Artykuł metodologiczny

Optymalizacja metody zamykania tętnic środkowych Longa w celu uzyskania pełnej reperfuzji

DOI:

10.3791/66720

⸱

22 listopada 2024

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia przewodnik krok po kroku dla badaczy, jak przeprowadzić procedurę zamknięcia tętnicy środkowej mózgu na myszach przy użyciu zmodyfikowanej metody Longa tętnicy szyjnej zewnętrznej. Modyfikacje przedstawione w artykule mają na celu zwiększenie dokładności niedrożności tętnicy środkowej mózgu i zapewnienie pełnej reperfuzji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu służy jako główny model zwierzęcy do badania udaru niedokrwiennego. Pomimo tego, że jest stosowany w badaniach od ponad trzech dekad, jego standaryzacja pozostaje niewystarczająca. Procedura, przeprowadzana głównie na szczurach i myszach, stanowi wyzwanie ze względu na mniejszą i bardziej delikatną naturę myszy. W przeciwieństwie do metody wspólnej tętnicy szyjnej Koizumi, tętnica szyjna zewnętrzna Longa jest jedynym modelem udaru włókna śródświetlnego zapewniającym całkowitą reperfuzję po niedokrwieniu. Aspekt ten ma kluczowe znaczenie dla badań nad zjawiskami reperfuzji. Modyfikacje chirurgiczne przedstawione w tym artykule zapewniają ciągły przepływ krwi z tętnicy szyjnej wspólnej przez całą fazę niedokrwienną i po rozpoczęciu reperfuzji. Celem tych modyfikacji jest selektywne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej poprzez utrzymanie nieprzerwanej perfuzji w gałęziach proksymalnych do środkowej tętnicy mózgowej w okresie niedokrwienia. Co więcej, początek reperfuzji jest nagły i może być precyzyjnie kontrolowany, co pozwala dokładniej modelować trombektomię wewnątrznaczyniową w medycynie ludzkiej. Naszym celem w przedstawieniu tego obszernego artykułu wideo jest ułatwienie szkolenia nowych chirurgów i promowanie standaryzacji procedur chirurgicznych w społeczności naukowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar mózgu jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów i trzecią główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności Combined1. Ze względu na przyczynę, udar może być niedokrwienny lub krwotoczny, przy czym udar niedokrwienny jest znacznie bardziej rozpowszechniony w praktyce klinicznej. Udar niedokrwienny powstaje w wyniku zablokowania tętnicy dostarczającej krew do tkanki mózgowej, co prowadzi do niedokrwienia, śmierci komórek i stanu zapalnego. Od czasu pojawienia się terapii reperfuzyjnych, takich jak tromboliza i trombektomia mechaniczna, poczyniono ogromne postępy w leczeniu udaru mózgu. Jednak wszystkie terapie reperfuzyjne niosą ze sobą ryzyko pogorszenia stanu pacjenta poprzez spowodowanie tego, co jest powszechnie określane jako uraz reperfuzyjny2. Dokładny mechanizm uszkodzenia reperfuzyjnego pozostaje niejasny, a badania przedkliniczne mają na celu zidentyfikowanie potencjalnych przyczyn i środków zapobiegawczych. W tym celu kluczowe staje się opracowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego uszkodzenia reperfuzyjnego, które następuje po udarze niedokrwiennym.

Zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej używanym modelem zwierzęcym do badania udaru niedokrwiennego. Przeprowadza się go głównie na gryzoniach i ma wiele różnych wariantów opisanych do tej pory w literaturze naukowej3,4. Dwa główne typy, Koizumi i Longa, znane jako warianty tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), technicznie różnią się miejscem wprowadzania włókien w arteriotomii5,6. W naszym niedawnym artykule, monitorując in vivo perfuzję naczyniową, wykazaliśmy, że tylko metoda Longa może być naprawdę uważana za model niedokrwienia/reperfuzji mózgu7. Procedura polega na wprowadzeniu włókna do ECA, przepuszczeniu go przez ICA i zabezpieczeniu go w punkcie rozgałęzienia tętnicy środkowej mózgu (MCA) w celu wywołania niedokrwienia tkanki mózgowej. Po z góry określonym okresie niedokrwienia, wycofanie włókna umożliwia reperfuzję, symulując przejściowe niedokrwienie mózgu. Po wystąpieniu udaru mózgu podstawową zmienną wynikową stosowaną w badaniach jest najczęściej objętość zmiany zawałowej, którą można zmierzyć za pomocą histologii ex vivo lub skanów mózgu in vivo. Wyzwania w modelach MCAO koncentrują się wokół niskiej odtwarzalności przypisywanej wariancjom międzywariantowym, międzyoperatorskim i międzyosobniczym, przy czym te ostatnie stanowią znaczące ograniczenie w przedklinicznych badaniach nad udarem4.

Ponadto, obszary zawału po MCAO u gryzoni są ogromne w stosunku do wielkości mózgu gryzonia. Ponadto tylne obszary mózgu hipokampa często są rekrutowane do objętości zawału, mimo że te regiony są głównie zależne od przepływu krwi z tylnej tętnicy mózgowej (PCA), a nie MCA8. Podobnie jak w przypadku metod Koizumi i Longa opisanych w literaturze, CCA jest utrzymywane w stanie ligacji w okresie niedokrwienia ze względu na niepełną drożność koła Willisa u myszy, co prowadzi do indukcji niedokrwienia w znacznie szerszym regionie niż zamierzono5,6,9. Nawet w metodach, w których CCA jest ponownie otwierane lub naprawiane po okresie niedokrwienia, zwykle 30-60 minut niedokrwienia powoduje nieodwracalne uszkodzenie tkanek w regionach niebędących MCA10. Ponadto, wbrew oczekiwaniom, wcześniejsze badania wykazały, że długość powłoki silikonowej filamentu nie ma wpływu na rozmiar zmiany11. Jednak wybór długości powłoki silikonowej filamentu był poruszany wyłącznie w modelach z podwiązanym CCA w okresie okluzji.

Celem tej metody było zmodyfikowanie metody Longa MCAO u myszy, aby umożliwić nieprzerwany przepływ krwi z CCA podczas okresu niedokrwienia, zwiększając tym samym selektywność MCAO, a także zapewniając pełną reperfuzję obszaru po zabiegu. Modyfikacje te przyniosłyby ogromne korzyści w badaniach podłużnych badających uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne u myszy, obniżając śmiertelność i zmniejszając wariancję między osobnikami.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury postępowania ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Licencjonowania Etyki Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Zagrzebiu oraz Komisję Etyki ds. Ochrony Zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych Ministerstwa Rolnictwa Republiki Chorwacji. Procedury doświadczalne przeprowadzono zgodnie z chorwacką ustawą o ochronie zwierząt (NN 102/17, 32/19), zmianami w ustawie o ochronie zwierząt (NN 37/13) oraz wytycznymi dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (NN 55/13), które są zgodne z europejskim przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania (dyrektywa 2010/63/UE).

1. Przygotowanie zwierzęcia i miejsca operacji

  1. Umieścić zwierzę w pudełku do wybijania i wywołać znieczulenie za pomocą 5% objętości izofluranu w mieszaninie tlenu i azotu (stosunek 1:2).
  2. Po oględzinach stanu świadomości i częstotliwości oddychania zwierzęcia przynieś je do wagi laboratoryjnej i zważ
    3. .
  3. Sprawdź odruch, ściskając skórę międzypalcową kończyny dolnej, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
  4. Umieść zwierzę na podgrzewanym stole operacyjnym i włóż jego nos do maski anestezjologicznej. Ustaw początkową temperaturę stołu operacyjnego na 36 °C i dostosuj ją tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C (mierzoną za pomocą sondy doodbytniczej wprowadzonej w późniejszych krokach). We wszystkich dalszych krokach należy dostosować frakcję objętościową izofluranu, aby utrzymać częstość oddechów zwierzęcia na poziomie 100 oddechów/min.
    UWAGA: Wszystkie powierzchnie i materiały mające bezpośredni kontakt ze zwierzęciem muszą być dokładnie zdezynfekowane przed zabiegiem.
  5. Nałóż maść na oczy zwierzęcia, aby chronić je przed odwodnieniem i gazem izofluranowym.
  6. Obróć zwierzę na plecy i wyciągnij szyję, umieszczając pod nim małą poduszkę wykonaną z taśmy chirurgicznej.
  7. Zabezpiecz kończyny zwierzęcia na miejscu za pomocą taśmy chirurgicznej. Należy uważać, aby nie wyprostować zbyt mocno kończyn przednich, aby nie spowodować nieumyślnego zwichnięcia stawu barkowego.
  8. Nasmaruj sondę doodbytniczą białą galaretką naftową i włóż ją do odbytnicy w celu ciągłego pomiaru temperatury ciała. Zamocuj sondę na miejscu wraz z ogonem za pomocą taśmy chirurgicznej.
  9. Przedoperacyjne wstrzyknięcie soli fizjologicznej i buprenorfiny (0,5 mg/kg) należy wykonać dootrzewnowo, aby zwierzę było dobrze nawodnione i znajdowało się w stanie znieczulenia podczas zabiegu.
  10. Ogol sierść zwierzęcia w okolicy szyi za pomocą bezprzewodowej maszynki do strzyżenia zwierząt. Zbierz całe ogolone futro za pomocą kawałków taśmy chirurgicznej. Dodatkowo ogol obszar brzytwą, aby był całkowicie wolny od sierści.
  11. Wybierz filament MCAO w oparciu o mierzoną wagę i/lub wiek zwierzęcia. Wyjmij go z pojemnika i umieść na szalce Petriego w widocznym miejscu. Nałóż kroplę soli fizjologicznej na silikonową część filamentu, aby była czysta i wolna od kurzu.
    UWAGA: Grubość silikonowej powłoki filamentu powinna być dobrana zgodnie z oficjalnymi zaleceniami producenta w przypadku 12-16 tygodniowej myszki. Dodatkowo długość powłoki silikonowej powinna być starannie zaplanowana z wyprzedzeniem, w zależności od wielkości obszaru irygacji, który ma być zasłonięty (patrz Dyskusja).
  12. Umieść czystą serwetę chirurgiczną na stole operacyjnym.
  13. Nałóż kroplę Betadine na ogoloną skórę zwierzęcia. Użyj bawełnianego wacika, aby wetrzeć środek dezynfekujący w skórę w okrężny sposób od wewnątrz na zewnątrz. Następnie zrób to samo z wacikiem nasączonym etanolem. Powtórz ten krok 3 razy ze świeżą parą sterylnych wacików bawełnianych przy każdym powtórzeniu.
  14. Nałóż odrobinę żelu lidokainowego na zdezynfekowany obszar przyszłego miejsca nacięcia w celu miejscowego znieczulenia rany.

2. Operacja indukcji niedokrwienia

  1. Wykonaj wstępne nacięcie na zdezynfekowanej skórze za pomocą skalpela. Utrzymuj liczbę pociągnięć nacięć skóry na minimalnym poziomie, aby rana pooperacyjna łatwiej się goiła.
    UWAGA: Wszystkie narzędzia muszą być wcześniej wysterylizowane. Czytelnik powinien zapoznać się z ich instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi używania sterylnych lub chirurgicznych rękawiczek.
  2. Za pomocą kleszczy typu 7 i 5 oderwij powięź powierzchowną i odłącz gruczoły ślinowe od leżącej poniżej tkanki.
    UWAGA: Zawsze przesuwaj się z zamkniętymi kleszczami i rozciągaj je, odsuwając się, aby odepchnąć tkankę. W ten sposób przestrzenie anatomiczne mogą być przemierzane przy minimalnym urazie tkanki.
  3. Umieść zwijacz drutu w pozycji wyjściowej, upewniając się, że gruczoły ślinowe nie przeszkadzają w kolejnych krokach.
  4. Usuń głęboką powięź szyi za pomocą kleszczy typu 7 i odłącz mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe od okolicy szyjnej, aby zmienić położenie retraktora.
  5. Zmień położenie retraktora, aby sięgnąć pod mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe, aby umożliwić dostęp do okolicy szyjnej.
  6. Wytnij mięsień omohyoidalny, aby umożliwić wyraźny wizualny i łatwiejszy dostęp do okolicy szyjnej.
  7. Uwolnij tętnicę szyjną i jej odgałęzienia od żyły szyjnej i nerwu błędnego, które są utrzymywane razem w powięzi szyjnej.
    UWAGA: Powięź tę należy usunąć ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia nerwu błędnego lub spowodowania znacznego krwawienia.
    1. Ściśnij powięź szyjną po bocznej stronie triady szyjnej i delikatnie pociągnij ją na boki, aby wizualnie zidentyfikować tętnicę, nerw, żyłę i wszystkie otaczające gałęzie naczyń krwionośnych.
    2. Ciągnąc powięź bocznie, za pomocą kleszczy typu 5, oddziel CCA od sąsiedniego nerwu i żyły aż do punktu rozgałęzienia i górnej żyły tarczycy, która przecina CCA.
    3. Całkowicie odłącz dolną część CCA od leżącej poniżej tkanki i powięzi za pomocą zakrzywionych kleszczy typu 7, upewniając się, że jest gotowa do zaciśnięcia w przyszłych krokach.
    4. Postępując czaszkowo w okolicy powyżej punktu rozgałęzienia CCA, rozerwij powięź szyjną za pomocą dwóch kleszczy.
    5. Podobnie pociągnij luźny koniec powięzi szyjnej przyśrodkowo i bocznie, aby precyzyjnie odłączyć ECA i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) odpowiednio od powięzi i otaczającej tkanki.
    6. Uwolnij ECA i ICA od leżącej pod spodem tkanki za pomocą zakrzywionych kleszczy typu 7.
  8. Po starannym przygotowaniu CCA z dwoma odpowiednimi gałęziami, podnieś ECA za pomocą zakrzywionych kleszczy typu 7 i zaciśnij je za pomocą kleszczy samozamykających typu N0.
  9. Ostrożnie opuść kleszcze samozamykające typu N0 na stole operacyjnym.
    UWAGA: Aby zmienić położenie punktu zacisku ECA, czasami konieczne jest lekkie zwolnienie uchwytu i doogonowe popchnięcie punktu rozgałęzienia ECA. W tym momencie ważne jest, aby upewnić się, że między zaciskiem ECA a punktem rozgałęzienia pozostaje więcej niż 1 mm ECA.
  10. Gdy ECA jest zaciśnięty i bezpiecznie trzymany pęsetą typu N0, wprowadź dwie plecione nici jedwabne za ECA.
    UWAGA: Nić czaszkowa będzie tworzyć węzeł podwiązania i musi być umieszczona czaszkowo od miejsca zaciskania.
  11. Całkowicie zwiąż nić czaszki, ponieważ jest trwała, i odetnij nadmiar nici za pomocą nożyczek.
  12. Zawiąż nić ogonową w luźny węzeł zabezpieczający.
    UWAGA: Musi być umieszczony blisko punktu rozgałęzienia ECA i trzymany luźno, aby filament MCAO mógł przez niego przejść.
  13. Za pomocą mikroklipsów naczyniowych zacisnąć CCA i ICA, aby zapobiec krwawieniu po arteriotomii.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że mikroklips nałożony na CCA ma wystarczająco mocny uchwyt, ponieważ CCA jest pulsującą tętnicą o dużej przepustowości, a niezastosowanie się do tego może spowodować obfite krwawienie i śmierć zwierzęcia w późniejszych etapach.
  14. Za pomocą nożyczek z mikrosprężynami wykonaj małą arteriotomię tuż pod miejscem mocowania ECA.
    UWAGA: Arteriotomia musi być wystarczająco duża, aby silikonowa część filamentu mogła się w nią wwiercić, ale nie większa niż połowa obwodu ECA, aby nie naruszyć napięcia utrzymywanego przez kleszcze typu N0.
  15. Przy kącie odpowiadającym kątowi ECA, wprowadzić włókno do miejsca arteriotomii w kierunku proksymalnym do CCA, przechodząc przez luźny węzeł zabezpieczający w miejscu rozgałęzienia ECA i wbijając się w światło CCA wraz z włóknem.
  16. Dokręć węzeł zabezpieczający wokół silikonowej części filamentu.
    UWAGA: W tym momencie należy zachować dużą ostrożność, ponieważ filament ma tendencję do wysuwania się z ECA w połowie ostatniego manewru, a włożenie go z powrotem w tym momencie jest bardzo trudne.
  17. Ostrożnie otwórz mikroklips ICA i wyjmij go.
  18. Po częściowym włożeniu filamentu do ECA i zabezpieczeniu go w dół, wykonaj pełną arterytomię, uwalniając w ten sposób kikut ECA z filamentem MCAO w środku. W tym momencie zwolnij kleszczyki samozamykające typu N0 i wyjmij je.
  19. Za pomocą jednego zestawu pęsety typu 5 mocno ściśnij kikut ECA i lekko go podnieś. Przytrzymując częściowo włożony filament innymi kleszkami, opuść i delikatnie pociągnij kikut ECA, aby zorientować wewnętrzny koniec filamentu w kierunku ICA. Nigdy nie ściskaj silikonowej części filamentu.
  20. Trzymając kleszcze za żarnik, powoli przesuwaj włókno przez ICA w kierunku okręgu Wills.
    UWAGA: Pierwszy punkt rozgałęzienia ICA jest również jedynym, w którym operator może pominąć żądany punkt rozgałęzienia MCA. Dlatego konieczny jest niewielki boczny kąt posuwu, aby poprowadzić żarnik do punktu rozgałęzienia MCA. Przy niewielkim bocznym kącie przesunięcia, włókno zakrzywia się od tętnicy skrzydłowo-podniebiennej (PPA) i sprawia, że posuwający się koniec z większym prawdopodobieństwem wejdzie w krąg Willisa (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ilustracja przesuwania się włókna okluzji tętnicy środkowej mózgu poza punkt rozgałęzienia tętnicy skrzydłowo-podniebiennej. Prawidłowe przesuwanie filamentu (po lewej) uzyskuje się poprzez zorientowanie filamentu MCAO w taki sposób, aby opierał się plecami o boczną ścianę ICA i zakrzywiał się od punktu rozgałęzienia PPA. Niezastosowanie się do tego (po prawej) może spowodować, że filament dostanie się do PPA i nie spowoduje udaru. W tym drugim przypadku filament nie będzie w stanie przesunąć się tak daleko, jak powinien, a chirurg powinien wycofać włókno do momentu, aż jego koniec stanie się widoczny w punkcie rozgałęzienia ICA i ponownie zacząć przesuwać włókno. Tętnice w kolorze zielonym reprezentują tylne tętnice komunikacyjne (PcomA), w większości nieopatentowane u myszy. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Powoli przesuwaj włókno MCAO przez krąg Willisa, aż poczujesz nagły wzrost oporu.
    UWAGA: W tym momencie ważne jest, aby obserwować pozostałą długość filamentu. Filament powinien bez wysiłku przesuwać się co najmniej 7 mm od punktu rozgałęzienia ICA u dorosłej myszy.
  2. Zaciśnij węzeł zabezpieczający, aby upewnić się, że filament nie zostanie przemieszczony podczas niedokrwienia.
  3. Zdejmij klips CCA i zanotuj czas.
    UWAGA: To oznacza początek początku niedokrwienia.
  4. Umieść luźny koniec filamentu MCAO w rowku między trójkątem tętnicy szyjnej a mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym ipsilateralnym, aby nie wystawał z rany operacyjnej.
  5. Wyjmij zwijacz drutu i zbliż krawędzie rany pooperacyjnej do siebie. Pozwól polu chirurgicznemu osiąść na kilka sekund, aby tkanka powróciła do swojej anatomicznej pozycji.
  6. Zamknij ranę pooperacyjną za pomocą taśmowych zamknięć ran, aby ułatwić szybsze ponowne otwarcie rany po okresie niedokrwienia.
    UWAGA: Jeśli badacz chce, aby zwierzę obudziło się w okresie niedokrwienia, zaleca się zszycie rany, aby zapobiec przedwczesnemu ponownemu otwarciu rany.

3. Okres niedokrwienia

  1. Potwierdź powodzenie operacji za pomocą rezonansu magnetycznego lub innej metody ilościowego pomiaru perfuzji.
    UWAGA: W przypadku wykonania rezonansu magnetycznego, obrazowanie perfuzyjne zależne (PWI) powinno wykazać krytyczne niedokrwienie w szerokim obszarze MCA, a obrazowanie dyfuzyjne (DWI) powinno nakreślić miejsce zmniejszonego pozornego współczynnika dyfuzji (ADC) z powodu obrzęku komórek.
  2. Umieść zwierzę w czystej klatce, aż skończy się okres niedokrwienia.

4. Operacja odłączenia filamentu

  1. Na około 5 minut przed upływem wyznaczonego czasu niedokrwienia należy ułożyć zwierzę i ponownie przymocować je do stołu operacyjnego.
  2. Usuń zamknięcia owijania ran taśmą i ponownie otwórz ranę pooperacyjną za pomocą zwijacza drutu.
  3. Uwolnij luźny koniec filamentu MCAO z otaczającej tkanki i końców nici węzła zabezpieczającego.
  4. Za pomocą kleszczyków typu N0 ściśnij i pociągnij brzusznie krawędź kikuta ECA, aby go napiąć. Ostrożnie opuść kleszcze zaciskowe w dół, podobnie jak w przypadku pierwszego zabiegu chirurgicznego.
    UWAGA: Operator musi unikać ściskania węzła zabezpieczającego, ponieważ uniemożliwi to rozwiązanie węzła.
  5. Ponownie zacisnąć CCA za pomocą klipsa mikronaczyniowego.
  6. Za pomocą kleszczyków typu 5 poluzuj węzeł zabezpieczający, aby umożliwić wyjęcie filamentu.
    UWAGA: Najlepszym sposobem na rozpoczęcie poluzowywania węzła jest ściskanie go, aż rozdzieli się na poszczególne części, a następnie dociśnięcie końców nici w kierunku węzła.
  7. Powoli wyjmij filament MCAO, aż część silikonowa zacznie wystawać z kikuta ECA. Lekko dokręć węzeł zabezpieczający, aby przygotować się do całkowitego wyjęcia filamentu.
  8. Gdy zbliżysz się do silikonowego końca filamentu, dokręć węzeł zabezpieczający tak, aby wypchnął filament MCAO i zamknął kikut ECA jednym manewrem. Całkowicie zaciśnij węzeł po wysunięciu się filamentu.
  9. Otwórz i wyjmij kleszczyki zaciskowe wraz z klipsem CCA.
    UWAGA: Oznacza to koniec okresu niedokrwienia i początek procesu reperfuzji.
  10. Wyjmij zwijacz drutu i ponownie zbliż krawędzie rany pooperacyjnej do siebie.
  11. Zszyć ranę pooperacyjną, zaczynając od jej obrzeża, całkowicie zamykając ranę bez widocznej tkanki znajdującej się pod spodem.
    UWAGA: Liczba wymaganych szwów zależy od wielkości rany pooperacyjnej.
  12. Oczyść i zdezynfekuj pole operacyjne za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem.

5. Opieka pooperacyjna

  1. Umieść zwierzę w czystej klatce i pozwól mu spontanicznie obudzić się z narkozy.
  2. Umieść granulowaną żywność na dnie klatki, aby ułatwić dostęp. Zmiękcz granulki żywności za pomocą wody pitnej. Napełnij małą szalkę Petriego wodą pitną i przynieś ją również na podłogę klatki.
  3. W ciągu następnych 48 godzin wstrzykiwać 0,25 ml soli fizjologicznej z buprenorfiną (0,5 mg/kg) co 24 godziny dootrzewnowo.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródoperacyjne lub pooperacyjne skany MRI, w szczególności obrazowanie z użyciem perfuzji (PWI) i/lub obrazowanie dyfuzyjne (DWI) (Rysunek 2) mogą dostarczyć ostatecznego dowodu udanej procedury. Śródoperacyjne PWI wykazuje krytyczne niedokrwienie w ipsilateralnym obszarze MCA, potwierdzając w ten sposób, że umieszczenie włókna spowodowało całkowitą okluzję. Pooperacyjne PWI udanego zabiegu wykazuje hiperperfuzję w rdzeniu zmiany, a także pewien stopień reperfuzji na granicach regionu MCA. Śródoperacyjne zmiany DWI odpowiadają obserwowanym obszarom niedokrwiennym na śródoperacyjnym PWI. Pooperacyjne zmiany DWI wykazują kurczenie się w kierunku rdzenia zmiany niedokrwiennej, czemu towarzyszy znaczny spadek pozornego współczynnika dyfuzji zmiany, co sprawia, że jest ona ciemniejsza niż śródoperacyjne zmiany DWI i otaczająca je reperfuzyjna tkanka mózgowa. Standardowe skany anatomiczne T2, zarówno śródoperacyjne, jak i pooperacyjne, zazwyczaj nie wykazują niczego godnego uwagi, chyba że wystąpi krwotok wywołany włóknem

(Rysunek 3). W takich przypadkach skany PWI i DWI ujawniają niepełne niedokrwienie lub brak niedokrwienia.

Proces reperfuzji następuje w ciągu następnych 48 godzin i potwierdzono, że miał miejsce na skanach MRI wykonanych drugiego dnia po zabiegu (Rysunek 2, CBF w dniu 2). Skany PWI wykazują całkowitą reperfuzję w miejscu zmiany chorobowej z niewielką hiperperfuzją w rdzeniu zmiany. Skany DWI pokazują wiele obszarów obniżonych pozornych współczynników dyfuzji z powodu powstawania obrzęku mózgu. Skany anatomiczne T2 wskazują na hiperintensywne obszary obrzęku otaczające regiony MCA, bez udziału regionów innych niż MCA, takich jak hipokamp.

Po przebudzeniu, zwierzę wykazuje wyraźne oznaki ostrego udaru. Typowe objawy behawioralne obejmują zwiększone napięcie mięśniowe po stronie zmiany, co powoduje, że zwierzę zgina tułów w tym kierunku. Krążenie i obracanie się w kierunku ipsilateralnym jest również wyraźnymi oznakami ostrego udaru. Ataksja chodu często sugeruje udział hipokampa w objętości zmiany niedokrwiennej. Jednak objaw ten może nie być specyficzny w fazie nadostrej ze względu na skutki uboczne znieczulenia izofluranem. W kolejnych dniach u zwierzęcia powinno rozwinąć się ipsilateralne zgięcie kończyn przednich i pogorszenie stanu posturalnego, któremu towarzyszy brak odruchu wąsów. Śmiertelność osiąga szczyt około 3 dni po zabiegu z powodu obrzęku mózgu. Faza przewlekła rozpoczyna się po tym, jak obrzęk mózgu zacznie ustępować. W tym czasie zwierzę może mieć zatrzymanie moczu. Z tego powodu ważne jest, aby sprawdzić zwierzę pod kątem sztywności pęcherza, a także mocnej nasadki na ujściu cewki moczowej. W większości przypadków problem ten można rozwiązać, delikatnie masując pęcherz, aby ułatwić oddawanie moczu. Objawy odzyskania masy ciała pojawiają się zwykle w ciągu pierwszych 7 dni po wystąpieniu udaru.

figure-results-1
Rysunek 2: Reprezentatywny przykład udanego MCAO z pełną reperfuzją potwierdzoną skanami MRI. CBF, ADC i T2w oznaczają odpowiednio mapy przepływu krwi w mózgu, mapy współczynników pozornej dyfuzji i skany anatomiczne zależne od T2. IntraOP, postop i D02 oznaczają 3 różne punkty czasowe obrazowania odpowiednio po wystąpieniu niedokrwienia, po rozpoczęciu reperfuzji i na drugi dzień po MCAO. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Reprezentatywne skany MRI krwotoku wywołanego filamentem podczas procedury MCAO. CBF, ADC i T2w oznaczają odpowiednio mapy przepływu krwi w mózgu, mapy współczynników pozornej dyfuzji i skany anatomiczne zależne od T2. IntraOP, postOP i D02 oznaczają 3 różne punkty czasowe obrazowania: odpowiednio po wystąpieniu niedokrwienia, po rozpoczęciu reperfuzji i na drugi dzień po MCAO. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Ilustracja prawidłowego ułożenia włókien w środkowej gałęzi tętnicy mózgowej. W większości przypadków silikonowa część włókna (w kolorze białym) utknie w bliższej części przedniej tętnicy mózgowej (ACA) około 2 mm dalej niż punkt rozgałęzienia MCA. Zwykle region mózgu ACA nie ulega zmianie u myszy, ponieważ ACA łączy się z przeciwległym w pojedynczy azygos ACA. Dotknięte tętnice są pokazane na szaro. Po lewej stronie CCA jest pozostawione w stanie niedokrwienia, dostarczając w ten sposób krew do wszystkich gałęzi ICA aż do MCA, która jest zasłonięta silikonową częścią włókna. Po prawej stronie filament jest umieszczony identycznie, z wyjątkiem tego, że podwiązanie CCA jest utrzymywane w okresie niedokrwienia. Ze względu na to, że PcomA (kolor zielony) nie jest opatentowany w większości przypadków, jeśli podwiązanie CCA zostanie zachowane, udar nieselektywnie obejmuje większość półkuli ipsilateralnej poprzez MCA, AchA, VTA, HTA i PCA. W takich przypadkach można również zaobserwować objawy ostrego zawału oka (leukocoria i anizokoria) z powodu zablokowanego PPA. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCAO jest bardzo wymagającą procedurą dla operatora i wyniszczającą dla zwierzęcia. Z tego powodu niezwykle ważne jest, aby badacze dysponowali standardową procedurą operacyjną, która minimalizuje nasilenie udaru, zmniejsza liczbę niepowodzeń proceduralnych i poprawia samopoczucie zwierzęcia po zabiegu. Ten protokół MCAO podkreśla niektóre z kluczowych aspektów, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania tej procedury na myszy.

Wybór filamentu MCAO wpływa na wielkość i lokalizację indukowanej zmiany udarowej i dlatego jest krytycznym krokiem w tej procedurze11. Filamenty powlekane silikonem, takie jak te zapoczątkowane przez Doccol, dokonały dużego skoku w obniżaniu częstości występowania krwotoków wywołanych przez włókna12. Jednak włókna pokryte silikonem są dostępne w wielu różnych rozmiarach i długościach, co stanowi wyzwanie dla nowych badaczy, aby wybrać odpowiednie dla MCAO u zwierząt doświadczalnych. Podczas gdy producenci filamentów zwykle podają wytyczne dotyczące wyboru odpowiedniej średnicy filamentu dla danej wagi zwierzęcia, długość powłoki silikonowej jest uważana za osobistą preferencję operatora i powinna być wybierana wyłącznie na podstawie umiejętności operatora. W tej pracy opowiadamy się za zminimalizowaniem długości krzemu, aby zapewnić, że wywołana zmiana udarowa obejmuje tylko obszar irygacji MCA, poprawiając w ten sposób odtwarzalność. Rycina 4 ilustruje, że tylna tętnica mózgowa (PCA), pierwsza wewnątrzczaszkowa gałąź ICA, zaopatruje tylne obszary mózgu, w tym części hipokampa. Ostatnie badania mikro-CT na myszach zidentyfikowały dodatkowe trzy mniejsze gałęzie powstające z ICA przed punktem rozgałęzienia MCA13. Delikatna i zmienna tętnica podwzgórzowa (HTA), brzuszna tętnica nakrywkowa (VTA) i tętnica naczyniówkowa przednia (AChA), w kolejności rozgałęzień, w znacznym stopniu przyczyniają się do zmienności wewnątrzwariantowej i wewnątrzosobniczej8. Co więcej, badania mikro-CT wykazały, że u myszy średnia odległość od punktów rozgałęzień MCA i PCA wynosi około 1,7 mm, czyli znacznie krócej niż długość powłoki silikonowej większości produkowanych włókien14. Ponieważ jedyną informacją zwrotną, jaką otrzymuje operator podczas przesuwania żarnika, jest nagły wzrost oporu, gdy żarnik osiąga punkt rozgałęzienia MCA, długość spływu powłoki silikonowej włókna jest tym, co wywołuje niedokrwienie MCA i, w zależności od długości powłoki silikonowej, AChA, VTA, HTA, a nawet PCA, wprowadzenie zmienności sprzecznej z zamierzonym modelem MCAO. W związku z tym, aby zachować odtwarzalność i pooperacyjny dobrostan zwierząt, celem powinna być wyłącznie okluzja MCA. Doccol oferuje filamenty MCAO z powłokami silikonowymi o grubości od 1 do 2 mm, jednak z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie powłok o grubości 1-2 mm często skutkuje pozorowaną operacją bez powodowania udaru. Śródoperacyjne skany MRI wykazały, że włókno przesuwa się do 2 mm poza punkt rozgałęzienia MCA do przedniej tętnicy mózgowej (ACA) przed dostarczeniem operatorowi krytycznego rezystancyjnego sprzężenia zwrotnego. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy stosowanie powłok silikonowych o długości od 2 do 3 mm, które zmniejszają zaangażowanie hipokampa w zmiany udarowe w porównaniu z dłuższymi powłokami silikonowymi na włóknach MCAO.

Drugim krytycznym krokiem w tej procedurze jest prawidłowe umieszczenie filamentu MCAO w celu uzyskania całkowitej okluzji MCA. Błędne wejście do pierwszej gałęzi ICA, tętnicy skrzydłowo-podniebiennej (PPA), jest częstym problemem dla operatora, ponieważ nie ma prawie żadnej informacji zwrotnej, że filament MCAO skręcił w niewłaściwy sposób podczas posuwania się. Z tego powodu zalecamy niewielki boczny kąt wyprzedzenia, aby pokryta silikonem końcówka filamentu zakrzywiała się od punktu rozgałęzienia PPA, co zwiększa prawdopodobieństwo wejścia w wewnątrzczaszkową część ICA. (Rysunek 1) Jak stwierdzono w sekcji protokołu, ważne jest, aby obserwować długość włókna ciągnącego, aby stwierdzić, czy umieszczenie żarnika jest odpowiednie. W przypadku, gdy żarnik nie może zostać wsunięty na co najmniej 7 mm od punktu rozgałęzienia ICA, operator powinien wycofać żarnik i powtórzyć czynność. Każda niepotrzebna siła przyłożona podczas wkładania filamentu może spowodować krwotok i nieudaną procedurę. W tym przypadku można zastosować ciągły pomiar perfuzji laserowo-dopplerowskiej, aby potwierdzić prawidłowe ułożenie filamentu.

Zapewnienie niezakłóconego przepływu krwi z CCA w okresie niedokrwiennym jest kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole. W przeciwieństwie do większości ilustracji przedstawiających pełny krąg Willisa u myszy, badania wykazały, że tylna tętnica łącząca (PcomA) najczęściej nie jest obustronnie opatentowana u myszy i nie może niezawodnie zaopatrywać ipsilateralnej strony koła Willisa, jeśli CCA pozostaje zamknięta w okresie niedokrwienia15,16. W takich przypadkach, nawet jeśli badacz starannie wybierze odpowiednią długość silikonowej powłoki filamentu, skok obejmie całą półkulę lub tylko obszar MCA, w zależności od drożności PcomA, powodując nieuwzględnioną wariancję rozmiarów pociągnięć. Z tego powodu zmodyfikowaliśmy procedurę tak, aby obejmowała krok instrukcji, w którym operator zdejmuje klips CCA zaraz po ustawieniu zasłaniającego filamentu MCAO. Modyfikacje te mogą zwiększyć precyzję i powtarzalność operacji, a jednocześnie zmniejszyć niejednorodność wyników. Standaryzacja metod przyczyniłaby się do dalszej poprawy wskaźnika sukcesu i porównywalności, a także potencjału translacyjnego wyników17.

Największym ograniczeniem proponowanej techniki jest fakt, że ECA pozostaje podwiązany po zabiegu, co może potencjalnie pogorszyć stan zwierzęcia podczas rekonwalescencji18. Do tej pory bezskutecznie udało nam się doprowadzić do naprawy Trybunału Obrachunkowego, przy jednoczesnym utrzymaniu wskaźnika powodzenia procedury. Pozostaje to potencjalnym punktem dla przyszłych ulepszeń metody. Co więcej, zminimalizowanie czasu, w którym CCA pozostaje zaciśnięte, jest wyzwaniem, ale jest niezbędne, aby zapobiec rekrutacji regionów innych niż MCA w udarze. Ponieważ może to stanowić źródło wariancji między- i wewnątrzoperatorskiej, zaleca się pomiar czasu trwania zaciskania CCA, co potencjalnie umożliwi naukowcom statystyczne uwzględnienie przynajmniej ułamka obserwowanej całkowitej wariancji w rozmiarach skoków. Z drugiej strony, umiejętności i doświadczenie operatora odgrywają kluczową rolę w skróceniu czasu podwiązania CCA i skróceniu całkowitego czasu trwania zabiegu11.

Przedstawiona metoda jest istotna, ponieważ umożliwia naukowcom selektywne zamykanie MCA, dzięki czemu początek reperfuzji jest nagły i wysoce kontrolowany. Metoda naśladuje trombektomię wewnątrznaczyniową i jej późniejsze uszkodzenie reperfuzyjne dokładniej niż obecnie dostępne metody, dostarczając szczegółów dla powtarzalnego i klinicznie istotnego modelu uszkodzenia niedokrwiennego/reperfuzyjnego u zwierząt.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić. Autorzy nie są powiązani z nazwami handlowymi i znakami towarowymi wymienionymi w tej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez projekt Chorwackiej Fundacji Naukowej BRADISCHEMIA (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.01.0007 finansowany przez Unię Europejską za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego oraz przez Unię Europejską za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego na podstawie Umowy o udzielenie dotacji nr KK.01.1.1.07.0071, projekt "SineMozak. Praca doktorantek Roka Istera i Marty Pongrac została w pełni wsparta przez projekt "Rozwój kariery młodych naukowców – szkolenie doktorantów" Chorwackiej Fundacji Naukowej, finansowany przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego. Zabieg został sfilmowany za pomocą smartfona z systemem Android zamontowanego do mikroskopu chirurgicznego za pomocą ogólnego mocowania kamery. Materiały wideo zostały zmontowane, a lektor został nagrany za pomocą edytora wideo Wondershare Filmora.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Betadine roztwór do skóry 10g/100mlAlkaloidSkopje N/A
Pleciony jedwabny szewFine Science Tools18020-60
Dafilon szew 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 mg/g żelJadran-Galenski LaboratorijN/A
Dumont #5 kleszczeFine Science Tools11251-202 sztuki
Kleszcze Dumont #7Fine Science Tools11271-30
Kleszcze samozamykające Dumont N0Fine Science Tools11480-11
Taśma chirurgiczna Durapore 1,25cm x 9,1mTaśma chirurgiczna 3M
Durapore 2,5cm x 9,1m3M7100057168
Termostat zewnętrznyPetnap1012536
Uchwyty do igieł HalseyaFine Science Tools12500-12
Sterylizator gorących koralikówFine Science Tools18000-50
Nożyczki do tęczówkiFine Science Tools14060-10
Isofluran USPPiramal critical careN/A
Laserowy monitor dopplerowskiMoorMOORVMS-LDF2
Metalowa podkładka termiczna dla zwierząt Petnap
Nożyczki sprężynowe Micro VannasFine Science Tools15000-00
Zwijacz Mini-colibriFine Science Tools17000-01
Maść do oczu RecugelBausch& LombN/A
S& T B-1 mikrozacisk naczynia Narzędzia do nauki o naczyniu00396-012 sztuki
S& Zacisk T mikro kleszcz kleszczowyFine Science Tools00071-14
Mikro serfinezy SchwartzaNarzędzia do nauki18052-01
Stemi DV4 Mikroskop stereoskopowypunktowy Zeiss000000-1018-453
Steri-Strip Wzmocnione samoprzylepne zamknięcia skórne 3 mm x 75 mm3M7100236545
Kleszcze do tkanek prostychFine Science Tools11023-10
SZX Stand ArmOlympusSZ2-STS
Tec III 300 series kalibrowanywaporyzator Waporyzator Sprzedaż i serwis inc.Nie dotyczy
Uniwersalny stojak typu 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo Sześciokanałowy stojak anestezjologicznyKent ScientificVetFlo-1225Zmodyfikowany do mieszania O2/N2
7100057169 1012525

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feigin, V. L., et al. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).
  2. Bai, J., Lyden, P. D. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).
  3. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  4. Hill, J. W., Nemoto, E. M. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).
  5. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  6. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  7. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  8. El Amki, M., et al. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).
  9. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).
  10. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).
  11. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
  12. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  13. Guan, Y., et al. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).
  14. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  15. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  16. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  17. Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).
  18. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Middle Cerebral ArteryIschemic Stroke ModelCerebral Artery OcclusionComplete ReperfusionExternal Carotid ArteryIntraluminal Filament ModelRodent Stroke ModelSurgical StandardizationPerfusion Weighted ImagingApparent Diffusion Coefficient

Powiązane artykuły