Ten protokół przedstawia przewodnik krok po kroku dla badaczy, jak przeprowadzić procedurę zamknięcia tętnicy środkowej mózgu na myszach przy użyciu zmodyfikowanej metody Longa tętnicy szyjnej zewnętrznej. Modyfikacje przedstawione w artykule mają na celu zwiększenie dokładności niedrożności tętnicy środkowej mózgu i zapewnienie pełnej reperfuzji.
Artykuł metodologiczny
Optymalizacja metody zamykania tętnic środkowych Longa w celu uzyskania pełnej reperfuzji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu służy jako główny model zwierzęcy do badania udaru niedokrwiennego. Pomimo tego, że jest stosowany w badaniach od ponad trzech dekad, jego standaryzacja pozostaje niewystarczająca. Procedura, przeprowadzana głównie na szczurach i myszach, stanowi wyzwanie ze względu na mniejszą i bardziej delikatną naturę myszy. W przeciwieństwie do metody wspólnej tętnicy szyjnej Koizumi, tętnica szyjna zewnętrzna Longa jest jedynym modelem udaru włókna śródświetlnego zapewniającym całkowitą reperfuzję po niedokrwieniu. Aspekt ten ma kluczowe znaczenie dla badań nad zjawiskami reperfuzji. Modyfikacje chirurgiczne przedstawione w tym artykule zapewniają ciągły przepływ krwi z tętnicy szyjnej wspólnej przez całą fazę niedokrwienną i po rozpoczęciu reperfuzji. Celem tych modyfikacji jest selektywne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej poprzez utrzymanie nieprzerwanej perfuzji w gałęziach proksymalnych do środkowej tętnicy mózgowej w okresie niedokrwienia. Co więcej, początek reperfuzji jest nagły i może być precyzyjnie kontrolowany, co pozwala dokładniej modelować trombektomię wewnątrznaczyniową w medycynie ludzkiej. Naszym celem w przedstawieniu tego obszernego artykułu wideo jest ułatwienie szkolenia nowych chirurgów i promowanie standaryzacji procedur chirurgicznych w społeczności naukowej.
Wprowadzenie
Udar mózgu jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów i trzecią główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności Combined1. Ze względu na przyczynę, udar może być niedokrwienny lub krwotoczny, przy czym udar niedokrwienny jest znacznie bardziej rozpowszechniony w praktyce klinicznej. Udar niedokrwienny powstaje w wyniku zablokowania tętnicy dostarczającej krew do tkanki mózgowej, co prowadzi do niedokrwienia, śmierci komórek i stanu zapalnego. Od czasu pojawienia się terapii reperfuzyjnych, takich jak tromboliza i trombektomia mechaniczna, poczyniono ogromne postępy w leczeniu udaru mózgu. Jednak wszystkie terapie reperfuzyjne niosą ze sobą ryzyko pogorszenia stanu pacjenta poprzez spowodowanie tego, co jest powszechnie określane jako uraz reperfuzyjny2. Dokładny mechanizm uszkodzenia reperfuzyjnego pozostaje niejasny, a badania przedkliniczne mają na celu zidentyfikowanie potencjalnych przyczyn i środków zapobiegawczych. W tym celu kluczowe staje się opracowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego uszkodzenia reperfuzyjnego, które następuje po udarze niedokrwiennym.
Zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej używanym modelem zwierzęcym do badania udaru niedokrwiennego. Przeprowadza się go głównie na gryzoniach i ma wiele różnych wariantów opisanych do tej pory w literaturze naukowej3,4. Dwa główne typy, Koizumi i Longa, znane jako warianty tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), technicznie różnią się miejscem wprowadzania włókien w arteriotomii5,6. W naszym niedawnym artykule, monitorując in vivo perfuzję naczyniową, wykazaliśmy, że tylko metoda Longa może być naprawdę uważana za model niedokrwienia/reperfuzji mózgu7. Procedura polega na wprowadzeniu włókna do ECA, przepuszczeniu go przez ICA i zabezpieczeniu go w punkcie rozgałęzienia tętnicy środkowej mózgu (MCA) w celu wywołania niedokrwienia tkanki mózgowej. Po z góry określonym okresie niedokrwienia, wycofanie włókna umożliwia reperfuzję, symulując przejściowe niedokrwienie mózgu. Po wystąpieniu udaru mózgu podstawową zmienną wynikową stosowaną w badaniach jest najczęściej objętość zmiany zawałowej, którą można zmierzyć za pomocą histologii ex vivo lub skanów mózgu in vivo. Wyzwania w modelach MCAO koncentrują się wokół niskiej odtwarzalności przypisywanej wariancjom międzywariantowym, międzyoperatorskim i międzyosobniczym, przy czym te ostatnie stanowią znaczące ograniczenie w przedklinicznych badaniach nad udarem4.
Ponadto, obszary zawału po MCAO u gryzoni są ogromne w stosunku do wielkości mózgu gryzonia. Ponadto tylne obszary mózgu hipokampa często są rekrutowane do objętości zawału, mimo że te regiony są głównie zależne od przepływu krwi z tylnej tętnicy mózgowej (PCA), a nie MCA8. Podobnie jak w przypadku metod Koizumi i Longa opisanych w literaturze, CCA jest utrzymywane w stanie ligacji w okresie niedokrwienia ze względu na niepełną drożność koła Willisa u myszy, co prowadzi do indukcji niedokrwienia w znacznie szerszym regionie niż zamierzono5,6,9. Nawet w metodach, w których CCA jest ponownie otwierane lub naprawiane po okresie niedokrwienia, zwykle 30-60 minut niedokrwienia powoduje nieodwracalne uszkodzenie tkanek w regionach niebędących MCA10. Ponadto, wbrew oczekiwaniom, wcześniejsze badania wykazały, że długość powłoki silikonowej filamentu nie ma wpływu na rozmiar zmiany11. Jednak wybór długości powłoki silikonowej filamentu był poruszany wyłącznie w modelach z podwiązanym CCA w okresie okluzji.
Celem tej metody było zmodyfikowanie metody Longa MCAO u myszy, aby umożliwić nieprzerwany przepływ krwi z CCA podczas okresu niedokrwienia, zwiększając tym samym selektywność MCAO, a także zapewniając pełną reperfuzję obszaru po zabiegu. Modyfikacje te przyniosłyby ogromne korzyści w badaniach podłużnych badających uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne u myszy, obniżając śmiertelność i zmniejszając wariancję między osobnikami.
Protokół
Wszystkie zabiegi i procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki i Licencjonowania Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Zagrzebiu oraz Komisję Etyki ds. ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych Ministerstwa Rolnictwa Republiki Chorwacji. Procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z chorwacką ustawą o ochronie zwierząt (NN 102/17, 32/19), poprawkami do ustawy o ochronie zwierząt (NN 37/13) oraz wytycznymi dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (NN 55/13), które są zgodne z Europejskim przewodnikiem po pielęgnacji i wykorzystaniu zwierząt laboratoryjnych (Dyrektywa 2010/63/EU).
1. Przygotowanie zwierzęcia i pola operacyjnego
- Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wprowadź w stan znieczulenia, stosując 5% objętościowo izofluran w mieszaninie tlenu i azotu (w stosunku 1:2).
- Po wizualnej ocenie stanu przytomności i częstotliwości oddechów zwierzęcia, przenieś je na wagę laboratoryjną i zważ.
- Sprawdź odruch, uciśnięcie skóry między palcami kończyny dolnej, aby upewnić się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia.
- Ułóż zwierzę na podgrzewanym stole operacyjnym i umieść jego nos w masce anestezjologicznej. Ustaw początkową temperaturę stołu operacyjnego na 36 °C i dostosuj ją tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C (mierzoną za pomocą sondy rektalnej wprowadzonej w późniejszych krokach). Przez cały czas trwania kolejnych etapów reguluj ułamkową zawartość izofluranu, aby utrzymać częstość oddechów zwierzęcia na poziomie 100 breaths/min.
UWAGA: Wszystkie powierzchnie i materiały mające bezpośredni kontakt ze zwierzęciem muszą zostać dokładnie zdezynfekowane przed zabiegiem. - Nałóż maść do oczu na gałki oczne zwierzęcia, aby chronić je przed odwodnieniem i działaniem gazu izofluranowego.
- Ułóż zwierzę na plecach i wyprostuj jego szyję, umieszczając pod nią małą poduszkę wykonaną z taśmy chirurgicznej.
- Unieruchom kończyny zwierzęcia za pomocą taśmy chirurgicznej. Należy uważać, aby nie wyprostować przednich kończyn zbyt mocno, aby nie doprowadzić do przypadkowego zwichnięcia stawów barkowych.
- Nasmaruj sondę rektalną białą wazeliną i wprowadź ją do odbytnicy w celu ciągłego pomiaru temperatury ciała. Przymocuj sondę wraz z ogonem za pomocą taśmy chirurgicznej.
- Wykonaj przedoperacyjny zastrzyk z soli fizjologicznej i buprenorfiny (0.5 mg/kg) drogą dostępu dootrzewnowego, aby zapewnić zwierzęciu odpowiednie nawodnienie oraz analgezję podczas zabiegu.
- Wygol futro zwierzęcia w okolicy szyi za pomocą bezprzewodowej maszynki do strzyżenia zwierząt. Zbierz całe wygolone futro za pomocą kawałków taśmy chirurgicznej. Następnie dodatkowo ogol ten obszar brzytwą, aby był całkowicie wolny od włosów.
- Wybierz filament do modelu MCAO na podstawie zmierzonej masy ciała i/lub wieku zwierzęcia. Wyjmij go z pojemnika i umieść w szalce Petriego w widocznym miejscu. Nałóż kroplę soli fizjologicznej na silikonową część filamentu, aby utrzymać go w czystości i chronić przed kurzem.
UWAGA: Grubość silikonowej powłoki filamentu powinna być dobrana zgodnie z oficjalnymi zaleceniami producenta dla myszy w wieku 12-16 tygodni. Ponadto długość powłoki silikonowej powinna być starannie zaplanowana z wyprzedzeniem, w zależności od wielkości obszaru irygacyjnego, który ma zostać zamknięty (patrz Dyskusja). - Połóż czystą chustę chirurgiczną na stole operacyjnym.
- Nałóż kroplę Betadyny na wygoloną skórę zwierzęcia. Używając patyczka bawełnianego, wetrzyj środek dezynfekujący w skórę kolistymi ruchami, od wewnątrz na zewnątrz. Następnie wykonaj tę samą czynność za pomocą patyczka bawełnianego nasączonego etanolem. Powtórz ten krok 3 razy, używając nowej pary sterylnych patyczków bawełnianych przy każdym powtórzeniu.
- Nałóż niewielką ilość żelu z lidokainą na zdezynfekowany obszar w miejscu planowanego nacięcia w celu miejscowej analgezji rany.
2. Operacja indukcji niedokrwienia
- Wykonać pierwsze nacięcie zdezynfekowanej skóry za pomocą skalpela. Należy ograniczyć liczbę pociągnięć podczas nacinania skóry do minimum, aby ułatwić gojenie się rany chirurgicznej.
UWAGA: Wszystkie instrumenty muszą zostać uprzednio wysterylizowane. Czytelnik powinien zapoznać się z wytycznymi swojej instytucji dotyczącymi stosowania sterylnych lub chirurgicznych rękawiczek. - Używając pęset typu 7 i 5, oddzielić powięź powierzchowną i oddzielić gruczoły ślinowe od leżącej pod nimi tkanki.
UWAGA: Zawsze należy posuwać pęsetę zamkniętą i rozwierać ją podczas oddalania, aby odsunąć tkankę. W ten sposób można przejść przez przestrzenie anatomiczne przy minimalnej traumatyzacji tkanki. - Umieścić rozieracz druciany w pozycji początkowej, upewniając się, że gruczoły ślinowe nie utrudniają kolejnych kroków.
- Usunąć głęboką powięź szyjną za pomocą pęsety typu 7 i oddzielić mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe od okolicy tętnicy szyjnej, aby zmienić położenie rozieracza.
- Przestawić rozieracz tak, aby znalazł się pod mięśniami mostkowo-obojczykowo-sutkowymi, umożliwiając dostęp do okolicy tętnicy szyjnej.
- Wyciąć mięsień łopatkowo-gnykowy, aby zapewnić wyraczną widoczność i łatwiejszy dostęp do okolicy tętnicy szyjnej.
- Uwolnić tętnicę szyjną wspólną i jej odgałęzienia od żyły szyjnej oraz nerwu błędnego, które są połączone w powięzi szyjnej.
UWAGA: Powięź tę należy usuwać ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia nerwu błędnego lub wywołania istotnego krwawienia.- Uchwycić powięź szyjną po stronie bocznej triady szyjnej i delikatnie pociągnąć ją bocznie, aby wizualnie zidentyfikować tętnicę, nerw, żyłę oraz wszystkie otaczające odgałęzienia naczyń krwionośnych.
- Pociągając powięź bocznie, za pomocą pęsety typu 5 oddzielić CCA od sąsiedniego nerwu i żyły aż do miejsca rozgałęzienia oraz żyły tarczycowej górnej, która krzyżuje się z CCA.
- Całkowicie oddzielić dolną część CCA od leżącej pod nią tkanki i powięzi za pomocą zakrzywionej pęsety typu 7, upewniając się, że jest ona przygotowana do zaklemowania w kolejnych krokach.
- Kierując się kranialnie w obszarze powyżej punktu rozgałęzienia CCA, rozciąć powięź szyjną za pomocą dwóch pęset.
- Podobnie pociągnąć wolny koniec powięzi szyjnej przyśrodkowo i bocznie, aby precyzyjnie oddzielić odpowiednio ECA i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) od powięzi i otaczającej tkanki.
- Uwolnić ECA i ICA z leżącej pod nimi tkanki za pomocą zakrzywionej pęsety typu 7.
- Po starannym przygotowaniu CCA i jej dwóch odpowiednich odgałęzień, unieść ECA za pomocą zakrzywionej pęsety typu 7 i zaklemować ją pęsetą samozamykającą typu N0.
- Ostrożnie opuścić pęsetę samozamykającą typu N0 na stół operacyjny.
UWAGA: Aby zmienić położenie punktu zaklemowania ECA, czasami konieczne jest lekkie zwolnienie uścisku i przesunięcie punktu rozgałęzienia ECA w kierunku kaudalnym. W tym momencie ważne jest, aby między zaklemowaniem ECA a punktem rozgałęzienia pozostało więcej niż 1 mm ECA. - Przy zaklemowanej i pewnie utrzymywanej pęsetą typu N0 tętnicy ECA, wprowadzić dwie plecione nici jedwabne za ECA.
UWAGA: Nić kranialna będzie służyć do zawiązania węzła ligacyjnego i musi zostać umieszczona kranialnie względem miejsca zaklemowania. - Zaciągnąć całkowicie nić kranialną, ponieważ jest ona stała, i odciąć nadmiar nici nożyczkami.
- Związać nić kaudalną w luźny węzeł zabezpieczający.
UWAGA: Węzeł musi zostać umieszczony blisko punktu rozgałęzienia ECA i pozostawić go luźnym, aby filament MCAO mógł przez niego przejść. - Używając mikroklem vascular, zaklemować CCA i ICA, aby zapobiec krwawieniu po arteriotomii.
UWAGA: Kluczowe jest upewnienie się, że mikroklem zastosowany na CCA ma wystarczająco mocny chwyt, ponieważ CCA jest pulsującą tętnicą o wysokim przepływie; zaniedbanie tego może doprowadzić do obfitego krwawienia i śmierci zwierzęcia w późniejszych etapach. - Za pomocą mikro-nożyczek sprężynowych wykonać małą arteriotomię bezpośrednio pod miejscem zaklemowania ECA.
UWAGA: Arteriotomia musi być wystarczająco duża, aby wprowadzić silikonową część filamentu, ale nie większa niż połowa obwodu ECA, aby nie naruszyć napięcia utrzymywanego przez pęsetę typu N0. - Pod kątem odpowiadającym przebiegowi ECA, wprowadzić filament do miejsca arteriotomii w kierunku proksymalnym do CCA, przechodząc przez luźny węzeł zabezpieczający w miejscu rozgałęzienia ECA i wprowadzając filament do światła CCA.
- Zaciągnąć węzeł zabezpieczający wokół silikonowej części filamentu.
UWAGA: Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ filament ma tendencję do wysunięcia się z ECA w połowie ostatniego manewru, a ponowne jego wprowadzenie w tym momencie jest bardzo trudne. - Ostrożnie otworzyć mikroklem ICA i go usunąć.
- Przy częściowo wprowadzonym i zabezpieczonym filamencie w ECA, wykonać pełną arteriotomię, uwalniając tym samym kikut ECA z filamentem MCAO wewnątrz. W tym momencie zwolnić i usunąć pęsetę samozamykającą typu N0.
- Jednym zestawem pęset typu 5 mocno uchwycić kikut ECA i lekko go unieść. Trzymając częściowo wprowadzony filament drugą pęsetą, opuścić i delikatnie pociągnąć kikut ECA, aby skierować wewnętrzny koniec filamentu w stronę ICA. Nigdy nie ściskać silikonowej części filamentu.
- Trzymając filament pęsetą, powoli posuwać go przez ICA w kierunku kręgu Willisa.
UWAGA: Pierwszy punkt rozgałęzienia ICA jest również jedynym miejscem, w którym operator może ominąć pożądany punkt rozgałęzienia MCA. Dlatego konieczny jest lekki kąt posuwu bocznego, aby poprowadzić filament do punktu rozgałęzienia MCA. Przy lekkim bocznym kącie posuwu filament odchyla się od tętnicy skrzydłowopodniebiennej (PPA), co zwiększa prawdopodobieństwo wejścia końcówki posuwającej do kręgu Willisa (Rysunek 1).
Rysunek 1: Ilustracja wprowadzania filamentu w modelu okluzji tętnicy środkowej mózgu poza punkt rozgałęzienia tętnicy jarzmowo-podniebiennej. Prawidłowe wprowadzenie filamentu (po lewej) osiąga się poprzez takie zorientowanie filamentu MCAO, aby opierał się on o boczną ścianę ICA i wyginał w kierunku przeciwnym do punktu rozgałęzienia PPA. Brak zachowania tej orientacji (po prawej) może skutkować wniknięciem filamentu do PPA, co uniemożliwi wywołanie udaru. W tym drugim przypadku filament nie będzie mógł posunąć się tak daleko, jak powinno to mieć miejsce; wówczas chirurg powinien wycofać filament, aż jego koniec stanie się widoczny w punkcie rozgałęzienia ICA, a następnie ponownie rozpocząć jego wprowadzanie. Tętnice zaznaczone kolorem zielonym reprezentują tętnice łączące tylne (PcomA), które u myszy są zazwyczaj niedrożne. Stworzono za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Powoli przesuwaj filament MCAO przez krąg Willisa, aż do momentu poczucia nagłego wzrostu oporu.
UWAGA: W tym punkcie ważne jest sprawdzenie pozostałej długości filamentu. U dorosłej myszy filament powinien bez przeszkód przejść co najmniej 7 mm od punktu rozgałęzienia ICA. - Zaciśnij węzeł mocujący, aby upewnić się, że filament nie zostanie przesunięty podczas niedokrwienia.
- Zdejmij klips z CCA i zanotuj godzinę.
UWAGA: Moment ten wyznacza początek wystąpienia niedokrwienia. - Umieść wolny koniec filamentu MCAO w bruździe między trójkątem szyjnym a jednostronnym mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym, tak aby nie wystawał z rany operacyjnej.
- Usuń rozwierak druciany i zbliż do siebie brzegi rany operacyjnej. Odczekaj kilka sekund, aż miejsce operacyjne ustabilizuje się, a tkanki wrócą do pozycji anatomicznej.
- Zamknij ranę operacyjną za pomocą przylepnych plastrów do zamykania ran, aby ułatwić szybsze ponowne otwarcie rany po okresie niedokrwienia.
UWAGA: Jeśli badacz chce, aby zwierzę obudziło się w trakcie okresu niedokrwienia, zaleca się zaszycie rany, aby zapobiec jej przedwczesnemu otwarciu.
3. Okres niedokrwienia
- Potwierdź powodzenie zabiegu za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) lub innej ilościowej metody pomiaru perfuzji.
UWAGA: W przypadku wykonania badania MRI, obrazowanie perfuzyjne (PWI) powinno wykazać krytyczne niedokrwienie w szerokim obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA), a obrazowanie dyfuzyjne (DWI) powinno wskazać miejsce obniżonego pozornego współczynnika dyfuzji (ADC) wynikającego z obrzęku komórkowego. - Umieść zwierzę w czystej klatce do czasu zakończenia okresu niedokrwienia.
4. Operacja usunięcia filamentu
- Na około 5 min przed zakończeniem wyznaczonego czasu niedokrwienia, ponownie ustaw zwierzę i przymocuj je do stołu operacyjnego.
- Usuń taśmy zamykające ranę i ponownie otwórz ranę chirurgiczną za pomocą rozwieracza drucianego.
- Uwolnij luźny koniec filamentu MCAO z otaczających tkanek oraz końce nici węzła zabezpieczającego.
- Za pomocą pęsety typu N0 uciśnij i pociągnij krawędź kikutu ECA w kierunku brzusznym, aby go napiąć. Ostrożnie przesuń pęsetę w dół, podobnie jak podczas pierwszej procedury chirurgicznej.
UWAGA: Operator musi unikać uciskania węzła zabezpieczającego, ponieważ uniemożliwi to jego rozwiązanie. - Ponownie zaklemuj CCA za pomocą klipsa mikronaczyniowego.
- Używając pęsety typu 5, poluzuj węzeł zabezpieczający, aby umożliwić wycofanie filamentu.
UWAGA: Najlepszym sposobem na rozpoczęcie luzowania węzła jest jego powtarzane uciskanie, aż rozdzieli się on na poszczególne części, a następnie pchnięcie końców nici w stronę węzła. - Powoli wycofuj filament MCAO, aż silikonowa część zacznie wystawać z kikutu ECA. Lekko zaciśnij węzeł zabezpieczający, aby przygotować się do całkowitego wycofania filamentu.
- Gdy dojdziesz do silikonowego końca filamentu, zaciśnij węzeł zabezpieczający tak, aby wypchnął on filament MCAO i zamknął kikut ECA w jednym manewrze. Całkowicie zaciśnij węzeł po wysunięciu się filamentu.
- Otwórz i usuń pęsetę oraz klips CCA.
UWAGA: Oznacza to koniec okresu niedokrwienia i początek procesu reperfuzji. - Usuń rozwieracz druciany i ponownie zbliż brzegi rany chirurgicznej.
- Zszyj ranę chirurgiczną, zaczynając od obwodu, zamykając ją całkowicie tak, aby żadna tkanka podskórna nie była widoczna.
UWAGA: Liczba wymaganych szwów zależy od wielkości rany chirurgicznej. - Oczyść i zdezynfekuj miejsce operacyjne za pomocą gazików nasączonych alkoholem izopropylowym.
5. Opieka pooperacyjna
- Umieść zwierzę w czystej klatce i pozwól mu na spontaniczne wybudzenie z narkozy.
- Umieść pokarm w formie peletek na dnie klatki, aby był łatwiej dostępny. Zmiękcz pelety pokarmowe za pomocą wody pitnej. Napełnij małą szalkę Petriego wodą pitną i również umieść ją na dnie klatki.
- W ciągu następnych 48 h wstrzykuj dootrzewnowo 0.25 mL soli fizjologicznej z buprenorfiną (0.5 mg/kg) co 24 h.
Wyniki
Śródoperacyjne lub pooperacyjne skany MRI, a konkretnie obrazowanie perfuzyjne (PWI) i/lub obrazowanie dyfuzyjne (DWI) (Rycina 2), mogą dostarczyć jednoznacznego dowodu na powodzenie procedury. Śródoperacyjne PWI wykazuje krytyczne niedokrwienie w obszarze jednostronnej tętnicy środkowej mózgu (MCA), potwierdzając tym samym, że wprowadzenie filamentu doprowadziło do całkowitej okluzji. Pooperacyjne PWI w przypadku udanej procedury wykazuje hiperperfuzję w centrum zmiany oraz pewien stopień reperfuzji na obrzeżach obszaru MCA. Śródoperacyjne zmiany w DWI odpowiadają obszarom niedokrwiennym zaobserwowanym w śródoperacyjnym PWI. Pooperacyjne zmiany w DWI wykazują kurczenie się w stronę centrum zmiany niedokrwiennej, czemu towarzyszy znaczny spadek pozornego współczynnika dyfuzji zmiany, co sprawia, że jest ona ciemniejsza niż zmiany w śródoperacyjnym DWI oraz otaczająca reperfundowana tkanka mózgowa. Standardowe skany anatomiczne T2, zarówno śródoperacyjne, jak i pooperacyjne, zazwyczaj nie wykazują żadnych istotnych zmian, chyba że doszło do krwawienia wywołanego filamentem
(Rysunek 3). W takich przypadkach skany PWI i DWI wykazują niepełne niedokrwienie lub jego brak.
Proces reperfuzji następuje w ciągu kolejnych 48 godzin, a jego przebieg potwierdzono w badaniach MRI wykonanych w drugim dniu po zabiegu (Rysunek 2, CBF w 2. dniu). Skany PWI wykazują pełną reperfuzję w miejscu uszkodzenia z lekką hiperperfuzją w jądrze zmiany. Skany DWI wykazują liczne obszary obniżonych pozornych współczynników dyfuzji wynikające z tworzenia się obrzęku mózgu. Anatomiczne skany T2 wskazują na hiperintensywne obszary obrzęku obejmujące obszary MCA, bez zajęcia obszarów pozam MCA, takich jak hipokamp.
Po wybudzeniu zwierzę wykazuje wyraźne oznaki ostrego udaru. Typowe objawy behawioralne obejmują zwiększone napięcie mięśniowe po stronie zmiany, co powoduje zginanie tułowia zwierzęcia w tym kierunku. Krążenie i rotacja w kierunku ipsilateralnym są również wyraźnymi oznakami ostrego udaru. Ataksja chodu często sugeruje zaangażowanie hipokampa w objętość zmiany niedokrwiennej. Jednakże objaw ten może charakteryzować się niską swoistością w fazie hiperostrej ze względu na działania niepożądane znieczulenia izofluranem. W kolejnych dniach u zwierzęcia powinno rozwinąć się zgięcie kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej oraz pogorszenie stanu posturalnego, któremu towarzyszy brak odruchu wibrysowego. Wskaźnik śmiertelności osiąga szczyt około 3 dni po zabiegu z powodu obrzęku mózgu. Faza przewlekła rozpoczyna się po ustąpieniu obrzęku mózgu. W tym czasie u zwierzęcia może wystąpić retencja moczu. Z tego powodu ważne jest sprawdzenie, czy pęcherz zwierzęcia jest twardy oraz czy w ujściu cewki moczowej znajduje się twardy czop. W większości przypadków problem ten można rozwiązać poprzez delikatny masaż pęcherza, aby ułatwić oddawanie moczu. Oznaki regeneracji masy ciała pojawiają się zazwyczaj w ciągu pierwszych 7 dni od wystąpienia udaru.
Rysunek 2: Reprezentatywny przykład udanego MCAO z pełną reperfuzją potwierdzoną w badaniu MRI.CBF, ADC i T2w oznaczają odpowiednio mapy przepływu krwi w mózgu, mapy pozornego współczynnika dyfuzji oraz anatomiczne skany ważone T2. IntraOP, postop i D02 oznaczają odpowiednio trzy różne punkty czasowe obrazowania: po wystąpieniu niedokrwienia, po rozpoczęciu reperfuzji oraz w drugim dniu po MCAO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Reprezentatywne skany MRI krwotoku wywołanego filamentem podczas procedury MCAO. CBF, ADC oraz T2w oznaczają odpowiednio mapy przepływu krwi w mózgu, mapy pozornego współczynnika dyfuzji oraz anatomiczne skany ważone T2. IntraOP, postOP i D02 oznaczają 3 różne punkty czasowe obrazowania: odpowiednio po wystąpieniu niedokrwienia, po rozpoczęciu reperfuzji oraz w drugim dniu po MCAO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Ilustracja prawidłowego rozmieszczenia filamentu w odgałęzieniu tętnicy środkowej mózgu. W większości przypadków silikonowa część filamentu (zaznaczona na biało) osadza się w proksymalnej części tętnicy przedniej mózgu (ACA) około 2 mm dalej niż punkt odgałęzienia MCA. Zazwyczaj obszar mózgu zaopatrywany przez ACA u myszy nie ulega uszkodzeniu, ponieważ ACA łączy się z tętnicą przeciwległą, tworząc pojedynczą tętnicę ACA azygos. Tętnice dotknięte niedokrwieniem zaznaczono na szaro. Po lewej stronie CCA pozostaje drożna w okresie niedokrwienia, dostarczając krew do wszystkich odgałęzień ICA aż do MCA, która jest zamknięta silikonową częścią filamentu. Po prawej stronie filament jest umieszczony identycznie, z wyjątkiem tego, że podwiązanie CCA jest utrzymane w okresie niedokrwienia. Ze względu na to, że w większości przypadków PcomA (zaznaczona na zielono) nie jest drożna, utrzymanie podwiązania CCA powoduje nieselektywne objęcie udarem większości półkuli ipsilateralnej poprzez MCA, AchA, VTA, HTA i PCA. W takich przypadkach można również zaobserwować objawy ostrego zawału oka (leukokoria i anizokoria) z powodu zablokowania PPA. Utworzono za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
MCAO jest bardzo wymagającą procedurą dla operatora i wyniszczającą dla zwierzęcia. Z tego powodu niezwykle ważne jest, aby badacze dysponowali standardową procedurą operacyjną, która minimalizuje nasilenie udaru, zmniejsza liczbę niepowodzeń proceduralnych i poprawia samopoczucie zwierzęcia po zabiegu. Ten protokół MCAO podkreśla niektóre z kluczowych aspektów, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania tej procedury na myszy.
Wybór filamentu MCAO wpływa na wielkość i lokalizację indukowanej zmiany udarowej i dlatego jest krytycznym krokiem w tej procedurze11. Filamenty powlekane silikonem, takie jak te zapoczątkowane przez Doccol, dokonały dużego skoku w obniżaniu częstości występowania krwotoków wywołanych przez włókna12. Jednak włókna pokryte silikonem są dostępne w wielu różnych rozmiarach i długościach, co stanowi wyzwanie dla nowych badaczy, aby wybrać odpowiednie dla MCAO u zwierząt doświadczalnych. Podczas gdy producenci filamentów zwykle podają wytyczne dotyczące wyboru odpowiedniej średnicy filamentu dla danej wagi zwierzęcia, długość powłoki silikonowej jest uważana za osobistą preferencję operatora i powinna być wybierana wyłącznie na podstawie umiejętności operatora. W tej pracy opowiadamy się za zminimalizowaniem długości krzemu, aby zapewnić, że wywołana zmiana udarowa obejmuje tylko obszar irygacji MCA, poprawiając w ten sposób odtwarzalność. Rycina 4 ilustruje, że tylna tętnica mózgowa (PCA), pierwsza wewnątrzczaszkowa gałąź ICA, zaopatruje tylne obszary mózgu, w tym części hipokampa. Ostatnie badania mikro-CT na myszach zidentyfikowały dodatkowe trzy mniejsze gałęzie powstające z ICA przed punktem rozgałęzienia MCA13. Delikatna i zmienna tętnica podwzgórzowa (HTA), brzuszna tętnica nakrywkowa (VTA) i tętnica naczyniówkowa przednia (AChA), w kolejności rozgałęzień, w znacznym stopniu przyczyniają się do zmienności wewnątrzwariantowej i wewnątrzosobniczej8. Co więcej, badania mikro-CT wykazały, że u myszy średnia odległość od punktów rozgałęzień MCA i PCA wynosi około 1,7 mm, czyli znacznie krócej niż długość powłoki silikonowej większości produkowanych włókien14. Ponieważ jedyną informacją zwrotną, jaką otrzymuje operator podczas przesuwania żarnika, jest nagły wzrost oporu, gdy żarnik osiąga punkt rozgałęzienia MCA, długość spływu powłoki silikonowej włókna jest tym, co wywołuje niedokrwienie MCA i, w zależności od długości powłoki silikonowej, AChA, VTA, HTA, a nawet PCA, wprowadzenie zmienności sprzecznej z zamierzonym modelem MCAO. W związku z tym, aby zachować odtwarzalność i pooperacyjny dobrostan zwierząt, celem powinna być wyłącznie okluzja MCA. Doccol oferuje filamenty MCAO z powłokami silikonowymi o grubości od 1 do 2 mm, jednak z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie powłok o grubości 1-2 mm często skutkuje pozorowaną operacją bez powodowania udaru. Śródoperacyjne skany MRI wykazały, że włókno przesuwa się do 2 mm poza punkt rozgałęzienia MCA do przedniej tętnicy mózgowej (ACA) przed dostarczeniem operatorowi krytycznego rezystancyjnego sprzężenia zwrotnego. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy stosowanie powłok silikonowych o długości od 2 do 3 mm, które zmniejszają zaangażowanie hipokampa w zmiany udarowe w porównaniu z dłuższymi powłokami silikonowymi na włóknach MCAO.
Drugim krytycznym krokiem w tej procedurze jest prawidłowe umieszczenie filamentu MCAO w celu uzyskania całkowitej okluzji MCA. Błędne wejście do pierwszej gałęzi ICA, tętnicy skrzydłowo-podniebiennej (PPA), jest częstym problemem dla operatora, ponieważ nie ma prawie żadnej informacji zwrotnej, że filament MCAO skręcił w niewłaściwy sposób podczas posuwania się. Z tego powodu zalecamy niewielki boczny kąt wyprzedzenia, aby pokryta silikonem końcówka filamentu zakrzywiała się od punktu rozgałęzienia PPA, co zwiększa prawdopodobieństwo wejścia w wewnątrzczaszkową część ICA. (Rysunek 1) Jak stwierdzono w sekcji protokołu, ważne jest, aby obserwować długość włókna ciągnącego, aby stwierdzić, czy umieszczenie żarnika jest odpowiednie. W przypadku, gdy żarnik nie może zostać wsunięty na co najmniej 7 mm od punktu rozgałęzienia ICA, operator powinien wycofać żarnik i powtórzyć czynność. Każda niepotrzebna siła przyłożona podczas wkładania filamentu może spowodować krwotok i nieudaną procedurę. W tym przypadku można zastosować ciągły pomiar perfuzji laserowo-dopplerowskiej, aby potwierdzić prawidłowe ułożenie filamentu.
Zapewnienie niezakłóconego przepływu krwi z CCA w okresie niedokrwiennym jest kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole. W przeciwieństwie do większości ilustracji przedstawiających pełny krąg Willisa u myszy, badania wykazały, że tylna tętnica łącząca (PcomA) najczęściej nie jest obustronnie opatentowana u myszy i nie może niezawodnie zaopatrywać ipsilateralnej strony koła Willisa, jeśli CCA pozostaje zamknięta w okresie niedokrwienia15,16. W takich przypadkach, nawet jeśli badacz starannie wybierze odpowiednią długość silikonowej powłoki filamentu, skok obejmie całą półkulę lub tylko obszar MCA, w zależności od drożności PcomA, powodując nieuwzględnioną wariancję rozmiarów pociągnięć. Z tego powodu zmodyfikowaliśmy procedurę tak, aby obejmowała krok instrukcji, w którym operator zdejmuje klips CCA zaraz po ustawieniu zasłaniającego filamentu MCAO. Modyfikacje te mogą zwiększyć precyzję i powtarzalność operacji, a jednocześnie zmniejszyć niejednorodność wyników. Standaryzacja metod przyczyniłaby się do dalszej poprawy wskaźnika sukcesu i porównywalności, a także potencjału translacyjnego wyników17.
Największym ograniczeniem proponowanej techniki jest fakt, że ECA pozostaje podwiązany po zabiegu, co może potencjalnie pogorszyć stan zwierzęcia podczas rekonwalescencji18. Do tej pory bezskutecznie udało nam się doprowadzić do naprawy Trybunału Obrachunkowego, przy jednoczesnym utrzymaniu wskaźnika powodzenia procedury. Pozostaje to potencjalnym punktem dla przyszłych ulepszeń metody. Co więcej, zminimalizowanie czasu, w którym CCA pozostaje zaciśnięte, jest wyzwaniem, ale jest niezbędne, aby zapobiec rekrutacji regionów innych niż MCA w udarze. Ponieważ może to stanowić źródło wariancji między- i wewnątrzoperatorskiej, zaleca się pomiar czasu trwania zaciskania CCA, co potencjalnie umożliwi naukowcom statystyczne uwzględnienie przynajmniej ułamka obserwowanej całkowitej wariancji w rozmiarach skoków. Z drugiej strony, umiejętności i doświadczenie operatora odgrywają kluczową rolę w skróceniu czasu podwiązania CCA i skróceniu całkowitego czasu trwania zabiegu11.
Przedstawiona metoda jest istotna, ponieważ umożliwia naukowcom selektywne zamykanie MCA, dzięki czemu początek reperfuzji jest nagły i wysoce kontrolowany. Metoda naśladuje trombektomię wewnątrznaczyniową i jej późniejsze uszkodzenie reperfuzyjne dokładniej niż obecnie dostępne metody, dostarczając szczegółów dla powtarzalnego i klinicznie istotnego modelu uszkodzenia niedokrwiennego/reperfuzyjnego u zwierząt.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić. Autorzy nie są powiązani z nazwami handlowymi i znakami towarowymi wymienionymi w tej pracy.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez projekt Chorwackiej Fundacji Naukowej BRADISCHEMIA (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.01.0007 finansowany przez Unię Europejską za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego oraz przez Unię Europejską za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego na podstawie Umowy o udzielenie dotacji nr KK.01.1.1.07.0071, projekt "SineMozak. Praca doktorantek Roka Istera i Marty Pongrac została w pełni wsparta przez projekt "Rozwój kariery młodych naukowców – szkolenie doktorantów" Chorwackiej Fundacji Naukowej, finansowany przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego. Zabieg został sfilmowany za pomocą smartfona z systemem Android zamontowanego do mikroskopu chirurgicznego za pomocą ogólnego mocowania kamery. Materiały wideo zostały zmontowane, a lektor został nagrany za pomocą edytora wideo Wondershare Filmora.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Betadine roztwór do skóry 10g/100ml | Alkaloid | Skopje N/A | |
| Pleciony jedwabny szew | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Dafilon szew 5/0 DS16 | B. Braun | C0936154 | |
| Dolokain 20 mg/g żel | Jadran-Galenski Laboratorij | N/A | |
| Dumont #5 kleszcze | Fine Science Tools | 11251-20 | 2 sztuki |
| Kleszcze Dumont #7 | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Kleszcze samozamykające Dumont N0 | Fine Science Tools | 11480-11 | |
| Taśma chirurgiczna Durapore 1,25cm x 9,1m | Taśma chirurgiczna 3M | ||
| Durapore 2,5cm x 9,1m | 3M | 7100057168 | |
| Termostat zewnętrzny | Petnap | 1012536 | |
| Uchwyty do igieł Halseya | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Sterylizator gorących koralików | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Nożyczki do tęczówki | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Isofluran USP | Piramal critical care | N/A | |
| Laserowy monitor dopplerowski | Moor | MOORVMS-LDF2 | |
| Metalowa podkładka termiczna dla zwierząt Petnap | |||
| Nożyczki sprężynowe Micro Vannas | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Zwijacz Mini-colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| Maść do oczu Recugel | Bausch& Lomb | N/A | |
| S& T B-1 mikrozacisk naczynia | Narzędzia do nauki o naczyniu | 00396-01 | 2 sztuki |
| S& Zacisk T mikro kleszcz kleszczowy | Fine Science Tools | 00071-14 | |
| Mikro serfinezy Schwartza | Narzędzia do nauki | 18052-01 | |
| Stemi DV4 Mikroskop stereoskopowy | punktowy Zeiss | 000000-1018-453 | |
| Steri-Strip Wzmocnione samoprzylepne zamknięcia skórne 3 mm x 75 mm | 3M | 7100236545 | |
| Kleszcze do tkanek prostych | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| SZX Stand Arm | Olympus | SZ2-STS | |
| Tec III 300 series kalibrowany | waporyzator Waporyzator Sprzedaż i serwis inc. | Nie dotyczy | |
| Uniwersalny stojak typu 2 | Olympus | SZ2-STU2 | |
| VetFlo Sześciokanałowy stojak anestezjologiczny | Kent Scientific | VetFlo-1225 | Zmodyfikowany do mieszania O2/N2 |
Bibliografia
- Feigin, V. L., et al. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).
- Bai, J., Lyden, P. D. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
- Hill, J. W., Nemoto, E. M. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
- El Amki, M., et al. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).
- Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
- Guan, Y., et al. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
- Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).
- Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
Przedruki i uprawnienia
