Artykuł metodologiczny

Utrzymanie laboratoryjne muchówki dolnej Bradysia (Sciara) coprophila: nowy/stary wyłaniający się organizm modelowy

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66751

⸱

19 kwietnia 2024

1Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine, Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia laboratoryjne utrzymanie (w tym krycie i karmienie) muchówki niższej Bradysia (Sciara) coprophila.

Streszczenie

Laboratoryjne zapasy muchówki niższej, Bradysia (Sciara) coprophila, są utrzymywane od ponad stu lat. Przedstawiono tutaj protokoły utrzymania laboratoryjnego B. coprophila. Protokoły te będą przydatne dla szybko rosnącej liczby laboratoriów badających B. coprophila w celu wykorzystania jego unikalnych cech biologicznych, które obejmują (1) wrzeciono monopolarne w mejozie męskiej I; (2) brak dysjunkcji diady X w męskiej mejozie II; (3) imprinting chromosomów w celu odróżnienia homologów matczynych od ojcowskich; (4) chromosomy ograniczone linią zarodkową (L); (5) eliminacja chromosomów (chromosomy ojcowskie w mejozie męskiej I; jeden do dwóch chromosomów X we wczesnych zarodkach; chromosomy L z somy we wczesnych zarodkach); (6) determinacja płci przez matkę (brak chromosomu Y); oraz (7) regulowana rozwojowo amplifikacja DNA w loci zaciągnięcia DNA w chromosomach politenowych gruczołów ślinowych larw.

Teraz można badać te wiele unikalnych cech mechaniki chromosomów, korzystając z najnowszych osiągnięć w sekwencjonowaniu i składaniu genomu B. coprophila oraz rozwoju metodologii transformacji dla inżynierii genomowej. Rosnąca społeczność naukowa, która wykorzystuje B. coprophila do badań, skorzysta z opisanych tutaj protokołów krycia much (markery fenotypowe dla matek, które będą miały tylko synów lub tylko córki; szczegóły masowego krycia do eksperymentów biochemicznych), sprawdzania wylęgu zarodka, karmienia larw i innych komentarzy na temat jego hodowli.

Wprowadzenie

Pełne zrozumienie zasad biologicznych wymaga badania wielu różnorodnych organizmów obejmujących Drzewo Życia. Chociaż do końca XIX wieku opisano szeroki zakres organizmówth wieku, do połowy XXth przez stulecie badania eksperymentalne ograniczały się do garstki, nie więcej niż tuzina organizmów modelowych. Wraz z nadejściem ery genomiki i dążeniem do zsekwencjonowania genomów wszystkich gatunków w Drzewie Życia1jesteśmy obecnie w stanie poszerzyć zakres organizmów wykorzystywanych w eksperymentach laboratoryjnych i w pełni wykorzystać korzyści płynące z ich różnorodności. Warunkiem koniecznym tak szerokiego wprowadzenia nowych organizmów modelowych do badań jest możliwość ich utrzymania w warunkach laboratoryjnych. W niniejszym opracowaniu opisano protokoły hodowli jednego z takich nowo wprowadzonych/ponownie odkrytych organizmów modelowych.

Większość życia zwierzęcego na Ziemi stanowią cztery nadrzędy owadów2. Wśród owadów istnieje około 158 000 gatunków Diptera (muchowców)3, z czego około 3000 gatunków należy do rodziny Sciaridae (ciemnice)4. Muszka owocowa Drosophila jest najlepiej zbadanym przedstawicielem muchowców. Niższy muchowiec (Nematocera), Bradysia (wcześniej nazywany Sciara) coprophila, oddzielił się 200 milionów lat temu od Drosophila, która jest muchowcem „wyższym” (Brachycera). W związku z tym B. coprophila znajduje się w korzystnej pozycji taksonomicznej do badań porównawczych z D. melanogaster (Rycina 1). Co więcej, B. coprophila posiada wiele unikalnych cech biologicznych, które same w sobie są warte badań5,6,7. Wiele z tych cech narusza zasadę stałości DNA, według której wszystkie komórki organizmu mają taką samą zawartość DNA. U B. coprophila (i) genom ojcowski jest eliminowany na wrzecionie jedbiegunowym podczas pierwszej mejozy u samców; (ii) występuje niepodział dyady X podczas drugiej mejozy u samców; (iii) chromosomy ograniczone do linii zarodkowej (L) są eliminowane z somy; oraz (iv) jeden lub dwa chromosomy X są eliminowane we wczesnym embrionie w zależności od płci osobnika. Imprinting chromosomowy służący odróżnieniu homologów macierzystych od ojcowskich został po raz pierwszy odkryty u B. coprophila i bierze udział w wielu z tych zdarzeń eliminacji chromosomów. Oprócz eliminacji chromosomów, inne odstępstwo od stałości DNA zachodzi poprzez regulowaną rozwojowo, specyficzną dla locus amplifikację DNA w locus „puff” w politennych chromosomach ślinianek larwalnych. Badania nad tymi unikalnymi cechami wymagają utrzymania B.coprophila w warunkach laboratoryjnych; szczegóły dotyczące ich hodowli zostały przedstawione tutaj, aby ułatwić prowadzenie takich badań.

Schemat drzewa filogenetycznego owadów przedstawiający relacje między Diptera a Hymenoptera oraz gałęzie ewolucyjne.
Rysunek 1: Filogeneza Bradysia (Sciara) coprophila. Popularne organizmy modelowe zaznaczono niebieską czcionką, a ich rzędy taksonomiczne czerwoną czcionką. Bradysia i inne ziemiórki z rodziny Sciaridae, a także komary, to muchówki z grupy dipterów niższych (dawniej podrząd Nematocera), natomiast gatunki Drosophila to muchówki z grupy dipterów wyższych (podrząd: Brachysera). Informacje po lewej stronie rysunku pochodzą z pracy Misof i wsp.33; informacje po prawej stronie pochodzą z prac Bertone i wsp.34 oraz Wiegmann i wsp.2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wcześniej rodzaj Sciara posiadał największą liczbę gatunków (700) spośród wszystkich eukariotów, co skłoniło Steffana do ich podziału8. Następnie Shin zaproponował podział rodziny Sciaridae na podrodzinę Sciarinae (obejmującą sześć rodzajów, w tym Sciara, Trichosia i Leptosciarella), podrodzinę Megalosphyinae (w tym rodzaj Bradysia) oraz trzy inne grupy (w tym Pseudolycoriella)9. Filogeneza Sciaridae była w ostatnich latach dalej badana przez kilka grup9,10,11. W ciągu ostatnich kilku dekad zmieniły się nazwy wielu organizmów z rodziny Sciaridae12. Chociaż większość literatury z okresu ponad stu lat odnosi się do badanego przez nas organizmu jako Sciara coprophila, jego obecna nazwa taksonomiczna to Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola i inne synonimy)10. Występują one na całym świecie i są powszechnie znane jako ziemiórki, ponieważ żywią się grzybami i innymi grzybniami. Po raz pierwszy zostały opisane w 1804 roku przez Meigena13 w Europie, a następnie przez Johannsena14,15 w Ameryce Północnej. B. coprophila została zebrana w Cold Spring Harbor Laboratory, a populacje laboratoryjne zostały założone przez Charlesa Metza na początku XX wieku, gdy był on doktorantem na Uniwersytecie Columbia u Thomasa Hunt Morgana. Tym samym obecne populacje odzwierciedlają wiek inbredu. Podobnie biologia B. coprophila została dalej wyjaśniona dzięki dziesięcioleciom badań cytogenetycznych prowadzonych przez Helen Crouse (która przygotowywała doktorat pod kierunkiem Barbary McClintock).

W latach 30. XX wieku Bradysia (Sciara) konkurowała z Drosophila melanogaster jako system modelowy w badaniach genetycznych. Pomimo wielu unikalnych cech biologicznych, B. coprophila została wyparta przez D. melanogaster jako popularny organizm modelowy, ponieważ do badań genetycznych potrzebne były mutacje fenotypowe indukowane promieniowaniem, które łatwiej było uzyskać u tej drugiej, mimo że B. coprophila jest tylko nieznacznie bardziej odporna na promieniowanie gamma niż D. melanogaster16. W nowoczesnej erze genomiki nie jest to już problemem. Ponieważ niedawno udostępniono sekwencję genomu17,18,19 (Urban, Gerbi i Spradling, dane nie pokazane) oraz metody transformacji20,21 (Yamamoto i Gerbi, dane nie pokazane) dla B. coprophila, nadszedł czas, aby wykorzystać ją jako nowy/stary wyłaniający się system modelowy, o czym świadczy rosnąca społeczność naukowców, którzy przyjęli ją w swoich badaniach. Niniejszy artykuł opisuje procedury dotyczące jej utrzymania w warunkach laboratoryjnych.

B. coprophila nie posiada chromosomu Y, a płeć potomstwa jest determinowana przez matkę. Samice posiadające chromosom X' („X-prime”) z długą inwersją paracentryczną będą miały tylko córki, podczas gdy samice homozygotyczne pod kątem standardowego (nieodwróconego) chromosomu X będą miały tylko synów5 (Rycina 2). Informacje sekwencyjne są dostępne dla chromosomu X'19, jednak mechanizm molekularny, w jaki sposób chromosom X' determinuje żeńską płeć potomstwa, pozostaje do wyjaśnienia. Samce nigdy nie posiadają chromosomu X', a po zapłodnieniu samice są X'X (heterozygotyczne pod kątem X') lub XX. Dorosłe samice X'X można odróżnić od samic XX za pomocą markerów fenotypowych na skrzydłach (Rycina 3). Samice X'X (które będą miały tylko córki) można rozpoznać po dominującym markerze skrzydłowym Wavy (W) na X' (jak w linii HoLo2)22. Alternatywnie, samice XX (które będą miały tylko synów) można rozpoznać po recesywnym markerze skrzydłowym petite (p) na X, jak w linii 91S23. W tym przypadku samice X'Xp będą miały skrzydła o pełnej długości (nie petite) i będą miały tylko córki. Linia 6980 niesie recesywny marker na chromosomie X dla spuchniętych (sw) żyłek24, a także dominujący marker Wavy na X', co umożliwia zastosowanie dwóch markerów do selekcji w krzyżówkach. Stopień ekspresji Wavy może być zmienny i wydaje się słabszy w przepełnionych fiolkach, gdzie dostępność pokarmu jest ograniczona, lub gdy temperatura staje się zbyt wysoka. Fenotyp skrzydła Wavy jest wyjątkowo silny, jeśli larwy są przechowywane w chłodni (4°-8 °C) zamiast w zwykłej temperaturze 21 °C. Chociaż recesywny marker skrzydła petite nie jest zmienny i jest bardzo łatwy do zidentyfikowania, linie 91S są stosowane rzadziej, ponieważ są mniej zdrowe niż linia HoLo2. Schematy kojarzenia B. coprophila są tutaj przedstawione (Rycina 2) i szczegółowo opisane dla linii HoLo2, 7298 i W14 (Plik uzupełniający 1), linii 91S (Plik uzupełniający 1), linii 6980 (Plik uzupełniający 1) oraz linii z translokacją (Plik uzupełniający 1). Linie z translokacją nie istnieją już obecnie; były to translokacje wzajemne heterochromomerów (H1, H2 i H3) na krótkim ramieniu X, który zawiera geny rybosomalnego RNA25,26,27.

Schemat dziedziczenia genetycznego; cechy sprzężone z płcią; formowanie gamet; rozwój zygoty; chromosom X.
Rysunek 2: Schemat krzyżowania B. coprophila. Organizm ten nie posiada chromosomu Y (soma samca posiada pojedynczy chromosom X); matki determinują płeć swojego potomstwa. Matki XX mają tylko synów, a samice X'X mają tylko córki. Chromosom X' wykazuje długą inwersję paracentryczną w porównaniu z chromosomem X. Linia ojcowskia lub matczyna chromosomu X (lub X') jest oznaczona na tym rysunku odpowiednio kolorem niebieskim lub czerwonym. Plemniki są haploidalne w odniesieniu do autosomów, lecz posiadają dwie kopie chromosomu X na skutek niedzielenia się w mejozie II. Linia somatyczna wczesnych embrionów eliminuje jedną lub dwie kopie pochodzącego od ojca chromosomu X, w zależności od tego, czy będą one samicami czy samcami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie morfologii skrzydeł owadów; adnotacje cech; obraz mikroskopowy, badanie biologiczne.
Rysunek 3Fenotypy skrzydeł u B. coprophila. Przedstawiono dorosłe samice much o różnych fenotypach skrzydeł: (A) proskrzydłe (XX), (B) Faliste skrzydła (X'WX), (C) ekstremalnie pofalowane skrzydła (X'WX) fenotyp o pomarszczonym wyglądzie po przechowywaniu larw w chłodnim, (D) małe skrzydło (XpXp), które przypomina skrzydło westygialne, (E) proste skrzydło z typem dzikim (XX) i nieopuchniętymi żyłkami, (F) proste skrzydło z nabrzmiałymi żyłkami (XswXsw), w którym małe pęcherzyki (czarne strzałki) pojawiają się na górnej krawędzi skrzydła i/lub w pobliżu wierzchołka obu skrzydeł, (Gekstremalny przykład postaci „swollen”, w której pęcherz (biała strzałka) występuje na jednym lub obu skrzydłach. Samce nie posiadają chromosomu X' i w związku z tym nigdy nie wykazują fenotypu „Wavy”, jednak w linii 91S lub 6980 posiadają odpowiednio skrzydła typu „petite” lub „swollen”. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Celem utrzymania populacji jest przeprowadzanie krzyżówek w taki sposób, aby połowa z nich pochodziła od matek produkujących osobniki żeńskie, a druga połowa od matek produkujących osobniki męskie, co pozwala na uzyskanie równej liczby dorosłych samic i samców w kolejnym pokoleniu do dalszych krzyżówek. Wymaga to jednak planowania, ponieważ cykl życiowy samców jest krótszy niż samic, a dorosłe samce wykluwają się nawet tydzień przed dorosłymi samicami. Natura kompensuje tę asynchronię między płciami poprzez to, że embriony samców wykluwają się jako larwy 1-2 dni po larwach samic z krzyżówki przeprowadzonej w tym samym terminie. Aby jednak zapewnić dostępność dorosłych samców i samic w tym samym czasie do krzyżówek laboratoryjnych, rozwój samic można nieco przyspieszyć, pozostawiając fiolki z larwami samic w temperaturze pokojowej zamiast w 21 °C lub umieszczając fiolki z larwami samców w nieco niższych temperaturach (np. 16 °C). Innym, bardziej niezawodnym sposobem jest przeprowadzanie krzyżówek z matkami produkującymi samice w poniedziałek, a krzyżówek z matkami produkującymi samców w piątek tego samego tygodnia. Najprostsza metoda, którą stosujemy, polega na przeprowadzaniu krzyżówek z matkami produkującymi samice i samców w tym samym dniu każdego tygodnia oraz powtarzaniu tych krzyżówek w tym samym dniu w każdym kolejnym tygodniu. W tym podejściu dorosłe samice z krzyżówki z tygodnia 1 mogą być kojone z dorosłymi samcami, które wykluły się z krzyżówki z tygodnia 2.

Cykl życiowy samic B. coprophila trwa 5 tygodni w temperaturze 21 °C (Tabela 1). Długość ich cyklu życiowego jest nieco większa w niższych temperaturach lub w przypadku niedożywienia. Cykl życiowy samców B. coprophila trwa ok. 4-4,5 tygodnia, ponieważ przechodzą one w stadium poczwarki 0,5-1 tydzień przed samicami. Koniec każdego stadium larwalnego jest oznaczony zrzuceniem kutykuli, co jest wywoływane przez gwałtowny wzrost poziomu hormonu steroidowego ecdysonu. W przeciwieństwie do D. melanogaster, która ma trzy stadia larwalne, B. coprophila ma cztery stadia larwalne.

Stadium rozwojudni po kopulacji (dpm)Długość etapu (dni)
Zniesione jajo1-2
Zarodek1-2 do 7-8~7 dni
Larwa 
I, II i III stadium larwalne7-8 do 16-19~10
4. stadium larwalne przed pojawieniem się plamek ocznych16-19 do 21-245
stadium plamek ocznych czwartego przyrzutka larwalnego21-24 do 25-284
poczwarka 25-28 do 30-335
Dorosłyprzeżywa 1–2 dni w temperaturze 21 °C jeśli zapłodnione lub żyje 2–3 tygodnie w temperaturze 16 °C jeżeli nie były kopulowane. 

Tabela 1: Cykl życiowy samicy B. coprophila w temperaturze 21 °C.

B. coprophila można hodować w temperaturze od 15 °C do 25 °C, przy czym w niższych temperaturach rozwój postępuje wolniej. Owad ten preferuje wilgotne środowisko (występuje m.in. w glebie roślin doniczkowych lub w grzybowniach), dlatego w inkubatorze umieszczamy zlewkę z wodą dejonizowaną. B. coprophila mogą być utrzymywane w temperaturze pokojowej w metalowej puszce na chleb z luźno dopasowaną pokrywką i zawierającej zlewkę z wodą, jednak w temperaturze 37 °C28 ulegają one szokowi termicznemu, co stanowi zagrożenie w gorącym klimacie. Michael Ashburner i inni próbowali z niewielkim sukcesem przechowywać D. melanogaster w chłodzie, aby skrócić czas potrzebny na utrzymanie populacji. Przeciwnie, istotną zaletą B. coprophila jest to, że fiolki z larwami w średnim stadium rozwoju mogą być przechowywane do 3 miesięcy na otwartej półce w chłodni (4-8 °C) przy minimalnej opiece ograniczającej się do karmienia raz w miesiącu. W niskich temperaturach rozwijają się one niezwykle powoli aż do stadium poczwarki i wykluwają się jako płodne osobniki dorosłe po przeniesieniu fiolek z powrotem do temperatury 21 °C. Prawdopodobnie naśladuje to ich przezimowanie w naturze. To indukowane zimnem zahamowanie rozwoju może być porównywalne z tym obserwowanym po naświetlaniu larw B. coprophila w średnim stadium rozwoju promieniowaniem gamma16, jednak zahamowanie rozwoju nie występuje u larw w późnym stadium, które przekroczyły punkt krytyczny dla normalnego przebiegu rozwoju.

Protokół

Opisane tutaj protokoły reprezentują stuletnie doświadczenie z centrów magazynowych Bradysia (Sciara), nadzorowane kolejno przez Charlesa Metza, Helen Crouse i Susan Gerbi, a także wkład innych osób.

1. Krzyżówki godowe

  1. Należy użyć jednej dorosłej samicy i dwóch dorosłych samców na szklaną fiolkę o średnicy 28 mm. Po osiągnięciu 100% sukcesu w rozpoznawaniu fenotypów skrzydeł u matek, które będą miały tylko córki lub synów, użyj dwóch samic i dwóch samców na fiolkę, aby zwiększyć liczbę larw / fiolkę. Dodaj samice do każdej fiolki przed dodaniem samców, którzy budzą się szybciej po znieczuleniu niż samice.
    UWAGA: Poniższy opis zakłada, że masz CO2 ; Alternatywnie eter może być użyty do znieczulenia dorosłych much.
  2. Jeśli używasz eteru do znieczulenia dorosłych muszek, przyklej podkładkę ze złożonymi chusteczkami laboratoryjnymi (np. chusteczkami kimwicy) do wewnętrznej strony okrągłej szklanej pokrywki słoika Coplin i użyj zakraplacza, aby przenieść trochę eteru z butelki, aby zwilżyć laboratoryjną podkładkę do chusteczek (ale nie nasyconą i tak mokrą, że płyn eterowy spadnie z niej i grozi utopieniem much). W kroku 1.6 poniżej, umieść zwilżoną podkładkę eterową na wierzchu otwartej fiolki na ~1 minutę, aż dorośli przestaną się poruszać. Po przeniesieniu dorosłych osobników na białą płytkę ceramiczną (używaną zamiast białej podkładki na muchy), okresowo (gdy nogi much zaczynają drgać) trzymaj podkładkę, która została świeżo zwilżona eterem, nad (nie dotykając) much na talerzu przez ~1 min.
    UWAGA: Eter jest łatwopalny i powinien być przechowywany w okapie wentylacyjnym, a nie w lodówce.
  3. Ułóż w zasięgu ręki tacę z fiolkami dorosłych samic, tacę z dorosłymi samcami oraz tacę z pustymi fiolkami zawierającymi 2,2% (wag./obj.) agar. Na stole laboratoryjnym umieść tabliczki z informacją "samica" lub "samiec" oraz fenotyp skrzydeł matki, tak aby fiolka z dorosłymi osobnikami wybranymi do krzyżowania została umieszczona we właściwej grupie, gdzie wszystkie fiolki w jednej grupie będą miały tylko męskie potomstwo, a wszystkie fiolki w drugiej grupie będą miały tylko żeńskie potomstwo.
    UWAGA: Upewnij się, że w fiolce nie znajdują się kropelki kondensatu, ponieważ dorosłe osobniki przykleją się do kropel. Jeśli fiolki były przechowywane w plastikowym pudełku, przed użyciem należy je umieścić na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić odparowanie kondensatu.
  4. Włącz gaz CO2 i lampę mikroskopu preparacyjnego.
    UWAGA: Preferowane jest źródło światła ze światłowodami, ponieważ emituje mniej ciepła, co powoduje, że znieczulone muchy szybciej się budzą.
  5. Energicznie postukać w fiolkę z dorosłymi osobnikami w gumową podkładkę, tak aby dorosłe osobniki opadły na dno fiolki i wyjąć zatyczkę; włożyć dyszę pistoletu CO2 i ponownie włożyć korek.
  6. Nacisnąć spust dyszy, aby CO2 przepływał do fiolki przez ~1 minutę w celu znieczulenia dorosłych.
  7. Postaw stopę na pedale nożnym, aby CO2 spływał na białą podkładkę przeciw muchom, a nie na dyszę pistoletu. Trzymaj pedał nożny wciśnięty przez cały czas, gdy muchy znajdują się na białej podkładce przeciw muchom (lub z przerwami wciskaj pedał nożny, gdy nogi much zaczynają drgać).
  8. Wyjąć dyszę i zatyczkę z fiolki i odwrócić fiolkę na białej panewce pod mikroskopem preparacyjnym
    9. .
  9. Postukać dnem odwróconej fiolki o mikroskop tak, aby dorosłe osobniki spadły z fiolki na białą poduszkę na muchy.
  10. Wybierz najgrubsze dorosłe osobniki (ostatnio zamknięte białymi brzuchami) i użyj kleszczy z cienką końcówką, aby delikatnie podnieść dorosłego za środkową lub tylną nogę. Nie uszkadzaj przednich nóg, które są używane do tańca godowego. Nie należy używać dorosłych osobników, które właśnie się zamknęły i których ciała są całkowicie białe i nie stały się jeszcze czarne, ponieważ ich skrzydła będą krótkie i nie w pełni rozwinięte, tak że nie będzie można ocenić fenotypu skrzydeł. Dorośli z szczuplejszymi brzuchami mogą być nadal używani, chociaż mają zmniejszoną płodność. Nie używaj chudych dorosłych, których skrzydła są uniesione pionowo od ciała, ponieważ są martwe.
  11. Drugą ręką wyjąć zatyczkę z fiolki z agarem o stężeniu 2,2% (wag./obj.). Trzymając rękę trzymającą kleszcze z osobą dorosłą, energicznie postukaj kleszczami o górną wewnętrzną ściankę fiolki, tak aby osoba dorosła upadła na dno fiolki. Włożyć zatyczkę do fiolki.
  12. Powtórzyć kroki 1.5-1.11 powyżej, aby przygotować każdą fiolkę zawierającą dorosłe samice. Użyj pędzla, aby zmieść niewykorzystane muchy z białej poduszki z powrotem do ich fiolki rodzicielskiej. Umieść znacznik wyboru na etykiecie fiolki macierzystej, aby wskazać, że została ona użyta do krycia (chociaż w razie potrzeby można jej użyć ponownie).
  13. Do rutynowego utrzymywania stada należy ustawić 6-8 fiolek z matkami płci żeńskiej i 6-8 fiolek z matkami płci męskiej (Rysunek 4). Połowę fiolek należy umieścić u matek (lub ojców) z jednej fiolki dla dorosłych, a drugą połowę nowych fiolek przy użyciu innej fiolki dla dorosłych, aby zminimalizować wąskie gardła genetyczne.
    1. Sporadycznie, w wyniku błędnej segregacji, pojawi się wyjątkowy samiec w fiolkach produkujących samice. Jeśli fiolka z dorosłymi samicami ma wyjątkowego samca, wyjmij i zgnieć, aby zabić tego samca. Jeśli to możliwe, wyrzuć wszystkie samice z tej fiolki i odczekaj kilka dni, aż więcej dorosłych samic zejdzie i będzie można je bezpiecznie wykorzystać do krzyżowania.
      UWAGA: Lepiej jest nie używać samic w tej fiolce do krzyżówek, ponieważ mogły one kojarzyć się z wyjątkowym samcem i nie wytwarzać płodnej krzyżówki.
  14. Po dodaniu dorosłych samic do wszystkich fiolek, powtórz kroki 1.5-1.11, aby dodać dwa dorosłe samce (Ryc. 4) do każdej fiolki zawierającej już samice much. Postukaj w fiolkę z samicami na gumowej podkładce, aby nie uciekły, gdy dwa samce są dodawane sekwencyjnie.
    UWAGA: Pracuj szybko i nie znieczulaj nadmiernie dorosłych much, ponieważ to je zabije.
  15. Do każdej fiolki należy dodać etykietę określającą bulion, krzyżówkę (dla potomstwa żeńskiego czy męskiego), informację, czy matka pochodzi z dorosłej fiolki #1 czy #2 oraz datę krycia. Wprowadź również powyższe informacje do notatnika i podaj liczbę fiolek ustawionych dla każdej krzyżówki.
    UWAGA: Wygodnie jest dodać ręcznik papierowy, aby oddzielić fiolki produkujące samce od fiolek wytwarzających samice na tacy.
  16. Pozostaw fiolki w spokoju na blacie na ~15 minut, aby mieć pewność, że dorośli obudzą się i będą latać dookoła. Obserwuj, czy łączą się w pary (bardzo szybko po przebudzeniu), gdzie samica i samiec są zorientowane od tyłu do tyłu (samiec chwyta spiczasty pokładełko samicy) (Rysunek 4, na dole).
    UWAGA: Dorosła samica zaakceptuje dorosłego samca tylko raz, więc nie przepychaj fiolek po kryciu, ponieważ może to oddzielić samca od samicy podczas krycia i samica nie będzie ponownie kryć.
  17. Umieścić tackę z dopasowanymi fiolkami w inkubatorze (np. w temperaturze 21 °C). Oznacz tacę nazwą wywaru (np. HoLo2) i tygodniem cyklu 5-tygodniowego (tygodnie 1, 2, 3, 4 lub 5).
    UWAGA: Tackę z dopiero co pokrytymi muchami należy przechowywać w oddzielnej części inkubatora lub innego inkubatora jako przypomnienie, aby nie podawać fiolek, dopóki nie pojawią się larwy (opisane poniżej).

2. Masowe krycie

UWAGA: Zazwyczaj, samotna matka B. coprophila będzie miała 60 potomstwa w swoim potomstwie. Gdy do eksperymentów wymagana jest większa liczba potomstwa, zamiast opisanego powyżej krycia pojedynczej pary można przeprowadzić krycie masowe. Krycie masowe można przeprowadzić w standardowych szklanych fiolkach o średnicy 28 cm, gdy matki zostaną zebrane dzień później w celu indukowanego składania jaj i pobierania zarodków. Jeśli jednak potrzebna jest większa liczba larw, masowe krycie odbywa się w słoiku o większej powierzchni, aby zapobiec przepełnieniu. Przebij kilka małych otworów w pokrywce słoika, aby larwy mogły zaczerpnąć powietrza do oddychania.

  1. Postępuj zgodnie z powyższymi krokami w sekcji 1, ale użyj kleszczy z cienką końcówką, aby przenieść wszystkie matki płci żeńskiej (lub wszystkie matki produkujące samce) do przedniego rogu białej podkładki na muchy. Użyj 10-15 znieczulonych grubych dorosłych samic i zmieść tę grupę pędzlem do fiolki lub słoika z małymi otworami przebitymi w pokrywce.
    UWAGA: Wykonaj kroki 2.1 i 2.2. szybko do masowego krycia, aby uniknąć nadmiernego znieczulenia, które zapobiegłoby płodnym krzyżówkom.
  2. Wybierz 20-25 znieczulonych, grubych dorosłych mężczyzn i przenieś je kleszczami z cienką końcówką do przedniego rogu białej poduszki na muchy.
  3. Energicznie postukaj w fiolkę lub słoik z samicami na gumowej podkładce, aby nie uciekły po zdjęciu zatyczki lub pokrywki, aby zmieść znieczuloną grupę dorosłych samców z białej poduszki na muchy za pomocą pędzla.

3. Pobieranie zarodków po masowym kryciu

  1. Jednego dnia (24 h) po kryciu wykonaj kroki 1,5-1,11, aby znieczulić dorosłe muchy (mieszankę samic i samców) i przenieść je do białej podkładki przeciwmuchowej.
    UWAGA: Oogeneza nie jest jeszcze zakończona, gdy dorosłe muchy łączą się w pary, co powoduje mejozę końcową; Dojrzałe komórki jajowe są zapładniane przez plemniki przechowywane w spermatece, gdy jaja są wyładowywane 29. Zakończenie oogenezy może trwać 1-2 dni, dlatego przed indukcją składania jaj dopuszcza się 1 dzień po kryciu.
  2. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką podnieś dorosłą samicę za skrzydła i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 2,2% agaru (wag./obj.), ze skrzydłami włożonymi do agaru. Powtórz ten krok sekwencyjnie dla każdej dorosłej samicy na białym nauszniku. Wyrzuć dorosłe samce na podkładkę muchową.
  3. Gdy wszystkie samice much zostaną nabite na agar, wywołaj składanie jaj, delikatnie ściskając głowę kleszczami, aż samica muchy zacznie wykonywać ruchy podobne do napadów. Możesz też delikatnie ścisnąć jej klatkę piersiową. Następnie w ciągu 30-60 minut złoży skupisko zapłodnionych jaj. Przykryj szalkę Petriego pokrywką, która jest zwilżona chusteczką laboratoryjną zwilżoną wodą, aby zapobiec elektrostatycznemu przyciąganiu jaj do pokrywki.

4. Sprawdzanie "wylęgu" larw

  1. Sprawdzić, czy larwy nie mają "wylęgu" 1 tydzień po kryciu; wyjąć zatyczkę z fiolki i użyć mikroskopu preparacyjnego, aby ocenić larwy. Ich szczęka będzie się wielokrotnie otwierać i zamykać i powoli będą poruszać się do przodu. Jeśli jest tylko kilka larw, napisz "kilka" na etykiecie fiolki, jako przypomnienie, aby karmić tę fiolkę mniej. Zbadaj każdą fiolkę na tacy z tym krzyżykiem i wprowadź liczbę fiolek z larwami w zeszycie w kolumnie obok liczby fiolek, które zostały ustawione w tym kojarzeniu.
    UWAGA: Ciemnożółte jaja nie rozwiną się. Białe jaja prawdopodobnie się rozwiną, a na 1 dzień przed pojawieniem się larw na przednim końcu jaja rozwinie się pigment (przyszła szczęka). Nie myl pleśni z białym włóknem zakończonym czarną kulą na końcu z larwami - pleśń nie będzie się poruszać, w przeciwieństwie do larw, które pełzają do przodu po agarze .
  2. Dodaj trochę słomy (tylko raz) do każdej fiolki z larwami, aby kontrolować nadmierną wilgotność i zapewnić larwom kryjówkę.
  3. Przenieść tacę do inkubatora (np. o temperaturze 21 °C) z tacami z larwami z krzyżówek krytych z poprzednich tygodni i rozpocząć karmienie fiolek nowo pojawiającymi się larwami (patrz punkt poniżej dotyczący karmienia).
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, larwy będą znajdować się w skupisku w pobliżu swojej zmarłej matki i zaczną ją zjadać; Przypuszczalnie powoduje to przeniesienie drożdży z jelita matki do jelita larw. Możesz rozpocząć karmienie w dniu pojawienia się larw lub w ciągu 2 dni później. UWAGA: Jeśli karmienie jest opóźnione, larwy zjadają się nawzajem, a w każdej fiolce pozostaje tylko jedna tłusta larwa!
  4. Kontynuuj sprawdzanie fiolek, w których nie ma jeszcze larw, przez 3 dni w tygodniu. Jeśli po 7-10 dniach nie pojawią się żadne larwy, należy wyrzucić fiolkę lub przechowywać ją do umycia fiolki.

5. Przygotowanie jedzenia

UWAGA: Wszystkie składniki żywności powinny być wolne od pestycydów!

  1. Użyj łyżki stołowej, aby odmierzyć objętość następujących składników i umieść je na metalowej lub szklanej patelni (np. metalowej formie do pieczenia o wymiarach 8 cali x 8 cali): 4 części słomy owsianej (8 łyżek), 2 części sproszkowanych grzybów shitake (4 łyżki), 1 część szpinaku w proszku (2 łyżki), 1 część pokrzywy w proszku (2 łyżki). Użyj łyżki stołowej, aby dobrze wymieszać składniki na patelni.
    UWAGA: Alternatywnie zamiast 1 części każdego z nich można użyć 2 części samego szpinaku w proszku lub tylko pokrzywy w proszku.
  2. Przykryj patelnię folią aluminiową i sterylizuj w autoklawie na sucho przez 20-30 minut. Pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej przez noc lub dłużej.
  3. Zdejmij folię z patelni i rozbij zbryloną, wysterylizowaną mieszankę żywności, wykonując ruch mielenia łyżką stołową, aby uzyskać sproszkowaną mieszankę.
  4. Dodaj 1 część (2 czubate łyżki) drożdży piwnych i dobrze wymieszaj z autoklawowaną mieszanką spożywczą.
    UWAGA: Drożdże piwne nie są sterylizowane w autoklawie, ponieważ zabiłoby to drożdże.
  5. Przenieś mieszankę spożywczą do sterylnego słoika z nakrętką.
    UWAGA: Można użyć tego samego rodzaju słoika o pojemności 240 ml, który jest używany do łączenia masowego, a powyższy przepis wypełni słoik. Podobnie, ten sam rodzaj wysterylizowanego słoika z nakrętką powinien być wypełniony tylko słomką, która została autoklawizowana na patelni pokrytej folią.

6. Karmienie

UWAGA: Dostosuj ilość podawanego pokarmu do wieku i ilości larw. Daj dużo jedzenia do słoików z wieloma larwami z masowego krycia. Wystarczy lekko posypać pokarmem szalki Petriego z larwami, które są przechowywane przez kilka dni w celu stadium rozwoju. Opisana poniżej metoda karmienia została opracowana w laboratorium Charlesa Metza 29 i jest stosowana z powodzeniem przez jego laboratorium oraz przez Helen Crouse, Susan Gerbi i innych od stu lat.

  1. Umyj ręce i dobrze spłucz, aby usunąć mydło.
    UWAGA: Nie zaleca się noszenia rękawiczek, ponieważ zmniejszają one czucie palców przy regulowaniu ilości pokarmu podawanego do każdej fiolki.
  2. Sterylny słoik ze zmieloną słomą i sterylny słoik z pokarmem należy przechowywać w inkubatorze (np. w temperaturze 21 °C), w którym trzymane są larwy. Zdejmij pokrywkę ze słoika i wlej trochę jedzenia do czystej miski (np. naczynia na cukierki), aby uzyskać łatwiejszy dostęp; Załóż pokrywkę na słoik zawierający pozostałą żywność. Przechowuj otwartą miskę z jedzeniem na metalowej lub szklanej małej tacy; Zapobiegnie to czołganiu się roztoczy lub innych owadów po ściance tacy, aby dostać się do miski z jedzeniem.
  3. Podnieś trochę jedzenia między drugim a trzecim palcem (lub między kciukiem a drugim palcem). Drugą ręką wyjmij fiolkę z tacki i wyjmij zatyczkę, trzymając ją palcami podczas karmienia. Zbadać fiolkę pod kątem wieku i liczby larw i umieścić odpowiednią ilość pokarmu w fiolce, obracając dwa palce przytrzymujące pokarm względem siebie. Fiolki z nowo pojawiającymi się larwami potrzebują tylko kilku ziaren pokarmu. Fiolki ze starszymi larwami powinny mieć cienką warstwę pokarmu pokrywającą górną część agaru.
  4. Jeśli w fiolce znajduje się biała pleśń, użyj 70% etanolu rozpylonego na chusteczkę laboratoryjną, aby wytrzeć długą metalową sondę (np. z drewnianą rączką), wyjmij korek i włóż czystą sondę do fiolki, aby spukać w formę na powierzchni agaru. Jeśli jest dużo pleśni, zakręć sondą, aby owinąć formę wokół sondy, aby usunąć ją z fiolki. Nie naruszaj górnej części agaru, ponieważ żyją tam larwy; Dodać tylko niewielką ilość jedzenia i wymienić zatyczkę w fiolce. Wytrzyj sondę do czysta chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem przed przechowywaniem sondy lub użyciem jej do czyszczenia innej fiolki.
  5. Po nakarmieniu wszystkich fiolek z tacki należy ją wymienić na nową w inkubatorze i wyjąć następną tackę do karmienia, jak opisano w punkcie 6.3.
  6. Po zakończeniu karmienia wlej pozostały pokarm z miski do wcześniej wysterylizowanego słoika, zakręć słoik i przechowuj go w inkubatorze.

7. Zbiór larw lub poczwarek na płytkach Petriego

  1. W przypadku małej liczby larw użyj metalowej sondy lub szpatułki, która została przetarta 70% etanolem, aby wkopać się w górną warstwę agaru w fiolce, aby przenieść przylegający agar z niektórymi larwami na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm wypełnioną do połowy 2,2% (wag./obj.) agarem.
  2. W przypadku większej liczby larw należy włożyć szpatułkę wzdłuż ścianki na dnie fiolki, aby usunąć korek agarowy z fiolki i umieścić go stroną do góry na pustej szalce Petriego. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby znaleźć larwy na górze korka agarowego i przenieś je za pomocą kleszczyków z cienką końcówką na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm wypełnioną do połowy agarem o zawartości 2,2% (wag. / obj.).
  3. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby posortować larwy za pomocą kleszczy z cienką końcówką na grupy o tym samym stadium rozwoju.
    UWAGA: Ze względu na niewielką asynchroniczność rozwojową, na płytce Petriego z agarem o zawartości 2,2% (wag./vol) będzie kilka różnych skupisk posortowanych larw.
  4. Dodaj niewielką ilość jedzenia i umieść szalkę Petriego z larwami w inkubatorze. Wyjmuj go codziennie w celu obserwacji pod mikroskopem preparacyjnym w celu wyboru pożądanego etapu rozwoju.
    UWAGA: W przypadku badań zaciągnięć DNA, wczesne larwy plamki ocznej przechodzą przez etapy 10x5, 12x6, 14x7 i krawędziowe oko/szczęka z ~1 dniem na każdym z tych etapów 30,31. Wybierz poczwarki, których oczy są w 1/4 do 1/2 wypełnione pigmentem, aby mieć mejozę I i II etapy w jądrach poczwarki.

8. Przechowywanie larw w chłodni

  1. Jako zapas przechowywać w chłodni około czterech fiolek larw żeńskich i czterech fiolek larw męskich z 2 kolejnych tygodni krzyżówek.
  2. W celu przechowywania zapasowego należy karmić larwy, które są we wczesnym 4. stadium rozwoju (stadium przed plamką oczną) i umieścić je na otwartej tacy na półce w chłodni; podawać te fiolki tylko raz w miesiącu.
  3. Po 2-3 miesiącach należy wyjąć 16 fiolek z 2 kolejnych tygodni krzyżówek krytych z zimna (zaznacz to w kalendarzu jako przypomnienie); umieścić je w inkubatorze (np. w temperaturze 21 °C), aby karmić je normalnie i pozwolić im rozwinąć się w dorosłe osobniki, które będą mogły używać do krzyżowania.
  4. Po wyjęciu fiolek z chłodni należy umieścić w chłodni świeży zestaw fiolek z wczesnymi larwami 4. stadium rozwojowym, tak aby fiolki te były zawsze dostępne jako zapasowe zapasy.
    UWAGA: Żywotność po przechowywaniu w chłodni nie była systematycznie testowana dla różnych etapów rozwoju, ale nasze doświadczenie pokazuje, że przechowywanie w chłodni wczesnych larw 4wieku rozwojowego działa dobrze.

9. Mycie fiolek

  1. Po śmierci dorosłych osobników (~2-3 tygodnie po eklacji) wyjmij fiolki z inkubatora i umieść je w temperaturze 60-70 °C na 1 godzinę, aby zabić wszelkie pozostałe organizmy.
  2. Wyjmij bawełniane zatyczki i przechowuj je w plastikowym pudełku.
  3. Za pomocą szpatułki zeskrobać korek agarowy z fiolki do kosza na śmieci.
  4. Namocz fiolki przez noc lub dłużej zanurzone w wodzie w rondlu.
  5. Użyj szczotki do probówek przeznaczonych tylko do tego celu (nigdy nie używaj do naczyń z chemikaliami ani z mydłem) i szoruj w górę iw dół fiolkę pod bieżącą wodą z kranu. Umieścić oczyszczoną fiolkę otwartą stroną do dołu w metalowym koszu. Napełnij kosz oczyszczonymi fiolkami.
    UWAGA: Nigdy nie używaj mydła w fiolkach, ponieważ wszelkie pozostałości mydła mogą zabić B. coprophila.
  6. Dodaj pokrywkę z siatki drucianej do kosza i trzymając pokrywkę na miejscu, odwróć kosz, aby napełnić wszystkie fiolki wodą dejonizowaną. Trzymając pokrywkę na miejscu, odwróć kosz, aby opróżnić dejonizowaną wodę z fiolek. Powtórz płukanie wodą dejonizowaną 4x.
  7. Umieść kosze z oczyszczonymi fiolkami na ręcznikach papierowych lub otwartej platformie siatkowej (np. wózku laboratoryjnym) do wyschnięcia przez noc lub dłużej. Przechowywać suche fiolki w szufladzie.
    UWAGA: Nie pozwól, aby fiolki z martwymi osobnikami pozostawały zbyt długo przed ich umyciem, ponieważ może to spowodować inwazję roztoczy.

10. Nalewanie agaru

  1. Napełnić duży pojemnik (metalowy kosz lub metalową tacę) czystymi fiolkami i dodać bawełnianą zatyczkę do każdej fiolki. Należy ponownie użyć zatyczek wyjętych ze starych fiolek, gdy fiolki zostały umyte, i używać zatyczek wielokrotnie, aż ulegną degradacji i rozpadną się i należy je wyrzucić. Wysterylizuj pojemnik z zatkanymi fiolkami w suchym cyklu przez ~30 minut i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej, aby przechowywać je w pojemniku autoklawu. Zawsze należy mieć pod ręką dwa pojemniki (jeden aktywnie używany i jeden zapasowy) z autoklawowanymi fiolkami zatkanymi.
  2. Umieścić 11,0 g proszku agarowego w 1 litrowej kolbie Erlenmeyera i dodać 500 ml wody destylowanej, aby uzyskać 2,2% (wag./obj.) roztwór agaru wystarczający do nalania ~24 fiolek (~21 ml / fiolkę). Zakręć kolbą i umieść ją w kuchence mikrofalowej.
    UWAGA: Od tego momentu do obsługi kolby należy używać żaroodpornej rękawicy autoklawu. Ten sam 2,2% (wag./obj.) roztwór agaru można przelać do szalek Petriego (dla wybranych larw) lub słoików (do łączenia masowego), jeśli są one potrzebne.
  3. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę, wyjmij kolbę, aby ją zakręcić, włóż ją do kuchenki mikrofalowej i ponownie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę. Powtórz to kilka razy.
  4. Obserwuj kolbę przez szklane drzwiczki kuchenki mikrofalowej. Gdy roztwór agaru zacznie się pienić i gotować, natychmiast użyj przycisku ręcznego zatrzymania. W tym momencie nie obracaj kolbą (może się wykipieć) i ostrożnie wyjmij ją z piekarnika na blat i odstaw na kilka minut.
  5. Wyjmij zatyczkę ze wysterylizowanej fiolki i przytrzymaj ją jedną ręką; drugą ręką wlej 2,2% agar o wysokości ~2,5 cm do wysterylizowanej fiolki. Następnie włożyć zatyczkę do fiolki. Powtarzaj to, aż cały agar zostanie wylany.
    UWAGA: Jeśli do fiolki wleje się zbyt mało agaru, wyschnie on szybciej podczas użycia i skurczy się od ścianek fiolki. Jeśli do fiolki wleje się zbyt dużo agaru, trudno jest skupić się na górnej warstwie podczas oceniania "wylęgu" larw za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
  6. Pozostaw nalane fiolki na blacie w temperaturze pokojowej przez 1-2 dni, aby agar stwardniał, a wilgoć całkowicie odparowała. Użyj fiolek do krzyżówek lub przechowuj je leżące na boku w plastikowym pudełku z ciasno przylegającą pokrywką; Umieścić ręcznik papierowy zwilżony wodą na wierzchu fiolek przed umieszczeniem pokrywki na pudełku (zapobiegnie to wysychaniu i kurczeniu się agaru od ścianki fiolki). Pudełko z rozlanymi fiolkami należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni lub w lodówce lub chłodni o temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Przed użyciem przechowywanych fiolek należy wyjąć je z pudełka i pozostawić na blacie w temperaturze pokojowej na godzinę lub dwie, aby kondensat odparował z wnętrza fiolek (dorosłe muchy przykleiłyby się do kondensatu i utonęły).

11. Tworzenie zatyczek do fiolek

  1. Umieść czystą fiolkę w styropianowym uchwycie na probówkę o pojemności 50 ml (wciśnij probówkę tak, aby stała prosto). Wytnij kwadrat gazy (o grubości 2-4 warstw) i umieść go na wierzchu fiolki.
  2. Umieść skrawki gazy z wcześniej wykonanych zatyczek na wierzchu gazy, aby utworzyć grubszą warstwę. Umieść bawełnę na wierzchu gazy i wciśnij do fiolki, upewniając się, że mocno wypełniłeś górny cal fiolki.
  3. Przytrzymaj górną część końców gazy razem i zawiąż ją sznurkiem. Odetnij nadmiar sznurka i nadmiar gazy (zostaw wystarczająco dużo ogonów sznurka, aby go związać i wystarczająco dużo gazy, aby wygodnie chwycić wtyczkę).
    UWAGA: Zamontuj zaślepki tak, aby były dobrze dopasowane. Powinieneś być w stanie wyciągnąć je palcem wskazującym i wskazującym, trzymając je w jednej ręce. Jeśli fiolka zostanie podniesiona za korek i wypadnie, oznacza to, że jest zbyt luźna. Jeśli po wyciągnięciu wydaje głośny trzask, może być zbyt ciasny. Jeśli jest zbyt ciasny lub jeśli na korku znajduje się warstwa twardego, suchego agaru, muchy mogą się udusić. Jeśli korek jest trochę za luźny lub zsuwa się po bokach fiolki, można go stuknąć w blat, aby zgnieść go do nieco szerszego rozmiaru.

12. Typowy tygodniowy harmonogram (dla największej efektywności, wykonuj zadania w podanej kolejności)

  1. Poniedziałek (~30 min)
    1. Nakarm fiolki larwami.
    2. Wlać agar do sterylnie czystych fiolek z zatyczkami.
  2. Środa (~2 h)
    1. Umieść fiolki z martwymi osobnikami w piekarniku na 1 godzinę i przechowuj do umycia.
    2. Sprawdź, czy nie ma larw "baby-hatch".
    3. Nakarm fiolki larwami.
    4. Wykonuj cotygodniowe krzyżówki godowe.
    5. Inne obowiązki w zależności od potrzeb: czyste fiolki w autoklawie z zatyczkami, aby mieć zapas zapasu w razie potrzeby; przygotowanie nowej żywności i słomki do autoklawu w razie potrzeby; słoiki do autoklawu w razie potrzeby na żywność i słomę.
  3. Piątek (~30 min)
    1. Sprawdź, czy nie ma larw "baby-hatch".
    2. Nakarm fiolki larwami.

Wyniki

Opisane tutaj protokoły zapewniły udaną hodowlę B. coprophila. Gdy do kojarzenia wybierane są niedawno wyklucone, dobrze odżywione osobniki dorosłe (Rycina 4), ponad 90% krzyżówek może być płodnych i dawać potomstwo. Skuteczność zapłodnienia różni się w zależności od linii (Tabela 2). Linia 7298 (chromosom X z markerem Wavy) była najzdrowszą z linii, lecz przeszła okres regresu, prawdopodobnie z powodu aktywacji mobilnych elementów DNA powodujących rearanżacje genomu32. Linia HoLo2 reprezentuje zdrowy szczep pochodzący z linii 7298, w którym rearanżacje genomu najwyraźniej uległy stabilizacji; zastąpiła ona rodzielską linię 7298 w centrum zasobów. Linia HoLo2 została wykorzystana do sekwencjonowania genomu B. coprophila i jest najszerzej stosowana przez różne grupy badawcze. Niedawno mutagenza CRISPR much HoLo2 została wykorzystana do stworzenia linii W14 z fenotypem białych oczu, przeznaczonej do transformacji markerami fluorescencyjnymi oczu (Yamamoto i Gerbi, dane nie pokazane). Szczep W14 jest wyjątkowo odporny. Linia 6980 (markery Wavy wing i swollen vein) jest nieco mniej odporna, a linia 91S (marker petite wing) jest jeszcze mniej odporna.

Skuteczne krzyżówki prowadzą do powstania embrionów (Rysunek 5). W embrionach dochodzi do eliminacji imprintingowanych ojcowskich chromosomów X podczas 7.th do 9.th podziału łupinowego. Ponadto chromosomy L ograniczone do linii zarodkowej są eliminowane z linii somatycznej w embrionach podczas 5.th do 6.th podziału łupinowego. Embriony rozwijają się w larwy, których nie należy mylić z pleśnią, która również może być obecna (Rysunek 6). Plamki oczne (anlage oczu dorosłych) pojawiają się w drugiej połowie 4.th stadium larwalnego (Rysunek 7). Wielkość plamek ocznych stanowi wygodny marker fenotypowy początku i przebiegu amplifikacji puf DNA, która jest jednym z zaledwie dwóch znanych przykładów naturalnie występującej, regulowanej rozwojowo, specyficznej dla miejsca wewnątrzchromosomowej amplifikacji DNA (genu). Następnie rozwijają się poczwarki, a ilość pigmentu wypełniającego ich oczy może służyć jako marker rozwojowy dla mejozy I i II w spermatogenezie (Rysunek 8) z jej unikalnym zachowaniem chromosomów w tych podziałach.

Schemat determinacji płci; X-w-X, samica XX, samiec XO; fenotypy owadów; badanie genetyczne.
Rysunek 4: Kopulacja dorosłych much B. coprophila. Górny panel przedstawia trzy typy dorosłych much w linii HoLo2: samice produkujące potomstwo żeńskie z pofalowanymi skrzydłami (dorosłe samice X'WX), samice produkujące potomstwo męskie z prostymi skrzydłami (dorosłe samice XX) oraz samce z prostymi skrzydłami (dorosłe samce X0). Należy zwrócić uwagę na spiczasty wydawek jajowodu na tylnym końcu much samic oraz haczykowaty chwytnik na tylnym końcu much samców. Dolny panel przedstawia kopulację samca i samicy, podczas której chwytnik samca uchwycił wydawek jajowodu samicy. Plemniki zostaną zmagazynowane w spermatece samicy i zapłodnią jaja podczas ich wydalania na zewnątrz. Długość osobników dorosłych wynosi 2.0 mm (samce), 2.5 mm (samice). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Embriogeneza Drosophila, progresja cyklu komórkowego, mikroskopia fluorescencyjna, analiza time-lapse.
Rycina 5: B. coprophila zarodki. Panel w lewym górnym rogu przedstawia widok embrionów przy użyciu standardowego oświetlenia w mikroskopie stereoskopowym; jądra w cytoplazmie syncytialnej widoczne są jako czarne kropki. Panel po prawej stronie wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji jąder embrionów barwionych jodkiem propidyny. Embriony mają średnią długość 200 mikronów i średnią szerokość 150 mikronów. Jądra komórek linii zarodkowej skupiają się na biegunie tylnym embrionu, co widać w cyklach 6 (embrion pochylony do przodu) oraz 7–9, po czym przeplatają się z jądrami somatycznymi. Eliminacja chromosomów L w linii somatycznej zachodzi podczas 5. lub 6. podziału rozszczepieniowego; eliminacja chromosomów X w linii somatycznej zachodzi w 7.th, 8thlub 9th podziały dwoiste. Celularyzacja zachodzi podczas interfazy cyklu 11. Tabela po lewej stronie przedstawia średni czas trwania każdego cyklu podziału w 22 °CTabela po lewej stronie oraz panel po prawej stronie zostały zaadaptowane za zgodą de Saint Phalle i Sullivan.35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat interakcji grzyb-owad; Mikroskopowe zdjęcie wzrostu grzyba na owadzie-gospodarzu.
Rycina 6: Zarodki B. coprophila wykluwają się jako larwy. Grupa zarodków (gruba niebieska strzałka) widoczna jest w pobliżu wywijaka dorosłej samicy, która padła po zniesieniu jaj. Tydzień po zniesieniu jaj zarodki przekształcają się w młode larwy, z których kilka wskazano czarnymi strzałkami. Nowo wyklute larwy mają czarną żuwaczkę na końcu przednim i półprzezroczyste ciało. Poruszają się po powierzchni agaru i nie należy ich mylić z nieruchomą pleśnią. Wstawka przedstawia fragment pleśni z białym filamentem (czerwona strzałka) i czarnym zarodnikiem na jego końcu (zielona strzałka), która jest nieco mniejsza od nowo wyklutych larw. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy rozwoju larwalnego; obraz mikroskopowy; formowanie się wzoru komórkowego w różnych stadiach.
Rycina 7: Stadia plamek ocznych larw B. coprophila. Plamki oczne formują się w przedniej części larwy, tuż za żuwaczkami i składają się z ziarn pigmentu, których liczba wzrasta. Plamki oczne stanowią zalążek oka dorosłego osobnika. Górny panel przedstawia larwy obserwowane pod mikroskopem stereoskopowym; dolny panel to powiększony widok plamek ocznych wykonany za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego w celu wizualizacji larwy na szkiełku przedmiotowym z kroplą wody destylowanej i lekko pływającym na wierzchu szkiełkiem nakrywkowym. Nomenklatura stadiów plamek ocznych jest zgodna z opracowaniem Gabrusewycz-Garcia30, gdzie liczba ziarn jest liczona w najdłuższym rzędzie (np. 12), a liczba dodatkowych rzędów z wyłączeniem rzędu najdłuższego jest odnotowywana (np. 6 dla stadium plamki ocznej 12x6). Inicjacja specyficznej dla miejsca amplifikacji DNA w politenicznych chromosomach gruczołów ślinowych rozpoczyna się w stadium plamki ocznej 10x5 i kończy w stadium 14x7, kiedy następuje gwałtowny wzrost transkrypcji w locus oraz ekspansja pęczków DNA31. W następnym stadium (edge-eye/dropped jaw), ziarna plamek ocznych zaczynają się łączyć i przemieszczać bocznie od linii środkowej; długość ciała larwy ulega skróceniu. Ponadto w tym stadium następuje kondensacja pęczków DNA. Przejście przez każde stadium plamki ocznej trwa około jednego dnia w temperaturze 21 °C. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat porównawczy stadiów poczwarki Drosophila; panele A-D pokazują kolejne stadia rozwoju.
Rysunek 8: Rozwój poczwarek B. coprophila. Podczas poczwarowania wszystkie tkanki larwalne, z wyjątkiem układu nerwowego, ulegają histolizie i są zastępowane przez tkanki osobnika dorosłego, które powstają w wyniku podziałów komórkowych tarczek imaginalnych. Kolor ciała zmienia się z białego na beżowy, brązowy, a następnie czarny. Pigment stopniowo wypełnia oko poczwarki; mejoza I i II zachodzą u samców w stadium, gdy oczy są wypełnione pigmentem w 1/4 do 1/236. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Nazwa zapasuMarkery Współczynnik dzietności Komentarze
7298skrzydło pofalowane (W)~75%
HoLo2Skrzydło pofalowane (W)~90%pochodna z 7298
W14Skrzydła pofalowane (W); oczy białe~95%pochodna HoLo2
6980skrzydło pofalowane (W); żyłki spuchnięte (sw)~65%
91Ssłabo pofalowane (W) skrzydła; drobne (p) skrzydła~50%marker Wavy wprowadzono w krzyżówce w celu uratowania 91S

Tabela 2: Populacje Bradysia (Sciara) coprophila. Tabela 1 z pracy Gerbi6 wymienia te markery oraz inne, które nie są już obecne. Pięć translokacji (T1, T23, T29, T32, T70) na końcu centromerowym chromosomu X27 zostało podsumowanych na Rysunku 8 pracy Gerbi6, lecz nie są one już obecne.

Plik uzupełniający 1: krzyżówki HoLo2 (oraz 7298 i W14), krzyżówka i ratunek 91S, krzyżówka 6980, krzyżówki translokacyjne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawione tutaj protokoły hodowli B. coprophila będą przydatne dla naukowców, którzy chcą hodować ten organizm w swoich laboratoriach w celu przeprowadzenia eksperymentów mających na celu zagłębienie się w jego unikalne cechy biologiczne. Wstępny opis metody karmienia przy użyciu drożdży i proszku grzybowego rozsypanych na bazie agaru w celu utrzymania B. coprophila29 został wykorzystany w laboratorium w Metz do hodowli 14 różnych gatunków much Sciarid5. Następnie zaobserwowano, że dodatek pokrzywy i/lub szpinaku w proszku dodatkowo zwiększył witalność B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, komunikacja osobista). Metody te okazały się skuteczne w utrzymaniu pokrewnych gatunków w obrębie rodziny Sciaridae, w tym Bradysia impatiens i Lycoriella ingenua , które są obecnie w kulturze (Robert Baird, komunikacja osobista).

Inne metody (takie jak alternatywne metody karmienia opisane poniżej) zostały wypróbowane w celu wyhodowania B. coprophila, ale opisane tutaj protokoły zostały zoptymalizowane tak, aby uzyskać najkorzystniejszy stosunek larw na powierzchnię agaru, aby uzyskać najbardziej płodne tłuste dorosłe osobniki i zminimalizować rozwój pleśni. Aby zwiększyć skalę, masowe kojarzenie można przeprowadzić w szklanych fiolkach, jak opisano w protokole 2 powyżej. Alternatywnie, kilka (2-4) dorosłych samic można umieścić razem z dwukrotnie większą liczbą dorosłych samców w kolbie, takiej jak ta używana do hodowli Drosophila (jednorazowa 6 uncji = 177,4 ml kwadratowej butelki polipropylenowej Drosophila ). W obu przypadkach badacz musi być w pełni pewien, że w kolbie znajdują się tylko wszystkie matki płci żeńskiej lub wszystkie matki płci męskiej.

Karm tylko larwy, ponieważ poczwarki i dorosłe osobniki nie jedzą. Nie należy podawać fiolki, jeśli larwy zamieniły się w poczwarki (oznaką tego jest pojawienie się pierwszych wcześnie pojawiających się dorosłych much). Po zamknięciu ciała dorosłego osobnika należy umieścić fiolki w chłodniejszym inkubatorze (np. o temperaturze 16 °C), jeśli jest dostępna, ponieważ pozwoli to dorosłym osobnikom żyć dłużej. Karmić trzy razy w tygodniu (np. w poniedziałek, środę, piątek), zwiększając ilość pokarmu podawanego w fiolce wraz z wiekiem larw. Karm się hojnie, a zostaniesz nagrodzony tłustymi, płodnymi dorosłymi. Jeśli jednak nakarmisz za dużo, pojawi się biała pleśń, co jest znakiem, aby zmniejszyć ilość jedzenia, które odkładasz w fiolce. Ponadto, jeśli karmisz za dużo, na wierzchu agaru pojawi się gruba podkładka z jedzeniem, która utrudni dorosłym wynurzanie się (możesz usunąć podkładkę za pomocą kleszczy, ale uważaj, aby nie wyjmować larw za pomocą podkładki - najlepiej, aby w ogóle tego nie robić). Fiolki z niewielką liczbą larw (oznaczone jako "kilka") potrzebują mniej pokarmu. Jeśli karmisz za mało, larwy będą wspinać się po ściankach fiolki w poszukiwaniu pożywienia. Niedożywione larwy skutkują małymi dorosłymi osobnikami, które są mniej płodne.

Alternatywne metody karmienia
Próbowano różnych metod, aby karmić larwy tylko raz w stadium larwalnym, a nie 3 razy w tygodniu. B. coprophila nie będzie rosła na pokarmie w stylu Drosophila . John Urban (komunikacja osobista) próbował zmieszać pokarm B. coprophila z agarem, ale wyrosło zbyt dużo pleśni. Odkrył, że dodanie dwóch inhibitorów pleśni (tegoseptu i kwasu propionowego) w połączeniu i osobno, próbując kilku różnych stężeń, było toksyczne dla B. coprophila na poziomach, które hamują pleśń. Agar powinien mieć pH 6-7 (obojętne), ponieważ B. coprophila choruje przy kwaśnym pH (jak w przypadku kwasu propianowego). Alternatywnie, aby uniknąć karmienia trzy razy w tygodniu, próbował użyć szpatułki lub strzykawki bez igły, aby dozować gęstą pastę drożdżową (aktywne suche drożdże Red Star zmieszane z niewielką ilością wody destylowanej w celu ich zwilżenia) jako porcję na wierzchu agaru w każdej fiolce tydzień po kryciu (tj. mniej więcej w czasie, gdy larwy zaczną się wyłaniać).

Inną metodą uniknięcia karmienia trzy razy w tygodniu jest dodanie żywej kultury grzybów do każdej fiolki. Bath i Sponsler37 stwierdzili, że pochyła powierzchnia agaru z pożywką Sabouraud powinna być pokryta kulturą grzybów z rodzaju Chaetoconidia (najlepiej) lub Baplosporangia lub Xllescheria. Grzyb był uprawiany od kilku dni do tygodnia przed wprowadzeniem B. coprophila . Po tym nie było potrzeby karmienia. Wariant tej metody stosowała również Ellen Rasch (komunikacja osobista). W naszych rękach fiolki były zbyt mokre tą metodą i larwy utonęły, ale można było spróbować ponownie, aby zoptymalizować liczbę larw w stosunku do fiolek z żywymi grzybami.

Arthur Forer (komunikacja osobista) odniósł pewne sukcesy w hodowli B. coprophila w taki sam sposób, jak muchy żurawi38. Dzięki takiemu podejściu poczwarki były hodowane na wilgotnym papier mâché. Następnie dorosłe osobniki zostały pokryte, a jaja zostały złożone na świeżym, wilgotnym papier mâché. Powstałe larwy trzymano na papier mâché na szalkach Petriego i karmiono sproszkowanymi liśćmi pokrzywy dwa razy w tygodniu. Poczwarki umieszczono w klatce, aby powtórzyć cykl.

Yukiko Yamashita (komunikacja osobista) bezskutecznie próbowała hodować B. coprophila na glebie, naśladując warunki, w których występują w naturze w roślinach doniczkowych i szklarniach o wysokiej wilgotności. Jednak pleśń może stać się problemem, gdy poziom wilgotności zostanie podniesiony. Niemniej jednak wilgotna gleba została z powodzeniem wykorzystana do hodowli larw Pseudolycoriella (wcześniej Bradysia) hygida w plastikowych pudełkach z wilgotną glebą; karmione są rozłożonymi liśćmi ostrokrzewu paragwajskiego, uzupełnionymi w późnym okresie larwalnym 1,2% ekstraktem drożdżowym, 1,4% skrobią kukurydzianą, 0,8% mąką owsianą, 1,2% agarem12. Podobnie wilgotną glebę można zastąpić wilgotnym mchem torfowym z pokruszoną fasolą, aby wyhodować muchy Sciarid39,40.

Jeszcze inne metody zostały zastosowane do utrzymania laboratoryjnych kultur Bradysii: (i) autoklawizowany ziemniak, do którego dodaje się drożdże i suszony nawózkrwi41; ii) obornik 42,43,44, do którego można dodać zaschniętą krew 45; (iii) plastikowe pojemniki z wacikami i zwilżonymi ręcznikami papierowymi ze zmielonymi ziarnami soi46.

Roztocza
Roztocza mogą być przenoszone z Drosophila na B. coprophila. Aby to zminimalizować, najlepiej trzymać B. coprophila w osobnym inkubatorze lub pomieszczeniu, nie w pobliżu stad Drosophila . Ponadto wszelkie prace pielęgnacyjne B. coprophila należy wykonywać wcześnie rano przed kontaktem z Drosophila. Roztocza mogą być również przenoszone na B. coprophila z roślin doniczkowych, więc nie trzymaj roślin w tym samym pomieszczeniu co B. coprophila. Jeśli roztocza zaatakują fiolki, można je zobaczyć jako małe białe kuliste organizmy pełzające po ciele B. coprophila. Zabiegi chemiczne, które działają w celu zniszczenia roztoczy u Drosophila, nie mogą być stosowane w przypadku B. coprophila, ponieważ chemikalia zabijają B. coprophila (B. coprophila jest również wrażliwy na opary organiczne, takie jak fenol). Jedynym sposobem na pozbycie się roztoczy z B. coprophila jest ręczne zebranie zarodków na płytce agarowej, zbadanie każdego z nich pod kątem braku roztoczy, a następnie przeniesienie ich do świeżych fiolek z agarem za pomocą cienkiego pędzla. Zatyczki z gazy wypełnione bawełną i flugi z pianki octanu celulozy (stosowane w fiolkach polipropylenowych Drosophila ) pomagają zapobiegać przedostawaniu się roztoczy do fiolek.

Przydatność protokołów hodowlanych
Opisane tutaj protokoły umożliwią rosnącej społeczności naukowców wyhodowanie B. coprophila jako nowego/starego wyłaniającego się organizmu modelowego w celu zbadania jego unikalnych cech biologicznych. Nowe grupy laboratoryjne są zachęcane do przyłączenia się do rosnącej społeczności w celu utrzymania i zbadania unikalnych cech biologicznych Bradysia (Sciara).

Oświadczenia

Autor nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla poprzednich hodowców B. coprophila (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) i personelu badawczego (szczególnie Roberta Bairda, Michaela S. Foulka, Donny Kubai, Johna M. Urbana, Yutaka Yamamoto) za dopracowanie protokołów hodowlanych. Wstępnych instrukcji dotyczących opieki nad B. coprophila udzielili Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz i Ellen Rasch. Z podziękowaniami dla Yukiko Yamashita i Anne W. Kerrebrock za przejęcie centrum akcji Bradysia (Sciara). Wielkie podziękowania dla następujących osób za pomocne przygotowanie rysunków: Brian Wiegmann (Rysunek 1), John M. Urban (Rysunek 4 górny panel), Laura Ross (Rysunek 4 dolny panel), Yutaka Yamamoto (Rysunek 5 lewy panel), Leo Kadota (Rysunek 7 i Rysunek 8). Wielkie podziękowania dla Avy Filiss i Brown University Multidisciplinary Laboratory za pomoc w fotografowaniu i filmowaniu. Podziękowania dla Roberta Bairda za komentarze do tego manuskryptu. Nasze badania i utrzymanie B. coprophila były wspierane przez NIH i NSF, w tym najnowsze wsparcie od NIH GM121455 dla SAG. Więcej informacji na temat B. coprophila można znaleźć na stronach internetowych Centrum Hodowli Bradysia (Sciara) (https://sites.brown.edu/sciara/ i https://sciara.wi.mit.edu), które są obecnie budowane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar (bakteriologiczny)U.S. BiologicalA0930https://www.usbio.net;  
CO2 Pedał nożny FlyStuffGenesee Scientific59-121
CO2 FlyStuff DmuchawkaGenesee Scientific54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypadGenesee Scientific59-172https://www.geneseesci.com
Wyciąg wyciągowyLabconco 3955220Siedzi na ławce laboratoryjnej
         Wymiana filtra  kat. # 6961300
Kuchnia: Piwowar' s Drożdże w proszkuSolgar   Zaopatrz się w Amazon lub sklepie ze zdrową żywnością
         https://www.solgar.com;
Jedzenie: Pokrzywa w proszku  (bez pestycydów)Starwest Botanicals209460-51
Jedzenie: Grzyby Shitake (wolne od pestycydów)Starwest Botanicals202127-5https://www.starwest-botanicals.com;
Jedzenie: Szpinak w proszku (bez pestycydów)Starwest Botanicals209583-5
Jedzenie: Słoma (bez pestycydów)Starwest Botanicals209465-3
Słoik: przezroczyste szkło, pokrywka polipropylenowaFisher Scientific:FB02911765średnica 73 mm, wys. 89 mm (240 ml)
https://www.fishersci.com;
Sonda igłowa, drewniana rączkaUS Geo Supply IncSKU: 4190Długa sonda 5,75 ",
igła ze stali nierdzewnej
https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Fiolki: szkło, preferowane:Wilmad LabGlass
Fiolkio średnicy wewnętrznej 38-33 mm, średnicy zewnętrznej 33 mm, wys. 9,5 cm
Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Fiolki: szkło (tańsze i ok) Fisher Scientific03-339-26HŚrednica zewnętrzna 29 mm, 9,5 cm h
  https://www.fishersci.com;  
Fiolki: szklane (nieco wąskie) Genesee Scientific 32-201Średnica zewnętrzna 24,5 mm, 9,5 cm h
thttps://www.geneseesci.com
Fiolki: polipropylen Genesee Scientific32-11428,5 mm średnica zewnętrzna, 9,5 cm ht
Zatyczki do fiolek rolka
z niechłonnej bawełnyFisher Scientific22-456881
gazaFisher Scientific22-055053https://www.fishersci.com;
na zamówienie ze szkła Wilmad

Bibliografia

  1. Lewin, H. A., et al. Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).
  2. Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).
  3. Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. Phylogeny of Diptera. Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).
  4. Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species. Insects. 14 (2), 173(2023).
  5. Metz, C. W. Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).
  6. Gerbi, S. A. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line - Soma Differentiation. Hennig, N. 13, Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 71-104 (1986).
  7. Gerbi, S. A. Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara). 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.", Chromosome Research.(special issue). Larracuente, A., Hanlon, S. 30, 273-288 (2022).
  8. Steffan, W. A. A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico. University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).
  9. Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats. Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).
  10. Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America. Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).
  11. Ševčík, J., et al. Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera). PeerJ. 4, e2563(2016).
  12. Menzel, F., et al. Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics. Insects. 15 (2), 118(2024).
  13. Meigen, J. W. Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn). 1 (1), Karl Reichard. Braunschweig. (1804).
  14. Johannsen, O. A. The fungus gnats of North America part I. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).
  15. Johannsen, O. A. Mycetophilidae of North America. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).
  16. Urban, J. M., et al. Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation. Genetics. (3), (2024).
  17. Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization. PLoS Biology. 20 (2), e3001559(2021).
  18. Urban, J. M., et al. High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing. BMC Genomics. 22, 643(2021).
  19. Baird, R. B., et al. Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods. Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).
  20. Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing. Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).
  21. Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Development of transformation for genome editing of an emerging model organism. Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).
  22. Metz, C. W., Smith, H. B. Further observation on the nature of the x-prime (X') chromosome in Sciara. Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).
  23. Crouse, H. V. X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila. Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).
  24. Metz, C. W., Ullian, S. S. Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera). Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).
  25. Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization. Chromosoma. 63, 39-55 (1977).
  26. Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).
  27. Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element. Chromosoma. 74, 219-239 (1979).
  28. Mok, E. H., et al. Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription. Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).
  29. Smith-Stocking, H. Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner. Genetics. 21 (4), 421-443 (1936).
  30. Gabrusewycz-Garcia, N. Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes. Chromosoma. 15, 312-344 (1964).
  31. Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription. Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).
  32. Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Anatomy and evolution of a DNA replication origin. Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).
  33. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  34. Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).
  35. de Saint Phalle, B., Sullivan, W. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis. Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).
  36. de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis. BioRxiv. , (2021).
  37. Bath, J. D., Sponsler, O. L. An alternative method for the culture of Sciara larvae. Science. 109 (2828), 255(1949).
  38. Forer, A. Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components. Methods Cell Biol. 25, Pt B 227-252 (1982).
  39. Gillespie, D. R. A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history. J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).
  40. Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).
  41. Hungerford, H. B. Sciara maggots injurious to potted plants. J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).
  42. Thomas, C. A. A method for rearing mushroom insects and mites. Entomol News. 40, 222-225 (1929).
  43. Austin, M. D., Pitcher, R. S. A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies. Entomol Mon Mag. 72, No. 860 12-15 (1936).
  44. Butt, F. H. Culture of Sciara. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publ. Co. Ithaca. 400-401 (1937).
  45. Hudson, E. K. Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea). J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).
  46. Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures. Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bradysia coprophilahodowla laboratoryjnaimprinting chromosomowywrzeciono monopolarnemacierzy ska determinacja p cichromosomy politenicznesekwencjonowanie genomuhodowla larw
Utrzymanie laboratoryjne muchówki dolnej Bradysia (Sciara) coprophila: nowy/stary wyłaniający się organizm modelowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.