Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66735

⸱

19 lipca 2024

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Streszczenie

Mikroskopia arkuszowa stała się metodologią wyboru do obrazowania na żywo zarodków danio pręgowanego w długich skalach czasowych przy minimalnej fototoksyczności. W szczególności system multiview, który umożliwia rotację próbek, umożliwia obrazowanie całych zarodków pod różnymi kątami. Jednak w większości sesji obrazowania z użyciem systemu multiview montaż próbki jest kłopotliwym procesem, ponieważ próbki są zwykle przygotowywane w probówce polimerowej. Aby pomóc w tym procesie, protokół ten opisuje podstawowe strategie montażu do obrazowania wczesnego rozwoju zebry między 70% stadiami epibolii i wczesnych somitów. W szczególności badanie dostarcza danych statystycznych na temat różnych pozycji, w których zarodki domyślnie znajdują się na 70% etapach epibolii i pąków w kosmówce. Ponadto omówiono optymalną liczbę kątów i odstęp między kątami wymagany do obrazowania całych zarodków danio pręgowanego we wczesnych stadiach rozwoju, tak aby można było uzyskać informacje w skali komórkowej poprzez połączenie różnych widoków. Wreszcie, ponieważ zarodek obejmuje całe pole widzenia kamery, które jest wymagane do uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej, protokół ten szczegółowo opisuje proces wykorzystywania informacji o koralikach z góry lub z dołu zarodka do rejestracji różnych widoków.

Wprowadzenie

Zapewnienie minimalnej fototoksyczności jest głównym wymogiem dla obrazowania żywych embrionów z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez długi czas. W ciągu ostatniej dekady mikroskopia arkuszy świetlnych stała się metodologią z wyboru w celu spełnienia tego wymogu1,2,3,4,5,6,7. Krótko mówiąc, w tej technice, która została po raz pierwszy użyta w 2004 roku do uchwycenia procesów rozwojowych8, dwa wyrównane cienkie arkusze lasera przechodzą przez zarodek z przeciwnych końców, oświetlając tylko płaszczyznę zainteresowania. Obiektyw detekcyjny jest umieszczany prostopadle, a następnie emitowane światło fluorescencyjne ze wszystkich oświetlonych punktów w próbce jest zbierane jednocześnie. Obraz 3D uzyskuje się następnie poprzez sekwencyjne przesuwanie zarodka przez statyczny arkusz świetlny.

Ponadto, w specyficznej formie tej metodologii, określanej jako mikroskopia z wieloma arkuszami świetlnymi, próbki mogą być zawieszone w polimerowej rurce, która może być obracana za pomocą wirnika, umożliwiając obrazowanie tego samego zarodka pod wieloma kątami9,10,11. Po obrazowaniu obrazy pod różnymi kątami są łączone na podstawie markerów rejestracyjnych, które są zazwyczaj globularnymi markerami fluorescencyjnymi w zarodku (np. jądrach) lub w probówce (np. kulki fluorescencyjne). Obrazowanie wielowidokowe i fuzja znacznie poprawiają rozdzielczość osiową, zapewniając rozdzielczość izotropową we wszystkich trzech wymiarach12. Chociaż jest to duża zaleta, głównym wyzwaniem związanym z metodologią multiview jest montowanie próbek, w którym zarodki muszą być montowane i utrzymywane na miejscu w probówkach przez cały czas trwania obrazowania.

Do wykonywania obrazowania wielowidokowego, aby utrzymać zarodki na miejscu i zapobiec ruchom podczas obrazowania, zarodki mogą być osadzone w agarozie. Jednak często prowadzi to do szkodliwego wzrostu i rozwoju, szczególnie w przypadku zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju13, systemu modelowego, który jest tutaj omawiany. Drugą strategią montażu jest użycie cienkiej rurki, która jest tylko nieznacznie większa niż średnica zarodka, gdzie zarodek może zostać wciągnięty do probówki wraz z pożywką zarodkową, a następnie zamknięcie dna probówki za pomocą zatyczki agarozowej14. W tej metodzie, ponieważ probówka jest wypełniona pożywką zarodkową, markery rejestracyjne, takie jak koraliki fluorescencyjne, nie mogą być używane do fuzji różnych widoków, a zatem rejestracja jest zależna od markerów w zarodku. Ogólnie rzecz biorąc, koraliki działają jako lepsze markery rejestracyjne, ponieważ sygnał markerów w zarodku ulega degradacji po wejściu w głąb próbki ze względu na ograniczenia zarówno oświetlenia, jak i wykrywania dowolnego mikroskopu.

Tak więc, trzecie podejście, które zostanie tutaj szczegółowo opisane i używane wcześniej5,13,14,15,16, obrazuje wczesne zarodki danio pręgowanego z nienaruszoną kosmówką i wypełnia probówkę minimalnym procentem agarozy, która zawiera koraliki jako znaczniki rejestracji. W tym scenariuszu, ponieważ ręczna interwencja w celu umieszczenia zarodków w kosmówce nie jest możliwa, badanie to dostarcza statystyk dotyczących domyślnej orientacji, w jaką wpadają wczesne zarodki danio pręgowanego, koncentrując się w szczególności na 70% epibolii i stadiach pąków. Następnie omówiono optymalną liczbę widoków wymaganych do obrazowania zarodków we wczesnym stadium w rozdzielczości w skali komórkowej i szczegółowo opisano proces fuzji za pomocą BigStitcher, wtyczki opartej na FIDŻI10,17,18. Łącznie ten protokół, który wykorzystuje obiektyw 20x/1 NA, ma na celu ułatwienie embriologom danio pręgowanego korzystania z wielowidokowych systemów arkuszy świetlnych do obrazowania zarodków z jądrami i markerami błonowymi od gastrulacji do wczesnych stadiów somitów.

Protokół

Procedury utrzymania i eksperymentów nad danio pręgowanym użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt, vide Referencje TIFR/IAEC/2023-1 i TIFR/IAEC/2023-5. Zarodki uzyskane przez krzyżowanie heterozygotycznych ryb z ekspresją Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 wstrzyknięto mRNA H2A-mCherry (30 pg) w stadium jednokomórkowym. MRNA H2A-mCherry zsyntetyzowano przy użyciu plazmidu pCS2 + H2A-mCherry (prezent od laboratorium Oates, EPFL) przez transkrypcję in vitro. Zarodki wykazujące ekspresję obu markerów, określane odpowiednio jako Utr-GFP i H2A-mCherry, w pozostałej części protokołu, zostały zobrazowane w 70% stadiach epibolii i pąków. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki do obrazowania wielowidokowego

  1. Przygotowanie rurek FEP/PTFE
    1. Wyczyść rurki FEP/PTFE zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami14.
    2. Po oczyszczeniu pokrój probówki na odcinki 2-2,5 cm zgodnie z wymaganiami i przechowuj je w probówkach mikrowirówek o pojemności 2 ml zawierających podwójnie destylowaną wodę. Probówki można przechowywać w ten sposób przez około miesiąc.
    3. Przed przygotowaniem próbki podgrzej probówki w temperaturze 70-75 °C przez około 25 minut, aby je wyprostować. Unikaj przepełnienia w każdej probówce mikrowirówki, aby zapobiec zbrylaniu, zapewniając wystarczającą ilość miejsca na skuteczne prostowanie probówki.
      UWAGA: Podczas całej procedury obsługi probówki należy nosić rękawice, ponieważ wszelkie odciski palców/cząsteczki kurzu pozostawione na probówkach mogą zakłócać obrazowanie.
  2. Przygotowanie agarozy
    1. Przygotować bufor E3 50x roztwory podstawowe w następujący sposób:
      1. Zapas 1 - 3,252 g Na2HPO4, 0,285 g KH2PO4, 11,933 g NaCl, 0,477 g KCl w 1 l wody dejonizowanej
      2. Zapas 2 - 2,426 g CaCl2, 4,067 gMgSO4 w 1 l wody dejonizowanej.
    2. Aby zrobić 1x bufor E3, dodaj po 20 ml roztworów podstawowych 1 i 2 w 960 ml wody dejonizowanej.
      UWAGA: Nie dodawaj błękitu metylenowego do bufora E3 używanego do obrazowania, ponieważ powoduje to rozpraszanie światła.
    3. Rozpuść agarozę o niskiej temperaturze topnienia w 1x E3, ogrzewając w temperaturze 70-75 °C na bloku grzewczym z mieszaniem, aż roztwór stanie się klarowny bez grudek i kryształów.
    4. W przypadku obrazowania wielowidokowego należy dodać dostępne na rynku kulki fluorescencyjne (patrz Tabela materiałów) do roztworu agarozy, co umożliwia rejestrację obrazu podczas analizy. Sonikować kulki w temperaturze pokojowej o częstotliwości 40 kHz przez 20-30 minut w ultradźwiękowej łaźni wodnej w celu dezagregacji kulek.
    5. Po sonikacji dodać 1 μl kulek do 10 ml roztworu agarozy w probówce o pojemności 15 ml i dobrze przemieszać probówkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie kulek.
      UWAGA: Objętość roztworu kulek, który należy dodać do agarozy, zależy od roztworu podstawowego i producenta. Wypróbuj zakres objętości i wybierz stężenie, w którym kulki wydają się dobrze rozproszone podczas obrazowania w systemie arkuszy świetlnych. Zbyt wiele koralików może się agregować pomimo sonikacji i wirowania, podczas gdy zbyt mało koralików może wpływać na rejestrację obrazu.
    6. Probówkę agarozową z dodanymi kulkami przechowywać w zamkniętej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przed przygotowaniem próbki. Dzięki temu temperatura agarozy spada z 70 °C do 37 °C.
  3. Przygotowanie próbki
    1. Ustaw ryby w parach z przegrodami wieczorem przed dniem obrazowania. Usuń przegrody na około 15 minut i zbierz zarodki za pomocą standardowej procedury20.
    2. Gdy zarodki osiągną etap przygotowania próbki, należy wlać całe 10 ml agarozy (z kulkami), która jest przechowywana w temperaturze 37 °C, na 6-centymetrową szalkę Petriego.
    3. Odczekaj około 2-3 minut, aby obniżyć temperaturę poniżej 33 °C przed przeniesieniem 10 do 15 zarodków do roztworu agarozy.
      UWAGA: Jest to ważny krok w celu zapobieżenia ewentualnemu szokowi cieplnemu dla zarodków przeniesionych do agarozy.
    4. Upewnij się, że podczas transferu zarodków do roztworu agarozy dodano jak najmniej buforu E3. Zakręć szalką Petriego tak, aby mały bufor, który zostałby przeniesiony, został dobrze rozproszony.
    5. Przez pozostałą część procedury przygotowania próbki należy nosić rękawice.
    6. Weź mikropipetę o pojemności 200 μl z odpowiednią końcówką do pipety i włóż oczyszczoną prostą probówkę wyjętą z probówki do mikrowirówki do końcówki pipety, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A,B.
    7. Odessać trochę agarozy do probówki, a następnie 2-3 zarodki za pomocą mikropipety (Rysunek 1C, D). Upewnij się, że zarodki znajdują się blisko dna probówki (Rysunek 1E), co stanie się ważne podczas ustawiania obrazowania. Upewnij się również, że pomiędzy różnymi zarodkami znajduje się trochę agarozy (Ryc. 1E), aby koraliki w tym regionie mogły być używane jako znaczniki rejestracji.
    8. Nie zwalniając ciśnienia z pipety, odłącz rurkę od końcówki pipety i umieść ją na pokrywie szalki Petriego wypełnionej E3, aby agaroza zastygła (Rysunek 1F).
    9. Powtarzać kroki od 1.3.6 do 1.3.8 aż do momentu, gdy wszystkie zarodki na szalce Petriego zostaną przeniesione do probówek.
    10. Gdy agaroza zastygnie (co może zająć 5-10 minut i można to potwierdzić, sprawdzając agarozę na szalce Petriego), przenieś probówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej E3 (Rysunek 1G).
    11. Przechowywać probówki z zarodkami w inkubatorze w temperaturze 28 °C lub 33 °C, w zależności od potrzeb, przed przystąpieniem do obrazowania wielowidokowego.

2. Obrazowanie wielowidokowe

UWAGA: Ten krok przedstawia ogólną procedurę obrazowania wielowidokowego zarodków danio pręgowanego we wczesnych stadiach rozwoju. Opisaną poniżej metodę można łatwo dostosować do dowolnego systemu mikroskopii z wieloma arkuszami świetlnymi.

  1. Lokalizacja zarodka
    UWAGA: Napełnij komorę próbki mikroskopu pożywką dla zarodków20 i ustaw temperaturę komory próbki na temperaturę zainteresowania co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.
    1. Zmontuj uchwyt na próbkę zgodnie z wcześniejszym opisem21, jednak z jedną modyfikacją. Ponieważ obrazowanie będzie wykonywane przez probówkę, włóż probówkę z zarodkami bezpośrednio do naczynia włosowatego o odpowiedniej średnicy, tak aby była utrzymywana na miejscu bez wypychania agarozy i naruszania zarodków na dole (Rysunek 1H).
      UWAGA: Ponieważ komora na próbkę ma określoną wysokość, upewnienie się, że zarodki znajdują się na dnie probówki podczas przygotowywania próbki (jak wspomniano w kroku 1.3.7) umożliwiłoby ustawienie zarodka w polu widzenia bez uderzania o podłogę komory.
    2. Włóż uchwyt na próbkę do systemu multiview i użyj elementów sterujących x i y, aby sprowadzić zarodek do środka pola widzenia.
    3. Użyj elementu sterującego z nawigatora próbki, aby ustawić ostrość zarodka.
    4. W tym momencie orientacja zarodka w kosmówce będzie wyraźnie widoczna, a jeśli nie jest zadowalająca, włóż nową rurkę i wybierz zarodek o interesującej orientacji.
  2. Wyrównywanie arkuszy świetlnych
    1. Gdy zarodek znajdzie się na swoim miejscu, ustaw wszystkie ustawienia eksperymentalne - lasery, ścieżkę światła, filtr, rozdzielacz wiązki i kamerę.
    2. Podczas ustawiania parametrów akwizycji, jeśli oprogramowanie udostępnia opcję skanowania przestawnego, wybierz ją. Skanowanie obrotowe zmniejszy efekt cieniowania wyłaniający się z arkusza światła, gdy napotka on jakiekolwiek struktury lub nieprzezroczyste obszary w próbce.
    3. Rozpocznij skanowanie próbki na żywo. Ustaw rozmiar bitu, moc lasera i żądane powiększenie, które określą grubość arkusza świetlnego, a tym samym rozdzielczość osiową.
    4. Aby wyrównać arkusze świetlne, najpierw przełącz się na oświetlenie jednostronne i zmieniaj kolejno ustawienia dwóch arkuszy świetlnych (lewej i prawej). Cyfrowe powiększenie obszaru próbki, w którym widoczne są wyraźne struktury będące przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: W tym badaniu do wyrównania arkuszy użyto markera jądrowego (H2A-mCherry) lub membranowego (Utr-GFP). Zalecana jest zmiana ustawień arkusza świetlnego w oprogramowaniu, aby uzyskać najostrzejszy kontrast sygnału w obszarze zainteresowania.
    5. Gdy dwie arkusze świetlne zostaną indywidualnie zoptymalizowane w celu uzyskania najlepszego sygnału, włącz obie arkusze świetlne. Wykonaj drugą rundę wyrównywania i upewnij się, że migotanie jest minimalne, co wskazuje na dość dobre wyrównanie dwóch arkuszy.
    6. Po zakończeniu wyrównania aktywuj opcję automatycznego łączenia obrazów generowanych przez dwa arkusze, jeśli zezwala na to oprogramowanie. Alternatywnie, można najpierw zgrubnie wyrównać arkusze światła, skupiając się na koralikach wokół próbki, a następnie dostroić wyrównanie, korzystając z informacji z próbki.
      UWAGA: Podczas obrazowania za pomocą dwóch fluoroforów (takich jak markery jądrowe i błonowe), optymalne wyrównanie jest zwykle nieznacznie różne dla tych dwóch struktur. W tym scenariuszu wybierz ustawienie na podstawie ograniczeń dotyczących przetwarzania podrzędnego. Na przykład, jeśli granice komórek mają być segmentowane, co jest stosunkowo bardziej intensywne w przetwarzaniu, wyrównaj arkusze świetlne na podstawie znacznika membranowego.
  3. Konfigurowanie obrazowania wielowidokowego
    1. Po wyrównaniu arkuszy świetlnych aktywuj opcje wykonywania obrazowania z-stack oraz multiview.
    2. Rozpocznij skanowanie na żywo i nawiguj za pomocą nawigatora próbek, aby wybrać pierwszy widok. W tym widoku ustaw interwał wycinków, a następnie pierwszy i ostatni wycinek stosu z. Dodaj tę pozycję w oknie dialogowym multiwidoku, w którym są zapisywane informacje o położeniu i stosie z dla tego widoku.
    3. Przejdź do następnego widoku, zmieniając kąt w nawigatorze próbek. Skonfiguruj stos osi Z dla drugiego widoku i dodaj informacje w oknie dialogowym multiwidoku.
    4. Powtórz to samo dla dodatkowych widoków.
      UWAGA: Upewnij się, że w każdym widoku jest obrazowana pewna minimalna liczba plasterków, tak aby różne widoki wystarczająco się nakładały, co ostatecznie pomoże w rejestrowaniu widoków podczas przetwarzania. Minimalna liczba plasterków będzie zależeć od współczynnika powiększenia, a także od liczby kątów wybranych do obrazowania.
    5. Po ustawieniu wszystkich widoków, zapisz te informacje w pliku tekstowym (na przykład o nazwie "pozycje zarodka"), który będzie zawierał informacje o stosie z, współrzędne (x, y, z) rury, a także specyfikacje kąta dla każdego widoku. Po zapisaniu wyczyść wszystkie pozycje w oknie dialogowym multiwidoku.
    6. Ponieważ obrazowanie odbywa się z nienaruszoną kosmówką, która jest stosunkowo duża, nie jest możliwe oglądanie koralików w rurce przy tych samych ustawieniach. W związku z tym informacje o stopkach muszą być pozyskiwane z innego miejsca w tubie. Aby to zrobić, przetłumacz na inną współrzędną "y" z dala od zarodka, gdzie widoczne są koraliki. Dodaj tę pozycję do okna dialogowego multiview i zapisz ją w pliku tekstowym (na przykład o nazwie 'beads-y').
      UWAGA: Zobrazuj koraliki jak najbliżej próbki zarodka, aby zminimalizować skutki ewentualnych różnic w krzywiźnie rurki w obu pozycjach. Dlatego, jeśli w probówce zamontowanych jest wiele zarodków, ważne jest, aby pozostawić trochę agarozy między probówkami, aby zobrazować koraliki (jak wspomniano w kroku 1.3.7).
    7. Przejdź do folderu, w którym zapisane są pliki tekstowe i zduplikuj plik "pozycje zarodków" do nowego pliku o nazwie "pozycje-koralików". Zastąp współrzędną y dla wszystkich widoków w pliku 'beads-positions' współrzędną y z pliku 'beads-y'. Zapewni to, że koraliki będą obrazowane z tą samą liczbą widoków, stosów z i współrzędnych x, ale w innej pozycji y w tubie.
    8. Wróć do oprogramowania do obrazowania i załaduj plik "pozycje ściegów" do oprogramowania. Jeśli opcja szeregów czasowych jest aktywna, wybierz jeden cykl i rozpocznij eksperyment. Zapisuj obrazy koralików jako "koraliki", które będą używane do rejestrowania różnych widoków podczas przetwarzania obrazu.
    9. Po wykonaniu zdjęć koralików wyczyść pozycje i załaduj początkowy plik "pozycje zarodków" do oprogramowania. Ustaw żądaną liczbę cykli z odpowiednim odstępem czasu i rozpocznij eksperyment.

3. Analiza obrazu wielowidokowego

UWAGA: Do łączenia obrazów multiview używana jest wtyczka FIJI, BigStitcher, która jest najnowszą wersją wtyczki Multiview Reconstruction10,17,18. Wtyczkę można zainstalować, dodając wtyczkę BigStitcher w funkcji "Zarządzaj witrynami aktualizacji", do której można uzyskać dostęp w opcji "Aktualizacja" w menu "Pomoc". Po zainstalowaniu wtyczka pojawi się w menu "Wtyczki". Ogólne etapy fuzji są następujące: (1) Zdefiniuj pary pilników .xml/.h5 zarówno dla koralików, jak i zarodków; (2) Zarejestruj wszystkie widoki za pomocą pliku koralików; (3) Funkcja rozproszenia punktu ekstrakcji (PSF) dla koralików, która może być używana do dekonwolucji ( Rysunek 2A); (4) Przenieść informacje o rejestracji i poliestrowych włóknach odcinkowych z pliku koralików do pliku zarodków i rozpocząć dekonwolucję wielowidokową. Większość z tych kroków została wcześniej szczegółowo opisana21, a tutaj opisane są kroki, które są inaczej przetwarzane.

  1. Definiowanie zestawu danych .xml
    1. Zdefiniuj nowy zestaw danych zarówno dla koralików, jak i zarodka, odpowiednio jako "beads.xml" i "embryo.xml", zgodnie z wcześniejszym opisem21.
  2. Wykrywanie i rejestracja za pomocą punktów procentowych
    1. Po pomyślnym wyeksportowaniu pliku beads.xml wybierz widoki, które są wymagane do rejestracji w oknie dialogowym "Multiview Explorer" (Rysunek 2B). Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Wykryj punkty zainteresowania. Postępuj zgodnie z opisem21.
    2. Po wykryciu punktów zainteresowania zaznacz wszystkie widoki, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Zarejestruj przy użyciu punktów zainteresowania. Postępuj zgodnie z opisem21.
    3. Dokładnie sprawdź, czy rejestracja ściegu zadziałała pomyślnie. Po udanej rejestracji nakładające się na siebie koraliki z różnych widoków są nakładane (Rysunek 2C). Aby sprawdzić, jak dokładnie zadziałała pasacja, wybierz dwa kolejne widoki, przejdź do nakładającego się regionu i przełączaj się między tymi dwoma widokami, aby zobaczyć, czy koraliki obrazowane pod różnymi kątami są nałożone. Powtórz tę czynność dla każdego kolejnego widoku.
    4. Jeśli nakładanie się nie jest precyzyjne, ponów próbę rejestracji, zmniejszając wymagane znaczenie dla rejestracji i/lub dopuszczalny błąd nakładania się (określany jako "błąd RANSAC" w oknie dialogowym "Rejestracja").
    5. Po udanej rejestracji kliknij Zapisz w oknie "Multiview Explorer", aby zapisać zaktualizowany plik .xml.
      UWAGA: Zapisz również plik dziennika, ponieważ zawiera on dalsze szczegółowe informacje na temat skuteczności rejestracji. Aby przetłumaczyć informacje rejestracyjne z koralików na zarodek, wykonaj czynności opisane poniżej.
    6. Otwórz plik bead.xml w wybranym edytorze tekstu i skopiuj cały blok w obszarze "ViewRegistrations".
    7. Otwórz embryo.xml i zastąp blok "ViewRegistrations" blokiem skopiowanym z pliku koralików. Jeśli istnieje wiele kanałów, zastąp informacje rejestracyjne dla każdego kanału, jak powyżej. Informacje rejestracyjne można przesłać ręcznie lub za pomocą niestandardowego kodu MATLAB, który można pobrać tutaj: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
    8. Otwórz plik embryo.xml w "BigStitcher" i dokładnie sprawdź, czy rejestracja zadziałała pomyślnie dla zarodka. Powtórz to samo, co w przypadku koralików, sprawdzając nakładanie się interesujących struktur w każdych dwóch kolejnych widokach.
      UWAGA: Czasami rejestracja zarodka może nie być tak pożądana, mimo że koraliki są doskonale zarejestrowane. Jest to możliwe, jeśli występują niewielkie zmiany w krzywiźnie rurki od pozycji, w której koraliki są obrazowane, do pozycji zarodka. Ponadto mogą wystąpić subtelne ruchy zarodka między widokami, ponieważ swobodnie unosi się on w kosmówce. W takim przypadku należy przeprowadzić drugą rundę rejestracji przy użyciu markera jądrowego w zarodku.
    9. Aby to zrobić, otwórz plik embryo.xml w "BigStitcher", kliknij prawym przyciskiem myszy wszystkie widoki, które mają znacznik jądrowy i wybierz Wykryj punkty zainteresowania.
    10. Zmień nazwę punktów procentowych na "jądra" i postępuj zgodnie z krokami wykonywanymi dla koralików.
    11. Ustawiając parametry "Różnicy Gaussa", upewnij się, że większość jąder, jeśli nie wszystkie, zostały wykryte i że nie ma ektopowej detekcji jądra. Następnie kliknij Gotowe.
    12. Następnie zarejestruj te widoki, wybierając opcję Zarejestruj przy użyciu punktów zainteresowania i wybierz opcję Oparty na precyzyjnym deskryptorze (niezmiennym tłumaczeniu). Upewnij się, że wybrana jest opcja "porównaj wszystkie widoki i punkty zainteresowania" i użyj "jąder" jako punktów zainteresowania. Użyj opcji naprawiania pierwszego widoku i nie odwzorowuj z powrotem.
    13. Do rejestracji użyj modelu afinicznego ze sztywną regularyzacją i domyślnymi parametrami we wtyczce.
    14. Ponownie sprawdź powodzenie rejestracji, porównując co dwa kolejne wyświetlenia.
    15. Po udanej rejestracji kliknij Zapisz w oknie "Multiview Explorer", aby zapisać zaktualizowany plik .xml.
    16. Otwórz plik embryo.xml w wybranym edytorze tekstu i skopiuj informacje rejestracyjne ze znaczników jądrowych do innych kanałów.
  3. Ekstrakcja i przypisanie funkcji rozproszenia punktów
    1. Aby przeprowadzić dekonwolucję wielowidokową, należy wyodrębnić PSF systemu obrazowania z zestawu danych zarejestrowanych koralików i zastosować go do pliku zarodków.
    2. Aby uzyskać te informacje, zaznacz wszystkie widoki w pliku ściegu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcje Funkcje rozkładu punktów i Wyodrębnij.
    3. W wyświetlonym oknie dialogowym upewnij się, że zaznaczone są opcje Użyj odpowiednich punktów procentowych i Usuń projekcje minimalnej intensywności z PSF, przejdź do domyślnych rozmiarów PSF i kliknij OK.
      UWAGA: Jeśli wyodrębnianie PSF powiedzie się dla wszystkich widoków, w pliku dziennika zostanie wyświetlony komunikat "Wyodrębnione n/n PSF"
    4. Następnie ponownie zapisz plik .xml. Pojawi się zaznaczone pole wyboru w kolumnie PSF w oknie dialogowym "Multiview Explorer", a folder "psf" zostanie wygenerowany w odpowiednim folderze ze wszystkimi wyodrębnionymi PSF.
    5. Otwórz plik embryo.xml i przypisz plik PSF dla każdego widoku osobno. Kliknij prawym przyciskiem myszy "widok" → kliknij Funkcje rozproszenia punktów → wybierz Przypisz → wybierz Zaawansowane, a następnie Przypisz nowy PSF do wszystkich wybranych widoków. Kliknij Przeglądaj, przejdź do .xml ścieżki pliku i otwórz folder psf.
    6. Wybierz pasujący PSF z odpowiednim identyfikatorem w wybranym widoku i kliknij OK, po czym pole wyboru PSF pojawi się zaznaczone w oknie "Multiview Explorer".
    7. Powtórz ten proces dla wszystkich innych widoków.
  4. Fuzja i dekonwolucja wielu widoków
    1. Po przypisaniu funkcji rozkładu punktów do wszystkich widoków kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Dekonwolucja wielu widoków.
    2. Wybierz obwiednię jako aktualnie wybrane widoki. W przypadku tej pracy dobrze sprawdza się domyślne przyspieszenie OSEM i liczba iteracji.
    3. Zmniejsz próbkowanie obrazów zgodnie z wymaganiami, jeśli wymagane jest szybsze obliczanie lub jeśli pamięć procesora jest ograniczona.
      UWAGA: Jeśli wymagana pamięć RAM przekroczy istniejącą pamięć, w dolnej części okna pojawi się ostrzegawczy komunikat o błędzie w kolorze czerwonym. Nie rozpoczynaj dekonwolucji, jeśli pojawi się to ostrzeżenie, ponieważ wtyczka zatrzyma się i przestanie odpowiadać w pewnym momencie podczas przetwarzania.
    4. Aby ocenić postęp dekonwolucji, sprawdź plik dziennika, który będzie wyświetlał wyniki co 5 iteracji.
    5. Aby zwiększyć szybkość obliczeń, wykonaj dekonwolucję wielu widoków w GPU, jeśli jest wcześniej zainstalowana.
      UWAGA: Pod koniec tego procesu pojawi się okno połączonego obrazu, który można zapisać jako plik tiff.

Wyniki

Precyzyjne orientowanie próbki jest kluczowym elementem efektywnego wykorzystania zestawu do mikroskopii. Jednakże ręczne orientowanie próbek jest często niemożliwe przy użyciu systemu arkusza światła o wielu widokach (multiview light sheet system), ze względu na konieczność przygotowania próbek w probówce. Aby zatem sprawdzić, czy embriony przyjmują w obrębie chorionu stereotypowe pozycje, wykonano obrazowanie embrionów zebrafish w fazie 70% epibolii (około 7 h po zapłodnieniu (hpf)), ponieważ przedmiotem niniejszego badania było obrazowanie time-lapse od gastrulacji do wczesnych stadiów somitycznych. Gdy próbki przygotowywano bezpośrednio przed obrazowaniem w fazie 70% epibolii, embriony nie wykazywały specyficznej orientacji, która byłaby często obserwowana w różnych próbkach. Ponieważ jest to zazwyczaj niepożądane, próbki przygotowywano znacznie przed gastrulacją i przechowywano w probówkach do mikrowirówki w odpowiedniej temperaturze aż do rozpoczęcia obrazowania. W tych warunkach, przy 70% epibolii (N = 3; n = 87 embrionów), orientację embrionów można było sklasyfikować jako: (1) poziomą, gdy oś zwierzęco-roślinna (AV) embrionu była prostopadła do osi podłużnej polimerowej probówki, (2) pionową, gdy oś AV była równoległa do osi podłużnej polimerowej probówki, oraz (3) ukośną, gdy oś AV była pod kątem ostrym (Rycina 3A). Pozycja pozioma była najrzadziej reprezentowana, natomiast pozycje pionowa i ukośna występowały z jednakową częstotliwością (Rycina 4).

Kiedy embriony pozostały w probówkach, były one stabilne w poszczególnych pozycjach aż do etapu 90% epibolii, po którym większość embrionów zmieniła orientację. W związku z tym konieczne było przeprowadzenie drugiej serii dokumentacji orientacji na etapie pączka embriogenezy (około 10 hpf), aby uwzględnić te zmiany. Zostało to wykonane dla niezależnie przygotowanych próbek. W przypadku obrazowania wczesnych etapów somitycznych wcześniej zgłoszono, że idealną orientacją jest taka, w której notochorda embrionu jest prostopadła do długiej osi probówki polimerowej, ponieważ pozwala to na wizualizację wielu bilateralnych somitów formujących się wzdłuż osi15. Gdy próbki przygotowywano przed gastrulacją (N = 3, n = 93 embriony), około 25% embrionów wykazywało taką orientację (Rycina 4) i pozostawały one stabilne w tej orientacji co najmniej do etapu 8 somitów, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami15. Pozostałe embriony wykazywały różne inne orientacje na etapie pączka (sklasyfikowane na Rycina 3B i Rycina 4); jednak wiele z nich zmieniło orientację na poziomą podczas wczesnego formowania somitów. Co ciekawe, podobny odsetek embrionów prezentował orientację poziomą na etapie pączka, niezależnie od tego, czy próbkę przygotowano przed gastrulacją, przy 70% epibolii, czy bezpośrednio przed etapem pączka. Zatem moment przygotowania próbek wydaje się mniej krytyczny dla poziomej orientacji istotnej dla obrazowania etapów somitycznych, w przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano podczas obrazowania przy 70% epibolii.

Zaletą systemu wielowidokowego (multiview) jest możliwość obserwacji tej samej próbki pod wieloma kątami. Jednak w przypadku zarodków zebrafish na wymienionych etapach rozwoju nie jest jasne, ile widoków jest wymaganych do uzyskania rozdzielczości komórkowej w całym zarodku. Aby to scharakteryzować, obrazowano zarodki zebrafish przy użyciu obiektywu 20x/1 NA w ramieniu detekcyjnym z powiększeniem (zoom factor) wynoszącym 1, co odpowiadało grubości arkusza światła 4,57 µm. Przy tych ustawieniach zarodek wypełniał całe pole widzenia kamery sCMOS o rozmiarze piksela 6,5 µm i obszarze 1920 na 1920 pikseli. Mikroiniekcja mRNA dla fluoroforu znakującego histony (H2A-mCherry) do zarodków w stadium jednego komórki, uzyskanych z linii transgenicznej znakującej filamenty aktynowe (Utr-GFP), pozwoliła na wizualizację zarówno jąder komórkowych, jak i błon komórkowych w zarodku. W celu przeprowadzenia fuzji wielowidokowej zarodków przy różnych interwałach kątowych, wykonano akwizycję 360° zarodków podwójnie transgenicznych oraz kulek w probówce w odstępach co 30° (n = 3 zarodki na etapie 70% epibolii; n = 3 zarodki w stadium bud) lub 45° (n = 3 zarodki na etapie 70% epibolii; n = 3 zarodki w stadium bud), wykonując około 100 przekrojów pod każdym kątem z odstępem między przekrojami wynoszącym 2 µm. Poprzez pomijanie naprzemiennych kątów podczas przetwarzania obrazów, akwizycje co 30° i 45° dostarczyły dodatkowo zestawów danych dla kątów 60° i 90°.

Pozyskane obrazy zostały następnie zarejestrowane przy użyciu informacji o koralikach, a szczegóły rejestracji przeniesiono do zestawu danych zarodków, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Pomyślną rejestrację za pomocą wtyczki BigStitcher osiągnięto dla różnych serii akwizycji z wyjątkiem zestawu danych z kąta 90°, co prawdopodobnie wynika z mniejszego pokrycia próbki z każdego kąta. Aby temu zaradzić, obrazy zarodków były pobierane co 90° przy około 400 przekrojach pod każdym kątem i odstępie między przekrojami wynoszącym 2 µm, zarówno w stadium 70% epibolii, jak i w stadium pączka, co pozwoliło na pomyślną rejestrację (n = 3 zarodki dla każdego stadium).

Kolejnym krokiem było przeprowadzenie fuzji wielowidokowej oraz dekonwolucji zarejestrowanych zestawów danych. Proces ten wykonano z 4-krotną podpróbkowaniem (downsampling), aby przyspieszyć obliczenia. Jak widać na reprezentacji jąder z poszczególnych widoków oraz na zrekonstruowanym wielowidokowo embrionie (Rycina 5), poszczególne widoki obejmują mniejszy obszar, co po fuzji pozwoliło uzyskać obraz całego embrionu. Do stworzenia reprezentacji wykorzystano program Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), wtyczkę do programu FIJI, którą można dodać w sekcji „Manage Update Sites” w menu „Help” programu FIJI, a po dodaniu uzyskać do niej dostęp w menu wtyczek. W celu detekcji odpowiednie obrazy przekształcono najpierw do formatu XML/hdf5, a następnie wykonano detekcję jąder przy użyciu wtyczki „Detection” programu Mastodon z detektorem DoG (średnica 6 µm i próg jakości 80).

Spośród różnych obrazów scalonych, zestaw danych 90° wykazał bardzo wysokie tło w głębszych warstwach próbki, co czyni go nieprzydatnym do przeprowadzania jakiejkolwiek kwantyfikacji. Zatem w przeciwieństwie do mniejszych próbek, takich jak embriony Drosophila, które w innych badaniach często obrazowano w odstępach 90°9,22, takiego podejścia nie zaleca się w przypadku obrazowania wczesnych embrionów zebrafish przy użyciu obiektywu 20x/1 NA. Pomiędzy scalonymi zestawami danych 30°, 45° i 60° jakościowo nie stwierdzono istotnych różnic w informacjiach o jądrach (Rycina 6B, górny rząd); jednak drobniejsze struktury, takie jak granice komórek, wydawały się znacznie lepiej rozdzielone w scalonym zestawie danych 30° w porównaniu do pozostałych (Rycina 6C, górny rząd).

Aby potwierdzić tę obserwację, użyto oprogramowania Mastodon do wykrywania jąder komórkowych na obrazach scalonych uzyskanych z obrazowania co 30°, 45° i 60°. Do analizy wybrano trzy obszary na obrazach scalonych, jeden na każdej z głębokości 20 µm (Rysunek 6A), 50 µm i 100 µm od powierzchni embrionu. Aby porównać wydajność detekcji jąder na obrazach, detekcję przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem, stosując identyczne parametry dla obrazów scalonych z różnych interwałów kątowych. We wszystkich analizowanych obszarach każde jądro zostało wykryte niezależnie od tego, czy obrazy scalone uzyskano z obrazowania co 30°, 45° czy 60° (Rysunek 6B, dolny rząd). Zatem struktury kuliste, takie jak jądra komórkowe, można obrazować przy każdym z powyższych interwałów kątowych bez utraty informacji.

Do analizy granic komórek wykorzystano Tissue Analyzer23, wtyczkę do programu FIJI rutynowo stosowaną do segmentacji komórek24,25,26. Podobnie jak w przypadku Mastodon, wtyczkę Tissue Analyzer można dodać w sekcji „Manage Update Sites” w menu „Help” programu FIJI, a po dodaniu uzyskać do niej dostęp w menu wtyczek. Granice komórek segmentowano za pomocą algorytmu watershed z domyślnymi parametrami oraz silnym rozmyciem (strong blur) w zakresie od 1,5 do 2, zależnie od głębokości tkanki, oraz słabym rozmyciem (weak blur) o wartości 1. Parametry te pozostawały stałe we wszystkich analizach, co ułatwiło bezpośrednie porównanie. Podczas ręcznego porównania obrazów po segmentacji z oryginalnymi obrazami wejściowymi zaobserwowano błędy, polegające na tym, że oprogramowanie nie wykryło granicy komórki lub wyznaczyło nieistniejące granice komórek (Rysunek 6C, dolny rząd). Liczbę błędów popełnionych przez wtyczkę Tissue Analyzer znormalizowano do całkowitej liczby wykrytych w danym obszarze wiązań i obliczono jako „błąd segmentacji granic”. Choć błędy te występowały we wszystkich analizowanych obszarach, ich liczba drastycznie wzrosła w obrazach scalonych uzyskanych przy obrazowaniu w odstępach kątowych 45° i 60° w porównaniu do 30° (Rysunek 6D). Wskazuje to, że rozdzielczość w obrazach scalonych pogarszała się wraz ze zwiększaniem odstępu kątowego. Zatem w przypadku segmentacji drobniejszych struktur, takich jak granice komórek, mniejszy odstęp kątowy umożliwia łatwiejszą dalszą obróbkę danych.

Etapy przygotowania i analizy próbek do oczyszczania białek przy użyciu wirówki i mikroskopii.
Rysunek 1: Przygotowanie próbek z wykorzystaniem probówek polimerowych. (A) Za pomocą pęsety pobrano probówkę polimerową z przechowywanych probówek do mikrowirówki. (B) Mocowanie probówki do końcówki mikropipety o objętości 200 µL. (C) Aspiracja embrionów do probówki za pomocą pipety. (D,E) Probówka polimerowa z widocznymi na dnie embrionami w stadium pączkowania. (F) Probówki polimerowe umieszczone na szalce Petriego z medium E3 w celu zestalenia agarozy. (G) Przechowywanie probówek polimerowych w probówce do mikrowirówki wypełnionej medium E3. (H) Złożony uchwyt próbki z zamontowaną probówką polimerową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Potok dekonwolucji wielowidokowej; schemat procesu i wyniki rejestracji w oprogramowaniu do obrazowania.
Rysunek 2: Przebieg analizy obrazów wielowidokowych i rejestracja z wykorzystaniem kulek. (A) Potok analizy obrazów wielowidokowych. (B) Obraz przedstawia okno „Multiview Explorer” w BigStitcher, wtyczce do FIJI, w której każdy widok pojawia się jako pojedynczy wiersz i zawiera informacje o kącie, kanale, rejestracji, punktach zainteresowania oraz PSF. Wszystkie polecenia omówione w protokole pojawiają się po wybraniu widoku i kliknięciu prawym przyciskiem myszy, co przedstawiono w menu rozwijanym. Wybrane widoki można zwizualizować w oknie BigDataViewer, jak pokazano na rysunku. (C) Reprezentatywny obraz kulek przed (lewo) i po rejestracji (prawo) uzyskany z obrazowania w odstępach kątowych 30°. Wszystkie widoki kątowe zostały wybrane i wyświetlone. Paski skali: 75 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Orientacje zarodków w fazie 70% epibolii i w stadium pączka; schemat osi i faz rozwojowych.
Rycina 3: Przegląd domyślnych orientacji zarodków. Reprezentatywne obrazy orientacji, jakie przyjmują zarodki wewnątrz chorionu w fazie 70% epibolii (A) oraz w stadiach pączka (B). Górny rząd w każdym panelu przedstawia obrazy w jasnym polu uzyskane z systemu arkusza świetlnego (light sheet), a dolny rząd przedstawia reprezentatywne schematy. Strzałki w (B) wskazują położenie notochordu, który służył do identyfikacji orientacji. Ap, biegun zwierzęcy; Vp, biegun roślinny; A, przednio; P, tylno. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Procenty orientacji embrionów w 70% epibolii i w stadium pączka; wykres słupkowy; biologia rozwoju.
Rycina 4: Statystyka różnych orientacji embrionów. (A) Skumulowany słupek wskazuje procenty embrionów o określonych orientacjach w 70% epibolii, gdy próbki przygotowano przed gastrulacją. (B) Skumulowane słupki wskazują procenty embrionów o określonych orientacjach w stadium pączka, gdy próbki przygotowano przed gastrulacją (lewo), w 70% epibolii (środek) oraz w stadium pączka (prawo). N – liczba niezależnych miotów, z których pobrano embriony; n – całkowita liczba embrionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wielowidokowe schematy rozkładu 3D jąder komórkowych embrionu, kąty 0°, 60°, 120°, orientacja osi przestrzennych.
Rysunek 5: Reprezentacja jąder z embrionu zrekonstruowanego z wielu widoków. (A)Przedmiotowy Trójwymiarowy wykres punktowy przedstawia jądra wykryte w zarodku zrekonstruowanym z wielu widoków, obrazowanym pod kątem 30̛° przedział kątowy. Każde koło reprezentuje jądro komórkowe, a naniesiono centroidy pozycji jąder. Współrzędne jąder uzyskano za pomocą Mastodon, wtyczki do programu FIJI. (B) trójwymiarowe wykresy punktowe jąder z trzech reprezentatywnych widoków tego samego zarodka – przedstawienia te są 60° osobno. Kolory dla każdego jądra zostały przypisane losowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wieloobrazowe obrazowanie zarodka; jądra komórkowe, detekcja granic (H2A-mCherry, Ut-GFP); kwantyfikacja błędów.
Rysunek 6: Porównanie informacji w skali komórkowej w obrazach scalonych. (A) Obraz po lewej przedstawia ujęcie zrekonstruowanego wieloobrazowo zarodka na głębokości 20 µm od powierzchni. Żółte koło oznacza obszar wykorzystany do dalszej analizy. Paski skali: 50 µm (we wszystkich panelach). (B) Reprezentatywne surowe obrazy jąder komórkowych na głębokości 20 µm od powierzchni zarodka z trzech zestawów danych obrazowanych odpowiednio co 30°, 45° i 60° (góra). Jądra wykryte (na zielono) na tych samych obrazach przez Mastodon, wtyczkę do oprogramowania FIJI (dół). (C) Reprezentatywne surowe obrazy na głębokości 20 µm od powierzchni zarodka z trzech zestawów danych obrazowanych odpowiednio co 30°, 45° i 60°, z zastosowaniem markera aktyny, Utr-GFP (góra). Granice segmentowane przez Tissue Analyzer, wtyczkę do oprogramowania FIJI, przedstawione dla tych samych obrazów (dół). Strzałki wskazują błędy popełnione przez Tissue Analyzer podczas segmentacji granic, gdzie żółta strzałka oznacza brakującą granicę, a biała strzałka oznacza błędnie wykryte granice w miejscach, w których wizualnie nie występują żadne granice. (D) Wykres pudełkowy przedstawia procent błędów popełnionych przez Tissue Analyzer w zrekonstruowanych wieloobrazowo zarodkach obrazowanych co 30°, 45° i 60° na różnych głębokościach. Słupki błędów wskazują 1,5-krotność rozstępu międzykwartylnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ustawienie zarodka we właściwej orientacji w celu zobrazowania obszaru zainteresowania jest jednym z kroków ograniczających szybkość, które często skutkują nieudaną sesją mikroskopową dla użytkownika. Jest to szczególnie widoczne w mikroskopie z wieloma arkuszami świetlnymi, gdzie ręczna manipulacja orientacją jest trudna, ponieważ próbki są osadzone w probówce. Aby pomóc w tym procesie, badanie to przedstawia statystyki dotyczące różnych pozycji, w których zarodek danio pręgowanego zajmuje od 70% epibolii do wczesnych stadiów somitowych w kosmówce, gdy polimerowa probówka z zarodkami jest utrzymywana w pozycji pionowej w probówce mikrowirówkowej.

Przy 70% epibolii zarodki zorientowane pionowo lub poziomo dostarczają uzupełniających informacji o zdarzeniach w całym zarodku. Podczas gdy orientacja pozioma pozwala na wizualizację dynamiki komórkowej w biegunie zwierzęcym, a także dynamiki komórek przechodzących epibolię oglądanych z bieguna roślinnego, orientacja pionowa pozwala na wizualizację grzbietowej i brzusznej strony zarodka, w tym dynamiki komórkowej w organizatorze grzbietowym, internalizacji komórek podczas gastrulacji i przepływów konwergencji-rozciągnięcia. Badanie to pokazuje, że istnieje duże prawdopodobieństwo uzyskania zarodka w orientacji pionowej wyłącznie przypadkowo, jeśli próbki są przygotowywane na kilka godzin przed obrazowaniem; Jednak orientacja pozioma wydaje się być znacznie mniej powszechna na tych etapach. W przypadku etapów poprzedzających 70% epibolii zaleca się, aby użytkownicy udokumentowali podobne statystyki orientacji zarodka w kosmówce przed przystąpieniem do obrazowania poklatkowego, ponieważ posiadanie tych informacji z wyprzedzeniem oszczędza czas na dłuższą metę.

Od stadium pączka najlepszą orientacją do obrazowania jest zarodek ustawiony poziomo, ponieważ pozwala to na śledzenie dynamiki komórkowej wzdłuż całej przednio-tylnej osi ciała zarodków15. Uzyskanie zarodka w tej orientacji jest stosunkowo proste, ponieważ około 25% zarodków wpada w tę stabilną pozycję niezależnie od tego, kiedy próbka jest przygotowywana. Ogólnie rzecz biorąc, do obrazowania dowolnego etapu zainteresowania zaleca się przygotowanie około 15 probówek z dwoma do trzech zarodków w każdej probówce, co zapewni wysokie prawdopodobieństwo uzyskania zarodków w pożądanej orientacji, a co za tym idzie, udaną sesję mikroskopową w danym dniu. Ponadto zaleca się, aby jajowody zostały posortowane na około godzinę przed etapem zainteresowania, aby wybrać zarodek o odpowiedniej orientacji do obrazowania poklatkowego.

Po uzyskaniu zarodka w odpowiedniej orientacji ważne jest, aby wziąć pod uwagę liczbę widoków i odstęp kątów między widokami do obrazowania. Zależy to od minimalnej wymaganej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Im więcej kątów, z których obrazowana jest dana struktura lub obszar zarodka, tym lepsza rozdzielczość przestrzenna (jak pokazano na rycinie 6), ale prowadzi to do kompromisu w zakresie rozdzielczości czasowej. W tym protokole, przy systemie z dwoma ramionami oświetleniowymi i jednym dozorowym, obrazowanie dwóch kanałów w pełnym 360° z interwałem kątowym 30° i około 100 z-slice'ami pod każdym kątem z odstępem między warstwami 2 μm, zajęło około 3 minut dla jednego punktu czasowego. Chociaż jest to wystarczające do śledzenia komórek we wczesnych stadiach embrionalnych, jeśli mają zostać uchwycone zdarzenia o szybszej dynamice, należy uzyskać mniejszą liczbę kątów, zapewniając lepszą rozdzielczość czasową, ale z kompromisem w zakresie rozdzielczości przestrzennej, zwłaszcza jeśli drobniejsze struktury, takie jak granice komórek, muszą zostać podzielone na segmenty. Drugą opcją, którą należy rozważyć w celu poprawy rozdzielczości czasowej, jest użycie systemu multiview z dwoma ramionami detekcji, co znacznie zwiększy szybkość akwizycji, jak ostatnio stosowaną do śledzenia ruchów komórek podczas gastrulacji w zarodkach danio pręgowanego16. Ponadto, chociaż w tym protokole przetestowano tylko obiektyw 20x/1 NA, w zależności od obrazowanej próbki, wymaganej rozdzielczości przestrzennej i pola widzenia, należy wziąć pod uwagę właściwy obiektyw. Podsumowując, w oparciu o wymagane dalsze przetwarzanie i kwantyfikację dla danej próbki i pola widzenia, należy starannie dobrać liczbę widoków i przedział kątowy. Jednak do obrazowania całych wczesnych zarodków danio pręgowanego, szczególnie z rozdzielczością w skali komórkowej pod różnymi kątami, obiektyw 20x/1 NA wydaje się być optymalny, ponieważ obiektyw o mniejszym powiększeniu i NA (np. obiektyw 10x/0,5 NA) będzie miał znacznie niższą rozdzielczość, co prawdopodobnie doprowadzi do większej liczby błędów segmentacji, podczas gdy obiektyw o większym powiększeniu i NA nie będzie w stanie objąć całego zarodka w polu widzenia kamery.

W tym badaniu, w celu omówienia strategii montowania i obrazowania, wykorzystano marker aktynowy, który może być używany jako wskaźnik zastępczy do śledzenia granic komórek, oraz marker histonowy, do wykrywania i śledzenia jąder. W rzeczywistości większość wcześniej opublikowanych badań, w których wykorzystano system wielowidokowych arkuszy świetlnych, preferencyjnie używała podobnych markerów 5,7,15,16,27. Głównym powodem wyboru tych markerów jest to, że mikroskopia z wieloma arkuszami świetlnymi jest głównie stosowana do śledzenia dynamiki skali komórkowej (np. kształtu komórki i rearanżacji komórek) zarówno w skali tkankowej, jak i w całym zarodku przez długi czas trwający od kilku godzin do kilku dni. Z drugiej strony, jeśli istnieje potrzeba uzyskania rozdzielczości subkomórkowej, można zastosować inną transgeniczną linię wyznaczającą obszar zainteresowania, ale w tym scenariuszu mikroskop z wieloma arkuszami świetlnymi może nie być najlepszym wyborem instrumentu, a raczej konfokalny, system superrozdzielczy lub nawet mikroskop siatkowy z arkuszami świetlnymi28, 29 może lepiej odpowiadać badanemu problemowi.

Omawiany protokół działa dobrze od gastrulacji do 15-somitowych zarodków daniopręgowanego 30 (około 17 hpf) bez żadnych modyfikacji i chociaż nie został tutaj przetestowany, prawdopodobnie zadziała również w przypadku wcześniejszych zarodków przed etapem gastrulacji. Po przekroczeniu etapu 15-somitowego rozpoczynają się spontaniczne skurcze mięśni30,31, które można stłumić poprzez dodanie trykainy, środka znieczulającego, zarówno w probówce, jak i w komorze próbki. Ponadto przy około 18 hpf odchylenie ogona od żółtka zaczyna się30, co odsuwa zarodek od pola widzenia. Aby się tym zająć, należy zastosować algorytm śledzący, który śledzi wydłużający się koniec, aby utrzymać zarodek w ostrości32. Co więcej, w przypadku obrazowania zarodków w późniejszym stadium, gdy są one pozbawione kosmówki, na przykład w celu śledzenia rozwoju neuronalnego, należy zastosować alternatywną strategię montowania, tak jak ostatnio wykonano33.

W przypadku obrazowania zarodków danio pręgowanego z nienaruszoną kosmówką uchwycenie zarówno koralików, które działają jako znaczniki rejestracyjne, jak i zarodka w tym samym polu widzenia nie jest możliwe przy użyciu obiektywu 20x/1 NA. Badanie to stanowi prostą alternatywę polegającą na zarejestrowaniu różnych widoków z informacjami z koralików, które są obecne powyżej lub poniżej próbki, a następnie przeniesieniu rejestracji z koralików na zarodek podczas przetwarzania. Po zarejestrowaniu próbki zarodka w ten sposób można przeprowadzić drugą rundę rejestracji z wykorzystaniem jąder jako markerów rejestracyjnych, które są obecne w próbce, w celu dalszego dostrojenia początkowej rejestracji. Podczas wykonywania obrazowania poklatkowego informacje o jądrach mogą być z kolei wykorzystane do rejestracji kolejnych punktów czasowych, jak to opisano wcześniej21. Jedną z alternatyw dla tego protokołu jest rezygnacja z koralików i zamiast tego wykorzystanie informacji o jądrach do początkowej rejestracji. Jednak rejestracja często się nie powiodła (nie pokazano tutaj) we wtyczce BigStitcher, prawdopodobnie z powodu kombinacji wielu jąder, które nie zostały wykryte głębiej w zarodku podczas przetwarzania, a także z powodu stosunkowo mniejszej liczby jąder, które są obecne w zarodku, gdy patrzy się na nie pod pewnymi kątami (na przykład, gdy ogląda się je brzusznie w późnych stadiach epibolii).

W tym protokole, ponieważ informacje o koralikach z góry lub z dołu próbki są wykorzystywane do rejestracji i nie ma potrzeby obrazowania koralików w tym samym widoku, co obrazowanie próbki, można użyć tego protokołu do obrazowania tylko określonych obszarów zainteresowania, ale w dużym powiększeniu pod różnymi kątami, a nie całego zarodka. Co więcej, łatwo jest dostosować ten protokół do obrazowania wielu próbek ułożonych pionowo w probówce, wykorzystując informacje o kulkach spomiędzy próbek do rejestracji.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Kalidasowi Kohale'owi i jego zespołowi za utrzymanie obiektu rybackiego oraz KV Boby za utrzymanie mikroskopu z blachą świetlną. SRN przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej (DAE), rządu Indii (nr identyfikacyjny projektu. RTI4003, DAE OM nr 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 z dnia 11.02.2020 r.), program Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) oraz grant badawczy dla start-upów Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SRG/2023/001716).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigma-AldrichA9414
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-Aldrich12022
FIJIWersja: ImageJ 1.54f
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany karboksylanem, czerwień fluorescencyjna, 0,5 μ m średnia wielkość cząstek, zawiesina wodnaSigma-AldrichL3280
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiThermoFischer ScientificAM1340Do transkrypcji in vitro plazmidu H2A-mCherry
Potassium ChhlorideSigma-AldrichP9541
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP0662
Oplot ochronny PTFE AWG 15L - 1,58 mm średnica wewnętrzna x 0,15 mm ścianka +/-0,05 Innowacje Adtech w zakresie fluoroplastówSTW15Rurki PTFE
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-Aldrich71640
Myjka ultradźwiękowaLabmanLMUC3Ultradźwiękowiec
Zeiss LightSheet 7 SystemZeiss

Bibliografia

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  3. Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  4. Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168(2013).
  5. Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).
  6. Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
  7. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  8. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  9. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
  10. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
  11. Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  12. Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  14. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119(2014).
  15. Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
  16. Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
  19. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  21. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966(2016).
  22. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  23. Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
  24. Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519(2023).
  25. Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
  26. Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154(2023).
  27. Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).
  28. Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  29. York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).
  30. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  31. Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).
  32. Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , 13:RP93764 (2024).
  33. Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie wieloperspektywicznemonta pr bekobrazowanie ywych kom rekrozw j zarodkowyrotacja pr bekanaliza ilo ciowarozdzielczo kom rkowarejestracja obrazu
Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.