Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Podsumowanie

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Streszczenie

Pomimo tego, że są to pozbawione jądra fragmenty komórek, płytki krwi są obecnie powszechnie rozpoznawane ze względu na swoje wieloaspektowe zdolności. Nie tylko tworzą skrzepy krwi, aby zapobiec krwawieniu po urazie, ale także zwalczają infekcje i utrzymują integralność naczyń krwionośnych podczas chorób zapalnych. Podczas gdy czopy hemostatyczne wymagają zbiorowej aktywacji i agregacji płytek krwi, ich rola w ochronie naczyń krwionośnych objętych stanem zapalnym jest wykonywana na poziomie pojedynczych komórek. W tym kontekście ostatnie dane wykazały, że płytki krwi mogą migrować autonomicznie, co zależy od mechanowykrywania ich adhezji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół obrazowania migracji pojedynczych płytek krwi, wykorzystujący trójwarstwowy system powlekania składający się ze szkieletu poli-L-lizynowego z poli(glikolu etylenowego) (PLL-PEG)-biotyny (1), fluorescencyjnego łącznika awidyny (2) i biotynowo-cyklicznego Arg-Gly-Asp (cRGD) (3) jako motywu wiążącego integrynę płytkową. To redukcjonistyczne podejście pozwala na precyzyjną kontrolę właściwości adhezji substratu i służy jako prosty, standaryzowany test in vitro do badania mechanizmów leżących u podstaw migracji płytek krwi. Wyniki wskazują, że migrujące płytki krwi wiążące się z cRGD wywierają siły zdolne do przerwania wiązania awidyna-biotyna. Ponadto gęstość biotyny-cRGD znacząco wpływa zarówno na rozprzestrzenianie się płytek krwi, jak i migrację.

Wprowadzenie

Płytki krwi to małe fragmenty komórek jądrzastych pochodzące z megakariocytów w szpiku kostnym. Aktywowane płytki krwi łączą się w agregaty, które stanowią podstawę skrzepu krwi, aby uszczelnić zmiany naczyniowe w fizjologicznej hemostazie lub zamknąć chore naczynia krwionośne w patologicznej zakrzepicy¹. Jednak w ostatnich dziesięcioleciach stało się jasne, że płytki krwi odgrywają również kluczową rolę w patofizjologii stanu zapalnego, infekcji i nowotworów złośliwych, gdzie wieloaspektowe interakcje z komórkami odpornościowymi, komórkami rakowymi i atakującymi patogenami mają kluczowe znaczenie dla kształtowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza^2,3. Ostatnie dane wykazały, że płytki krwi mają zdolność do autonomicznej migracji⁴. W odpowiedzi na bakteriemię ogólnoustrojową płytki krwi są rekrutowane do sinusoid wątroby, gdzie przylegają i migrują. Migracja umożliwia płytki krwi wychwytywanie i wiązanie bakterii, co z kolei wspomaga aktywację leukocytów. Warto zauważyć, że płytki krwi pozostają wewnątrznaczyniowe podczas tego procesu i nie migrują do tkanki podśródbłonkowej ⁴. Ponadto płytki krwi są strażnikami zapalenia naczyń krwionośnych, skanując naczynia krwionośne w stanie zapalnym w poszukiwaniu mikrourazów spowodowanych przez wynaczynione komórki odpornościowe⁵ i wykorzystując migrację do ochrony naczyń krwionośnych w stanie zapalnym6^,7. W tym przypadku płytki krwi wykorzystują swoje integryny do wiązania fibrynogenu odkładającego się na śródbłonku objętym stanem zapalnym. Płytki krwi następnie tworzą blaszkowate wypukłości, które pozwalają im skanować właściwości adhezyjne ich środowiska. Płytki krwi następnie polaryzują się i migrują w kierunku większej gęstości fibrynogenu, proces znany jako haptotaksja. Ukierunkowana migracja płytek krwi ostatecznie wspomaga pozycjonowanie w mikrouszkodzeniach śródbłonka, które zapobiegają krwawieniu w tkankach objętych stanem zapalnym, w tym w mięśniach i płucach.

Migracja płytek krwi jest krytycznie zależna od właściwości mechanicznych podłoża adhezyjnego^4,8. Zadanie wykrywania i przekształcania właściwości mechanicznych środowiska jest przede wszystkim pośredniczone przez receptory integrynowe, które są transbłonowymi białkami heterodimerycznymi złożonymi z podjednostki α i β, przy czym domena zewnątrzkomórkowa wiąże się z ligandem na macierzy zewnątrzkomórkowej, a domena wewnątrzkomórkowa wiąże się z cytoszkieletem aktyny za pośrednictwem białek adaptorowych^9,10. Najliczniej występującą integryną płytkową jest α_IIbβ_3, a jej głównym ligandem jest fibryna(ogen)¹¹. Zaangażowanie integryna-ligand wyzwala zdarzenia sygnalizacyjne, których kulminacją jest tworzenie blaszki sterowanej przez Arp2/3, która tworzy krawędź czołową przylegającego płytki krwi⁷. Przylegające płytki krwi natychmiast badają właściwości mechaniczne swojego adhezyjnego środowiska, ciągnąc je⁴. Kiedy zależne od miozyny IIa siły ciągnące pokonują mechaniczną stabilność macierzy zewnątrzkomórkowej (np. fibryny (genu)), płytki krwi mechanicznie rozrywają osłabione ligandy i wykorzystują ich blaszkowate występy do skanowania mikrośrodowiska w poszukiwaniu ligandów adhezyjnych, ustanawiania nowych wiązań substratowych i migracji z dala od środowiska zubożonego w ligand⁶. Migracja komórek napędzana przez nieproteolityczne, mechaniczne zubożenie ligandów prawdopodobnie odgrywa rolę wykraczającą poza funkcję płytek krwi, ponieważ wydaje się, że jest to ogólne zjawisko obserwowane w komórkach zdolnych do mechanicznej przebudowy ich macierzy adhezyjnej⁸. Szybkość wyczerpywania się ligandów określa prędkość migracji i zależy zarówno od stabilności liganda, jak i gęstości ligandu substratu⁸. Płytki krwi o niskiej gęstości ligandów są w stanie mechanicznie rozbijać zmodyfikowane ligandy integrynowe (cykliczne Arg-Gly-Asp (cRGD))^6,7 związane ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi za pomocą wiązań biotyna-awidyna o sile rozwiązywania około 160 pikonewtonów (pN)^12,13,14,15.

Tutaj te obserwacje są wykorzystywane do opracowania prostego protokołu in vitro do generowania labilnych powierzchni adhezyjnych ligandów, ułatwiając badanie mechanizmów migracji płytek krwi. Powłoka adhezyjna opisana w niniejszym protokole składa się z trzech zasadniczych elementów: (1) szkieletu PLL-PEG-biotyny oraz (2) łącznika izotiocyjanianu neutrawidyny-fluoresceiny (NA-FITC), który ułatwia wiązanie (3) biotyny-cRGD (liganda adhezyjnego) ze szkieletem PLL-PEG-biotyna (patrz również Rysunek 1B). Stabilność tego konstruktu zależy od siły wiązania biotyna-awidyna, które może pęknąć na granicy faz (A) PLL-PEG-biotyna-NA-FITC lub (B) FITC-NA-BIOTYNA-cRGD. Ponadto gęstość ligandów adhezyjnych można dostosować, dostosowując stosunek PLL-PEG-biotyny do PLL-PEG w dolnej warstwie. Przerwanie wiązania (A) powoduje uwolnienie FITC z powłoki, co prowadzi do zmniejszenia sygnału fluorescencji pod migrującymi płytkami krwi. Powłoka opisana w tym protokole umożliwia zatem precyzyjne dostrajanie właściwości mechanicznych i adhezyjnych podłoża oraz zapewnia łatwy fluorescencyjny odczyt migracji płytek krwi.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi dotyczącymi badań na myszach i zostały zatwierdzone przez lokalne przepisy dotyczące ochrony zwierząt (Regierung von Oberbayern, Monachium, 190-15, 2015). W badaniu wykorzystano samice i samce myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni (masa ciała 20-25 g). Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Powłoka cRGD biotyna-neutrawidyna-biotyna

1. Sonizować szklane szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm; # 1,5) w obrębie 20% HNO₃ przez 1 minutę, a następnie sonikować w izopropanolu, etanolu i_H2Oprzez 1 minutę. Po każdej sonikacji należy dokładnie wypłukać szkiełka nakrywkowe w wodzie destylowanej (ddH₂O), a na koniec wysuszyć je w inkubatorze.
2. Wstępnie oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy traktować plazmą_O2 w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez 2 minuty, a następnie złożyć z lepkimi szkiełkami, jak opisano wcześniej¹⁶. Lepkie szkiełka podstawowe i szklane szkiełka nakrywkowe utworzą między nimi kanał (jak pokazano w Rysunek 1A).
   UWAGA: Ważna jest skuteczna obróbka plazmowa. Użyj O₂ jako źródła plazmy.
3. Napełnij kanał 2,5 μl PLL-PEG-biotyny (1 mg/ml) rozcieńczonej w 97,5 μl PLL-PEG (1 mg/ml) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przemyj trzykrotnie PBS. PLL-PEG-biotyna wiąże neutrawidynę w następnym etapie, podczas gdy szkielet PLL-PEG tworzy obojętny substrat, który zapobiega niespecyficznemu wiązaniu białek i płytek krwi.
   UWAGA: Stężenie PLL-PEG-biotyny w roztworach powlekających określa końcową gęstość ligandów cRGD.
4. Dodać 100 μl Neutravidin-FITC (25 μg/ml) i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć trzykrotnie PBS.
   UWAGA: Dostosuj stężenie neutrawidyny-FITC do stężenia PLL-PEG-biotyny. Zwiększyć stężenie neutrawidyny-FITC, jeśli powlekane są wyższe gęstości PLL-PEG-biotyny.
5. Dodać 100 μl cyklo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys (Biotin-PEG-PEG)] (cRGD-biotyny) (0,1-1 μM), inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemyć trzykrotnie PBS. Szkiełka nakrywkowe są gotowe do użycia. Schemat powłoki jest przedstawiony w Rysunek 1B.

2. Izolacja płytek krwi myszy od krwi

1. Przygotuj zmodyfikowany bufor Tyrode'a, który zawiera 136,9 mM NaCl, 12,1 mM NaHCO₃, 2,6 mM KCl, 5,5 mM glukozy, 10 mM HEPS i dostosuj pH do 7,4 i 6,5.
2. Znieczulenie myszy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5 mg/kg fentanylu, 5 mg/kg midazolamu i 0,05 mg/kg medetomidyny. Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi, usuń skórę klatki piersiowej nożyczkami.
3. Przygotuj strzykawkę o pojemności 2 ml (igła 26 G) ze 150 μl kwasu cytrynianu i dekstrozy (ACD) jako antykoagulantu. Włóż igłę między drugie i trzecie żebro po lewej stronie mostka, aby pobrać krew z serca. Następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
   UWAGA: (1) Skład buforu ACD: 85 mM tribasic dehydrate cytrynianu sodu i 65 mM monohydratu kwasu cytrynowego w 111 mM glukozy. (2) Pobieranie krwi powinno odbywać się płynnie, aby uniknąć tworzenia się skrzepów. Od 8-10-tygodniowych myszy można uzyskać około 1 ml krwi.
4. Wymieszać krew z 1 ml buforu Tyrode'a (pH 6,5) w probówce FACS (polistyren o okrągłym dnie) o pojemności 5 ml i odwirować przy 70 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.
5. Po odwirowaniu pobrać górną część (około 1 ml) zawierającą osocze bogatopłytkowe (PRP). Wymieszać z 3 ml buforu Tyrode'a (pH 6,5) i dodać 100 ng/ml prostacykliny (PGI₂), aby zapobiec aktywacji płytek krwi.
6. Wirować przy 1200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu Tyrode'a (pH 6,5) i zmierzyć liczbę płytek krwi za pomocą hemocytometru.

3. Migracja płytek krwi myszy na powłoce cRGD biotyna-neutrawidyna-biotyna

1. Uzupełnij zmodyfikowany bufor Tyrode'a (pH 7,4) 10 x 10 3/μL mysich płytek krwi, 1 mM CaCl₂, 2 μM U46619 i 4 μM soli sodowej adenozyno-5′-difosforanu (ADP) i odpipetuj całkowitą objętość 240 μl do kanałów przygotowanych w kroku 1.
2. Rejestruj żywą migrację płytek krwi za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w inkubator stopniowy. Alternatywnie, inkubować kanał przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
3. Utrwalić próbkę 4% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemyć pięciokrotnie PBS.
4. Udrażniać płytki krwi za pomocą Triton-X (0,2% w PBS) przez 5 minut, a następnie przemywać je pięciokrotnie PBS.
5. Rozcieńczyć 2,5 μl falloidyny Alexa Fluor 594 (40x bulion metanolowy) w 100 μl PBS. Inkubować z płytkami krwi przez 30 minut o zmroku, a następnie przemyć pięć razy PBS.
6. Zobrazuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Kwantyfikacja

UWAGA: Płytki krwi tworzące filopodia (wypukłości przypominające palce) lub lamellipodia (wypukłości przypominające arkusze) były liczone jako przylegające płytki krwi⁴. Płytki krwi, których odległość migracji jest większa niż jedna średnica, zdefiniowano jako płytki wędrowne.

1. Frakcja migrujących płytek krwi: Policz adhezję płytek krwi lub liczbę migracji za pomocą narzędzia Multi Point na Fidżi. Kliknij prawym przyciskiem myszy menu rozwijane narzędzia Punkt na pasku narzędzi, aby wybrać narzędzie Wielopunktowe. Oblicz frakcję migrujących płytek krwi, dzieląc liczbę migrujących płytek krwi przez liczbę płytek adhezyjnych.
2. Średnia odległość migracji: Wyodrębnij odległość migracji z utrwalonych próbek, mierząc długość ścieżki migracji "odciśniętej" w powłoce neutrawidyny FITC za pomocą narzędzia do wyznaczania linii z wolnej ręki. Kliknij prawym przyciskiem myszy menu rozwijane Linia prosta na pasku narzędzi, aby wybrać narzędzie Linia odręczna.
3. Deskryptory kształtu płytek krwi: Generuj maski binarne, segmentując fluorescencyjne płytki krwi (Alexa594-Phalloidin) za pomocą funkcji Próg. Wybierz opcję Obraz > Dostosuj próg > pasku narzędzi.
4. Deskryptory kształtu, takie jak powierzchnia, obwód, okrągłość i współczynnik kształtu, można uzyskać w analizowaniu cząstek. Wybierz deskryptory kształtów w obszarze Analizuj > ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Wyświetl wyniki w obszarze Analizuj > Analizuj cząstki.

Wyniki

Aktywowane płytki krwi łatwo przylegają i rozprzestrzeniają się na szkiełkach pokrytych PLL-PEG-biotyna-neutrawidyna-FITC-biotyna-cRGD (Rysunek 1C i Rysunek 2A; 0 min i 5 min), a następnie polaryzują się, tworząc lamellipodium na krawędzi natarcia (Rysunek 2A; 10 min). Podczas tego procesu pseudojądro (ciemny obszar w środku płytek krwi) przesunęło się ze środka do tyłu płytki krwi (Figura 2A). Spolaryzowane płytki krwi zaczynają następnie migrować bez oczywistej kierunkowości (Rysunek 2A; 15 minut i 20 minut oraz Rysunek 2B). Zaobserwowaliśmy, że płytki krwi migrujące na powłokach PLL-PEG-biotyna-neutrawidyna-FITC-biotyna-cRGD mogą zrywać wiązanie neutrawidyna-FITC-biotyna-PLL-PEG, o czym świadczy zmniejszenie intensywności fluorescencji wzdłuż ścieżki migracji (Rysunek 1C i Rysunek 2A,B). Ponadto na powierzchni płytek krwi gromadzi się zakłócony kompleks neutrawidyna-FITC-biotyna-cRGD (Rysunek 2A,B). Zjawisko to jest podobne do poprzednich odkryć, w których migrujące płytki krwi usuwały fibrynogen z podłoża i gromadziły go w swoim otwartym układzie kanałowym (OCS)⁴.

Aby zbadać, jak gęstość ligandów wpływa na migrację płytek krwi, dostosowano gęstość cRGD poprzez zmianę stosunku PLL-PEG-biotyny do PLL-PEG w pierwszej warstwie powłoki. Dane te pokazują, że płytki krwi myszy osiągają optymalną migrację przy 2,5% stężeniu PLL-PEG-biotyny. Migracja jest zmniejszona zarówno przy niższych (1%), jak i wyższych (10%) stężeniach PLL-PEG-biotyny (Rysunek 3A,B). Tym zależnym od substratu zmianom w zachowaniu migracyjnym towarzyszą zmiany w morfologii płytek krwi (Rysunek 3C). Przy niskiej gęstości ligandów (1%) płytki krwi nie rozprzestrzeniają się odpowiednio, o czym świadczy niska rzutowana powierzchnia i obwód płytek krwi (Ryc. 3C). Sugeruje to niewystarczającą aktywację integryny i sygnalizację zewnętrzną⁷. W związku z tym płytki krwi nie są w stanie wywierać sił na ligandy cRGD, nie są w stanie przemodelować substratu i nie migrują (Rysunek 3A, B).

Przy pośredniej gęstości ligandów (2,5%) następuje znaczny wzrost powierzchni i obwodu płytek krwi (Rysunek 3C). Płytki krwi skutecznie się rozprzestrzeniają, mechanicznie rozrywając labilne ligandy cRGD i migrują (Rysunek 3A,B). Jednak przy dużej gęstości ligandów (10%), mimo że rozprzestrzenianie się wzrasta, płytki krwi nie polaryzują się, na co wskazuje zmniejszony współczynnik proporcji (Rysunek 3C). W tych warunkach płytki krwi pozostają przyczepione do lepkiego podłoża i nie migrują, ponieważ nie mogą rozbić labilnych ligandów cRGD (Rysunek 3A, B).

Te wyniki pokazują, że migracja płytek krwi jest krytycznie zależna od właściwości adhezyjnych podłoża. Płytki krwi mogą migrować tylko wtedy, gdy wystarczająco angażują się w ligandy adhezyjne i jednocześnie generują siły trakcyjne wystarczająco silne, aby pokonać tolerancję na rozciąganie podłoża adhezyjnego^4,6,7,8.

Rysunek 1: Procedura powlekania i obrazowanie na żywo interakcji płytek krwi z substratem. (A) Zdjęcie zmontowanej komory. (B) Zasada protokołu. Po lewej: Schemat powłoki. Szkiełka nakrywkowe poddane obróbce plazmowej pokryto trzema warstwami. Pierwsza warstwa to mieszanina PLL-PEG i PLL-PEG-biotyna (szkielet PLL-PEG jest obojętny dla komórek i zapobiega niespecyficznemu wiązaniu). Druga warstwa to neutrawaryna-FITC, a trzecia warstwa to biotyna-cRGD. Neutravidin-FITC łączy PLL-PEG-biotynę i biotynę-cRGD. Płytki krwi wiążą się z biotyną-cRGD poprzez integryny w błonie komórkowej. Po prawej: Ilustracja rozwiązywania wiązania biotyny i awidyny przez integryny płytkowe. Płytki krwi wywierają siły na podłoże poprzez zaangażowanie integryny-cRGD i rozrywają górne wiązanie cRGD-biotyna-neutrawaryna-FITC - lub dolne wiązanie neutrawidyna-FITC - PLL-PEG-biotyna - . Zerwanie dolnego wiązania między neutrawaryną-FITC a biotyną-PLL-PEG powoduje zmniejszenie sygnału fluorescencyjnego, podczas gdy zerwanie górnego wiązania między biotyną-cRGD a neutrawaryną-FITC nie. (C) Szeregi czasowe pokazujące migrację płytek krwi i wyczerpanie labilnych ligandów cRGD. Obszary o zmniejszonej fluorescencji wskazują na ścieżki migracji płytek krwi (patrz również Rysunek 2A), a obszary o zwiększonej fluorescencji wskazują na akumulację FTIC-neutrawaryny-biotyny-cRGD na migrujących płytkach krwi. Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazowanie immunofluorescencyjne migracji płytek krwi kodowanej przez przebudowany substrat. (A) Reprezentatywna sekwencja filmowa migracji pojedynczej płytki krwi. Po lewej: Obrazy z kontrastem fazowym migrujących płytek krwi. Płytki krwi polaryzują się, tworząc blaszkę na krawędzi natarcia, a następnie migrują. Po prawej: Neutravidin-FITC został usunięty z substratu, pozostawiając "ślad" migracji płytek krwi. Pęknięta cRGD-biotyna-neutrawaryna-FITC gromadzi się w środku migrujących płytek krwi. (B) Reprezentatywne obrazy migracji płytek krwi na labilnych powłokach ligandowych cRGD-biotyna-awidyna. Górna: Płytki krwi barwione falloidyną (Alexa FluorTM 594) wykazywały dużą formację blaszki i spolaryzowany kształt przypominający migrujące płytki krwi. Migrujące płytki krwi rozrywają wiązanie cRGD-biotyna-neutrawaryna-FITC, generując ścieżki migracji na podłożu wskazane przez zmniejszony sygnał FITC. Dół: wykadrowany obraz z większym powiększeniem. (C) Szlaki migracyjne zostały ręcznie narysowane na Fidżi żółtymi liniami. Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Stosunek PLL-PEG-biotyny do PLL-PEG determinuje migrację i kształt płytek krwi. (A) Reprezentatywne obrazy płytek krwi na 1%, 2,5% i 10% powłokach PLL-PEG-biotyna, skala: 5μm. (B) Kwantyfikacja adhezji płytek krwi, efektywności migracji i odległości migracji, n = 4 niezależne eksperymenty; Średnia/SD; Jednokierunkowy ANOVA/Tukey; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001, ns: nieistotne (C) Kwantyfikacja deskryptorów kształtu płytek krwi (powierzchnia, obwód, okrągłość i współczynnik kształtu), n = 4 niezależne eksperymenty; Średnia/Min-Max; Jednokierunkowy ANOVA/Tukey; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001, ns: Nieistotne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W niniejszym protokole przedstawiono procedurę powlekania trójwarstwowego składającą się z (1) szkieletu PLL-PEG-biotyny oraz (2) łącznika neutrawidyna-FITC, który ułatwia wiązanie (3) biotyny-cRGD (ligandu adhezyjnego) ze szkieletem PLL-PEG-biotyna (patrz również rysunek 1B), który umożliwia precyzyjne dostrajanie właściwości podłoża mechanicznego i adhezyjnego poprzez zmianę stosunku PLL-PEG-biotyny do PLL-PEG i zapewnia łatwy fluorescencyjny odczyt migracji płytek krwi. Podczas gdy ten protokół wykorzystuje neutralidynę sprzężoną z FITC i falloidynę sprzężoną z Alexa Fluor 594 do śledzenia migracji i kształtu płytek krwi, można stosować inne alidyny i falloidyny sprzężone z fluoroforem. Ponieważ wszystkie odczynniki powlekające, w tym PLL-PEG, PLL-PEG-biotyna, neutrawidyna-FITC i cRGD-biotyna, a także aktywatory płytek krwi są dostępne na rynku, eksperyment ten można przeprowadzić bez większego dodatkowego wysiłku. Krytycznym etapem jest obróbka plazmowa, ponieważ nieefektywna obróbka plazmowa prowadzi do niewystarczającego wiązania biotyny PLL-PEG/PLL-PEG z podłożem, co skutkuje zanikiem adhezji i migracji płytek krwi. Ważna jest wydajność myjki plazmowej. Ogólnie rzecz biorąc, myjki plazmowe z generatorami 13,6 MHz działają lepiej niż te z 40 kHz lub 100 kHz. Ponadto źródło plazmy tlenowej jest bardziej odpowiednie niż powietrze otoczenia. Po udanej obróbce plazmowej etapy powlekania prawie nie są podatne na błędy.

Wcześniej wykazano, że płytki krwi wykorzystują mezenchymalny tryb migracji, który jest w dużym stopniu zależny od adhezji substratu ^4,17. Analogicznie do fibroblastów, niska gęstość ligandów utrudnia migrację, ponieważ płytki krwi mają trudności z przyleganiem do substratu, podczas gdy wysokie gęstości ligandów utrudniają migrację, zapobiegając rozłączaniu się twardych zrostów¹⁸ (ryc. 3). Przy gęstościach pośrednich płytki krwi przylegają, podczas gdy zależne od miozyny IIA siły ciągnące na wiązanie integrynowe są nadal wystarczające do zerwania zrostów. Warto zauważyć, że wysokie powinowactwo między integryną_{α IIb}β₃ a jej ligandem fibryną (ogenem) powoduje demontaż adhezji nie poprzez uwolnienie liganda adhezyjnego, ale raczej poprzez jego pęknięcie lub oderwanie się od podłoża znajdującego się pod spodem, takiego jak komórki śródbłonka in vivo lub szkiełka nakrywkowe in vitro ^4,6. Siła wiązania wymagana do oderwania fibrynogenu od leżącego pod nim substratu jest silnie uzależniona od właściwości fizycznych i (bio)chemicznych, które często są trudne do kontrolowania, co może prowadzić do znacznej zmienności wydajności migracji. Przedstawiony tutaj test oferuje redukcjonistyczne podejście do rozwiązania tego problemu. Jednak siła zrywająca wiązania awidyna-biotyna jest ustalona na około 160 pN, dlatego do badania adhezji płytek krwi przy niższych warunkach siły^należy użyć bardziej wyrafinowanych czujników napięcia, takich jak te oparte na dwuniciowym uwięzi DNA.

Wcześniejsze badania wykazały, że migracja płytek krwi jest zaangażowana w infekcje bakteryjne i zapalenie naczyń krwionośnych in vivo. W związku z tym płytki krwi z defektami migracji, takimi jak upośledzona kurczliwość miozyny, polimeryzacja aktyny lub sygnalizacja integryna zewnątrz, wykazują upośledzony klirens bakterii i integralność naczyniową ^4,6,7. Przedstawiony tutaj test jest prosty, stabilny, a zatem nadaje się do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych i ich wpływu na migrację płytek krwi. Stanowi nowatorskie narzędzie in vitro do badania celów terapeutycznych w zapaleniu lub zakrzepicy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól sodowa adenozyno-5&-difosforanu (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
Alexa Fluor 594 falloidyna	Thermofisher	A12381
Licznik krwi	Sysmex	XN-1000
Bezdenna 6-kanałowa prowadnica samoprzylepna	IBIDI, szkiełka samoprzylepne VI0,4	80608
Wirówka	Eppendorf	5804
Mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM880
cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]	Peptyd międzynarodowe	rurki PCI-3697-PI
FACS	Corning
FITC koniugat neutrawidyny	Thermofisher	A2662
Formaldehyd	Thermofisher	28908
Roztwór HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Mikroskop kontrastu fazowego i epifluorescencyjnego	Olympus	IX83
Środek do czyszczenia plazmowego	Diener	116531
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotyna(50%)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotyna (50%)
Poli(L-lizyna)- kopolimer poli(glikolu etylenowego)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)Sól
sodowa prostaglandyny I2 (PGI2)	Abcam	ab120912
Sonikator	BANDELIN	SONNOREX RK514M
Ttriton X-100 20% v/v	Cayman Chemical
U46619	Enzo Life Sciences	BML-PG023-0001)