Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66752

⸱

26 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Streszczenie

Komórki T (TFH) są postrzegane jako niezależna linia limfocytów T CD4+, która pomaga pokrewnym limfocytom B w wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie, tworząc w ten sposób długotrwałą odporność humoralną. Podczas ostrej infekcji wirusowej zaangażowanie w los specyficznych dla wirusa limfocytów TFH jest określane we wczesnej fazie infekcji, a badania wcześnie zróżnicowanych limfocytów TFH mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia zależnej od limfocytów T odporności humoralnej i optymalizacji projektu szczepionki. W badaniu, wykorzystując mysi model zakażenia wirusem ostrego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV) i transgenicznej myszy TCR-SMARTA (SM) z limfocytami T CD4 + specyficznie rozpoznającymi epitop glikoproteiny LCMV I-ABGP66-77, opisaliśmy procedury uzyskiwania dostępu do wczesnego zaangażowania losu specyficznych dla wirusa komórekT FH na podstawie barwień cytometrii przepływowej. Ponadto, wykorzystując transdukcję retrowirusową limfocytów T SM CD4+, opracowano również metody manipulowania ekspresją genów w wcześnie zróżnicowanych komórkach TFH specyficznych dla wirusa. W związku z tym metody te pomogą w badaniach nad mechanizmem (mechanizmami) leżącym u podstaw wczesnego zaangażowania limfocytówT FH specyficznych dla wirusa.

Wprowadzenie

Napotykając różne patogeny lub zagrożenia, naiwne limfocyty T CD4+ dostosowują swoje odpowiedzi immunologiczne poprzez różnicowanie się w różne podzbiory komórek pomocniczych T (TH) o wyspecjalizowanych funkcjach1. W scenariuszu ostrej infekcji wirusowej duża część naiwnych limfocytów T CD4 + różnicuje się w pęcherzykowe komórki pomocnicze T (TFH), które zapewniają pomoc limfocytom B2,3. W odróżnieniu od innych podzbiorów komórek TH CD4 + (np. Komórek TH1,T H2, TH9 i TH17), komórki TFH wyrażają znaczny poziom CXCR5, który jest receptorem chemokiny dla chemokiny naprowadzającej komórki B CXCL13, umożliwiając komórkom TFH migrację do pęcherzyków komórek B. W pęcherzykach limfocytów B limfocyty TFH pomagają pokrewnym limfocytom B w inicjowaniu i utrzymywaniu reakcji centrum rozrodczego, umożliwiając w ten sposób szybką produkcję przeciwciał o wysokim powinowactwie i długotrwałą pamięć humoralną2,3.

Po ostrym zakażeniu wirusowym, wczesne zaangażowanie w los specyficznych dla wirusa komórek TFH występuje w ciągu 72 h4,5i jest kontrolowane przez chłoniaka z komórek B represora transkrypcji-6 (Bcl-6)5,6,7,8, który działa jako "główny regulator" zarządzający TFH decyzje dotyczące losu komórki. Niedobór Bcl-6 poważnie stępia różnicowanie komórek TFH, podczas gdy ektopowa ekspresja Bcl-6 znacznie sprzyja zaangażowaniu komórek TFH w los. Oprócz Bcl-6 wiele cząsteczek bierze udział w instruowaniu wczesnego zaangażowania komórekT FH w los. Czynniki transkrypcyjne TCF-1 i LEF-1 inicjują różnicowanie komórek TFH poprzez indukcję Bcl-69,10,11. Hamowanie Blimp1, zarówno przez Bcl-6, jak i TCF-1, jest wymagane do wczesnego zaangażowania losu komórekT FH11,12. STAT1 i STAT3 są również wymagane do wczesnego różnicowania komórek TFH13. Poza tym modyfikacje epigenetyczne przez metylotransferazę histonową EZH214,15i metylotransferazę m6A METTL316 pomagają ustabilizować programy transkrypcyjne komórekT FH (zwłaszcza Bcl6 i Tcf7), a tym samym przygotować wczesne zaangażowanie losu komórekT FH. Podczas gdy postępy, w tym wyżej wymienione cząsteczki i inne, podsumowane w innym miejscu3, zostały poczynione w celu zrozumienia transkrypcyjnych i epigenetycznych regulacji zaangażowania wczesnych komórekT FH w los, wcześniej nieznane cząsteczki pozostają do poznania.

W mysim modelu zakażenia wirusem ostrego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), adoptyjnie przenoszone kongeniczne TCR-transgeniczne limfocyty T CD4+ SMARTA (SM), które specyficznie rozpoznają epitop glikoproteiny LCMVI-A bGP66-77, ulegają różnicowaniu komórek TFH lub TH1 podczas infekcji wirusowej. Ten wzorzec różnicowania bifurkacji TFH/T H1 wspiera postęp modelu zakażenia SM / ostrego LCMV w badaniu biologii komórek TFH specyficznych dla wirusa. Rzeczywiście, model ostrego zakażenia SM/LCMV jest szeroko stosowany w dziedzinie badań nad komórkami TFH i odegrał kluczową rolę w przełomowych odkryciach w biologii komórek TFH. Obejmuje to identyfikację wspomnianego wcześniej Bcl-6 jako czynnika transkrypcyjnego definiującego linię komórek TFH5,6, a także inne ważne czynniki transkrypcyjne (np. Blimp-16, TCF-1/LEF9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218, oraz Itch19) kierujące różnicowaniem komórekT FH, regulacjami potranskrypcyjnymi (np. METTL316 i miR-17~9220) różnicowania komórek TFH, pamięci i plastyczności komórek TFH21,22 oraz racjonalnych strategii szczepień ukierunkowanych na komórkiT FH (np. selenium23).

Obecne badanie opisuje powtarzalne metody dostępu do wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH, w tym (1) stworzenie ostrego modelu myszy SM chimery zakażonego LCMV, odpowiedniego do uzyskania dostępu do wcześnie zróżnicowanych komórek TFH, (2) przeprowadzanie barwienia cytometrią przepływową cząsteczek związanych z wcześnie różnicowanymi komórkami TFH, oraz (3) przeprowadzanie manipulacji genami w SM CD4+ opartej na wektorach retrowirusowych. Limfocyty T. Metody te będą przydatne w badaniach nad wczesnym zaangażowaniem komórekT FH specyficznych dla wirusa we wczesnym losie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. W niniejszym badaniu wykorzystano następujące szczepy myszy: mysz C57BL/6J (B6) (obojga płci), w wieku od 6 do 8 tygodni, o masie ciała 25-30 g; Mysz transgeniczna CD45.1+SM TCR (transgeniczna B6 CD45.1 × SM TCR), obojga płci, w wieku od 6 do 8 tygodni, o masie ciała 25-30 g; oraz mysz transgeniczna CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × transgeniczna × CXCR5-GFP knock-in), obojga płci, w wieku od 6 do 8 tygodni, o masie ciała 25-30 g. Gatunki transgeniczne zostały wygenerowane na podstawie wcześniej opublikowanego raportu24. Szczegółowe informacje na temat odczynników, i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zbieranie limfocytów T CD45.1+ SM CD4+ do transferu adoptywnego

  1. Poddaj eutanazji (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) wymaganą liczbę myszy transgenicznych SM CD45.1 + TCR w wieku od 6 do 8 tygodni24. Wykonaj 1-calowe nacięcie po lewej stronie ściany otrzewnej myszy poddanych eutanazji za pomocą nożyczek chirurgicznych, wypreparuj śledziony z otrzewnej i rozerwij tkankę łączną za śledzioną25,26.
  2. Umieścić każdą śledzionę w sitku o wielkości 70 μm na szalce Petriego (60 mm × 15 mm) i zmielić śledzionę za pomocą 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Użyj okrągłej strony tłoka strzykawki, aby rozdrobnić śledzionę, aż pozostanie tylko tkanka łączna.
  3. Dodaj 6 ml RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) do każdego naczynia, aby rozcieńczyć 3 ml buforu do lizy RBC. Odpipetować zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z naczynia. Opłucz naczynie dodatkowymi 3 ml 2% RPMI i przenieś do tej samej stożkowej probówki.
  4. Odwirować zawiesiny komórek o stężeniu 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez dekantację. Ponownie zawieś komórki za pomocą bufora izolacyjnego i dostosuj gęstość komórek do ~1 × 108 komórek na ml. Umieść rurkę na lodzie.
  5. Przygotuj 1x biotynylowany koktajl przeciwciał przeciwko CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c i Ter119 w buforze izolacyjnym w celu wzbogacenia limfocytów T CD4 +.
    UWAGA: Dodać biotynylowane przeciwciała do buforu izolacyjnego we wskazanym rozcieńczeniu, jak podano w Tabeli Materiałów. Utrzymuj objętość koktajlu przeciwciał na tym samym poziomie, co objętość buforu izolacyjnego w kroku 1.4.
  6. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez dekantację.
  7. Zawiesić osad komórkowy ze wskazanym 1x biotynylowanym koktajlem przeciwciał w stożkowej probówce.
  8. Połóż stożkową rurkę na lodzie w wytrząsarce na 30 minut przy 45 obr./min.
  9. Podczas inkubacji z biotynylowanymi przeciwciałami należy przygotować wymaganą objętość kulek pokrytych streptawidyną zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Całkowita liczba splenocytów od jednej naiwnej myszy potrzebuje 200 μl kulek pokrytych streptawidyną.
  10. Przemyć komórki przez odwirowanie w temperaturze 800 x g z 8-10 ml buforu izolacyjnego przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
  11. Zawiesić osad komórkowy za pomocą przygotowanych kulek pokrytych streptawidyną.
  12. Połóż rurkę na lodzie w wytrząsarce na 40 minut przy 45 obr./min.
  13. Następnie umieść rurkę na stojaku magnetycznym na 3-4 minuty, aż wszystkie koraliki zostaną zmontowane po stronie magnetycznej.
  14. Ostrożnie zebrać supernatant i przenieść go do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  15. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez dekantację><. UWAGA: Dostępne są inne komercyjne zestawy do wzbogacania limfocytów T CD4 +, które można stosować jako substytuty procedury wzbogacania limfocytów T CD4 + opisanej w krokach 1.5-1.15.
  16. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2-3 ml 2% RPMI. Odessać 50 μl zawiesiny komórkowej do analizy cytometrii przepływowej skuteczności wzbogacania limfocytów T CD4 + (CD4 i Vα2) i żywotności komórek.
  17. Odwirować zawiesiny komórek o stężeniu 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez dekantację. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą RPMI i dostosować gęstość komórek do 1 ×10 7 komórek CD4 + Vα2 + SM na ml. Połóż rurkę na lodzie i przejdź do adoptywnego transferu komórek w następnym kroku.

2. Opracowanie modelu myszy SM z ostrą chimerą zakażoną LCMV w celu uzyskania dostępu do wcześnie zróżnicowanych komórek SM TFH

  1. Ogrzej myszy w wieku od 6 do 8 tygodni biorcy C57BL/6 lampą podczerwieni, aby rozszerzyć żyłę ogonową do wstrzyknięcia dożylnego.
  2. Odessać 100 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 1 × 106 komórek SM przygotowanych w kroku 1.17 za pomocą strzykawki insulinowej.
    UWAGA: Objętość wstrzykniętej dawki powinna być modyfikowana przez każdego badacza i nie powinna przekraczać maksymalnej objętości wstrzyknięcia dozwolonej przez prawo instytucjonalne i lokalne.
  3. Przytrzymaj myszy na miejscu za pomocą utrwalacza myszy, wyprostuj ogon i przetrzyj ogon 75% etanolem za pomocą wacika, aby żyła ogonowa była widoczna
    4. .
  4. Wprowadzić igłę strzykawki insulinowej do żyły ogonowej i wstrzykiwać zawiesiny komórkowe płynnie i powoli. Następnie pozwól myszom biorcom odpocząć przez noc.
  5. Następnego dnia rozcieńczyć zapas wirusa Armstronga LCMV pożywką RPMI, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 × 107 jednostek tworzących płytki miażdżycowe/ml.
  6. Wstrzyknąć 100 μl rozcieńczonego roztworu LCMV Armstronga (zawierającego 1 ×10 6 jednostek tworzących płytkę nazębną) do żyły ogonowej myszy biorcy.
    UWAGA: Każdy badacz powinien zachować ostrożność co do tego, czy zalecane miano infekcji jest dozwolone przez prawo instytucjonalne i lokalne.

3. Barwienie metodą cytometrii przepływowej wcześnie zróżnicowanych komórek SM TFH

  1. Uśmierc myszy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) od kroku 2.6 w 3 dniu po zakażeniu i przetwarzaj limfocyty ze śledziony zgodnie z opisem w kroku 1. Dostosuj gęstość komórek do około 2 × 107 komórek na ml.
  2. Załaduj 50 μl zawiesin komórkowych (~1 × 106 komórek) na okrągłodenną 96-dołkową płytkę i uzupełnij 150 μl buforu barwiącego na studzienkę. Trzymaj talerz na lodzie.
  3. Przygotować oczyszczony koktajl przeciwciał anty-mysich CXCR5 (tj. przeciwciało pierwszorzędowe CXCR5) w rozcieńczeniu 1:50 w 50 μl buforu do barwienia komórek TFH dla każdej próbki w probówce. Dokładnie zwirować probówkę i odwirować ją w temperaturze 15 000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w celu agregacji cząstek. Trzymaj probówkę na lodzie.
  4. Odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 200 μl buforu barwiącego do każdego dołka.
  5. Powtórz krok 3.4 i ponownie zawieś komórki z 50 μl przeciwciała pierwszorzędowego CXCR5 na dołek. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
  6. Przygotować koktajl biotynylowanych kozich przeciwciał antyszczurzych (tj. przeciwciało drugorzędowe CXCR5) w rozcieńczeniu 1:200 w 50 μl buforu do barwienia komórek TFH dla każdej próbki w nowej probówce. Wirować probówkę i odwirowywać ją przy 15 000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w celu agregacji cząstek. Trzymaj probówkę na lodzie.
  7. Odwirować płytkę w temperaturze 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 200 μl buforu barwiącego do każdego dołka.
  8. Powtórz krok 3.7 dwa razy i trzymaj talerz na lodzie.
  9. Dodać 50 μl przeciwciała wtórnego CXCR5 na dołek do płytki. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut.
  10. Przygotować streptawidynę sprzężoną z fluorescencją (tj. trzeciorzędowe przeciwciało CXCR5) w rozcieńczeniu 1:200 w 50 μl buforu do barwienia komórek TFH dla każdej próbki. W międzyczasie dodaj inne przeciwciała przeciwko markerom powierzchniowym (np. CD45.1, CD4, PD-1, CD25 i innym zainteresowanym cząsteczkom) oraz barwienie martwych komórek wraz z trzeciorzędowym przeciwciałem CXCR5.
  11. Wirować probówkę i odwirowywać ją w temperaturze 15 000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w celu agregacji cząstek. Trzymaj probówkę na lodzie.
  12. Odwirować płytkę w temperaturze 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 200 μl buforu barwiącego do każdego dołka.
  13. Powtórz krok 3.12 dwa razy i trzymaj talerz na lodzie.
  14. Dodaj 50 μl trzeciorzędowego koktajlu przeciwciał CXCR5 na dołek do płytki. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
  15. Przygotować 200 μl buforu utrwalającego/przepuszczalnego dla każdej studzienki zgodnie z instrukcjami producenta.
  16. Odwirować płytkę w temperaturze 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 200 μl buforu barwiącego do każdego dołka.
  17. Powtórz krok 3.16 dwa razy i trzymaj talerz na lodzie w ciemności.
  18. Dodać 200 μl buforu do utrwalania/przepuszczalności do każdej studzienki. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół i inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut (w ciemności).
    UWAGA: Przygotować bufor permeabilizacyjny (1x) zgodnie z zaleceniami producenta.
  19. Przygotuj koktajl przeciwciał przeciwko czynnikom transkrypcyjnym, w tym Bcl-6, TCF-1, T-bet i innym zainteresowanym cząsteczkom, w 50 μl buforu permeabilizacji (1x) dla każdej studzienki w nowej probówce.
  20. Wirować probówkę i odwirowywać przy 15 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w celu agregacji cząstek.
  21. Odwirować płytkę w temperaturze 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 50 μl koktajlu przeciwciał z czynnikiem transkrypcyjnym do dołka. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut w ciemności.
  22. Odwirować płytkę przy 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant, krótko zawirować płytkę przez dekantację i dodać 200 μl buforu permeabilacyjnego (1x) do każdego dołka.
  23. Powtórz krok 3.22.
  24. Dodać 200 μl buforu barwiącego do każdej studzienki, odwirować płytkę o stężeniu 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez dekantację i krótko zawirować płytkę.
  25. Zawiesić osad komórkowy w każdym dołku za pomocą 200 μl buforu barwiącego i przenieść komórki do probówek cytometrii przepływowej w celu natychmiastowej analizy cytometru przepływowego.
    UWAGA: Alternatywnie, próbki można wykryć w ciągu 3 dni w warunkach dodania 200 μl 2% PFA do każdej probówki i przechowywania w temperaturze 4 °C w ciemności.

4. Produkcja retrowirusów

  1. Hodować komórki 293T (z mniej niż dziesięcioma pasażkami) z pożywką DMEM 10% w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm przez czas 2-3 pasaży.
  2. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, wyrzuć starą pożywkę i delikatnie umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie krótką trypsynizację komórek 293T przy użyciu 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej przez 1 min.
  3. Zatrzymać proces trawienia poprzez ponowne zawieszenie komórek w 2 ml wstępnie podgrzanej 10% pożywki DMEM, przeniesienie ich do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirowanie przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy, pipetując w górę i w dół pożywkę hodowlaną z 2 ml wstępnie podgrzanej 10% pożywki DMEM.
  5. Określ ilościowo liczbę komórek i płytki 5 × 105 komórek w 2,5 ml 10% pożywki DMEM na dołek w płytce 6-dołkowej.
    UWAGA: Delikatnie zakręć naczyniem, aby komórki 293T równomiernie rozprowadziły się po całej płycie.
  6. Gdy konfluencja komórek 293T przekroczy 80%, przygotuj odczynniki do transfekcji zgodnie z opisem w krokach od 4.7 do 4.9.
  7. Do każdego dołka na płytce 6-dołkowej dodać 250 μl wstępnie podgrzanej pożywki Opti-MEM do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 3 μg plazmidowego DNA (zawierającego 2 μg wektora retrowirusowego i 1 μg pCL-Eco) do pożywki Opti-MEM, a następnie delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
    UWAGA: Wektory retrowirusowe użyte jako przykłady w tym badaniu to MigR1 i zmodyfikowany wektor MigR1 z regionem CDS Bcl6 w górę IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Następnie dodaj 7,5 μl wstępnie podgrzanego odczynnika do transfekcji (uzyskanego w handlu) do mieszaniny i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
  9. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  10. Dozuj mieszaninę kroplami do różnych obszarów dołka z hodowlą komórkową 293T, a następnie delikatnie kołysz naczyniem hodowlanym w przód iw tył oraz na boki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszaniny.
  11. Inkubować komórki 293T przez 72 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 .
  12. Wykryj znacznik wektora retrowirusowego jako wskaźnik skuteczności transfekcji w transfekowanych komórkach 293T za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Na przykład potwierdziliśmy sygnał fluorescencji GFP w znacznej części komórek 293T transfekowanych wektorem MigR1, co sugeruje transfekcję wysokiej jakości.
  13. Zebrać pożywkę do hodowli komórkowych i odwirować przy 2 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wyeliminowania resztek komórkowych. Otrzymany supernatant powinien być starannie zebrany i przechowywany w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C lub tymczasowo przechowywany w temperaturze 4 °C.

5. Aktywacja in vivo, transdukcja retrowirusa i adoptywny transfer limfocytów T SM CD4+

    Wstrzyknij dożylnie jedną mysz CD45.1+ SM (w wieku od 6 do 8 tygodni) z 200 μg peptydu LCMV GP61-7711,14 w objętości 100 μL pożywki RPMI.
  1. UWAGA: Objętość wstrzykniętej dawki powinna być modyfikowana przez każdego badacza i nie przekraczać maksymalnej objętości wstrzyknięcia dozwolonej przez instytucję i lokalne prawo.
  2. Poddaj mysz eutanazji SM po 16-18 godzinach od wstrzyknięcia peptydu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Pozyskaj splenocyty zgodnie z wyżej wymienionymi procedurami w kroku 1.
    UWAGA: Alternatywnie, metoda stymulacji in vitro anty-CD3/anty-CD28 27,28 może być użyta do aktywacji limfocytów T SM CD4+ zamiast stymulacji peptydowej in vivo opisanej w krokach 5.1 i 5.2.
  3. Zawieś splenocyty z 2% RPMI i dostosuj gęstość komórek do około 1 × 108 komórek na ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Trzymaj probówkę na lodzie.
  4. Dozować 50 μl zawiesiny komórkowej do okrągłodennej 96-dołkowej płytki i uzupełnić 150 μl buforu barwiącego na dołek.
  5. Odwirować 96-dołkową płytkę o stężeniu 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek, ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 200 μl buforu barwiącego do każdego dołka.
  6. Powtórz krok 5.5 i ponownie zawieś komórki za pomocą 50 μl powierzchniowego koktajlu przeciwciał, w tym CD4, CD25 i CD69, aby wykryć stan aktywacji limfocytów T SM CD4 +. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
  7. Uzupełnić każdą studzienkę buforem barwiącym do 200 μl, a następnie odwirować płytkę o stężeniu 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez dekantację i krótko zawirować płytkę.
  8. Powtórz krok 5.7 dwa razy.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.
  10. Analizuj komórki barwione przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić stan aktywacji limfocytów T SM CD4 +.
    UWAGA: Aktywowane limfocyty T SM CD4 + wykazywały obfite ekspresje CD25 i CD69 w porównaniu z komórkami naiwnymi, umożliwiając w ten sposób późniejsze procedury transdukcji.
  11. Dodaj 1 × 106 limfocytów T SM CD4+ (z kroku 5.3) na dołek do płytki 24-dołkowej. Odwirować komórki w temperaturze 800 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie usunąć pożywkę przez dekantację.
  12. Dodać 1 ml pożywki retrowirusowej, jak opisano w kroku 4.13 i 8 μg polibrenu do każdej studzienki.
  13. Wirować komórki w temperaturze 800 × g przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  14. Ostrożnie wyrzuć pożywkę retrowirusową przez pipetowanie i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego 10% RPMI uzupełnionego 10 ng / ml rekombinowanej mysiej IL-2 do każdej studzienki.
  15. Inkubować komórki przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 .
  16. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 800 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Usunąć supernatant przez dekantację i ponownie zawiesić komórki o odpowiedniej objętości 2% RPMI, aby uzyskać gęstość komórek 1 ×10 8 komórek na ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Trzymaj probówkę na lodzie.
  18. Dozować 50 μl zawiesiny komórkowej do okrągłodennej 96-dołkowej płytki i uzupełnić 150 μl buforu barwiącego na dołek.
  19. Odwirować 96-dołkową płytkę o stężeniu 800 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek, ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację, krótko zawirować płytkę i dodać 200 μl buforu barwiącego do każdego dołka.
  20. Powtórz krok 5.19 i ponownie zawieś komórki za pomocą 50 μl powierzchniowego koktajlu przeciwciał, w tym CD4, Vα2 i przeciwciała związanego ze znacznikiem wektora. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
  21. Uzupełnić każdą studzienkę buforem barwiącym do 200 μl, a następnie odwirować płytkę o stężeniu 800 × g przez 1 minutę. Odrzucić supernatant przez dekantację i krótko zawirować płytkę.
  22. Powtórz krok 5.21 dwa razy.
  23. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.
  24. Analizuj komórki barwione przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić skuteczność transdukcji w limfocytach T SM CD4 +.
    UWAGA: Skutecznie transdukowane limfocyty T SM CD4 + wykazywały w badaniu wysoką ekspresję znacznika retrowirusa, takiego jak GFP.
  25. Odwirować zawiesiny komórek z etapu 5.17 w temperaturze 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez dekantację. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą RPMI i dostosować gęstość komórek do 1 ×10 7 komórek CD4 + Vα2 + SM / ml.
  26. Adoptywnie przenieś całkowitą liczbę 1 × 106 limfocytów T CD45.1 + SM CD4 + do każdej myszy biorcy C57BL / 6 (w wieku od 6 do 8 tygodni) przez dożylne wstrzyknięcie 100 μl zawiesiny komórkowej w kroku 5.25.
  27. Następnego dnia należy zainfekować myszy biorcy C57BL/6 za pomocą 1 × 106 jednostek tworzących płytki nazębne LCMV Armstrong poprzez wstrzyknięcie dożylne.

6. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek SM TFH transdukowanych retrowirusem we wczesnym stadium ostrego zakażenia LCMV

  1. Uzyskaj splenocyty od myszy C57BL/6 z kroku 5.25 w 3 dniu po zakażeniu.
  2. Wykonaj barwienie cytometrią przepływową markerów powierzchniowych, w tym CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 i innych zainteresowanych cząsteczek, w splenocytach, jak opisano w kroku 3.
  3. W celu wykrycia czynników transkrypcyjnych w limfocytach T SM CD4 + transdukowanych retrowirusem znakowanym białkami fluorescencyjnymi, dodaj 200 μl 2% PFA do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.
  4. Wykonaj fiksację/przepuszczalność, barwienie cytometrią przepływową zainteresowanych czynników transkrypcyjnych i wykonaj analizę cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w kroku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka wcześnie zróżnicowanych wirusowo-specyficznych komórek TFH podczas ostrej infekcji LCMV
Aby zbadać wczesne determinowanie losów wirusowo-specyficznych komórek TFH, naiwne kongeniczne komórki T SM CD4+, które specyficznie rozpoznają epitop LCMV GP I-AbGP66-77, przeniesiono adoptywnie do biorców C57BL/6 CD45.2+. Następnego dnia biorcy ci zostali zainfekowani dożylnie wysoką dawką wirusa LCMV Armstrong w modelu ostrej infe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania w dziedzinie limfocytów TFH zostały podkreślone od czasu odkrycia wyspecjalizowanej funkcji komórek TFH we wspomaganiu komórek B. Coraz więcej badań wykazało, że różnicowanie komórek TFH jest procesem wieloetapowym i wieloczynnikowym30, w którym zaangażowanie komórek TFH w los określa się we wczesnym stadium5. Dlatego lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wcześnie różnicujących się limfocytów TFH ma ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32300785 do X.C.), Chińskiego Narodowego Programu Podoktorskiego dla Innowacyjnych Talentów (No. BX20230449 do X.C.) oraz National Science and Technology Major Project (nr 2021YFC2300602 do L.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% roztwór utrwalający paraformaldehyd, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μ m sitko komórkoweMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anty-mysie TCR Vα 2 (klon B20.1)Biolegend127812rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 700 anty-mysie CD45.1 (klon A20)Biolegend110724rozcieńczenie 1:200
APC anty-mysie CD25 (klon PC61)Biolegend1019101:200 rozcieńczenie
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) myszLaboratorium Jacksona002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotyna anty-mysie przeciwciało F4/80 (klon BM8)Biolegend123106rozcieńczenie 1:200
Biotyna Szczur anty-mysz CD11c (klon N418)Biolegend1173041:200 rozcieńczenie
Biotyna Szczur anty-mysz CD19 (klon 6D5)Biolegend115504Rozcieńczenie 1:200
Biotyna Szczur anty-mysi CD8a (klon 53-6,7)Biolegend1007041:200 rozcieńczenie
Biotyna Szczur anty-mysz NK-1.1 (klon PK136)Biolegend1087041:200 rozcieńczenie
Biotyna Szczur anty-mysie TER-119 / Komórki erytroidalne (klon TER-119)Biolegend1162041:200 rozcieńczenie
albuminy surowicy bydlęcej, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (klon 4B10)Biolegend644816rozcieńczenie 1:100
Brilliant Violet 605 anty-mysz CD279 (PD-1) (klon 29F.1A12)Mysz Biolegend1352201:200 rozcieńczenie
C57BL/6J (B6)
CXCR5-GFPW domu; linia myszy knock-in CXCR5-GFP została wygenerowana przez wstawienie konstrukcji IRES-GFP po otwartej ramce odczytu Cxcr5.
DMEM 10% pożywkaDMEM zawierająca 10%
pożywki FBS Pożywka DMEMGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Surowica bydlęca płodu, FBSSigmaF8318
FlowJo (wersja 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnegoInvitrogen00-5523-00Zestaw zawiera trzy odczynniki: a. Koncentrat utrwalający/przepuszczalny (4X); b. Rozcieńczalnik utrwalający / przepuszczalny; c. Bufor do przepuszczalności.
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L), biotynylowanelaboratoria wektoroweBA-9400-1.5Rozcieńczenie 1:200
System automatycznego obrazowania komórek Invitrogen EVOS FLBufor
Bufor izolacyjny FACS zawierający 0,5% peptydu BSA i 2mM EDTA
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nmLife TechnologiesL10199Rozcieńczenie 1:200
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anty-mysz CD69 (klon H1.2F3)Biolegend104508Rozcieńczenie 1:200
PE Mysz anty-Bcl-6 (klon K112-91)BD Biosciences561522rozcieńczenie 1:50
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CXCR5 (klon 2G8)BD Biosciences5519611:50 rozcieńczenie
Szczur monoklonalny PerCP anty-mysz CD4 (klon RM4-5)Biolegend1005381:200 rozcieńczenie
rekombinowana mysia IL-2Gibco212-12-1MG
Bufor do lizy czerwonych krwinekBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 średniSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 zawierający 2% FBS
SMARTA (SM) Transgeniczna mysz TCRLinia transgeniczna SM TCR w naszym laboratorium to prezent od dr Rafi Ahmeda (Emory University). Dodatkowo, tę linię myszy można również uzyskać z The Jackson Laboratory (plama #: 030450).
BuforPBS zawierający 2% FBS i 0,01% NaN3
Streptawidyna PE-cyjanina7eBioscience25-4317-82Rozcieńczenie 1:200
TCF1/TCF7 (C63D9) MAb królika (koniugat Alexa Fluor 488) Technologia sygnalizacji komórkowej6444SRozcieńczenie 1:400
Bufor do barwienia komórek TFH,Bufor FACS zawierający 1% BSA i 2%
odczynnik TransIT-293Mirus BioMIRUMIR2700
Mysz reporterowa Jackson Laboratory 000664 izolacyjny ThermoFisher Scientific LCMV GP61-77 (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chińska firma peptydowa barwiący w surowicy myszy

Bibliografia

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931(2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

limfocyty T pomocnicze folikularnewirusowo specyficzne limfocyty Tostra infekcja LCMVcytometria przepływowatransdukcja retrowirusowalimfocyty T CD4-dodatniewczesne różnicowanie limfocytów Tekspresja BCL6determinacja losu limfocytów Tprojektowanie szczepionek
Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.