Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie nanocząstek tlenku i ocena ich działania przeciwbakteryjnego

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66725

⸱

27 września 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 2Feynman Institute of Technology, Nanomedicine Corporation, 3Department of Chemical Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Kumoh National Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu, nanocząstki tlenku zostały zsyntetyzowane przy użyciu metody wytrącania. Działanie przeciwbakteryjne zsyntetyzowanych cząstek przetestowano przeciwko wielolekoopornym szczepom szczepów Staphylococcus aureus (MRSA) opornych na metycylinę i Pseudomonas aeruginosa.

Streszczenie

Szpitalne infekcje bakteryjne stają się coraz większym wyzwaniem ze względu na ich wrodzoną oporność na antybiotyki. Pojawienie się wielolekoopornych szczepów bakteryjnych w szpitalach przypisuje się szerokiemu i zróżnicowanemu stosowaniu antybiotyków, co jeszcze bardziej pogłębia problem oporności na antybiotyki. Nanomateriały metalowe są szeroko badane jako alternatywne rozwiązanie do eliminowania komórek bakteryjnych opornych na antybiotyki. Nanocząstki metaliczne atakują komórki bakteryjne poprzez różne mechanizmy, takie jak uwalnianie jonów przeciwbakteryjnych, wytwarzanie reaktywnych form tlenu lub zakłócenia fizyczne, na które bakterie nie mogą się uodpornić. Wśród aktywnie badanych przeciwdrobnoustrojowych nanocząstek metali, nanocząstki tlenku, które są zatwierdzone przez FDA, są znane ze swojej biokompatybilności i właściwości przeciwbakteryjnych. W tym badaniu skupiliśmy się na pomyślnym opracowaniu metody wytrącania do syntezy nanocząstek tlenku, analizie właściwości tych nanocząstek oraz przeprowadzeniu testów przeciwdrobnoustrojowych. Nanocząstki tlenku scharakteryzowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), dynamicznego rozpraszania światła (DLS), spektroskopii ultrafioletowej/widzialnej i dyfrakcji rentgenowskiej (XRD). Testy przeciwbakteryjne przeprowadzono przy użyciu testu mikrorozcieńczenia bulionu z wielolekoopornymi szczepami gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) i Pseudomonas aeruginosa. Badanie to wykazało potencjał nanocząstek tlenku w hamowaniu namnażania się bakterii opornych na antybiotyki.

Wprowadzenie

Zakażenia bakteryjne wielolekooporne (MDR) stanowią poważne globalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego1. Ponieważ infekcje te mogą być śmiertelne u pacjentów z chorobami podstawowymi, aktywne badania próbują rozwiązać ten problem2. Bakterie ewoluowały, aby unikać działania różnych leków. Penicylina, powszechnie znana i uznawana za ratującą miliony istnień ludzkich na całym świecie, jest antybiotykiem β-laktamowym, który hamuje syntezę ściany komórkowej bakterii3. Jednak bakterie ewoluowały, aby neutralizować skuteczność leków poprzez różne mechanizmy, takie jak pompy wypływowe, zmiany transpeptydazy lub zmniejszona przepuszczalność4. Dodatkowo, komórki bakteryjne mogą przekazywać te geny oporności następnemu pokoleniu, zwiększając przeżywalność kolejnego pokolenia i wzmacniając problem opornych szczepów5.

Wzrost liczby bakterii opornych na antybiotyki doprowadził do pojawienia się bakterii MDR, które często wykazują oporność na wiele antybiotyków. Szczepy MDR są najczęściej spotykane w warunkach szpitalnych, gdzie wiele szczepów bakteryjnych jest narażonych na różne antybiotyki i w konsekwencji rozwija oporność na różne antybiotyki6. Staphylococcus aureus, szczególnie oporny na metycylinę S. aureus (MRSA), jest bakterią komensalną Gram-dodatnią, która tworzy skupiska na skórze około 30% ludzi7,8. MRSA, który został po raz pierwszy zidentyfikowany w latach 60., wykazuje zmniejszoną wrażliwość na antybiotyki β-laktamowe, co skutkuje gwałtownym wzrostem wskaźników infekcji od lat 90><. Wśród bakterii Gram-ujemnych Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych szczepów nabytych w szpitalach. Gatunek ten, fakultatywna bakteria w kształcie pałeczki, powoduje oportunistyczne infekcje u ludzi10. W szczególności szczepy MDR, które mają bezpośredni wpływ na zdrowie ludzi, są odpowiedzialne za ponad 50% zakażeń związanych z opieką zdrowotną11. W tym badaniu wykorzystaliśmy najczęściej spotykane szczepy wielolekooporne w szpitalach, MRSA i P. aeruginosa.

Wykorzystanie nanocząsteczek (NPs) do celów przeciwbakteryjnych zostało dokładnie zbadane w celu rozwiązania problemu oporności na antybiotyki. W szczególności metaliczne nanocząsteczki indukują śmierć komórek bakteryjnych poprzez różne mechanizmy, oferując potencjalne rozwiązanie problemu oporności na leki. Metaliczne nanocząsteczki wywierają aktywność przeciwdrobnoustrojową poprzez wiele mechanizmów, w tym między innymi uwalnianie jonów przeciwdrobnoustrojowych, wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i fizyczne rozrywanie komórek12. Nanocząsteczki składające się ze srebra, miedzi, tlenku (ZnO) i tlenku tytanu mają wysoką skuteczność przeciwdrobnoustrojową i dlatego są aktywnie badane13.

ZnO NPs zostały zatwierdzone przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do stosowania u ludzi. I odwrotnie, pomimo ich wysokiej skuteczności przeciwdrobnoustrojowej, stosowanie nanocząsteczek srebra i miedzi u ludzi jest ograniczone przez ich wysoką cytotoksyczność. Jednak nanocząsteczki ZnO są powszechnie spotykane w życiu codziennym i są nawet obecne w powszechnie stosowanych preparatach przeciwsłonecznych14. Warto zauważyć, że jony Zn2+ uwalniane z NP ZnO są wysoce skuteczne w leczeniu bakteryjnym, indukując śmierć komórek bakteryjnych poprzez generowanie ROS i inne mechanizmy uszkodzeń fizycznych15.

To badanie przedstawia protokół syntezy nanocząstek ZnO (NPs) za pomocą metody wytrącania i wprowadza podejście do testowania przeciwdrobnoustrojowego przy użyciu metody rozcieńczania mikrobulionu z klinicznymi próbkami MRSA i P. aeruginosa. Metoda wytrącania nanocząsteczek ZnO polega na syntezie nierozpuszczalnych stałych nanocząsteczek ZnO poprzez dostosowanie pH i temperatury przy użyciu rozpuszczalnych prekursorów, takich jak octan lub azotan16. Wraz ze stosunkowo łatwą i szybką produkcją, metoda ta zapewnia powtarzalność syntezy i ułatwia kontrolę nad wielkością i morfologią cząstek17. W tym protokole syntezy wodorotlenek sodu (NaOH), jeden z najczęściej stosowanych środków strącających, został wykorzystany do wytrącenia octanu, a niewielka ilość bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB) została użyta do zahamowania niekontrolowanej syntezy nanocząstek18. Wśród różnych testów przeciwdrobnoustrojowych, aktywność przeciwbakteryjną nanocząstek ZnO oceniono przy użyciu metody rozcieńczania mikrobulionu, która pozwala uniknąć zakłóceń optycznych ze strony nanocząstek tlenku metalu i umożliwia bezpośredni pomiar kolonii w celu określenia klasy MIC19.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyte w niniejszym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie nanocząstek tlenku cynku

  1. Odmierz 200 mL bezwodnego alkoholu etylowego i wlej go do szklanej kolby okrągłodennej.
  2. Umieść kolbę okrągłodenną na płaszczu grzejnym i prowadź mieszanie w temperaturze 25-40 °C.
  3. Odmierz 500 mg CTAB do fiolki o pojemności 50 mL i dodaj do alkoholu etylowego w kolbie. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia CTAB.
  4. Dodaj 1,4 g octanu cynku do roztworu i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.
  5. Podnieś temperaturę roztworu, ustawiając temperaturę płaszcza grzejnego na 70 °C.
  6. Dodaj 25 mL 0,5 M roztworu NaOH do mieszaniny i pozostaw do reakcji na 1 h, aż przejrzysty roztwór zmieni kolor na biały.
  7. Rozdziel roztwór do probówek stożkowych o pojemności 50 mL, wiruj przy 15000 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie odlej nadsącz.
  8. Dodaj 10 mL wody destylowanej do jednej z probówek stożkowych i resuspenduj nanocząstki, sonikując roztwór. Przenieś zawiesinę do innej probówki stożkowej zawierającej osad ZnO i powtarzaj czynność, aż wszystkie roztwory ZnO zostaną zebrane w jednej probówce stożkowej.
  9. Przemyj nanocząstki poprzez wirowanie przy 15000 × g przez 15 min (temperatura pokojowa), usuń nadsącz i resuspenduj w wodzie destylowanej. Sprawdzaj pH roztworu nadsączu za pomocą papierka wskaźnikowego pH i powtarzaj czynność, aż pH roztworu stanie się obojętne.
    UWAGA: Gdy pH roztworu nadsączu stanie się obojętne (pH = 7), odlej nadsącz i nie resuspenduj w wodzie destylowanej.
  10. Wysusz próbkę w próżni w temperaturze 60 °C przez 24 h, aby otrzymać proszek z ZnO NP.

2. Testy przeciwbakteryjne z użyciem MRSA oraz P. aeruginosa

  1. Hodowla bakterii
    UWAGA: Kliniczne szczepy bakterii MDR pozyskano ze szpitala Uniwersytetu Chung-Ang w Seulu w Korei Południowej.
    1. Wyjmij z zamrażarki niskotemperaturowej szczepy bakterii MRSA oraz P. aeruginosa przechowywane w bulionie sojowo-kazeinowym (TSB).
    2. Po rozmrożeniu zawiesin bakteryjnych, wykonaj posiew metodą smugową na płytkę z agarem sojowo-kazeinowym (TSA), używając jednorazowej pętli do posiewu. Umieść posiane płytki agarowe w inkubatorze i inkubuj przez 24 h.
      UWAGA: Pojedynczą kolonię pobraną z płytki TSA przeniesiono do 10 mL pożywki TSB w probówce stożkowej o pojemności 50 mL za pomocą pętli do posiewu bakterii. Bakterie hodowano przez 24 h w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.
    3. Aby zmierzyć stężenie zawiesiny bakteryjnej, rozcieńcz hodowlę za pomocą 10-krotnych rozcieńczeń szeregowych do stężenia 10-6, używając wody destylowanej. Następnie nanieś 50 µL rozcieńczonej zawiesiny na płytki TSA i rozprowadź roztwór za pomocą rozpylacza w kształcie litery L.
    4. Inkubuj płytki w inkubatorze przez 24 h.
      UWAGA: Kolonie policzono optycznie, a stężenie hodowli obliczono, mnożąc czynniki rozcieńczenia przez liczbę policzonych kolonii.
  2. Pobieranie próbek bakteryjnych
    1. Aby przetestować szeroki zakres stężeń ZnO, przygotuj roztwór ZnO NPs o stężeniu 2 mg/mL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) i wykonaj 2-krotne rozcieńczenia szeregowe w celu uzyskania różnych stężeń.
      UWAGA: Przetestowano stężenia 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL i 62,5 µg/mL.
    2. Do płytki 96-dołkowej dodaj po 100 µL każdego z testowanych stężeń ZnO NPs.
      UWAGA: Należy użyć dwukrotnego (2x) docelowego stężenia ZnO NPs, ponieważ każda próbka w dołku zostanie rozcieńczona po dodaniu 100 µL hodowli bakteryjnej. Jako kontrolę pozytywną zastosuj 2% roztwór antybiotyku-antymykotyku (A/A), a jako kontrolę negatywną DPBS. A/A to kompleks antybiotyków penicyliny i streptomycyny, skutecznych odpowiednio przeciwko bakteriom gram-dodatnim i gram-ujemnym.
    3. Rozcieńcz hodowlę bakteryjną do stężenia 1 × 106 CFU/mL za pomocą pożywki TSB i dodaj 100 µL do każdego dołka zawierającego różne stężenia ZnO NPs.
      UWAGA: Początkowe stężenia hodowli MRSA i P. aeruginosa wynosiły 3 x 109 CFU/mL. Stężenie hodowli 1 x 106 CFU/mL uzyskano poprzez rozcieńczenie roztworu hodowlanego 1/20 i 1/150. Po zmieszaniu ze 100 µL ZnO NPs końcowe stężenie bakterii wyniesie 5 × 105 CFU/mL.
    4. Umieść płytkę 96-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez 24 h.
  3. Rozsiewanie bakterii
    1. Pipetuj 100 µL z każdego dołka i przygotuj różne 10-krotne rozcieńczenia szeregowe aż do 10-6.
      UWAGA: Dodaj 100 µL zawiesiny bakteryjnej zawierającej ZnO NPs do 900 µL sterylnej wody destylowanej i powtórz czynność 6 razy.
    2. Pipetuj 50 µL z czterech rozcieńczonych roztworów i nanieś na płytki z pożywką TSA. Użyj rozpylacza w kształcie litery L, aby rozprowadzić zawiesinę bakteryjną na płytce agarowej.
      UWAGA: Użyj rozcieńczeń 100, 10-2, 10-4 i 10-6. Wszystkie eksperymenty przeprowadź w trzech powtórzeniach. Rozprowadzaj do momentu całkowitego wchłonięcia zawiesiny bakteryjnej przez płytkę agarową.
    3. Umieść płytki agarowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez 24 h.
  4. Zliczanie CFU bakterii
    1. Dla każdej grupy wybierz czynnik rozcieńczenia umożliwiający zliczenie kolonii. Zaznacz wszystkie kolonie na płytce z rozcieńczeniem nadającym się do zliczenia i przelicz wynik tak, aby stężenie wyrażone było w CFU/mL.
      UWAGA: Jako czynnik rozcieńczenia umożliwiający zliczanie uznaje się płytki, na których znajduje się od 20 do 100 CFU. Początkowe wyniki stężenia to liczba policzonych CFU/50 µL. Korzystając z płytki z nieodcieńczoną zawiesiną bakteryjną, określ potencjalne minimalne stężenie bakteriobójcze.
    2. Wykorzystaj uzyskane dane do przedstawienia procentowej zawartości żywych bakterii w stosunku do bakterii w kontroli negatywnej.
      UWAGA: Procent żywych bakterii (%) =   Równanie analizy bakteryjnej, obliczanie stężenia procentowego, przedstawienie wyników naukowych.

Wyniki

Pomyślną syntezę ZnO NPs potwierdzono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), co przedstawiono na Rysunku 1A. Zaobserwowano, że otrzymane ZnO NPs mają kształt okrągły, przy średnicy cząstek wynoszącej 35.35 nm i odchyleniu standardowym 6.81 nm. Wytrącanie tych nanocząstek nastąpiło w wyniku reakcji podwójnego wymiany po dodaniu roztworu NaOH do octanu cynku, w której jony Zn2+ uległy hydrolizie.

Przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) określono, że średnia wielkość i potencjał zeta zsyntetyzowanych nanocząsteczek wynosiły odpowiednio 130,4 nm i 28,92 mV, co przedstawiono na Rysunku 1B. Różnica w wielkości nanocząsteczek ZnO zmierzonych za pomocą DLS w porównaniu z wielkością uzyskaną z obrazu TEM została przypisana agregacji niezmodyfikowanych nanocząsteczek. Dodatni potencjał zeta pośrednio potwierdził otrzymanie nanocząsteczek ZnO, które mogą oddziaływać elektrostatycznie z powierzchniami komórek bakteryjnych, potencjalnie powodując uszkodzenia fizyczne. Wartość potencjału zeta wskazuje na potencjalną stabilność układu koloidalnego. Gdy wszystkie cząsteczki w zawiesinie mają wysoki dodatni lub ujemny potencjał zeta, istnieje tendencja do ich wzajemnego odpychania się, co zapobiega agregacji. Cząsteczki o potencjale zeta większym niż +30 mV lub mniejszym niż -30 mV są zazwyczaj uznawane za stabilne. Zsyntetyzowane nanocząsteczki ZnO wykazały potencjał zeta wynoszący +28,92 mV, co wskazuje na względną stabilność w wodzie20.

Widma absorpcyjne nanocząsteczek (NPs) ZnO zbadano przy użyciu czytnika mikropłytek, co wykazało specyficzny pik absorpcyjny dla ZnO przy 360 nm (Rysunek 1C). Prekursor, octan cynku, nie wykazuje unikalnego piku, podczas gdy wiadomo, że NPs ZnO posiadają charakterystyczny pik w zakresie 360-370 nm. Syntezę potwierdzono obecnością unikalnego piku przy 360 nm w zsyntetyzowanych NPs ZnO21. Te specyficzne właściwości absorpcji UV potwierdziły bezpośrednią syntezę NPs ZnO. Ponadto analiza dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) (Rysunek 1D) ujawniła wyraźne piki krystaliczne charakterystyczne dla ZnO. W porównaniu z reprezentatywną strukturą wurcytową NPs ZnO (JCPDS nr 36-1415) zaobserwowano, że wszystkie płaszczyzny (1, 0, 0), (0, 0, 2), (1, 0, 1), (1, 0, 2), (1, 1, 0), (1, 0, 3), (2, 0, 0), (1, 1, 2) oraz (2, 0, 1) były zgodne22.

Skuteczność przeciwdrobnoustrojową zsyntetyzowanych ZnO NPs oceniono za pomocą testu mikrorozcieńczeń w bulionie przeciwko próbkom klinicznym P. aeruginosa oraz MRSA pozyskanym ze szpitala Uniwersytetu Chung-Ang w Seulu, w Korei Południowej. W celu przeprowadzenia analizy wykonano zdjęcia kultur bakteryjnych. Aby wizualnie ocenić skuteczność przeciwdrobnoustrojową nanocząsteczek przy zastosowaniu tego samego czynnika rozcieńczenia, wykorzystano metodę posiewu powierzchniowego z nierozcieńczonym roztworem bakterii (Rycina 2A,B). Posiewy powierzchniowe z oryginalnego roztworu zastosowano do określenia potencjalnego minimalnego stężenia bakteriobójczego. Ponieważ kolonie bakterii zaobserwowano nawet przy najwyższym stężeniu dla obu szczepów, nie osiągnięto pełnego efektu bakteriobójczego. Stężenia bakterii w każdej grupie obliczono przy użyciu przeliczalnych czynników rozcieńczenia. Porównując przeżywalność w każdej grupie badawczej z grupą kontrolną negatywną, efekty przeciwdrobnoustrojowe ZnO NPs były wyraźne zarówno w przypadku szczepów P. aeruginosa, jak i MRSA. Biorąc pod uwagę zbadany zakres cytotoksyczności ZnO NPs, przetestowano różne stężenia ZnO, zaczynając od najwyższego stężenia znanego z wywoływania toksyczności, wynoszącego 1000 µg/mL, aż do zakresu nietoksycznego 62,5 µg/mL, poprzez rozcieńczenia seryjne23,24. W przypadku P. aeruginosa aktywność przeciwdrobnoustrojowa ZnO NPs wzrastała w sposób zależny od stężenia (Rycina 2A). Jednakże nie odnotowano widocznego spadku liczby kolonii bakteryjnych P. aeruginosa w stosunku do wyjściowej nierozcieńczonej (100) kultury bakterii.

Z drugiej strony, nanocząsteczki ZnO wykazały wysoką aktywność przeciwdrobniczą wobec bakterii Gram-dodatnich MRSA, co objawiło się wyraźnym spadkiem liczby jednostek tworzących kolonie (CFU), potwierdzonym poprzez porównanie obrazów rozcieńczonych kultur bakteryjnych z obrazem nierozcieńczonej kultury wyjściowej (100) hodowli bakteryjnej. Wynik ten potwierdził, że zsyntetyzowane nanocząsteczki ZnO wykazują aktywność przeciwdrobniczą wobec obu szczepów bakterii, wykazując w szczególności zwiększoną skuteczność przeciwko MRSAszczep

Schemat charakterystyki nanocząstek; obrazy TEM, rozkład rozmiarów, DLS, potencjał zeta, analiza XRD.
Rycina 1: Charakterystyka nanocząstek tlenku cynku. (A) Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego ZnO NPs przy różnych powiększeniach. (B) Rozkład rozmiaru (lewo) i potencjału zeta (prawo) w analizie DLS. (C) Widmo absorbancji ZnO NPs zmierzone za pomocą czytnika mikropłytek. (D) Analiza XRD ZnO NPs i ich piki krystaliczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Hamowanie P. aeruginosa i MRSA przez nanocząstki ZnO; wykres słupkowy i zdjęcia szalek Petriego; efekt stężenia.
Rysunek 2: Właściwości przeciwbakteryjne nanocząstek ZnO przetestowane na szczepach bakteryjnych o stężeniu 5 x 105 CFU/mL. (A) Test przeciwbakteryjny przeciwko szczepowi P. aeruginosa . (B) Test przeciwbakteryjny przeciwko szczepowi MRSA. N = kontrola negatywna (DPBS), P = kontrola pozytywna (A/A). Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną w porównaniu z kontrolami, ****p ≤ 0.0001. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów wykonanych w trzech powtórzeniach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Synteza nanocząsteczek ZnO poprzez wytrącanie jest stosunkowo prosta i nieskomplikowana. Aby skutecznie zsyntetyzować nanocząsteczki ZnO przy użyciu tej metody, mieszanie ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że prekursor (octan) jest całkowicie rozpuszczony w rozpuszczalniku. Co więcej, zwiększenie temperatury pomaga wywołać udaną reakcję podwójnego przemieszczenia. W syntezie nanocząsteczek ZnO istnieje wiele czynników, które decydują o wielkości i kształcie, w tym czynnik strącający, stężenie środka strącającego i środek powierzchniowo czynny. Stosowanie środków strącających innych niż NaOH może zmienić kształt cząstek. Jak donoszą Gharpure i wsp.25, gdy wodorotlenek amonu (NH4OH) został użyty do wytrącenia octanu z różnymi środkami powierzchniowo czynnymi, cząstki były głównie syntetyzowane w kształcie stożka i trójkąta. Nawet podczas syntezy przy użyciu wodorotlenku potasu (KOH) trudno było dostrzec kuliste cząstki26. Obserwacja ta potwierdziła, że wytrącanie NaOH ułatwiało syntezę nanocząstek ZnO o zaokrąglonych kształtach.

W tym badaniu zsyntetyzowaliśmy nanocząsteczki ZnO przy użyciu niewielkiej ilości środka powierzchniowo czynnego i NaOH ze względu na ich potencjalne zastosowanie w zastosowaniach biomedycznych i opracowanie metody szybkiej syntezy. W rezultacie, mimo że synteza okrągłych cząstek w skali nano była możliwa, synteza jednorodnych cząstek sferycznych była ograniczona bez dodatkowych modyfikacji27. Wiadomo, że nanocząsteczki ZnO dobrze dyspergują w rozpuszczalnikach niepolarnych lub mieszanych rozpuszczalnikach polarnych i niepolarnych, co prowadzi do ograniczonej stabilności i problemów z agregacją w wodzie28,29. Ze względu na rozproszenie nanocząsteczek ZnO w DPBS zaobserwowano zjawiska agregacji, co było widoczne w różnicy w wielkości między obrazami TEM a pomiarami DLS. Oczekuje się, że wprowadzenie środków zamykających i sprzęgających, takich jak 3-aminopropylotrietoksysilan (APTES), zwiększy dyspersję w wodzie, chociaż w tym badaniu nie przeprowadzono żadnych modyfikacji w celu oceny wewnętrznych właściwości przeciwdrobnoustrojowych ZnO NPs30.

Przedstawiona w tym badaniu metoda syntezy nanocząsteczek ZnO różni się od technik wspomaganych mikrofalami lub solwotermicznych tym, że nie wymaga wysokiego ciśnienia ani ciepła i nie zawiera żadnego łącznika innego niż niewielka ilość środka powierzchniowo czynnego31,32. Dzięki czasowi reakcji syntezy wynoszącemu zaledwie 2 godziny jest łatwo dostępny dla każdego. Z perspektywy zastosowań biomedycznych w badaniu tym oceniono właściwości przeciwbakteryjne nanocząsteczek ZnO przy użyciu próbek klinicznych MDR uzyskanych z Uniwersytetu Chung-Ang, umożliwiając określenie niezbędnego stężenia ZnO do eliminacji bakterii w rzeczywistych środowiskach. W porównaniu z badaniem Khana i wsp., w którym większość bakterii została zwalczona w zakresie stężeń 60 μg/ml przeciwko P. aeruginosa, stwierdzono, że szczepy kliniczne MDR użyte w tym badaniu wykazywały wyższe wskaźniki przeżycia33.

Skuteczność przeciwdrobnoustrojową zsyntetyzowanych nanocząsteczek ZnO oceniano w stosunku do szczepów P. aeruginosa i MRSA. Biorąc pod uwagę krótki czas podwajania się bakterii podczas eksperymentu, kluczowe znaczenie ma najpierw umieszczenie roztworu nanocząstek w 96-dołkowej płytce, a następnie szybkie dodanie roztworu bakteryjnego. Co więcej, stosowanie różnych rozcieńczeń do hodowli ma kluczowe znaczenie dla dokładnego określenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek. Kluczowe znaczenie ma również dokładne wymieszanie roztworu bakteryjnego podczas wytwarzania 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych; Dlatego konieczne jest staranne pipetowanie i wirowanie. Należy jednak pamiętać, że ta eksperymentalna procedura jest czasochłonna. W związku z tym wstępna ocena przy użyciu pomiarów absorbancji przy 600 nm może zapewnić przybliżone oszacowanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej przed hodowlą.

Zsyntetyzowane nanocząsteczki ZnO wykazywały wyższą aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec szczepu MRSA, prawdopodobnie ze względu na różnice w strukturze bakterii. Bakterie Gram-ujemne, takie jak P. aeruginosa, różnią się od MRSA strukturą błony komórkowej, w szczególności tworzeniem podwójnej błony zawierającej lipopolisacharydy, w przeciwieństwie do jednowarstwowej grubej błony peptydoglikanu MRSA. Ta struktura podwójnej błony potencjalnie utrudnia przenikanie przeciwdrobnoustrojowych jonów Zn2+ , zwiększając przeżywalność P. aeruginosa. ZnO NPs są wykorzystywane ze względu na swoje właściwości przeciwdrobnoustrojowe, a także są aktywnie wykorzystywane w ochronie przeciwsłonecznej i regeneracji skóry. W związku z tym przewiduje się, że w przyszłości kontynuowane będą różnorodne badania z wykorzystaniem nanocząsteczek ZnO.

Nanocząstki ZnO mogą być stosowane w różnych dziedzinach, poprzez modyfikację powierzchni i różne koniugacje materiałowe. ZnO ma potencjalne zastosowania m.in. w dostarczaniu leków, powłokach przeciwbakteryjnych, terapii nowotworów i gojeniu ran34. Nanocząsteczki ZnO mogą być stosowane w dostarczaniu leków poprzez koniugację cząsteczek docelowych, takich jak przeciwciała, umożliwiając celowane dostarczanie do określonych komórek lub tkanek35. Dodatkowo, poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu, nanocząsteczki ZnO mogą celować nie tylko w komórki bakteryjne, ale także w komórki rakowe. Ponadto uwalnianie jonów Zn2+ z nanocząstek ZnO i wytwarzanie nadtlenku wodoru (H2O2) pod wpływem reaktywnych form tlenu może sprzyjać procesom gojenia się ran w miejscu rany36. Oczekuje się, że potencjał ten doprowadzi do licznych badań nad zastosowaniem nanocząsteczek ZnO w różnych dziedzinach.

Oświadczenia

Dr Jonghoon Choi jest dyrektorem generalnym/założycielem, a dr Yonghyun Choi jest dyrektorem technicznym Feynman Institute of Technology w Nanomedicine Corporation.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez stypendium badawcze Uniwersytetu Chung-Ang w 2022 roku (Pani Gahyun Lee). Prace te były również wspierane przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd koreański (MSIT) (nr 2020R1A5A1018052) oraz przez Program Rozwoju Technologii (RS202300261938) finansowany przez Ministerstwo MŚP i Start-upów (MSS, Korea).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DLSZetasizer Pro
Alkohol etylowy, absolutnyDAEJUNG4023-2304
Czytnik mikropłytek BioTeck
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich221465
TEMJEOL JEM-F200
TSADB difco236950
TSBDB difco211825
XRDNOWOŚĆ D8-Advance
OctanSigma-Aldrich383317

Bibliografia

  1. Catalano, A., et al. Multidrug resistance (MDR): A widespread phenomenon in pharmacological therapies. Molecules. 27 (3), 616(2022).
  2. Bazaid, A. S., et al. Bacterial infections among patients with chronic diseases at a tertiary care hospital in Saudi Arabia. Microorganisms. 10 (10), 1907(2022).
  3. Miller, E. L. The penicillins: A review and update. J Midwifery Women's Health. 47 (6), 426-434 (2002).
  4. Martínez-Trejo, A., et al. Evasion of antimicrobial activity in acinetobacter baumannii by target site modifications: An effective resistance mechanism. Int J Mol Sci. 23 (12), 6582(2022).
  5. Jiang, J. -H., et al. Antibiotic resistance and host immune evasion in staphylococcus aureus mediated by a metabolic adaptation. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3722-3727 (2019).
  6. Lee, H. N., et al. A lateral flow assay for nucleic acid detection based on rolling circle amplification using capture ligand-modified oligonucleotides. BioChip J. 16 (4), 441-450 (2022).
  7. Craft, K. M., Nguyen, J. M., Berg, L. J., Townsend, S. D. Methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA): Antibiotic-resistance and the biofilm phenotype. Med Chem Comm. 10 (8), 1231-1241 (2019).
  8. Tieu, M. -V., Pham, D. T., Le, H. T. N., Hoang, T. X., Cho, S. Rapid and ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus using a gold-interdigitated single-wave-shaped electrode (AU-ISWE) electrochemical biosensor. BioChip J. 17, 1-10 (2023).
  9. Turner, N. A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: An overview of basic and clinical research. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 203-218 (2019).
  10. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  11. Sarabhai, S., Sharma, P., Capalash, N. Ellagic acid derivatives from terminalia chebula retz. Downregulate the expression of quorum sensing genes to attenuate pseudomonas aeruginosa pao1 virulence. PLoS One. 8 (1), e53441(2013).
  12. Dizaj, S. M., Lotfipour, F., Barzegar-Jalali, M., Zarrintan, M. H., Adibkia, K. Antimicrobial activity of the metals and metal oxide nanoparticles. Mat Sci Eng: C. 44, 278-284 (2014).
  13. Ribeiro, A. I., Dias, A. M., Zille, A. Synergistic effects between metal nanoparticles and commercial antimicrobial agents: A review. ACS App Nano Mater. 5 (3), 3030-3064 (2022).
  14. Newman, M. D., Stotland, M., Ellis, J. I. The safety of nanosized particles in titanium dioxide-and zinc oxide-based sunscreens. J Am Acad Dermatol. 61 (4), 685-692 (2009).
  15. Sivakumar, P., Lee, M., Kim, Y. -S., Shim, M. S. Photo-triggered antibacterial and anticancer activities of zinc oxide nanoparticles. J Mater Chem B. 6 (30), 4852-4871 (2018).
  16. Kołodziejczak-Radzimska, A., Jesionowski, T. Zinc oxide-from synthesis to application: A review. Materials. 7 (4), 2833-2881 (2014).
  17. Raoufi, D. Synthesis and microstructural properties of ZnO nanoparticles prepared by precipitation method. Renew Energy. 50, 932-937 (2013).
  18. Wang, Y. -X., Sun, J., Fan, X., Yu, X. A CTAB-assisted hydrothermal and solvothermal synthesis of ZnO nanopowders. Ceram Int. 37 (8), 3431-3436 (2011).
  19. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. J Pharm Anal. 6 (2), 71-79 (2016).
  20. Clogston, J. D., Patri, A. K. Zeta potential measurement. Characterization of nanoparticles intended for drug delivery. Methods Mol Biol. McNeil, S. , 63-70 (2011).
  21. Abdelbaky, A. S., Mohamed, A. M., Sharaky, M., Mohamed, N. A., Diab, Y. M. Green approach for the synthesis of ZnO nanoparticles using Cymbopogon citratus aqueous leaf extract: Characterization and evaluation of their biological activities. Chem Biol Technol Agric. 10 (1), 63(2023).
  22. Ankamwar, B. G., Kamble, V. B., Annsi, J. I., Sarma, L. S., Mahajan, C. M. Solar photocatalytic degradation of methylene blue by ZnO nanoparticles. J Nanosci Nanotechnol. 17 (2), 1185-1192 (2017).
  23. Babayevska, N., et al. Zno size and shape effect on antibacterial activity and cytotoxicity profile. Scientific Rep. 12 (1), 8148(2022).
  24. Hamidian, K., Sarani, M., Behjati, S., Mahjoub, M., Zafarnia, N. Cytotoxic performance of synthesized mn-doped ZnO nanorods in mcf-7 cells. ChemistrySelect. 8 (19), e202300292(2023).
  25. Gharpure, S., et al. Non-antibacterial and antibacterial ZnO nanoparticles composed of different surfactants. J Nanosci Nanotechnol. 21 (12), 5945-5959 (2021).
  26. Dhoke, S. K. Synthesis of nano-ZnO by chemical method and its characterization. Results Chem. 5, 100771(2023).
  27. Choi, K. -C., et al. Modifying hydrogen bonding interaction in solvent and dispersion of ZnO nanoparticles: Impact on the photovoltaic performance of inverted organic solar cells. RSC Adv. 4 (14), 7160-7166 (2014).
  28. Lee, W., et al. High colloidal stability ZnO nanoparticles independent on solvent polarity and their application in polymer solar cells. Scientific Rep. 10 (1), 18055(2020).
  29. Cozzoli, P. D., Kornowski, A., Weller, H. Colloidal synthesis of organic-capped ZnO nanocrystals via a sequential reduction-oxidation reaction. J Phy Chem B. 109 (7), 2638-2644 (2005).
  30. Roh, S., Jang, Y., Yoo, J., Seong, H. Surface modification strategies for biomedical applications: Enhancing cell-biomaterial interfaces and biochip performances. BioChip J. 17, 1-18 (2023).
  31. Chen, D., Jiao, X., Cheng, G. Hydrothermal synthesis of zinc oxide powders with different morphologies. Solid State Commun. 113 (6), 363-366 (1999).
  32. Hu, X. -L., Zhu, Y. -J., Wang, S. -W. Sonochemical and microwave-assisted synthesis of linked single-crystalline ZnO rods. Mater Chem Phys. 88 (2-3), 421-426 (2004).
  33. Ahamad Khan, M., et al. Phytogenically synthesized zinc oxide nanoparticles (ZnO-NPs) potentially inhibit the bacterial pathogens: In vitro studies. Toxics. 11 (5), 452(2023).
  34. Xie, J., et al. Recent advances in ZnO nanomaterial-mediated biological applications and action mechanisms. Nanomaterials. 13 (9), 1500(2023).
  35. Chawla, U., et al. A review on ZnO-based targeted drug delivery system. Lett Drug Des Discov. 21 (3), 397-420 (2024).
  36. Alavi, M., Nokhodchi, A. An overview on antimicrobial and wound healing properties of ZnO nanobiofilms, hydrogels, and bionanocomposites based on cellulose, chitosan, and alginate polymers. Carbohydr Polym. 227, 115349(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza nanocz stekmetoda str caniatransmisyjna mikroskopia elektronowadynamiczne rozpraszanie wiat adyfrakcja rentgenowskatest mikrorozcie cze w bulioniebakterie wielolekoopornejednostki tworz ce kolonie
Otrzymywanie nanocząstek tlenku i ocena ich działania przeciwbakteryjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.