E., Song, K. J., Lee, K. B., Kang, H. W. Organotypic human spinal cord slice culture as an alternative to direct transplantation of human bone marrow precursor cells for treating spinal cord injury. World Neurosurg. 75 (3-4), 533-539 (2011).
  34. Riggio, C., et al. Generation of magnetized olfactory ensheathing cells for regenerative studies in the central and peripheral nervous tissue. Int J Mol Sci. 14 (6), 10852-10868 (2013).
  35. Kamei, N., et al. Neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic co-cultures. Neuroreport. 15 (17), 2579-2583 (2004).
  36. Kamei, N., et al. NGF released from transplanted neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic cocultures. Spine. 32 (12), Phila Pa. 1272-1278 (2007).
  37. Hamasaki, T., et al. Magnetically labeled neural progenitor cells, which are localized by magnetic force, promote axon growth in organotypic cocultures. Spine. 32 (21), Phila Pa. 2300-2305 (2007).
  38. Kim, H. M., Lee, H. J., Lee, M. Y., Kim, S. U., Kim, B. G. Organotypic spinal cord slice culture to study neural stem/progenitor cell microenvironment in the injured spinal cord. Exp Neurobiol. 19 (2), 106-113 (2010).
  39. Liu, X., Chu, T. H., Su, H., Guo, A., Wu, W. Neural progenitor cell apoptosis and differentiation were affected by activated microglia in spinal cord slice culture. Neurol Sci. 35 (3), 415-419 (2014).
  40. De Vincentiis, S., et al. Low forces push the maturation of neural precursors into neurons. Small. 19 (30), 2205871(2023).
  41. Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohmura, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
  42. Sypecka, J., Koniusz, S., Kawalec, M., Sarnowska, A. The organotypic longitudinal spinal cord slice culture for stem cell study. Stem Cells Int. 2015, 471216(2015).
  43. Tanvig, M., et al. A brain slice culture model for studies of endogenous and exogenous precursor cell migration in the rostral migratory stream. Brain Res. 1295, 1-12 (2009).
  44. Tennstaedt, A., et al. Human neural stem cell intracerebral grafts show spontaneous early neuronal differentiation after several weeks. Biomaterials. 44, 143-154 (2015).
  45. Vogel, S., et al. The in vivo timeline of differentiation of engrafted human neural progenitor cells. Stem Cell Res. 37, 101429(2019).
  46. Onorati, M., et al. Zika virus disrupts phospho-TBK1 localization and mitosis in human neuroepithelial stem cells and radial glia. Cell Rep. 16 (10), 2576-2592 (2016).
  47. Vyas, A., et al. An in vitro model of adult mammalian nerve repair. Exp Neurol. 223 (1), 112-118 (2010).
  48. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  49. De Vries, G. H., Boullerne, A. I. Glial cell lines: an overview. Neurochem Res. 35 (12), 1978-2000 (2010).
  50. Ziv-Polat, O., et al. The role of neurotrophic factors conjugated to iron oxide nanoparticles in peripheral nerve regeneration: in vitro studies. Biomed Res Int. 2014, 267808(2014).
  51. Mesa-Infante, V., Afonso-Oramas, D., Salas-Hernández, J., Rodríguez-Núñez, J., Barroso-Chinea, P. Long-term exposure to GDNF induces dephosphorylation of Ret, AKT, and ERK1/2, and is ineffective at protecting midbrain dopaminergic neurons in cellular models of Parkinson's disease. Mol Cell Neurosci. 118, 103684(2022).
  52. Montero, A. M., Huang, A. H. The regenerative capacity of neonatal tissues. Development. 149 (12), (2022).
  53. Feng, L., Kwon, O., Lee, B., Oh, W. C., Kim, J. Using mammalian GFP reconstitution across synaptic partners (mGRASP) to map synaptic connectivity in the mouse brain. Nat Protoc. 9 (10), 2425-2437 (2014).
  54. Il Choi, D., Kaang, B. -K. Interrogating structural plasticity among synaptic engrams. Curr Opin Neurobiol. 75, 102552(2022).
  55. Choi, J. -H., et al. Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation. Science. 360 (6387), 430-435 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

neuronalne kom rki macierzysteplatforma ex vivoterapia zast pcza kom rekhodowla d ugoterminowaintegracja tkankowapowr t funkcji
Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.