Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66735

⸱

19 lipca 2024

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Streszczenie

Mikroskopia arkuszowa stała się metodologią wyboru do obrazowania na żywo zarodków danio pręgowanego w długich skalach czasowych przy minimalnej fototoksyczności. W szczególności system multiview, który umożliwia rotację próbek, umożliwia obrazowanie całych zarodków pod różnymi kątami. Jednak w większości sesji obrazowania z użyciem systemu multiview montaż próbki jest kłopotliwym procesem, ponieważ próbki są zwykle przygotowywane w probówce polimerowej. Aby pomóc w tym procesie, protokół ten opisuje podstawowe strategie montażu do obrazowania wczesnego rozwoju zebry między 70% stadiami epibolii i wczesnych somitów. W szczególności badanie dostarcza danych statystycznych na temat różnych pozycji, w których zarodki domyślnie znajdują się na 70% etapach epibolii i pąków w kosmówce. Ponadto omówiono optymalną liczbę kątów i odstęp między kątami wymagany do obrazowania całych zarodków danio pręgowanego we wczesnych stadiach rozwoju, tak aby można było uzyskać informacje w skali komórkowej poprzez połączenie różnych widoków. Wreszcie, ponieważ zarodek obejmuje całe pole widzenia kamery, które jest wymagane do uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej, protokół ten szczegółowo opisuje proces wykorzystywania informacji o koralikach z góry lub z dołu zarodka do rejestracji różnych widoków.

Wprowadzenie

Zapewnienie minimalnej fototoksyczności jest głównym wymogiem dla obrazowania żywych embrionów z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez długi czas. W ciągu ostatniej dekady mikroskopia arkuszy świetlnych stała się metodologią z wyboru w celu spełnienia tego wymogu1,2,3,4,5,6,7. Krótko mówiąc, w tej technice, która została po raz pierwszy użyta w 2004 roku do uchwycenia procesów rozwojowych8, dwa wyrównane cienkie arkusze lasera przechodzą przez zarodek z przeciwnych końców, oświetlając tylko płaszczyznę zainteresowania. Obiektyw detekcyjny jest umieszczany prostopadle, a następnie emitowane światło fluorescencyjne ze wszystkich oświetlonych punktów w próbce jest zbierane jednocześnie. Obraz 3D uzyskuje się następnie poprzez sekwencyjne przesuwanie zarodka przez statyczny arkusz świetlny.

Ponadto, w specyficznej formie tej metodologii, określanej jako mikroskopia z wieloma arkuszami świetlnymi, próbki mogą być zawieszone w polimerowej rurce, która może być obracana za pomocą wirnika, umożliwiając obrazowanie tego samego zarodka pod wieloma kątami9,10,11. Po obrazowaniu obrazy pod różnymi kątami są łączone na podstawie markerów rejestracyjnych, które są zazwyczaj globularnymi markerami fluorescencyjnymi w zarodku (np. jądrach) lub w probówce (np. kulki fluorescencyjne). Obrazowanie wielowidokowe i fuzja znacznie poprawiają rozdzielczość osiową, zapewniając rozdzielczość izotropową we wszystkich trzech wymiarach12. Chociaż jest to duża zaleta, głównym wyzwaniem związanym z metodologią multiview jest montowanie próbek, w którym zarodki muszą być montowane i utrzymywane na miejscu w probówkach przez cały czas trwania obrazowania.

Do wykonywania obrazowania wielowidokowego, aby utrzymać zarodki na miejscu i zapobiec ruchom podczas obrazowania, zarodki mogą być osadzone w agarozie. Jednak często prowadzi to do szkodliwego wzrostu i rozwoju, szczególnie w przypadku zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju13, systemu modelowego, który jest tutaj omawiany. Drugą strategią montażu jest użycie cienkiej rurki, która jest tylko nieznacznie większa niż średnica zarodka, gdzie zarodek może zostać wciągnięty do probówki wraz z pożywką zarodkową, a następnie zamknięcie dna probówki za pomocą zatyczki agarozowej14. W tej metodzie, ponieważ probówka jest wypełniona pożywką zarodkową, markery rejestracyjne, takie jak koraliki fluorescencyjne, nie mogą być używane do fuzji różnych widoków, a zatem rejestracja jest zależna od markerów w zarodku. Ogólnie rzecz biorąc, koraliki działają jako lepsze markery rejestracyjne, ponieważ sygnał markerów w zarodku ulega degradacji po wejściu w głąb próbki ze względu na ograniczenia zarówno oświetlenia, jak i wykrywania dowolnego mikroskopu.

Tak więc, trzecie podejście, które zostanie tutaj szczegółowo opisane i używane wcześniej5,13,14,15,16, obrazuje wczesne zarodki danio pręgowanego z nienaruszoną kosmówką i wypełnia probówkę minimalnym procentem agarozy, która zawiera koraliki jako znaczniki rejestracji. W tym scenariuszu, ponieważ ręczna interwencja w celu umieszczenia zarodków w kosmówce nie jest możliwa, badanie to dostarcza statystyk dotyczących domyślnej orientacji, w jaką wpadają wczesne zarodki danio pręgowanego, koncentrując się w szczególności na 70% epibolii i stadiach pąków. Następnie omówiono optymalną liczbę widoków wymaganych do obrazowania zarodków we wczesnym stadium w rozdzielczości w skali komórkowej i szczegółowo opisano proces fuzji za pomocą BigStitcher, wtyczki opartej na FIDŻI10,17,18. Łącznie ten protokół, który wykorzystuje obiektyw 20x/1 NA, ma na celu ułatwienie embriologom danio pręgowanego korzystania z wielowidokowych systemów arkuszy świetlnych do obrazowania zarodków z jądrami i markerami błonowymi od gastrulacji do wczesnych stadiów somitów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury utrzymania i eksperymentów nad danio pręgowanym użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt, vide Referencje TIFR/IAEC/2023-1 i TIFR/IAEC/2023-5. Zarodki uzyskane przez krzyżowanie heterozygotycznych ryb z ekspresją Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 wstrzyknięto mRNA H2A-mCherry (30 pg) w stadium jednokomórkowym. MRNA H2A-mCherry zsyntetyzowano przy użyciu plazmidu pCS2 + H2A-mCherry (prezent od laboratorium Oates, EPFL) przez transkrypcję in vitro. Zarodki wykazujące ekspresję obu markerów, określane odpowiednio jako Utr-GFP i H2A-mCherry, w pozostałej części protokołu, zostały zobrazowane w 70% stadiach epibolii i pąków. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki do obrazowania wielowidokowego

  1. Przygotowanie rurek FEP/PTFE
    1. Wyczyść rurki FEP/PTFE zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami14.
    2. Po oczyszczeniu pokrój probówki na odcinki 2-2,5 cm zgodnie z wymaganiami i przechowuj je w probówkach mikrowirówek o pojemności 2 ml zawierających podwójnie destylowaną wodę. Probówki można przechowywać w ten sposób przez około miesiąc.
    3. Przed przygotowaniem próbki podgrzej probówki w temperaturze 70-75 °C przez około 25 minut, aby je wyprostować. Unikaj przepełnienia w każdej probówce mikrowirówki, aby zapobiec zbrylaniu, zapewniając wystarczającą ilość miejsca na skuteczne prostowanie probówki.
      UWAGA: Podczas całej procedury obsługi probówki należy nosić rękawice, ponieważ wszelkie odciski palców/cząsteczki kurzu pozostawione na probówkach mogą zakłócać obrazowanie.
  2. Przygotowanie agarozy
    1. Przygotować bufor E3 50x roztwory podstawowe w następujący sposób:
      1. Zapas 1 - 3,252 g Na2HPO4, 0,285 g KH2PO4, 11,933 g NaCl, 0,477 g KCl w 1 l wody dejonizowanej
      2. Zapas 2 - 2,426 g CaCl2, 4,067 gMgSO4 w 1 l wody dejonizowanej.
    2. Aby zrobić 1x bufor E3, dodaj po 20 ml roztworów podstawowych 1 i 2 w 960 ml wody dejonizowanej.
      UWAGA: Nie dodawaj błękitu metylenowego do bufora E3 używanego do obrazowania, ponieważ powoduje to rozpraszanie światła.
    3. Rozpuść agarozę o niskiej temperaturze topnienia w 1x E3, ogrzewając w temperaturze 70-75 °C na bloku grzewczym z mieszaniem, aż roztwór stanie się klarowny bez grudek i kryształów.
    4. W przypadku obrazowania wielowidokowego należy dodać dostępne na rynku kulki fluorescencyjne (patrz Tabela materiałów) do roztworu agarozy, co umożliwia rejestrację obrazu podczas analizy. Sonikować kulki w temperaturze pokojowej o częstotliwości 40 kHz przez 20-30 minut w ultradźwiękowej łaźni wodnej w celu dezagregacji kulek.
    5. Po sonikacji dodać 1 μl kulek do 10 ml roztworu agarozy w probówce o pojemności 15 ml i dobrze przemieszać probówkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie kulek.
      UWAGA: Objętość roztworu kulek, który należy dodać do agarozy, zależy od roztworu podstawowego i producenta. Wypróbuj zakres objętości i wybierz stężenie, w którym kulki wydają się dobrze rozproszone podczas obrazowania w systemie arkuszy świetlnych. Zbyt wiele koralików może się agregować pomimo sonikacji i wirowania, podczas gdy zbyt mało koralików może wpływać na rejestrację obrazu.
    6. Probówkę agarozową z dodanymi kulkami przechowywać w zamkniętej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przed przygotowaniem próbki. Dzięki temu temperatura agarozy spada z 70 °C do 37 °C.
  3. Przygotowanie próbki
    1. Ustaw ryby w parach z przegrodami wieczorem przed dniem obrazowania. Usuń przegrody na około 15 minut i zbierz zarodki za pomocą standardowej procedury20.
    2. Gdy zarodki osiągną etap przygotowania próbki, należy wlać całe 10 ml agarozy (z kulkami), która jest przechowywana w temperaturze 37 °C, na 6-centymetrową szalkę Petriego.
    3. Odczekaj około 2-3 minut, aby obniżyć temperaturę poniżej 33 °C przed przeniesieniem 10 do 15 zarodków do roztworu agarozy.
      UWAGA: Jest to ważny krok w celu zapobieżenia ewentualnemu szokowi cieplnemu dla zarodków przeniesionych do agarozy.
    4. Upewnij się, że podczas transferu zarodków do roztworu agarozy dodano jak najmniej buforu E3. Zakręć szalką Petriego tak, aby mały bufor, który zostałby przeniesiony, został dobrze rozproszony.
    5. Przez pozostałą część procedury przygotowania próbki należy nosić rękawice.
    6. Weź mikropipetę o pojemności 200 μl z odpowiednią końcówką do pipety i włóż oczyszczoną prostą probówkę wyjętą z probówki do mikrowirówki do końcówki pipety, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A,B.
    7. Odessać trochę agarozy do probówki, a następnie 2-3 zarodki za pomocą mikropipety (Rysunek 1C, D). Upewnij się, że zarodki znajdują się blisko dna probówki (Rysunek 1E), co stanie się ważne podczas ustawiania obrazowania. Upewnij się również, że pomiędzy różnymi zarodkami znajduje się trochę agarozy (Ryc. 1E), aby koraliki w tym regionie mogły być używane jako znaczniki rejestracji.
    8. Nie zwalniając ciśnienia z pipety, odłącz rurkę od końcówki pipety i umieść ją na pokrywie szalki Petriego wypełnionej E3, aby agaroza zastygła (Rysunek 1F).
    9. Powtarzać kroki od 1.3.6 do 1.3.8 aż do momentu, gdy wszystkie zarodki na szalce Petriego zostaną przeniesione do probówek.
    10. Gdy agaroza zastygnie (co może zająć 5-10 minut i można to potwierdzić, sprawdzając agarozę na szalce Petriego), przenieś probówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej E3 (Rysunek 1G).
    11. Przechowywać probówki z zarodkami w inkubatorze w temperaturze 28 °C lub 33 °C, w zależności od potrzeb, przed przystąpieniem do obrazowania wielowidokowego.

2. Obrazowanie wielowidokowe

UWAGA: Ten krok przedstawia ogólną procedurę obrazowania wielowidokowego zarodków danio pręgowanego we wczesnych stadiach rozwoju. Opisaną poniżej metodę można łatwo dostosować do dowolnego systemu mikroskopii z wieloma arkuszami świetlnymi.

  1. Lokalizacja zarodka
    UWAGA: Napełnij komorę próbki mikroskopu pożywką dla zarodków20 i ustaw temperaturę komory próbki na temperaturę zainteresowania co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.
    1. Zmontuj uchwyt na próbkę zgodnie z wcześniejszym opisem21, jednak z jedną modyfikacją. Ponieważ obrazowanie będzie wykonywane przez probówkę, włóż probówkę z zarodkami bezpośrednio do naczynia włosowatego o odpowiedniej średnicy, tak aby była utrzymywana na miejscu bez wypychania agarozy i naruszania zarodków na dole (Rysunek 1H).
      UWAGA: Ponieważ komora na próbkę ma określoną wysokość, upewnienie się, że zarodki znajdują się na dnie probówki podczas przygotowywania próbki (jak wspomniano w kroku 1.3.7) umożliwiłoby ustawienie zarodka w polu widzenia bez uderzania o podłogę komory.
    2. Włóż uchwyt na próbkę do systemu multiview i użyj elementów sterujących x i y, aby sprowadzić zarodek do środka pola widzenia.
    3. Użyj elementu sterującego z nawigatora próbki, aby ustawić ostrość zarodka.
    4. W tym momencie orientacja zarodka w kosmówce będzie wyraźnie widoczna, a jeśli nie jest zadowalająca, włóż nową rurkę i wybierz zarodek o interesującej orientacji.
  2. Wyrównywanie arkuszy świetlnych
    1. Gdy zarodek znajdzie się na swoim miejscu, ustaw wszystkie ustawienia eksperymentalne - lasery, ścieżkę światła, filtr, rozdzielacz wiązki i kamerę.
    2. Podczas ustawiania parametrów akwizycji, jeśli oprogramowanie udostępnia opcję skanowania przestawnego, wybierz ją. Skanowanie obrotowe zmniejszy efekt cieniowania wyłaniający się z arkusza światła, gdy napotka on jakiekolwiek struktury lub nieprzezroczyste obszary w próbce.
    3. Rozpocznij skanowanie próbki na żywo. Ustaw rozmiar bitu, moc lasera i żądane powiększenie, które określą grubość arkusza świetlnego, a tym samym rozdzielczość osiową.
    4. Aby wyrównać arkusze świetlne, najpierw przełącz się na oświetlenie jednostronne i zmieniaj kolejno ustawienia dwóch arkuszy świetlnych (lewej i prawej). Cyfrowe powiększenie obszaru próbki, w którym widoczne są wyraźne struktury będące przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: W tym badaniu do wyrównania arkuszy użyto markera jądrowego (H2A-mCherry) lub membranowego (Utr-GFP). Zalecana jest zmiana ustawień arkusza świetlnego w oprogramowaniu, aby uzyskać najostrzejszy kontrast sygnału w obszarze zainteresowania.
    5. Gdy dwie arkusze świetlne zostaną indywidualnie zoptymalizowane w celu uzyskania najlepszego sygnału, włącz obie arkusze świetlne. Wykonaj drugą rundę wyrównywania i upewnij się, że migotanie jest minimalne, co wskazuje na dość dobre wyrównanie dwóch arkuszy.
    6. Po zakończeniu wyrównania aktywuj opcję automatycznego łączenia obrazów generowanych przez dwa arkusze, jeśli zezwala na to oprogramowanie. Alternatywnie, można najpierw zgrubnie wyrównać arkusze światła, skupiając się na koralikach wokół próbki, a następnie dostroić wyrównanie, korzystając z informacji z próbki.
      UWAGA: Podczas obrazowania za pomocą dwóch fluoroforów (takich jak markery jądrowe i błonowe), optymalne wyrównanie jest zwykle nieznacznie różne dla tych dwóch struktur. W tym scenariuszu wybierz ustawienie na podstawie ograniczeń dotyczących przetwarzania podrzędnego. Na przykład, jeśli granice komórek mają być segmentowane, co jest stosunkowo bardziej intensywne w przetwarzaniu, wyrównaj arkusze świetlne na podstawie znacznika membranowego.
  3. Konfigurowanie obrazowania wielowidokowego
    1. Po wyrównaniu arkuszy świetlnych aktywuj opcje wykonywania obrazowania z-stack oraz multiview.
    2. Rozpocznij skanowanie na żywo i nawiguj za pomocą nawigatora próbek, aby wybrać pierwszy widok. W tym widoku ustaw interwał wycinków, a następnie pierwszy i ostatni wycinek stosu z. Dodaj tę pozycję w oknie dialogowym multiwidoku, w którym są zapisywane informacje o położeniu i stosie z dla tego widoku.
    3. Przejdź do następnego widoku, zmieniając kąt w nawigatorze próbek. Skonfiguruj stos osi Z dla drugiego widoku i dodaj informacje w oknie dialogowym multiwidoku.
    4. Powtórz to samo dla dodatkowych widoków.
      UWAGA: Upewnij się, że w każdym widoku jest obrazowana pewna minimalna liczba plasterków, tak aby różne widoki wystarczająco się nakładały, co ostatecznie pomoże w rejestrowaniu widoków podczas przetwarzania. Minimalna liczba plasterków będzie zależeć od współczynnika powiększenia, a także od liczby kątów wybranych do obrazowania.
    5. Po ustawieniu wszystkich widoków, zapisz te informacje w pliku tekstowym (na przykład o nazwie "pozycje zarodka"), który będzie zawierał informacje o stosie z, współrzędne (x, y, z) rury, a także specyfikacje kąta dla każdego widoku. Po zapisaniu wyczyść wszystkie pozycje w oknie dialogowym multiwidoku.
    6. Ponieważ obrazowanie odbywa się z nienaruszoną kosmówką, która jest stosunkowo duża, nie jest możliwe oglądanie koralików w rurce przy tych samych ustawieniach. W związku z tym informacje o stopkach muszą być pozyskiwane z innego miejsca w tubie. Aby to zrobić, przetłumacz na inną współrzędną "y" z dala od zarodka, gdzie widoczne są koraliki. Dodaj tę pozycję do okna dialogowego multiview i zapisz ją w pliku tekstowym (na przykład o nazwie 'beads-y').
      UWAGA: Zobrazuj koraliki jak najbliżej próbki zarodka, aby zminimalizować skutki ewentualnych różnic w krzywiźnie rurki w obu pozycjach. Dlatego, jeśli w probówce zamontowanych jest wiele zarodków, ważne jest, aby pozostawić trochę agarozy między probówkami, aby zobrazować koraliki (jak wspomniano w kroku 1.3.7).
    7. Przejdź do folderu, w którym zapisane są pliki tekstowe i zduplikuj plik "pozycje zarodków" do nowego pliku o nazwie "pozycje-koralików". Zastąp współrzędną y dla wszystkich widoków w pliku 'beads-positions' współrzędną y z pliku 'beads-y'. Zapewni to, że koraliki będą obrazowane z tą samą liczbą widoków, stosów z i współrzędnych x, ale w innej pozycji y w tubie.
    8. Wróć do oprogramowania do obrazowania i załaduj plik "pozycje ściegów" do oprogramowania. Jeśli opcja szeregów czasowych jest aktywna, wybierz jeden cykl i rozpocznij eksperyment. Zapisuj obrazy koralików jako "koraliki", które będą używane do rejestrowania różnych widoków podczas przetwarzania obrazu.
    9. Po wykonaniu zdjęć koralików wyczyść pozycje i załaduj początkowy plik "pozycje zarodków" do oprogramowania. Ustaw żądaną liczbę cykli z odpowiednim odstępem czasu i rozpocznij eksperyment.

3. Analiza obrazu wielowidokowego

UWAGA: Do łączenia obrazów multiview używana jest wtyczka FIJI, BigStitcher, która jest najnowszą wersją wtyczki Multiview Reconstruction10,17,18. Wtyczkę można zainstalować, dodając wtyczkę BigStitcher w funkcji "Zarządzaj witrynami aktualizacji", do której można uzyskać dostęp w opcji "Aktualizacja" w menu "Pomoc". Po zainstalowaniu wtyczka pojawi się w menu "Wtyczki". Ogólne etapy fuzji są następujące: (1) Zdefiniuj pary pilników .xml/.h5 zarówno dla koralików, jak i zarodków; (2) Zarejestruj wszystkie widoki za pomocą pliku koralików; (3) Funkcja rozproszenia punktu ekstrakcji (PSF) dla koralików, która może być używana do dekonwolucji ( Rysunek 2A); (4) Przenieść informacje o rejestracji i poliestrowych włóknach odcinkowych z pliku koralików do pliku zarodków i rozpocząć dekonwolucję wielowidokową. Większość z tych kroków została wcześniej szczegółowo opisana21, a tutaj opisane są kroki, które są inaczej przetwarzane.

  1. Definiowanie zestawu danych .xml
    1. Zdefiniuj nowy zestaw danych zarówno dla koralików, jak i zarodka, odpowiednio jako "beads.xml" i "embryo.xml", zgodnie z wcześniejszym opisem21.
  2. Wykrywanie i rejestracja za pomocą punktów procentowych
    1. Po pomyślnym wyeksportowaniu pliku beads.xml wybierz widoki, które są wymagane do rejestracji w oknie dialogowym "Multiview Explorer" (Rysunek 2B). Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Wykryj punkty zainteresowania. Postępuj zgodnie z opisem21.
    2. Po wykryciu punktów zainteresowania zaznacz wszystkie widoki, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Zarejestruj przy użyciu punktów zainteresowania. Postępuj zgodnie z opisem21.
    3. Dokładnie sprawdź, czy rejestracja ściegu zadziałała pomyślnie. Po udanej rejestracji nakładające się na siebie koraliki z różnych widoków są nakładane (Rysunek 2C). Aby sprawdzić, jak dokładnie zadziałała pasacja, wybierz dwa kolejne widoki, przejdź do nakładającego się regionu i przełączaj się między tymi dwoma widokami, aby zobaczyć, czy koraliki obrazowane pod różnymi kątami są nałożone. Powtórz tę czynność dla każdego kolejnego widoku.
    4. Jeśli nakładanie się nie jest precyzyjne, ponów próbę rejestracji, zmniejszając wymagane znaczenie dla rejestracji i/lub dopuszczalny błąd nakładania się (określany jako "błąd RANSAC" w oknie dialogowym "Rejestracja").
    5. Po udanej rejestracji kliknij Zapisz w oknie "Multiview Explorer", aby zapisać zaktualizowany plik .xml.
      UWAGA: Zapisz również plik dziennika, ponieważ zawiera on dalsze szczegółowe informacje na temat skuteczności rejestracji. Aby przetłumaczyć informacje rejestracyjne z koralików na zarodek, wykonaj czynności opisane poniżej.
    6. Otwórz plik bead.xml w wybranym edytorze tekstu i skopiuj cały blok w obszarze "ViewRegistrations".
    7. Otwórz embryo.xml i zastąp blok "ViewRegistrations" blokiem skopiowanym z pliku koralików. Jeśli istnieje wiele kanałów, zastąp informacje rejestracyjne dla każdego kanału, jak powyżej. Informacje rejestracyjne można przesłać ręcznie lub za pomocą niestandardowego kodu MATLAB, który można pobrać tutaj: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
    8. Otwórz plik embryo.xml w "BigStitcher" i dokładnie sprawdź, czy rejestracja zadziałała pomyślnie dla zarodka. Powtórz to samo, co w przypadku koralików, sprawdzając nakładanie się interesujących struktur w każdych dwóch kolejnych widokach.
      UWAGA: Czasami rejestracja zarodka może nie być tak pożądana, mimo że koraliki są doskonale zarejestrowane. Jest to możliwe, jeśli występują niewielkie zmiany w krzywiźnie rurki od pozycji, w której koraliki są obrazowane, do pozycji zarodka. Ponadto mogą wystąpić subtelne ruchy zarodka między widokami, ponieważ swobodnie unosi się on w kosmówce. W takim przypadku należy przeprowadzić drugą rundę rejestracji przy użyciu markera jądrowego w zarodku.
    9. Aby to zrobić, otwórz plik embryo.xml w "BigStitcher", kliknij prawym przyciskiem myszy wszystkie widoki, które mają znacznik jądrowy i wybierz Wykryj punkty zainteresowania.
    10. Zmień nazwę punktów procentowych na "jądra" i postępuj zgodnie z krokami wykonywanymi dla koralików.
    11. Ustawiając parametry "Różnicy Gaussa", upewnij się, że większość jąder, jeśli nie wszystkie, zostały wykryte i że nie ma ektopowej detekcji jądra. Następnie kliknij Gotowe.
    12. Następnie zarejestruj te widoki, wybierając opcję Zarejestruj przy użyciu punktów zainteresowania i wybierz opcję Oparty na precyzyjnym deskryptorze (niezmiennym tłumaczeniu). Upewnij się, że wybrana jest opcja "porównaj wszystkie widoki i punkty zainteresowania" i użyj "jąder" jako punktów zainteresowania. Użyj opcji naprawiania pierwszego widoku i nie odwzorowuj z powrotem.
    13. Do rejestracji użyj modelu afinicznego ze sztywną regularyzacją i domyślnymi parametrami we wtyczce.
    14. Ponownie sprawdź powodzenie rejestracji, porównując co dwa kolejne wyświetlenia.
    15. Po udanej rejestracji kliknij Zapisz w oknie "Multiview Explorer", aby zapisać zaktualizowany plik .xml.
    16. Otwórz plik embryo.xml w wybranym edytorze tekstu i skopiuj informacje rejestracyjne ze znaczników jądrowych do innych kanałów.
  3. Ekstrakcja i przypisanie funkcji rozproszenia punktów
    1. Aby przeprowadzić dekonwolucję wielowidokową, należy wyodrębnić PSF systemu obrazowania z zestawu danych zarejestrowanych koralików i zastosować go do pliku zarodków.
    2. Aby uzyskać te informacje, zaznacz wszystkie widoki w pliku ściegu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcje Funkcje rozkładu punktów i Wyodrębnij.
    3. W wyświetlonym oknie dialogowym upewnij się, że zaznaczone są opcje Użyj odpowiednich punktów procentowych i Usuń projekcje minimalnej intensywności z PSF, przejdź do domyślnych rozmiarów PSF i kliknij OK.
      UWAGA: Jeśli wyodrębnianie PSF powiedzie się dla wszystkich widoków, w pliku dziennika zostanie wyświetlony komunikat "Wyodrębnione n/n PSF"
    4. Następnie ponownie zapisz plik .xml. Pojawi się zaznaczone pole wyboru w kolumnie PSF w oknie dialogowym "Multiview Explorer", a folder "psf" zostanie wygenerowany w odpowiednim folderze ze wszystkimi wyodrębnionymi PSF.
    5. Otwórz plik embryo.xml i przypisz plik PSF dla każdego widoku osobno. Kliknij prawym przyciskiem myszy "widok" → kliknij Funkcje rozproszenia punktów → wybierz Przypisz → wybierz Zaawansowane, a następnie Przypisz nowy PSF do wszystkich wybranych widoków. Kliknij Przeglądaj, przejdź do .xml ścieżki pliku i otwórz folder psf.
    6. Wybierz pasujący PSF z odpowiednim identyfikatorem w wybranym widoku i kliknij OK, po czym pole wyboru PSF pojawi się zaznaczone w oknie "Multiview Explorer".
    7. Powtórz ten proces dla wszystkich innych widoków.
  4. Fuzja i dekonwolucja wielu widoków
    1. Po przypisaniu funkcji rozkładu punktów do wszystkich widoków kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Dekonwolucja wielu widoków.
    2. Wybierz obwiednię jako aktualnie wybrane widoki. W przypadku tej pracy dobrze sprawdza się domyślne przyspieszenie OSEM i liczba iteracji.
    3. Zmniejsz próbkowanie obrazów zgodnie z wymaganiami, jeśli wymagane jest szybsze obliczanie lub jeśli pamięć procesora jest ograniczona.
      UWAGA: Jeśli wymagana pamięć RAM przekroczy istniejącą pamięć, w dolnej części okna pojawi się ostrzegawczy komunikat o błędzie w kolorze czerwonym. Nie rozpoczynaj dekonwolucji, jeśli pojawi się to ostrzeżenie, ponieważ wtyczka zatrzyma się i przestanie odpowiadać w pewnym momencie podczas przetwarzania.
    4. Aby ocenić postęp dekonwolucji, sprawdź plik dziennika, który będzie wyświetlał wyniki co 5 iteracji.
    5. Aby zwiększyć szybkość obliczeń, wykonaj dekonwolucję wielu widoków w GPU, jeśli jest wcześniej zainstalowana.
      UWAGA: Pod koniec tego procesu pojawi się okno połączonego obrazu, który można zapisać jako plik tiff.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Precyzyjne orientowanie próbki jest kluczowym elementem efektywnego wykorzystania zestawu do mikroskopii. Jednakże ręczne orientowanie próbek jest często niemożliwe przy użyciu systemu arkusza światła o wielu widokach (multiview light sheet system), ze względu na konieczność przygotowania próbek w probówce. Aby zatem sprawdzić, czy embriony przyjmują w obrębie chorionu stereotypowe pozycje, wykonano obrazowanie embrionów zebrafish w fazie 70% epibolii (około 7 h po zapłodnieniu (hpf)), ponieważ przedmiotem niniejszego ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ustawienie zarodka we właściwej orientacji w celu zobrazowania obszaru zainteresowania jest jednym z kroków ograniczających szybkość, które często skutkują nieudaną sesją mikroskopową dla użytkownika. Jest to szczególnie widoczne w mikroskopie z wieloma arkuszami świetlnymi, gdzie ręczna manipulacja orientacją jest trudna, ponieważ próbki są osadzone w probówce. Aby pomóc w tym procesie, badanie to przedstawia statystyki dotyczące różnych pozycji, w których zarodek danio pręgowanego zajmuje od 70% epibolii do wczesnych s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Kalidasowi Kohale'owi i jego zespołowi za utrzymanie obiektu rybackiego oraz KV Boby za utrzymanie mikroskopu z blachą świetlną. SRN przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej (DAE), rządu Indii (nr identyfikacyjny projektu. RTI4003, DAE OM nr 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 z dnia 11.02.2020 r.), program Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) oraz grant badawczy dla start-upów Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SRG/2023/001716).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigma-AldrichA9414
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-Aldrich12022
FIJIWersja: ImageJ 1.54f
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany karboksylanem, czerwień fluorescencyjna, 0,5 μ m średnia wielkość cząstek, zawiesina wodnaSigma-AldrichL3280
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiThermoFischer ScientificAM1340Do transkrypcji in vitro plazmidu H2A-mCherry
Potassium ChhlorideSigma-AldrichP9541
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP0662
Oplot ochronny PTFE AWG 15L - 1,58 mm średnica wewnętrzna x 0,15 mm ścianka +/-0,05 Innowacje Adtech w zakresie fluoroplastówSTW15Rurki PTFE
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-Aldrich71640
Myjka ultradźwiękowaLabmanLMUC3Ultradźwiękowiec
Zeiss LightSheet 7 SystemZeiss

Bibliografia

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  3. Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  4. Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168(2013).
  5. Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).
  6. Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
  7. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  8. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  9. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
  10. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
  11. Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  12. Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  14. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119(2014).
  15. Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
  16. Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
  19. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  21. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966(2016).
  22. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  23. Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
  24. Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519(2023).
  25. Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
  26. Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154(2023).
  27. Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).
  28. Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  29. York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).
  30. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  31. Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).
  32. Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , 13:RP93764 (2024).
  33. Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie wieloperspektywicznemontaż próbekobrazowanie żywych komórekrozwój zarodkowyrotacja próbekanaliza ilościowarozdzielczość komórkowarejestracja obrazu
Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.