Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66706

⸱

1 listopada 2024

 ,  ,  ,  , 
1Neuromuscular Studies Lab (NeSt Lab), Institute of Anatomy, Histology, and Pathology, Faculty of Medicine, Universidad Austral de Chile, 2Faculty of Odontology and Rehabilitation Sciences, Universidad San Sebastian, 3Department of Cell Biology, Faculty of Biological Sciences, Universidad de Concepcion

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Streszczenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa obwodowa kontrolująca skurcz włókien mięśni szkieletowych, aby umożliwić skoordynowany ruch wielu organizmów. W NMJ presynaptyczny koniec aksonu ruchowego styka się z postsynaptyczną domeną mięśniową i jest pokryty końcowymi komórkami Schwanna. Integralność i funkcja NMJ jest zagrożona w kilku warunkach, w tym starzeniu się, chorobach nerwowo-mięśniowych i urazach. Aby przeanalizować potencjalny wkład białek pochodzących z mięśni w utrzymanie i regenerację NMJ, połączono strategię transferu genów in vivo z denerwacją mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL) po mechanicznym uszkodzeniu nerwów. Wcześniejsze odkrycia wykazały, że wymuszona ekspresja kontrolnych białek fluorescencyjnych nie zmienia organizacji NMJ ani neurotransmisji. Procedura ta ma na celu opisanie szczegółowej metody elektroporacji in vivo mięśnia LAL, po której następuje przecięcie lub zmiażdżenie określonej gałęzi nerwu twarzowego unerwiającego mięśnie czaszki, co prowadzi odpowiednio do odnerwienia i reinerwacji NMJ. Połączenie tych eksperymentalnych strategii w wygodnym mięśniu LAL stanowi skuteczną metodę badania potencjalnego udziału nadekspresji lub wyciszenia białek mięśniowych w kontekście krótkotrwałego unerwienia NMJ.

Wprowadzenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa obwodowa, która kontroluje skurcze mięśni i, pośrednio, skoordynowany ruch organizmów1. Jest tworzony przez presynaptyczne zakończenie aksonu ruchowego, postsynaptyczną domenę mięśniową wzbogaconą w receptory acetylocholiny (AChR) i niemielinowe końcowe komórki Schwanna pokrywające zakończenie aksonu2,3,4. Po odnerwieniu NMJ z powodu urazowego uszkodzenia nerwów obwodowych, choroby lub interwencji farmakologicznej, aktywność mięśni kurczliwych zostaje utracona5,6. Ponieważ pewne permisywne mikrośrodowiska umożliwiają szybką i skuteczną regenerację funkcjonalną, poszukiwanie białek, które mogłyby pomóc w procesie regeneracji, jest stałą koniecznością. W tym przypadku połączono dwie procedury, aby konkretnie ocenić potencjalną rolę manipulowania ekspresją białek mięśniowych w krótkoterminowej regeneracji NMJ po uszkodzeniu nerwu.

Mięsień dźwigacza długiego (LAL), znajdujący się na grzbietowej powierzchni czaszki, jest cienkim i płaskim mięśniem, który kontroluje ruch małżowiny usznej. Mięsień LAL składa się z pasm rostralnych i ogonowych, z których każdy zawiera dwie lub trzy warstwy włókien mięśniowych7,8. Tylna gałąź uszna nerwu twarzowego unerwia mięsień LAL, generując dobrze opisany wzór unerwienia składający się z pięciu regionów unerwienia rostralnego (R1-R5) i dwóch ogonowych (C1-C2)8,9,10. LAL jest mięśniem powierzchownie wyeksponowanym i łatwo dostępnym, dlatego jego stosowanie wymaga mało inwazyjnych zabiegów. Pozwala to na wizualizację NMJ za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym, dostarczanie leków, a także interwencję w kompletne preparaty mięśniowe zarówno in vivo, jak i ex vivo11,12. Wszystkie te cechy sprawiają, że mięsień LAL jest doskonałym modelem do badania zachowania i funkcji NMJ10,13.

Elektroporacja in vivo to technika transferu genów, która pozwala na inkorporację egzogennego DNA do tkanki poprzez przejściową przenikanie błon komórkowych i ruchliwość DNA wewnątrz komórek, oba generowane po wywołaniu pola elektrycznego14,15. Zabieg ten jest miejscowy i można go wykonać na każdym etapie rozwoju zwierzęcia. Biorąc pod uwagę unikalne cechy mięśnia LAL, jego elektroporacja in vivo stanowi minimalnie inwazyjną, wysoce wydajną i szybką procedurę16, co umożliwia zaobserwowanie silnej ekspresji białka dwa lub trzy dni po elektroporacji.

Procedura miażdżenia nerwu twarzowego jest szeroko stosowana w badaniach, ponieważ oferuje kilka zalet5,17,18. Protokół ten został wcześniej zmodyfikowany, aby celować w tylną gałąź uszną nerwu twarzowego, który unerwia mięśnie czaszki, w tym mięsień LAL, aby uniknąć paraliżu twarzy; W związku z tym myszy nie wymagają specjalnej opieki po operacji (np. smarującej maści do oczu na utratę odruchu mrugania). Ponieważ unerwienie NMJ w mięśniu LAL rozpoczyna się między 7-9 dniami po urazie6, jest to dobry krótkoterminowy model reinerwacji w porównaniu z powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia nerwu kulszowego w celu odnerwienia mięśni kończyn tylnych, gdzie reinerwacja następuje około trzech tygodni po urazie nerwu18.

Połączenie elektroporacji in vivo i uszkodzenia nerwu twarzowego w mięśniu LAL umożliwi badaczom ocenę zachowania komponentów synaptycznych przeciwko modulacji białek pochodzących z mięśni w różnych okresach regeneracji NMJ, w tym krótko- i długoterminowych efektów morfologicznych6,16, za pomocą szerokiej gamy technik, w tym testów immunohistochemicznych, histologicznych i funkcjonalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komitet Bioetyczny na Universidad Austral de Chile, Chile (protokół nr 503/2023) i przestrzegają norm nałożonych przez Komitet Bioetyczny Narodowej Agencji Badań i Rozwoju Chile (ANID), a także wytycznych Dyrektywy Rady Europejskiej dotyczącej opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. W niniejszym badaniu wykorzystano dorosłe (3-6 miesięcy) myszy CF-1 obojga płci (30-45 g). Eutanazja była dokonywana przez przedawkowanie wziewnego środka znieczulającego, po którym następowała wykrwawienie. Odczynniki i sprzęt użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Elektroporacja mięśni LAL in vivo

  1. preparat
    1. Delikatnie uspokaj mysz w akrylowej komorze indukcyjnej pod wpływem 2,5% izofluoranu z tlenem 0,8 l/min (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Następnie utrzymuj sedację myszy za pomocą maski z rurką na nos podłączonej do urządzenia do znieczulenia wziewnego pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym.
      UWAGA: Upewnij się, że mysz jest w stanie uśpienia przed rozpoczęciem procedury; Przetestuj odruch dotyku myszy, delikatnie ściskając jedną stopę kleszczami (wykonuj ten krok za każdym razem po wywołaniu znieczulenia).
    2. Zdezynfekować obszar szyjki macicy na poziomie szwu strzałkowego czaszki za pomocą antyseptycznego glukonianu chlorheksydyny 2% i wstrzyknąć podskórnie 20 μl hialuronidazy 2 mg/ml w PBS za pomocą strzykawki Hamiltona, aby ułatwić dostęp plazmidu DNA do powierzchni mięśnia.
    3. Wyłącz przepływ izofluoranu i pozwól myszy oddychać czystym tlenem przez 1 minutę.
    4. Zważyć mysz, aby obliczyć odpowiednią dawkę meloksykamu (patrz krok 1.3.2).
    5. Umieść zwierzę w pustej klatce (bez ściółki), aby doszło do siebie po znieczuleniu.
    6. Umieść zwierzę w normalnym pomieszczeniu na 30 min16.
  2. Przebieg zabiegu
    1. Ponownie znieczulić mysz poprzez inhalację 2,5% izofluoranu z mieszaniną tlenu o stężeniu 0,8 l/min (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) i utrzymywać ją w stanie sedacji przez cały zabieg chirurgiczny za pomocą wziewnego urządzenia do znieczulenia, pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym.
    2. Ogol okolicę szyjki macicy za pomocą obosiecznej żyletki i zdezynfekuj chlorheksydyną i 70% etanolem 3 razy.
    3. Wykonaj nacięcie 8 mm nad szwem strzałkowym czaszki i odsłoń mięsień LAL, delikatnie usuwając tłuszcz i tkankę łączną znajdującą się tuż pod skórą za pomocą nożyczek/kleszczy.
      UWAGA: Mięsień LAL jest najbardziej powierzchownym mięśniem w okolicy czaszki po nacięciu skóry. Można go łatwo rozpoznać po orientacji włókien mięśniowych, które biegną po przekątnej od środkowej czaszki w kierunku każdej klasy pinna8,16.
    4. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknij 10 μl komercyjnie uzyskanego DNA (0,8-1 μg/μL) w PBS do powięzi, która jest rozprowadzana po całym mięśniu, tworząc bańkę.
    5. Umieść dwie złote elektrody igłowe w odległości 5 mm od siebie, równolegle i nad włóknami mięśniowymi, zajmując całą długość mięśnia LAL (Rysunek 1A).
    6. Za pomocą elektroporatora wygeneruj pięć impulsów o napięciu 100 V/cm każdy, z których każdy trwa 20 ms, o częstotliwości 1 Hz.
    7. Powtórz procedurę w przeciwległym mięśniu LAL (powtarzając kroki 1.2.4-1.2.6).
  3. Szycie i rekonwalescencja
    1. Zszyj skórę (rozmiar szczepu 5/0, igła HR15) za pomocą wchłanialnej nici kwasu poliglikolowego.
    2. Wstrzykiwać podskórnie przeciwbólowy meloksykam w dawkach 1-2 mg/kg masy ciała w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego.
    3. Wyłącz przepływ izofluoranu i pozwól myszy oddychać czystym tlenem przez 1 minutę.
    4. Umieść zwierzę w pustej klatce (bez ściółki), aby doszło do siebie po znieczuleniu.
    5. Zwierzę należy umieścić w jego zwykłym pomieszczeniu i monitorować je przez 2 dni po operacji lub do czasu wyzdrowienia. Monitoruj objawy bólu lub stresu, przydzielając punkty dla każdego z różnych parametrów, biorąc pod uwagę wcześniej opisane kryteria humanitarnego punktu końcowego19.
      UWAGA: Umieść mysz w podgrzewanej podkładce pokrytej podkładką chirurgiczną, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała podczas operacji. Staraj się nie poświęcać więcej niż 30 minut na zabieg chirurgiczny, zapobiegając w ten sposób śmierci myszy z powodu nadmiernego znieczulenia. Jeśli ekspresja białka daje niski poziom fluorescencji, zaleca się koelektroporację ze znacznikiem (np. tdTomato lub GFP) w stosunku 1:5 (znacznik: DNA będące przedmiotem zainteresowania).

2. Odnerwienie wywołane uszkodzeniem nerwu

UWAGA: Ten protokół jest modyfikacją wcześniej opisanego protokołu17. Wykonaj tę procedurę z różnicą co najmniej 3 dni od elektroporacji. W zależności od pytań badawczych zabieg ten może być wykonywany przed lub po elektroporacji.

  1. Anestezjologia i ułożenie zwierząt
    1. Przeprowadzić sedację zwierzęcia w akrylowej komorze indukcyjnej pod wpływem 2,5% izofluoranu z tlenem o stężeniu 0,8 l/min (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    2. Zważyć mysz, aby obliczyć dawkę meloksykamu (patrz krok 2.3.2.).
    3. Utrzymuj sedację myszy za pomocą maski z rurką na nos podłączonej do urządzenia do znieczulenia wziewnego pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.
    4. Ustaw mysz po jej lewej stronie (aby oderwić prawy mięsień LAL). Przyklej prawe ucho w kierunku nosa, aby odsłonić tylną część małżowiny usznej.
  2. Przebieg zabiegu
    1. Ogol tylną część małżowiny usznej za pomocą obosiecznej żyletki i zdezynfekuj chlorheksydyną i 70% etanolem 3 razy.
    2. Zlokalizuj tylną żyłę uszną i wykonaj nacięcie w skórze, w odległości 2 mm doogonowo od niej, o długości około 5 mm za pomocą nożyczek sprężynowych. Unikaj cięcia naczyń krwionośnych i/lub tkanki mięśniowej.
    3. Przetnij tłuszcz i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek. Znajdź nerw dodatkowy rdzeniowy; Kontynuuj, aż znajdziesz brzuch mięśnia dwubrzuścowego i chrzęstny kanał słuchowy (półprzezroczysta biaława tkanka) (Ryc. 2A).
    4. Zlokalizuj początek rozgałęzienia nerwu twarzowego tuż pod mięśniem dwubrzuścowym.
    5. Podążaj za tylną gałęzią uszną (najbardziej grzbietową gałęzią nerwu twarzowego) i delikatnie usuń otaczającą ją tkankę łączną, ostrożnie unikając bezpośredniej manipulacji nerwów.
    6. Zmiażdż tylną gałąź uszną nerwu twarzowego przez 30 s, wywierając stały nacisk na nerw za pomocą kleszczy z końcówką nachyloną pod kątem 45°.
  3. Szycie i rekonwalescencja
    1. Zszyj skórę (rozmiar szczepu 5/0, igła HR15) za pomocą wchłanialnej nici kwasu poliglikolowego.
    2. Wstrzykiwać podskórnie przeciwbólowy meloksykam w dawkach 1-2 mg/kg masy ciała w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego.
    3. Zdejmij taśmę z ucha, wyłącz przepływ izofluoranu i pozwól myszy oddychać czystym tlenem przez 1 minutę.
    4. Umieść zwierzę w pustej klatce (bez ściółki), aby doszło do siebie po znieczuleniu.
    5. Przywróć mysz do jej zwykłej obudowy i monitoruj ją przez 2 dni po operacji lub do czasu wyzdrowienia.
    6. Po powrocie do zdrowia zbadaj mysz pod kątem błędów w ruchu chorego ucha jako oznaki skutecznego odnerwienia.
      UWAGA: U zwierząt kontrolnych należy wykonać nacięcie w skórze, odsłonić nerw twarzowy bez bezpośredniego dotykania, a następnie zszyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wysoka kwantowa wydajność fluorescencji białka tdTomato20 sprawia, że jest ono odpowiednim znacznikiem do oceny wydajności elektroporacji. W związku z tym oceniono ekspresję białka tdTomato w mięśniach LAL za pomocą elektroporacji in vivo (Rysunek 1). Mięśnie LAL wypreparowano 21 dni po elektroporacji. Preparaty całego narządu ukazują cienki pasy caudalny (cLAL, niebieski wielokąt) mięśnia LAL z dwoma obszarami unerwienia oraz gruby pas rostralny (rLAL, żółty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Połączenie elektroporacji mięśni in vivo i denerwacji jest cennym eksperymentalnym podejściem do badania niszy regeneracyjnej w NMJ4. Ponieważ mięsień LAL jest powierzchownie odsłonięty, te połączone procedury można łatwo uzupełnić o dostarczenie sond lub leków, które mogą wpływać na ekspresję lub aktywność białka12. Ponadto elektroporacja genów reporterowych w mięśniu LAL może stanowić cenne narzędzie do śledzenia aktywacji lub hamowania szlaków sygnałowych w kont...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wysoce współpracującemu i stymulującemu środowisku członków NeSt Lab za użyteczne dyskusje i komentarze na temat tej pracy. Prace w NeSt Lab są obecnie finansowane przez FONDECYT 1221213. Schemat w Rysunek 1A został stworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5/45 Kleszcze Dumonta Narzędzia naukowe 11251-35Sterylizuj przed użyciem
anty 2H3DSHBRozcieńczony 1 : 300
anty S100 Gotowy do użyciaDakoIR504Rozcieńczony 1 : 5
anty SV2DSHBRozcieńczony 1 : 50
Glukonian chlorheksydyny 2%DifenPharma
Mikroskop stereoskopowy do analizy zimnego światłaMoticModel SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Rozcieńczony 1 : 100
Dumont #5SF KleszczeNarzędzia do nauki pięknej 11252-00Sterylizuj przed użyciem
Dumont Mini Kleszcze – Styl 5Narzędzia do nauki pięknej 11200-14Sterylizuj przed użyciem
Elektroporator ECM 830BTX Harvard Apparatus
Złote elektrody igłowe Genetrody, BTX45-0114Hamilton prosta 10 mm
 Hamilton80400
HialuronidazaSigma-AldrichH3884
Aparat do znieczulenia wziewnegoSciVerma ScientificM3000 Stół
IsofluraneBaxter218-082
MyszyInstituto de Salud Publica - ChileDorosłe (3-6 miesięcy) myszy CF-1 obojga płci (30-45 g) 
ŻyletkiSchick
Suture Glicosorb 5/0TAGUMGS0812. JWchłanialna nić kwasu poliglikolowego 
tdPlazmid pomidorowyAddgene54642plazmid pomidorowy pod kontrolą promotora CMV
Chlorowodorek tramadolu 5% (Triamcol)Drag Pharma
Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki pięknej 91500-09Sterylizować przed użyciem
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Rozcieńczony
α-BTX Alexa Fluor 488 InvitrogenB13422Rozcieńczyć 1 : 500
Strzykawka

Bibliografia

  1. Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  3. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  4. Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
  5. Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
  6. Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158(2022).
  7. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  8. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
  9. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
  10. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  11. Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124(2011).
  12. Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).
  13. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).
  14. Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
  15. Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520(2009).
  16. Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).
  17. Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382(2015).
  18. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
  19. Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
  20. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  21. Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).
  22. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
  23. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  24. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240(2016).
  25. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  26. Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
  27. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  28. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
  29. Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  30. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  31. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
  32. Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
  33. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

złącze nerwowo-mięśniowedenerwacja mięśnireinnerwacja nerwówregeneracja mięśni szkieletowychtransfer genówmikroskopia konfokalnanadekspresja białek mięśniowychuszkodzenie nerwu twarzowego
Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.