Artykuł metodologiczny

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66718

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, Department of Critical Care Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Department of Pathogenic Biology and Immunology, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, School of Medicine, Southeast University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Streszczenie

Techniki różnicowania limfocytów T in vitro są niezbędne zarówno do funkcjonalnych, jak i mechanistycznych badań limfocytów T CD4+. Patogenne komórki Th17 zostały w ostatnim czasie powiązane z wieloma chorobami, w tym stwardnieniem rozsianym (SM), reumatoidalnym zapaleniem stawów, zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), posocznicą i innymi zaburzeniami autoimmunologicznymi. Jednak obecnie znane protokoły różnicowania in vitro mają trudności z osiągnięciem wysokiej czystości patogennych komórek Th17, przy skuteczności indukcji często poniżej 50%, co jest kluczowym wyzwaniem w eksperymentach in vitro. W tym protokole proponujemy ulepszony protokół hodowli i różnicowania in vitro dla patogennych komórek Th17, który służy do bezpośredniego różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 + wyizolowanych ze śledziony myszy w patogenne komórki Th17. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące izolacji splenocytów, oczyszczania naiwnych limfocytów T CD4 + i różnicowania patogennych komórek Th17. Dzięki temu protokołowi możemy osiągnąć czystość różnicowania na poziomie około 90% dla patogennych komórek Th17, co spełnia podstawowe potrzeby wielu eksperymentów komórkowych.

Wprowadzenie

Po opuszczeniu grasicy, naiwne limfocyty T CD4+ przechodzą przez wtórne narządy limfoidalne. Komórki prezentujące antygen, które przekazują homologiczne antygeny do naiwnych limfocytów T CD4 +, aktywują je, rozpoczynając serię programów różnicowania, które ostatecznie prowadzą do produkcji wysoce wyspecjalizowanych linii komórek T pomocniczych (Th)1. Produkcja interleukiny 17 (IL-17) charakteryzuje komórki Th17, subpopulację prozapalnych komórek Th2. Komórki Th17 odgrywają rolę w obronie gospodarza przed patogenami zewnątrzkomórkowymi oraz w patogenezie wielu chorób autoimmunologicznych, takich jak autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka i stwardnienie rozsiane. Sygnały z receptorów limfocytów T i cytokin IL-6 oraz transformującego czynnika wzrostu-β (TGF-β) indukują różnicowanie naiwnych limfocytów T w komórki Th17 poprzez fosforylację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT)33. STAT3 jest dodatkowo wzmacniany w pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego poprzez sygnalizację, w której pośredniczą IL-23 i IL-214,5. Fosforylacja STAT3 może indukować ekspresję czynników transkrypcyjnych RORγt i RORα, które działają jako główne przełączniki regulujące profil cytokin IL-17A, IL-17F, IL-21 i IL-22 w komórkach Th176. Doniesiono jednak, że komórki Th17 indukowane przez IL-6 i TGF-β są niewystarczające do wywołania chorób autoimmunologicznych, które wymagają kostymulacji przez IL-23 lub oddzielnej kostymulacji IL-6, IL-1β i IL-23 przy braku TGF-β7,8.

Th17 podzbiory, które nie mogą skutecznie wywołać eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), są czasami określane jako niepatogenne Th17, podczas gdy podzbiory Th17, które mogą indukować EAE, są znane jako patogenne Th179. Obecne badania wykazały, że chociaż patogenny Th17 i niepatogenny Th17 współwyrażają podstawowy czynnik transkrypcyjny RORγt, istnieją duże różnice w zdolności do wytwarzania IL-17A oraz właściwościach prozapalnych i przeciwzapalnych10. Oprócz wysokiej ekspresji RORγt, CCR6, STAT4 i RUNX4, które są powszechnymi charakterystycznymi czynnikami transkrypcyjnymi Th17, patogenne komórki Th17 wykazują również dodatkowe cechy ekspresji sygnału genowego związane z chorobą, takie jak TBX21, IFN-γ i CXCR3, które mają cechy podzbiorów komórek Th1. Patogenne komórki Th17 mogą wydzielać wysoki poziom czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α i innych cytokin11,12. Fenotyp niepatogennych komórek Th17 jest niestabilny i tylko pod wpływem stymulacji CD3 i cytokiny IL-2 niektóre z tych komórek mogą różnicować się w patogenne komórki Th17. Dlatego w powszechnych klinicznych modelach chorób, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i zespół ostrej niewydolności oddechowej, patogenne komórki Th17 wywierają przede wszystkim działanie patogenne.

Patogenne i niepatogenne komórki Th17 mogą różnicować się in vitro pod wpływem różnych cytokin. W ostatnich latach w kilku badaniach zaproponowano metody indukowania różnicowania komórek Th17 przy użyciu różnych typów i stężeń cytokin. Komórki Th17 są stymulowane przez kombinację IL-6, IL-1β i IL-2313,14,15,16. Udowodniono, że IL-6 i TGF-β, dwie cytokiny niezbędne do różnicowania komórek Th17, synergistycznie regulują ekspresję różnicowania komórek RORγt i Th17 poprzez interakcję z dwiema różnymi konserwatywnymi niekodującymi sekwencjami DNA w locusRorc class="xref">17. Stabilna faza patogennych komórek Th17 jest utrzymywana głównie przez IL-2318,19. IL-23 wiąże się ze swoim receptorem i aktywuje szlak sygnałowy JAK-STAT20, powodując w ten sposób fosforylację Jak2 i Tyk2 oraz promując fosforylację STAT1, STAT3, STAT4 i STAT5. IL-4 i IFN-γ są negatywnymi regulatorami tego szlaku. Jednak badania wykazały, że IL-1β może pozytywnie regulować transkrypcję Rorα i Rorγt poprzez szlak mTOR w celu utrzymania stabilności fenotypu komórek Th1721.

Ze względu na niejednorodność licznych badań, wybraliśmy protokoły indukcji dla patogennych i niepatogennych komórek Th17 z najnowszych badań jako kontrole22. Wyniki wskazują, że przy założeniu, że wszystko odbywa się zgodnie z tym protokołem, po 5 dniach hodowli pod warunkiem wytworzenia patogennego Th17, ponad 90% komórek, które przeżyły, może być patogennymi komórkami Th17.

Protokół

Instytucjonalna Komisja Rewizyjna ds. Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie Południowo-Wschodnim zatwierdziła wszystkie badania na zwierzętach, które są szczegółowo opisane w tym badaniu, które zostały przeprowadzone zgodnie zarówno z lokalnymi, jak i instytucjonalnymi standardami biurowymi. Próbki śledziony pobrano od myszy C57BL6/J. W badaniu tym uwzględniono zarówno samice, jak i samce myszy w wieku od 5 do 8 tygodni. Pożywkę hodowlaną i bufor przechowywano w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Narzędzia chirurgiczne przed użyciem były sterylizowane w autoklawie. Nosić rękawiczki i maski lateksowe, aby uniknąć zanieczyszczenia skóry, oczu i odzieży odczynnikami; Użyj dużej ilości wody lub płukanki z solą fizjologiczną do skóry i oczu.

1. Wstępne powlekanie 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej anty-CD3

  1. Rozcieńczyć anty-CD3 do końcowego stężenia 1 μg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym 1x fosforanem (PBS) lub pożywce RPMI 1640.
  2. Wypełnić 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej 1 ml roztworu anty-CD3 (1 μg/ml); następnie przykryć studzienkę parafilmem.
  3. Umieść płytkę pokrytą anty-CD3 w lodówce (2 °C-8 °C) na 16 godzin lub przechowuj ją w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 2-3 godziny.

2. Izolacja śledziony myszy i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej śledziony

  1. Wywołaj pełne znieczulenie w C57BL/6J z 3% izofluranem i poddaj eutanazji wdychając 100% dwutlenek węgla przez 2 minuty. Natychmiast po śmierci myszy namocz je w 75% etanolu w celu dezynfekcji, aby zapobiec zakażeniu.
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej na czystej ławce, rozetnij ją wzdłuż linii środkowej brzucha i oddziel struktury brzucha warstwa po warstwie. Delikatnie otwórz większą sieć i żołądek pęsetą, delikatnie wyciągnij śledzionę z więzadłem żołądkowo-śledzionowym i tępo oddziel śledzionę od otaczających tkanek i więzadeł, aby uzyskać nienaruszoną śledzionę (należy uważać, aby uniknąć zmiażdżenia lub pęknięcia śledziony).
    UWAGA: Aby utrzymać stan sterylny, w sterylnej, super czystej ławce przeprowadza się następującą operację.
  3. Umieścić filtr komórkowy o wielkości 70 μm w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm, dodać śledzionę do sitka komórkowego i rozdrobnić ją tłokiem strzykawki. W tym samym czasie dodaj 5-8 ml homogenatycznego płynu płuczącego, aby przepchnąć wszystkie komórki przez filtr do naczynia hodowlanego.
    UWAGA: Skład zestawu płynu do separacji limfocytów można zobaczyć w Tabeli materiałów.
  4. Odwirować filtrat o stężeniu 450 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy za pomocą rozcieńczalnika do próbek dostarczonego z zestawem do separacji limfocytów lub pożywki PBS lub RPMI 1640. Dostosuj stężenie komórek w zawiesinie komórek do 2 × 108-1 × 109 komórek/ml.
    UWAGA: Zazwyczaj na jedną śledzionę potrzeba 4-6 ml rozcieńczalnika do próbek.
  6. Do probówki wirówkowej należy pobrać taką samą ilość roztworu do separacji limfocytów, jak zawiesinę jednokomórkową tkanki. Ostrożnie odpipetować zawiesinę jednokomórkową na powierzchnię roztworu do separacji limfocytów i odwirować w temperaturze 800 × g, 25 °C przez 30 minut. Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki w odpowiednim zakresie (np. ustaw na 3, jeśli zwykle dostępne są 1 do 9 biegów).
    UWAGA: Roztwór do separacji limfocytów nie powinien być mniejszy niż 3 ml.
  7. Po odwirowaniu obserwuj cztery warstwy w probówce wirówkowej od góry do dołu. Pierwsza warstwa odpowiada rozcieńczalnikowi próbki, a następnie pierścieniowa mlecznobiała warstwa limfocytów. Trzecia warstwa to ciecz separacyjna, a czwarta warstwa składa się z czerwonych krwinek.
  8. Za pomocą pipety ostrożnie wciągnąć drugą warstwę pierścieniowej mlecznobiałej warstwy limfocytów do innej probówki wirówkowej i dodać 10 ml roztworu czyszczącego do probówki wirówkowej, aby wymieszać komórki.
  9. Wirować przy 250 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Użyj 10 ml pożywki RPMI 1640, aby ponownie zawiesić osad komórek do liczenia komórek.

3. Oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD4+ na podstawie negatywnej selekcji kulek magnetycznych

UWAGA: Izoluj nietknięte i wysoce oczyszczone naiwne limfocyty T CD4+ (CD4+CD44lowCD62Lhigh) od mysich splenocytów metodą immunomagnetycznej selekcji negatywnej.

  1. Przygotuj próbkę tak, aby zawierała 1 × 108 komórek/ml w zakresie objętości 0,1-2 ml.
  2. Dodać 50 μl/ml surowicy szczurzej i przenieść próbkę do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Skład naiwnego zestawu do sortowania limfocytów T CD4 można zobaczyć w Tabeli materiałów.
  3. Dodać 50 μl/ml koktajlu izolacyjnego do próbki, dobrze wymieszać i inkubować przez 7,5 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 50 μl/ml koktajlu zubożającego do próbki, dobrze wymieszać i inkubować przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Wiruj kulki magnetyczne, aby zapewnić równomierną dyspersję. Dodać 75 μl/ml kulek magnetycznych do próbki, dobrze wymieszać i inkubować przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Cząstki powinny wydawać się równomiernie rozproszone; Czas wirowania nie powinien być krótszy niż 30 s.
  6. Uzupełnić próbkę pożywką RPMI 1640 do końcowej objętości 2,5 ml. Wymieszaj kilka razy, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  7. Umieść probówkę (bez pokrywki) w magnesie i inkubuj przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Podnosząc magnes, odwróć magnes i rurkę jednym ciągłym ruchem i wlej wzbogaconą zawiesinę komórek do nowej probówki.
    UWAGA: Trzymaj rurkę i magnes odwrócone przez 2-3 sekundy przed obróceniem ich do pionu. Nie należy naruszać żadnych kropli, które mogą pozostać na wylocie tubki.
  9. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
  10. Wykonaj analizę cytometryczną przepływową dla naiwnych limfocytów T CD4 + przed i po izolacji (Rysunek 1).
  11. Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  12. Zawiesić komórki w 200-500 μl pożywki RPMI 1640 (uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą). Na każdy 1 ml hodowli komórkowej (np. ~106 komórek/ml) dodaj 2 μl koktajlu aktywacji leukocytów i wymieszaj. Hodować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i wilgotności nasyconej przez 4-6 h.
    UWAGA: Komórki były wirowane raz na 1-2 godziny.
  13. Odwirować komórki w temperaturze 400 × g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ostrożnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS. Dodaj 1 μl blokera Fc do komórek (np. ~106 komórek/ml). Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Przemyć komórki raz 1 ml PBS przez odwirowanie w stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS.
  15. Dodać koktajl przeciwciał (Fixable Viability Dye, 1:1 000; anty-CD4, 1:200; anty-CD44, 1:200; anty-CD62L, 1:200) i inkubować komórki przez 15-20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  16. Przemyć komórki 2 x 1 ml PBS, a następnie odwirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 250 μl stałego buforu i inkubować je przez 40-60 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Bufor utrwalający jest dostarczany z buforem barwiącym Foxp3 / czynnikiem transkrypcyjnym, który jest 4x roztworem podstawowym, który należy rozcieńczyć rozcieńczalnikiem do przepuszczalności.
  18. Dodać 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego, aby przemyć komórki 2x przez odwirowanie komórek w temperaturze 300 × g, 4 °C przez 5 min.
  19. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu permeabilizacji i dodać przeciwciało (Foxp3 [jądrowe], 1:200) do komórek. Po utrwaleniu i pęknięciu błony inkubować mieszaniny komórka-przeciwciało w ciemności przez 40-60 minut, od czasu do czasu wstrząsając przez krótkie okresy w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Roztwór do permeabilizacji/płukania jest 10-krotnym roztworem podstawowym, który należy rozcieńczyć przed użyciem z PBS.

4. Indukcja patogennych komórek Th17 in vitro

  1. Przed użyciem należy usunąć sterylny PBS z wstępnie powlekanych płytek 24-dołkowych.
  2. Do hodowli należy użyć pożywki do hodowli komórek Th17 (tabela 1) i pożywki kontrastowej, w tym pożywki do hodowli komórek Th0 (tabela 1), klasycznej niepatogennej pożywki do hodowli Th17 (tabela 1) i klasycznej patogennej pożywki do hodowli Th17 (tabela 1). Ponownie zawiesić wzbogacone naiwne limfocyty T CD4 + i dozować do różnych dołków w tej samej 24-dołkowej płytce (wstępnie pokrytej anty-CD3), dostosowując stężenie do 4 × 105 komórek/ml, z 1 ml pożywki w każdym dołku.
  3. Dodać 1 μl/ml roztworu anty-CD28 (końcowe stężenie: rozcieńczone pożywką do 2 μg/ml) do każdego dołka. Hodować komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 dni.
  4. Zastąp pożywkę szwadronową pożywką hodowlaną pożywką (Th0, niepatogenny Th17, klasyczny patogenny Th17 i obiektywny Th17) przez ostrożne pipetowanie w celu równomiernego rozprowadzenia komórek, wyrzuć połowę pożywki zawierającej komórki, a następnie dodaj nową pożywkę równą objętości odrzutu w dniu 2. Powtórz w 4 dniu.
  5. Obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym w 5 dniu (Rysunek 2). Zebrać supernatanty komórkowe z każdej grupy i zakonserwować je w temperaturze -80 °C.

5. Analiza cytometrii przepływowej dla patogennego różnicowania komórek Th17 i Th0

  1. Zbierz wszystkie komórki (na studzienkę) po 5 dniach od rozpoczęcia hodowli. Wykonaj kroki 3.12-3.15.
  2. Dodać koktajl przeciwciał (Fixable Viability Dye, 1:1 000; anty-CD4, 1:200) i inkubować komórki przez 15-20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  3. Wykonaj kroki 3.17-3.19.
  4. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu przepuszczalnego i dodać koktajl przeciwciał (IL-17A [wewnątrzkomórkowy], 1:200; RORγT [jądrowy], 1:200) do komórek. Po utrwaleniu i pęknięciu błony inkubować mieszaniny komórka-przeciwciało w ciemności przez 40-60 minut, od czasu do czasu wstrząsając przez krótki czas w temperaturze 4 °C.
  5. Dodać 1 ml 1x roztworu przepuszczalnego/płuczącego w celu przemycia komórek 2x, odwirowując komórki w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C; następnie odrzucić supernatant.
  6. Zbadaj komórki na cytometrze przepływowym i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania (Rysunek 3).
    1. Włącz cytometr przepływowy i włącz proces samodzielnego uruchamiania czyszczenia i kalibracji.
    2. Wybierz kanał laserowy używany w tym eksperymencie i ustaw pustą probówkę, pojedynczo barwione probówki i probówki z próbkami.
    3. Kliknij opcję pustej probówki i przetestuj na maszynie; dostosuj napięcie tak, aby zdarzenie ogniwa było, o ile to możliwe, w środku pudełka zbiorczego.
    4. Zbierz pojedynczo barwione komórki probówki i wykonaj detekcję spektralną odpowiednich kanałów, aby potwierdzić, że przeciwciało fluorescencyjne zostało dodane prawidłowo.
    5. Kliknij przycisk unmix i pozwól urządzeniu automatycznie dostosować kompensację spektralną. W przypadku innych przyrządów do cytometrii przepływowej należy normalnie wyregulować kompensację fluorescencji.
    6. Zbierz każdą komórkę probówki z próbką, zapisz format danych jako pliki FCS i wyeksportuj. Analizuj i sporządzaj wykresy w odpowiednim oprogramowaniu do analizy danych cytometrii przepływowej.
      1. Okrąż główną populację komórek i usuń ewentualne zrosty komórkowe przez bramki po przekątnej koła FSC-H i FSC-A.
      2. Zakreśl żywe komórki zgodnie z ujemnym obszarem okręgu FVS; następnie zakreśl populację komórek CD4+.
      3. Skonstruuj bramkę krzyżową z osią poziomą jako IL-17 A i osią pionową jako RORγT; podwójnie dodatnia selekcja w obszarze Q2 to populacja komórek Th17.

6. Test immunoenzymatyczny (ELISA) do wykrywania wydzielania IL-17A indukowanego przez różne pożywki

  1. Rozmrozić supernatanty z zamrożonych komórek zebrane w sekcji 4.5.
  2. Dodać 100 μl rozcieńczonego wzorca, próby ślepej i próbki do wyznaczonych studzienek. Za pomocą zgrzewarki przykryć płytkę i inkubować przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Dodaj roztwory na dno płytki mikro-ELISA, nie dotykając wewnętrznej ścianki ani nie powodując pienienia.
  3. Zdekantować płyn z każdej studzienki i natychmiast dodać 100 μl roztworu roboczego Biotynylowanego przeciwciała wykrywającego. Użyć nowego uszczelniacza, aby przykryć płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Zdekantować roztwór i dodać 350 μl buforu do przemywania do każdej studzienki. Po 1 minutach odessać lub zdekantować roztwór z każdej studzienki i osuszyć go na czystym bibułze chłonnym. Powtórz ten krok prania 3 razy.
  5. Do każdej studzienki dodać 100 μl sprzężonego roztworu roboczego peroksydazy chrzanowej. Użyć nowego uszczelniacza, aby przykryć płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Zdekantować roztwór z każdej studzienki i powtórzyć proces płukania 5 razy, jak opisano w kroku 6.4.
  7. Dodać 90 μl odczynnika do substratu do każdego dołka i inkubować przez około 15 minut w temperaturze 37 °C z nowym uszczelniaczem, chroniąc płytkę przed światłem.
    UWAGA: Czas reakcji można zmienić w zależności od rzeczywistej zmiany koloru, ale nie powinien przekraczać 30 minut. Pozwól czytnikowi mikropłytek rozgrzać się przez ~15 minut przed pomiarem średnicy zewnętrznej.
  8. Dodać 50 μl/studzienkę roztworu zatrzymującego w tej samej kolejności, co roztwór substratu.
  9. Określić gęstość optyczną (wartość OD) każdej studzienki jednocześnie za pomocą czytnika mikropłytek ustawionego na 450 nm.
  10. Uzyskać wartości OD dla próbek wzorcowych i powtórzyć studzienki próbek, a następnie odjąć wartości OD studzienek ślepej próby, aby uzyskać skorygowane wartości. Następnie wykonaj dopasowanie liniowe ze stężeniem jako odciętą i wartością OD jako rzędną. Na podstawie dopasowanego równania oblicz wartości stężenia IL-17A dla studzienek na próbki.
    UWAGA: Po 4 dniach różnicowania, zawartość IL-17A w supernatancie każdej grupy jest pokazana w Rysunek 4. Sposób dopasowania może odnosić się do oprogramowania Orgin21. Krzywa standardowa uzyskana w tym eksperymencie ma wartość R2 równą 0,9946.

7. Różnicowanie limfocytów T za pomocą testów ekspresji genów w ujęciu ilościowym (qPCR)

UWAGA: Aby wykluczyć możliwość niestabilności cytometrii przepływowej spowodowanej działaniem barwników i fiksacji/pęknięcia, wykryliśmy ekspresję charakterystycznych genów za pomocą qPCR, aby wyjaśnić efekt różnicowania patogennego Th17 na poziomie transkrypcji.

  1. Zmierz liczbę komórek na końcu hodowli limfocytów T. Zebrać komórki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować pod ciśnieniem 400 × g przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić wszystkie supernatanty.
  2. Ekstrakcja RNA
    UWAGA: Proces ekstrakcji musi być przeprowadzany w dygestoriach lub ultra czystym stole, aby uniknąć zanieczyszczenia enzymami RNA.
    1. Dodać 500 μl buforu do lizy (np. do 1-2 × 106 komórek) do probówki z próbką (krok 7.1), natychmiast wstrząsnąć i mieszać, aż nie będzie masy komórkowej i odstawić na 1 minutę.
    2. Dodać mieszaninę do kolumny adsorpcyjnej umieszczonej w probówce zbiorczej, odwirować przy 13 400 × g przez 30 s i wyrzucić filtrat.
    3. Dodaj określoną ilość bezwzględnego etanolu do butelki z buforem do mycia przed pierwszym użyciem. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny adsorpcyjnej, odwirować przy 13 400 × g przez 30 s i odrzucić filtrat.
    4. Powtórzyć pranie w kroku 7.2.3.
    5. Umieścić kolumnę adsorpcyjną RA w pustej probówce zbiorczej i odwirować przy 13 400 × g przez 2 minuty w celu usunięcia roztworu płuczącego.
      UWAGA: Roztwór płuczący należy usunąć, aby zapobiec zahamowaniu dalszej reakcji przez resztki etanolu w roztworze do płukania.
    6. Wyjmij kolumnę adsorpcyjną RA i umieść ją w czystej probówce wirówkowej wolnej od RNaz. Dodać 50 μl H2O wolnego od RNaz do środka membrany adsorpcyjnej, odstawić na 1 minutę w temperaturze pokojowej i odwirować przy 9 600 × g przez 1 minutę.
  3. Zmierz czystość i stężenie RNA.
  4. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
    1. Usuń genomowe DNA. Pobrać 500 ng wyekstrahowanej matrycy RNA do probówki wirówkowej wolnej od RNaz; dodaj wolną od RNaz mieszankę ddH, 2O i 4x gDNA, aby utworzyć mieszaninę. Delikatnie zmiksuj pipetą i umieść w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 2 min.
      UWAGA: Ilość mieszaniny reakcyjnej i ilość dodana są związane ze stężeniem RNA; Zapoznaj się ze szczegółowymi instrukcjami. W tym eksperymencie zastosowano układ reakcyjny o pojemności 20 μl.
    2. Bezpośrednio dodaj 5-krotny system reakcji odwrotnej transkrypcji do probówki reakcyjnej poprzedniego kroku. Pobrać 4 μl systemu reakcji odwrotnej transkrypcji i 16 μl mieszaniny z poprzedniego etapu i delikatnie wymieszać pipetą.
      UWAGA: System odwrotnej transkrypcji zawiera całą wymaganą odwrotną transkryptazę, która jest bezpośrednio skonfigurowanym systemem odwrotnej transkrypcji.
    3. Ustaw reakcję odwrotnej transkrypcji: 37 °C 15 min, 85 °C, 5 s, a na koniec schłodzić do 4 °C.
  5. Skonfiguruj reakcję PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Dodać 10 μl mieszaniny 2x enzymów reakcyjnych PCR do probówki qPCR, 0,4 μl startera 1, 0,4 μl startera 2, 0,4 μl 50x barwnika referencyjnego ROX 1, 2 μl matrycy cDNA i 6,8 μl ddH2O, aby przygotować mieszaninę 20 μl.
    2. Wykonać PCR w ilościowym przyrządzie do fluorescencji w czasie rzeczywistym przy użyciu następujących ustawień: etap 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; etap 2, najpierw 95 °C, 10 s, następnie 60 °C, 30 s, Rep x 40; etap 3, najpierw 95 °C, 15 s, następnie 60 °C, 60 s, wreszcie 95 °C, 15 s, rep x 1,
      UWAGA: Po 4 dniach różnicowania względne poziomy ekspresji Il17a, Il17f, Rora i Il23r w naiwnych limfocytach T CD4 + są pokazane w Rysunek 5.

Wyniki

Nasz protokół został opracowany w oparciu o wcześniejsze badania nad różnicowaniem patogennych komórek Th17. Pierwszym krokiem eksperymentu jest oznaczenie czystości naiwnych komórek T CD4+ wyizolowanych ze śledziony za pomocą sortowania magnetycznego, co stanowi podstawę sukcesu późniejszego różnicowania patogennych komórek Th17. Czystość naiwnych komórek T CD4+ oznaczano z wykorzystaniem markerów powierzchniowych CD62L23 oraz CD4424, natomiast FOXP325 służył jako marker komórek Treg. Stwierdzono, że zawartość komórek Treg uległa znacznemu zmniejszeniu po sortowaniu, a czystość naiwnych komórek T CD4+ mogła osiągnąć co najmniej 95% (Rycina 1). Aby porównać różnicowanie patogennych komórek Th17, naiwne komórki T CD4+ hodowano w medium Th0 (Tabela 1) oraz w medium do różnicowania Th17 (Tabela 1) przez łącznie 5 dni. Zaobserwowano, że komórki T wykazywały wzrost w klastrach w obu rodzajach mediów, Th0 i Th17 (Rycina 2).

Następnie komórki utrwalono, permeabilizowano i oznakowano przeciwciałami przeciwko kilku cytokinom w zróżnicowanych limfocytach T CD4+ przy użyciu cytometrii przepływowej. Analizowano IL17A26 oraz RORγT27 jako charakterystyczne cytokiny różnicowania komórek Th17 i stwierdzono, że 90% naiwnych limfocytów T CD4+ pomyślnie zróżnicowało się w patogenne komórki Th17 pod wpływem stymulacji nową pożywką do hodowli komórek Th17 (Rysunek 3). Rysunek 5 przedstawia geny sygnaturowe komórek Th17 wykryte metodą PCR, co potwierdziło stabilną ekspresję w uzyskanych w procesie różnicowania patogennych komórkach Th17.

figure-results-1
Rysunek 1: Strategia bramkowania dla analizy charakterystycznych cytokin u myszy C57BL/6J przed i po izolacji naiwnych limfocytów T CD4+. Skróty: FSC-H = wysokość piku rozproszenia w przód; SSC-H = wysokość piku rozproszenia bocznego; FSC-A = pole piku rozproszenia w przód; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fykoerytryna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy naiwnych komórek T CD4+ myszy hodowanych przez 5 dni w patogennych warunkach Th17 oraz warunkach Th0. (A) komórki Th0; (B) patogenne komórki Th17. Paski skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Analiza cytometryczna po różnicowaniu indukowanym przez pożywkę do hodowli komórek Th0 oraz pożywkę do hodowli komórek Th17. Skróty: FSC-H = wysokość piku rozproszenia przedniego; SSC-H = wysokość piku rozproszenia bocznego; FSC-A = pole piku rozproszenia przedniego; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fykoerytryna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Zawartość IL-17A w nadsączu pożywki do hodowli komórek Th0 oraz w nadsączu pożywki do hodowli komórek Th17 po indukcji różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki poziomów ekspresji charakterystycznych cytokin w zróżnicowanych limfocytach T CD4+ myszy C57BL/6J. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

 Poziom medium do hodowli patogennych komórek Th17pożywka do hodowli komórek Th0Klasyczna pożywka do hodowli niepatogennych limfocytów Th17Klasyczna pożywka do hodowli patogennych komórek Th17.
OdczynnikStężenie końcowe IlośćStężenie końcowe IlośćStężenie końcowe IlośćStężenie końcowe Ilość
Penicylina-streptomycyna (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
Płodowa surowica bydlęca10%5 ml10%5 mL10%5 mL10%5 mL
β-merkaptoetanol50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL
suplement GlutaMAXTM (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
Roztwór pirogronianu sodu (100x)1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL
Przeciwciało przeciwko IFN gamma mysiej (1 mg/ml)5 µg/mL250 μL10 µg/mL500 μL10 µg/mL500 μL
Przeciwciało przeciwko mysiej IL-4 (2 mg/mL)5 µg/mL125 μL5 µg/mL250 μL10 µg/mL250 μL
mysia rIL-1 beta (20 µg)20 ng/mLND
mysia rIL-6 (20 µg)20 ng/mLBrak dostępnych danych50 ng/mLBrak danych50 ng/mLBrak danych
mysia rIL-23 (50 µg)50 ng/mLND10 ng/mLBrak danych
mysi TGF beta (100 µg)3 ng/mLNA1 ng/mLND1 ng/mLND
 mysia IL-2 (5 µg)20 ng/mLNie dotyczy
RPMI 1640NDDo 50 mlND do 50 mlNDDo 50 ml
SumaBrak danych50 mlBrak danych50 mlBrak danych50 ml

Tabela 1: Pożywki do hodowli docelowych patogennych komórek Th17, komórek Th0, klasycznych niepatogennych oraz patogennych komórek Th17.

Dyskusja

Procedura ta zaoferowała produktywny sposób na zwiększenie liczby naiwnych limfocytów T CD4 + T śledziony myszy do produkcji in vitro patogennych komórek Th17. Chociaż używamy więcej cytokin niż inne zgłoszone pożywki do hodowli komórek Th17, jesteśmy zaangażowani w optymalizację warunków wzrostu patogennych komórek Th17. Rozważamy dalszą optymalizację naszego protokołu różnicowania indukowanego.

W tym przypadku po prostu użyliśmy cytometrii przepływowej i qPCR do zbadania produkcji charakterystycznych cytokin. Z kilkoma niewielkimi modyfikacjami, podejście to może być również stosowane do innych testów funkcjonalnych, takich jak proliferacja komórek.

Użyliśmy wyprodukowanego w Chinach zestawu do izolacji limfocytów do izolacji limfocytów śledziony myszy, ponieważ jest on skuteczny i oszczędza czas. Rozwiązania do separacji limfocytów oparte na innych markach mogą również osiągnąć cel separacji limfocytów śledziony myszy na różnych etapach. Inną metodą jest bezpośrednia liza czerwonych krwinek uzyskanej zawiesiny komórek śledziony; Odkryliśmy jednak, że czerwone krwinki śledziony często nie mogą być poddawane lizie w tym samym czasie.

Podczas wykonywania tego protokołu mogą wystąpić pewne problemy. Po pierwsze, liczba naiwnych limfocytów T CD4 + uzyskanych przez sortowanie magnetyczne kulek może być bardzo niska (krok 3 protokołu). Można to przypisać niewystarczającemu procesowi miażdżenia narządów. Ważne jest, aby upewnić się, że narząd jest odpowiednio homogenizowany. Zwiększenie częstotliwości płukania podczas procesu homogenizacji poprawi wskaźnik odzysku. Aby uzyskać większą liczbę naiwnych limfocytów T CD4 + śledziony, sugerujemy użycie młodszych myszy (w wieku 6-10 tygodni). Dostępne są różne metody oddzielania limfocytów śledziony, a wydajność może się różnić w zależności od użytego płynu separacyjnego. Zaleca się stosowanie uniwersalnie certyfikowanego płynu separacyjnego i próbę ekstrakcji warstwy limfocytów w jak największym stopniu.

Po drugie, proporcja limfocytów T CD4 + w cytometrii przepływowej może wynosić <80% (krok protokołu 5). Jedną z możliwych przyczyn tego problemu może być niedokładna liczba splenocytów, co skutkuje liczbą komórek większą niż w przypadku dodatkowego koktajlu przeciwciał i kulek magnetycznych. Aby zwiększyć skuteczność naiwnego oczyszczania limfocytów T CD4+ , liczenie komórek musi być precyzyjne. Dodatkowo można użyć o 10% więcej koktajlu przeciwciał i kulek magnetycznych w stosunku do tego, co zaleca ten protokół. Wreszcie, cytometrię przepływową można wykonać natychmiast po posortowaniu naiwnych limfocytów T CD4 + .

Po trzecie, podczas hodowli może nie powstać wiele skupisk limfocytów T, a większość komórek mogła umrzeć podczas różnicowania limfocytów T (krok 4 protokołu). Potencjalną przyczyną tego problemu może być niedokładne określenie liczby komórek dla naiwnych limfocytów T CD4 + przed wysiewem, co skutkuje niską gęstością komórek. Zaleca się przyjęcie dokładniejszej metody liczenia, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek około 4 × 105 komórek/ml na każdą studzienkę w płytce 48-dołkowej. Inną możliwą przyczyną mogą być problemy techniczne z inkubatorem CO2 , takie jak nieprawidłowa temperatura lub stężenie CO2 . Wreszcie, nadmierna siła podczas zmiany pożywki do hodowli komórkowej może potencjalnie spowodować śmierć komórki.

Po czwarte, względne poziomy ekspresji genów cytokin sygnatury mogą być niskie (krok 7 protokołu). Aby zapewnić autentyczność wyekstrahowanego RNA, zaleca się stosowanie stężenia wykrywającego nanokropelki większego niż 100 ng/ml. Potencjalną przyczyną spadku stężenia może być niezdrowy charakter hodowanych komórek, np. duża część pobranych komórek jest martwa lub w trakcie śmierci. Aby uzyskać prawdziwe stężenie RNA, konieczne jest rozwiązanie sytuacji, która może prowadzić do słabego wzrostu podczas hodowli komórek. Alternatywnym powodem tego problemu może być zbyt niska końcowa liczba komórek osiągnięta podczas ekstrakcji RNA, prawdopodobnie z powodu niezamierzonej utraty komórek podczas usuwania supernatantu. Korzystne może okazać się zastosowanie zaawansowanych technik ekstrakcji RNA, takich jak jednoetapowe zestawy do ekstrakcji RNA. Idealny stosunek OD260/OD280, mierzony za pomocą Nanodrop, powinien mieścić się w zakresie 1,9-2,1. W przypadku zbyt niskiego współczynnika możliwe staje się zanieczyszczenie białkami. Zwiększenie częstotliwości mycia wolnych od RNaz może pomóc w złagodzeniu tego problemu. I odwrotnie, nietypowo niski stosunek implikuje potencjalną degradację RNA. Aby przeciwdziałać temu problemowi, zaleca się stosowanie wody wolnej od RNaz i użycie probówek o pojemności 1,5 ml do celów dekontaminacji RNazy.

Podsumowując, obecny protokół opisuje zastosowanie nowej pożywki do hodowli komórkowych w celu bezpośredniego indukowania naiwnych limfocytów T CD4 + do różnicowania się w patogenne komórki Th17 in vitro. W porównaniu z separacją bezpośrednią nie ma wątpliwości, że ta metoda jest bardziej bezpośrednia, niedroga i bardziej wydajna. Konfiguracja pożywki jest również bardzo prosta, dzięki czemu zbudowane komórki Th17 mogą być bardziej intuicyjnie wykorzystywane do kolejnych eksperymentów, stanowiąc bardzo dobry model komórkowy do badania wielu chorób.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Podziękowania

Praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (No.2022YFC2304604), National Natural Science Foundation of China (No.81971812), National Natural Science Foundation of China (No.82272235), Science Foundation of the Commission of Health of Jiangsu Province (No. ZDB2020009), Kluczowy projekt badawczy, rozwojowy (rozwój społeczny) w prowincji Jiangsu (nr BE2021734), Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Ministerstwa Nauki i Technologii (nr 2020YFC083700), Kluczowe Laboratorium Medycyny Intensywnej Terapii w prowincji Jiangsu (BM2020004), Kluczowy projekt Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81930058), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (82171717), Fundusze Badań Podstawowych Uniwersytetów Centralnych (2242022K4007), oraz projekt ogólny Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20211170).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
Rat anty-myszy CD62L, BV650, klon MEL-14, rozcieńczenie 1:200BDCat# 564108; RRID: AB_2738597
Szczur monoklonalny anty-CD4, FITC, klon RM4-5, rozcieńczenie 1:200BioLegendCat#100509; RRID: AB_312712
Szczur monoklonalny anty-IL-17A, PE, klon TC11-18H10.1, rozcieńczenie 1:200BioLegendCat#506903; RRID: AB_ 315463
Szczur monoklonalny anty mysz/człowiek CD44, APC, klon IM&, rozcieńczenie 1:200BioLegendCat#103012; RRID: AB_312963
Szczurzy monoklonalny anty-RORγ T, APC, klon B2D, rozcieńczenie 1:200InvitrogenCat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Szczurze przeciwciało monoklonalne FOXP3, PE, klon FJK-16s, rozcieńczenie 1:200InvitrogenCat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane
Anti-Mouse CD3 SAFIRE oczyszczonebioklejnotyCat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE oczyszczonebioklejnotyCat#10312-25
Anti-Mouse IFN gammabiogemsCat#80822-25
Anti-Mouse IL-4biogemsKot#81112-25
EtanolXilong scientificKot#64-17-5
Płodowa surowica bydlęcaGibcoCat#10437-028
Odczynnik blokujący FcRMiltenyi BiotecCat#130-092-575
Suplement GlutaMAXgibcoCat#35050079
Mysz rIL-1 betaSinoBiologiczny Kot#50101-MNAE
Mysz rIL-6Sino Biological Cat#50136-MNAE
Mysz rIL-23Sino BiologicalCat#CT028-M08H
Mysz TGF beta 1Sino BiologicalCat#50698-M08H
PBSProcellCat#PB180327
Rekombinowana mysia IL-2peprotechCat#212-12
RPMI 1640 z L-glutaminąGibcoCat#11875-119
Roztwór penicyliny i streptomycynyGibcoCat#15070063
β-merkaptoetanolSigma-AldrichCat#M6250-100ML
strong>Krytyczne testy komercyjne
Zestaw roztworu do separacji limfocytów narządów zwierzęcychTbdscienceCat#TBD0018SOPZawiera płyn do separacji limfocytów w tkance śledziony zwierzęcej, rozcieńczalnik do próbek tkanek (nr kat. 2010C1119), roztwór do czyszczenia próbki (nr kat. 2010X1118), roztwór do mycia próbek (nr kat. TBTDM-W), płyn do płukania homogenatu tkankowego (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)VazymeCat#Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Utrwalanie/przepuszczalność KoncentratinvitrogenCat#00-5123-43
Utrwalanie / Permeabilization DiluentinvitrogenCat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506invitrogenCat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)VazymeCat#R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Koktajl aktywacji leukocytówBDCat#550583
Mysz IL-17A (interleukina 17A) Zestaw ELISAElabscience®Nr kat.#E-EL-M0047
Naï ve CD4+ zestaw do izolacji limfocytów T, mysiSTEMCELLCat#19765Zestaw EasySep zawiera koktajl izolacji limfocytów T CD4 + myszy [nr kat. 19852C.1], koktajl zubożający limfocyty T pamięci myszy [nr kat. 18766C], streptawidyna RapidSphered 50001 [nr kat. 50001], normalna surowica szczura [nr kat. 13551]); Przechowywać surowicę szczura tylko w temperaturze -20 & Deg; C; inne składniki należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
Bufor permeabilizacyjnyinvitrogenCat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA KitSparkjadeCat#AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Modele eksperymentalne: Organizmy/szczepy
Mysz: C57BL/6GempharmatechCat#000013
Oligonukleotydy
Mouse Il17a Startery TaqMan z sondąrybobioNA
Mysz Il17f Startery TaqMan z sondąrybobioNA
Mysz Il23r Startery TaqMan z sondąrybobioNA
Mysz Rora TaqMan startery z sondąrybobioNA
β-aktyna Startery TaqMan z sondąrybobioNA
strong>Oprogramowanie i algorytmy
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Drzewo Gwiazdahttps://www.flowjo.com
pryzmat GraphPad 9Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad-prism.cn
< strong>Inne
1 mL strzykawkaKindlyNA
1,5 ml Probówki wirówkoweEppendorfCat#MCT-150-C
5 mL Probówki okrągłodenneCorningCat#352235
15 mL Probówki wirówkoweNESTCat#601052
48-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (spłaszczone dno)CorningKat#3548
50 ml Probówki wirówkoweNESTCat#602052
70 µ m Sitko do komórekBiosharpCat#BS-70-XBS
płytki qPCR bez osłonkiVIOX scientificCat#V4801-M
100 mm szalka PetriegoCorningCat#430167
WirówkaEppendorf5425R
Inkubator CO2 do hodowli komórkowychThermo FisherHEPA Class100
Cytek AuroraCytekNA
nożyczki preparacyjneRWDS12003-09
HemocytometrAlphaCellCat#J633201
NanoDrop 2000 SpektrofotometrThermo FisherND-2000
System PCR w czasie rzeczywistymRocheLightCycler96
Pęseta chirurgicznaRWDF12005-10
TermocyklerBio-RadC1000 Touch
<< 96-dołkowe

Bibliografia

  1. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  2. Bhaumik, S., Basu, R. Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response. Front Immunol. 8, 254(2017).
  3. Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V. K. Induction and effector functions of T(H)17 cells. Nature. 453 (7198), 1051-1057 (2008).
  4. Korn, T., et al. IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells. Nature. 448 (7152), 484-487 (2007).
  5. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).
  6. Yang, X. O., et al. T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma. Immunity. 28 (1), 29-39 (2008).
  7. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  8. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  9. McGeachy, M. J., et al. The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo. Nat Immunol. 10 (3), 314-324 (2009).
  10. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323 (2021).
  11. Ramesh, R., et al. Pro-inflammatory human Th17 cells selectively express P-glycoprotein and are refractory to glucocorticoids. J Exp Med. 211 (1), 89-104 (2014).
  12. Basdeo, S. A., et al. Ex-Th17 (nonclassical Th1) cells are functionally distinct from classical Th1 and Th17 cells and are not constrained by regulatory T cells. J Immunol. 198 (6), 2249-2259 (2017).
  13. Cua, D. J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421 (6924), 744-748 (2003).
  14. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182 (10), 5904-5908 (2009).
  15. Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E., Kuchroo, V. K. Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes. J Immunol. 183 (11), 7169-7177 (2009).
  16. Lee, Y., Collins, M., Kuchroo, V. K. Unexpected targets and triggers of autoimmunity. J Clin Immunol. 34, Suppl 1 (0 1) S56-S60 (2014).
  17. Chang, D., et al. The conserved non-coding aequences CNS6 and CNS9 control cytokine-induced Rorc transcription during T helper 17 cell differentiation. Immunity. 53 (3), 614-626 (2020).
  18. Bunte, K., Beikler, T. Th17 cells and the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of periodontitis and immune-mediated inflammatory diseases. Int J Mol Sci. 20 (14), 3394(2019).
  19. Zhao, Y., Liu, Z., Qin, L., Wang, T., Bai, O. Insights into the mechanisms of Th17 differentiation and the Yin-Yang of Th17 cells in human diseases. Mol Immunol. 134, 109-117 (2021).
  20. Berghmans, N., et al. Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Interferon Cytokine Res. 31 (7), 575-587 (2011).
  21. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic Th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  22. Du, L., et al. Growth hormone releasing hormone signaling promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation. Nat Commun. 14 (1), 3298(2023).
  23. Ernst, D. N., Weigle, W. O., Noonan, D. J., McQuitty, D. N., Hobbs, M. V. The age-associated increase in IFN-gamma synthesis by mouse CD8+ T cells correlates with shifts in the frequencies of cell subsets defined by membrane CD44, CD45RB, 3G11, and MEL-14 expression. J Immunol. 151 (2), 575-587 (1993).
  24. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  25. El-Hindi, K., et al. T-cell-specific CerS4 depletion prolonged inflammation and enhanced tumor burden in the AOM/DSS-induced CAC model. Int J Mol Sci. 23 (3), 1866(2022).
  26. Cooney, L. A., Towery, K., Endres, J., Fox, D. A. Sensitivity and resistance to regulation by IL-4 during Th17 maturation. J Immunol. 187 (9), 4440-4450 (2011).
  27. Zhu, X., et al. A novel interleukin-2-based fusion molecule, HCW9302, differentially promotes regulatory T cell expansion to treat atherosclerosis in mice. Front Immunol. 14, 1114802(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek Th17izolacja splenocyt w mysichsortowanie za pomoc kulek magnetycznychcytometria przep ywowapo ywka do hodowli kom rkowejmodele chor b autoimmunologicznychseparacja limfocyt w

Powiązane artykuły