Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66759

⸱

2 sierpnia 2024

 , 
1APC Microbiome Ireland, University College Cork, 2School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Streszczenie

Śmierć komórek nabłonka jelitowego (IEC) jest zwiększona u pacjentów z chorobami zapalnymi jelit (IBD), takimi jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD). Może to przyczyniać się do zaburzeń funkcji bariery jelitowej, zaostrzenia stanu zapalnego i immunopatogenezy choroby. Cytokiny i ligandy receptora śmierci są częściowo odpowiedzialne za ten wzrost śmiertelności IEC. Cytokiny istotne dla IBD, takie jak TNF-α i IFN-γ, są cytotoksyczne dla IEC zarówno niezależnie, jak i w połączeniu. Protokół ten opisuje prosty i praktyczny test do ilościowego określania cytotoksyczności indukowanej cytokinami w organoidach okrężnicy pochodzących od pacjenta z CD przy użyciu fluorescencyjnego barwnika śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopii fluorescencyjnej na żywo i oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Pokazujemy również, jak wykorzystać model matematyczny niezależności Bliss do obliczenia współczynnika interakcji perturbagenu (CPI) na podstawie cytotoksyczności organoidów. CPI można wykorzystać do określenia, czy interakcje między kombinacjami cytokin lub innymi typami zaburzeń są antagonistyczne, addytywne czy synergistyczne. Protokół ten można wdrożyć do badania cytotoksycznej aktywności cytokin i innych zaburzeń przy użyciu organoidów okrężnicy pochodzących od pacjenta.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy tworzy fizyczną, półprzepuszczalną barierę między zawartością światła jelita a leżącymi pod nim tkankami. Aby skutecznie utrzymać tę barierę, komórki nabłonka jelitowego (IEC) przechodzą niezwykle wysoki obrót komórkowy, z ciągłym cyklem śmierci i regeneracji komórek. Jednak podczas zaburzeń zapalnych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD), występuje wyższy poziom nieprawidłowej śmierci komórek1. Może to sprzyjać załamaniu funkcji bariery i aktywacji układu odpornościowego, wywołując dalszy stan zapalny. W chorobie Leśniowskiego-Crohna (CD), formie IBD, wykazano, że sygnalizacja cytokin przyczynia się do zwiększonego poziomu śmiertelności IEC2. Badając, w jaki sposób sygnalizacja cytokin indukuje śmierć komórek IEC, można mieć nadzieję, że uda się opracować lepsze metody leczenia dla pacjentów z IBD i innymi zaburzeniami zapalnymi jelit1.

W badaniach nad biologią i odkrywaniem celów leków, synergia jest ogólnie rozumiana jako występująca, gdy system biologiczny traktowany kombinacjami indywidualnych bodźców wykazuje reakcję na kombinację, która jest większa niż połączone efekty addytywne samych pojedynczych bodźców. Synergiczne interakcje między cytokinami zostały dobrze udokumentowane w stymulowaniu wrodzonych odpowiedzi przeciwwirusowych3. Wiadomo również, że cytokiny indukują śmierć komórki synergistycznie, w tym w IECs4. Jednak rola, jaką synergiczna sygnalizacja cytokin cytotoksycznych odgrywa w zaburzeniach zapalnych jelit, takich jak IBD, jest niedostatecznie zbadana.

Organoidy jelitowe człowieka to mikrotkanki 3D produkowane in vitro, które są generowane z komórek macierzystych nabłonka jelitowego. Organoidy jelitowe mogą być hodowane z biopsji błony śluzowej jelita uzyskanej od pacjentów z IBD i zachowują wiele cech choroby5,6. Organoidy okazały się idealnym systemem modelowym do badania cytotoksyczności cytokin w kontekście zapalenia jelit7,8. Wcześniej nasza grupa scharakteryzowała synergistyczne efekty zabijania cytokin IFN-γ i TNF-α istotnych dla IBD w organoidach okrężnicy (kolonoidach) pochodzących od pacjenta z CD9,10. Jednak dokładne mechanizmy zaangażowane w pośredniczenie w tej formie synergistycznej śmierci komórki pozostają nieuchwytne. Istnieje również potencjalnie wiele innych niescharakteryzowanych interakcji cytokin cytotoksycznych, które są istotne dla zaburzeń zapalnych jelit.

Dostępnych jest kilka protokołów do badania śmierci komórek w organoidach jelitowych10,11,12,13; jednak każdy z nich ma wady. Niektóre z tych technik mierzą jedynie żywotność komórek i nie mierzą bezpośrednio śmierci komórki, nie są w stanie ocenić odpowiedzi pojedynczych organoidów lub wymagają drogiego sprzętu i złożonych protokołów. Potrzebne są solidne i proste metodologie do ilościowego określenia śmierci komórek organoidów i interakcji perturbagenów w organoidach jelitowych. Przedstawiony przez nas protokół jest prostym i niedrogim podejściem do pomiaru odpowiedzi pojedynczych organoidów na cytotoksyczne cytokiny, ale może być stosowany do każdego rodzaju bodźca lub perturbagenu. Pokazujemy również, jak wykorzystać model synergii niezależności Bliss do obliczenia współczynnika interakcji perturbagenu (CPI), który opisuje interakcje cytokin cytotoksycznych.

Protokół

Biopsje błony śluzowej okrężnicy pobrano od pacjentów z CD poddawanych rutynowej kolonoskopii w ramach standardowej opieki medycznej. Zgoda etyczna na wykorzystanie próbek tkanek pacjentów oraz tworzenie linii organoidów okrężnicy z tych próbek została uzyskana z Komitetu Etyki Badań Klinicznych Szpitali Nauczania w Cork (CREC). Pisemna świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich pacjentów zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszystkie prace z kulturami tkankowymi z biopsji pacjentów i kolonoidami muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza zgodnie z protokołami bezpieczeństwa BSL2. Przed użyciem należy upewnić się, że wszystkie elementy plastikowe są sterylne. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, instrumentów i oprogramowania użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

Protokoły stosowane przez naszą grupę do izolacji krypt i hodowli organoidów zostały dostosowane z uznanych metod14,15,16 i zostały opublikowane wcześniej9,10,17. W poniższym protokole kolonoidy hodowano z użyciem pożywki do proliferacji organoidów (Organoid Proliferation Media) (Tabela 1). Kolonoidy hodowane w pożywce Organoid Proliferation Media są niezróżnicowane i wzbogacone w komórki macierzyste jelita grubego. Głównym składnikiem pożywki Organoid Proliferation Media jest 50% kondycjonowanej pożywki L-WRN, która zawiera czynniki wzrostu niszy komórek macierzystych jelit: Wnt-3A (W), R-spondynę 3 (R) oraz Noggin (N)15. Pożywkę Organoid Proliferation Media przygotowuje się poprzez połączenie kondycjonowanej pożywki L-WRN i pożywki beztłuszczowej (Serum-free Media) w stosunku 1:1, a następnie uzupełnia się ją o nikotynamid i inhibitory chemiczne (Tabela 1).

1. Izolacja krypt jelita grubego i hodowla kolonoidów

  1. Przed wysianiem krypty preinkubować płytkę mikrotitracyjną 48-dołkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 72 h.
    UWAGA: Preinkubacja płytki przyspiesza polimeryzację ekstraktu z błony podstawnej (BME) podczas wysiewania.
  2. Rozmrozić BME na lodzie w temperaturze 4 °C wieczorem w dniu poprzedzającym izolację krypt.
  3. Biopsje okrężnicy zebrać do probówki z 15 mL pożywki do zbierania biopsji (Biopsy Collection Medium) (Tabela 1) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia procesu.
  4. Za pomocą pipety ostrożnie usunąć jak największą ilość pożywki do zbierania biopsji. Przemyć biopsje, dodając do probówki 15 mL lodowatego DPBS uzupełnionego o 2,5 µg/mL amfoterycyny B oraz 100 µg/mL gentamycyny. Energicznie wstrząsnąć probówką, aby oddzielić śluz lub zanieczyszczenia od biopsji. Pozostawić biopsje do osadzenia grawitacyjnie i ostrożnie usunąć jak największą ilość DPBS za pomocą pipety.
    1. Powtórzyć procedurę mycia z kroku 1.4 dwa razy (2x).
  5. Do probówki dodać 10 mL bezenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek uzupełnionego o 2,5 µg/mL amfoterycyny B oraz 200 µg/mL gentamycyny i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej przy kołysaniu z prędkością 30 rpm.
  6. Po inkubacji energicznie potrząsnąć probówką z boku na bok, aby uwolnić krypty okrężnicy. Sprawdzić zawartość probówki pod niskopowiększalnym mikroskopem świetlnym, poszukując uwolnionych krypt i fragmentów krypt w zawiesinie. Jeśli nie są widoczne, potrząsnąć probówką i sprawdzić ponownie; powtarzać do czasu zaobserwowania krypt w zawiesinie.
  7. Przymocować sitko komórkowe 70 µm do probówki 50 mL i przefiltrować zawiesinę krypt przez sitko. Do pustej probówki dodać 10 mL lodowatej pożywki do mycia organoidów (Organoid Wash Media) (Tabela 1), usunąć pożywkę, przepuszczając ją przez sitko komórkowe.
  8. Przenieść przefiltrowane krypty do dwóch probówek 15 mL (10 mL na probówkę) i wirować w temperaturze 4 °C przez 5 min przy 150 × g.
  9. Ostrożnie usunąć nadsącz z każdej probówki 15 mL, resuspendować osady krypt w 500 µL lodowatej pożywki do mycia organoidów, przenieść roztwór krypt z obu probówek 15 mL do jednej probówki mikrocentryfugacyjnej 1,5 mL i wirować w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 400 × g.
  10. Ostrożnie usunąć nadsącz z probówki mikrocentryfugacyjnej i resuspendować osad krypt w 70 µL BME (20 µL na dołek oraz 10 µL objętości zapasu).
  11. Używając preinkubowanej płytki 48-dołkowej (krok 1.1), wysiać 20 µL zawiesiny BME/krypt do centrum każdego dołka (1 kopułka BME na dołek). Płynnie i jednostajnie odwrócić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 20 min.
    UWAGA: Odwrócenie płytki zapobiega przyleganiu komórek do plastikowej powierzchni dołka i zapewnia ich równomierny rozkład w BME.
  12. Wyjąć płytkę z inkubatora. Upewnić się, że BME w pełni spolimeryzowało, a następnie przykryć kopułki 350 µL uprzednio ogrzanej pożywki do proliferacji organoidów (Organoid Proliferation Media) uzupełnionej o 100 µg/mL szerokospektrowego odczynnika przeciwdrobniczego. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    UWAGA: Szerokospektrowy odczynnik przeciwdrobniczy ma zapobiegać kontaminacji mikrobami śluzówki związanymi z biopsjami okrężnicy. Jest on wymagany tylko w pierwszym tygodniu hodowli po izolacji krypt.
  13. Wymieniać pożywkę 2-3 razy w tygodniu, używając uprzednio ogrzanej pożywki do proliferacji organoidów, uzupełniając ją o szerokospektrowy odczynnik przeciwdrobniczy w pierwszym tygodniu hodowli; po tym okresie odczynnik należy usunąć.
  14. Po pełnym uformowaniu się hodowli kolonoidów (1-2 tygodnie po izolacji), dysocjować kolonoidy za pomocą enzymatycznego odczynnika do dysocjacji uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK-I/II Y-27632 (szczegóły dotyczące dysocjacji kolonoidów znajdują się w sekcji 2).
    UWAGA: Przez pierwsze dwa pasażowania (P0-1, P1-2) kolonoidy należy powielać w stosunku 1:1/2; po P2 kolonoidy można pasażować w stosunku 1:3/4.
  15. Wysiać i utrzymywać kolonoidy zgodnie z krokami 1.11-1.13 (nie uzupełniać pożywki do proliferacji organoidów o szerokospektrowy odczynnik przeciwdrobniczy).

2. Przygotowanie kolonoidów do analizy śmierci komórek

UWAGA: Protokół badania śmierci komórek trwa 4 dni (Rycina 1A).

  1. Namnażaj kolonoidy w płytkach 48-dołkowych, wysiewając 20 µL zawiesiny BME/krypt na dołek, inkubując w 37 °C, 5% CO22oraz wymieniając pożywkę 2–3 razy w tygodniu (350 µL na dołek).
  2. Przeprowadź pasaż kolonoidów około 1 tydzień przed ich zbiorami do testu śmierci komórkowej. Przed zbiorem kolonoidów upewnij się, że zostały one namnożone do wysokiej gęstości (Rycina 1Bi), że mają one około 25-50 µm średnicy i wykazują aktywną proliferację.
    UWAGA: W tym teście wykorzystaliśmy kolonoidy od pasażu 3 do pasażu 14, uzyskując spójne wyniki. Wykazano jednak, że odpowiedź transkrypcyjna kolonoidów na cytokiny może ulegać zmianom w zależności od czasu trwania hodowli.18W związku z powyższym zalecamy, aby do tego testu nie wykorzystywać kolonoidów po 15. pasażu.
  3. Preinkubować płytki mikrotitracyjne 96-dołkowe w temperaturze 37 °C, 5% CO22 przez co najmniej 72 h przed wysianiem komórek kolonoidów.
  4. Odmrozić BME na lodzie w temperaturze 4 °C wieczorem przed rozpoczęciem eksperymentu.
  5. Przygotować odpowiednią objętość odczynnika do dysocjacji enzymatycznej (500 µL na studzienkę kolonoidów jelita grubego) poprzez uzupełnienie o 10 µM inhibitora ROCK-I/II Y-27632. Ostrożnie usunąć pożywkę z dołków zawierających kolonoidy; pipetować z brzegu dołka, aby uniknąć uszkodzenia kopuły kolonoidu. Dodać 300 µL odczynnika do dysocjacji enzymatycznej do każdej studzienki.
    1. W każdym dołku należy rozbić kopułkę kolonoidu, zeskrobując powierzchnię dołka końcówką pipety P1000 i wielokrotnie zasysając oraz wydmuchując zawiesinę komórkową; należy starać się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Zawiesinę komórkową należy zebrać do probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Ta probówka o pojemności 15 ml zostanie wykorzystana do zebrania kolonoidów z 10 studzienek płytki 48-dołkowej.
    2. Przemyj tę samą studzienkę kolejną porcją płynu 200 µL odczynnika do dysocjacji enzymatycznej, aby upewnić się, że cały materiał kolonoidowy został zebrany i przeniesiony do tej samej probówki 15 ml. Powtórz ten proces dla każdej studni z pozyskiwanymi kolonoidami w fazie ekspansji i zbierz je do tej samej pojedynczej probówki 15 ml.
      UWAGA: Aby zapewnić efektywną dysocjację, do jednej probówki należy zebrać zawartość maksymalnie 10 dołków z kolonoidami. W przypadku zbierania >10 dołków, zebrać kolonoidy i rozdzielić je w równych częściach do kilku probówek o pojemności 15 ml.
  6. Inkubować probówkę o pojemności 15 ml z zebranymi kolonoidami z etapu 2.5.2 w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 min. Po inkubacji wiruj probówkę przez 3 min przy 400 × gOstrożnie usunąć nadsącz, pozostawiając w probówce około 1,2 ml cieczy.
    UWAGA: Kolejny krok wymaga fizycznej dysocjacji kolonoidów poprzez szybkie pipetowanie. Aby proces ten był skuteczny, w probówce musi znajdować się niewielka objętość zawiesiny komórkowej – ilość 1,2 ml pozostała w probówce 15 ml jest do tego celu wystarczająca.
  7. Resuspender osad kolonoidów w pozostałych 1,2 ml odczynnika do dysocjacji enzymatycznej. Używając pipety P1000 ustawionej na 1,000 µLumieść końcówkę pipety w zawiesinie, trzymając ją tuż nad dnem probówki o pojemności 15 ml, a następnie szybko aspiruj i wydmuchuj zawiesinę przez końcówkę. Aby szybko pipetować, gwałtownie wciśnij tłok do pierwszego stopnia, zwolnij go do pozycji mniej więcej w połowie drogi do góry i powtórz tę czynność. Pipetuj w ten sposób przez około 10 s (30–40 naciśnięć), a następnie całkowicie resuspenduj zawiesinę i powtórz pipetowanie. Wykonaj 2–3 serie szybkiego pipetowania.
  8. Obejrzyj próbkę pod mikroskopem, aby potwierdzić, że nie pozostały w niej żadne całe kolonoidy, a większość fragmentów kolonoidów ma wielkość około 30-40 µm w rozmiarze (Rycina 1Bii).
  9. Jeśli próbka wymaga dalszej dysocjacji, inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 min powtarzać technikę pipetowania opisaną w kroku 2.7 i sprawdzać próbkę pod mikroskopem. Powtarzać ten proces do momentu, aż większość fragmentów kolonoidów osiągnie optymalny rozmiar.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej dysocjacji kolonoidów, ponieważ spowoduje to zbyt dużą śmierć komórek, niską wydajność wysiewu oraz powstanie zbyt małych kolonoidów.
  10. Dodaj 10 ml schłodzonego w lodzie Medium do Płukania Organoidów (Tabela 1) do probówki 15 ml. Wirować probówkę przez 3 min w temperaturze 400 × gusuń nadsącz, resuspenduj w 1 ml schłodzonego w lodzie Organoid Wash Media i przenieś do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml (określanej jako probówka z fragmentem kolonoidu).
  11. Wymieszać zawartość probówka z fragmentem kolonoidu poprzez pipetowanie, a następnie pobranie 50 µL próbka; przenieś to 50 µL próbkę do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml (zwanej dalej probówka do liczenia komórek). Przechowywać probówka z fragmentem kolonoidu utrzymywać w lodzie od tego momentu aż do zakończenia kroku 2.15.
  12. Wirować w wirówce probówka do liczenia komórek przez 3 min w 400 × g, odwiruj nadsącz i resuspenduj w 500 µL odczynnika do dysocjacji enzymatycznej uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK-I/II Y-27632.
  13. Inkubować pojedyncze probówka do liczenia komórek w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 min. Używając pipety P1000 ustawionej na 400 µLnastępnie nanieść próbkę pipetą zgodnie z opisem w kroku 2.7 i sprawdzić ją pod mikroskopem, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. W przeciwnym razie powtarzać ten proces do czasu pełnej dysocjacji kolonoidów do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
  14. Dodaj 1 ml pożywki do płukania organoidów do pojedynczej probówka do liczenia komórek, wiruj przez 3 min w temperaturze 400 × g i ostrożnie odpipuj nadsącz. Resuspenduj komórki w 50 µL pożywki do płukania organoidów, a następnie dodać 50 µL błękitu trypanu.
  15. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz liczbę komórek w 50 µL pobrać próbkę i wykorzystać ją do obliczenia stężenia komórek w probówka z fragmentem kolonoidu.
  16. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej wymaganą do eksperymentu, w którym 0,5 × 104 komórki kolonoidowe zostaną wysiane w każdym dołku 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej. Do obliczonej objętości należy dodać około 15% zapasu, aby uwzględnić objętość martwą. Całkowitą objętość należy przenieść z probówka z fragmentem kolonoidu (krok 2.11) do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    1. Wiruj nową probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą fragmenty kolonoidów przez 3 min w temperaturze 400 × g, odwiruj nadsącz i resuspenduj w BME (użyj 10 µL BME na 0,5 × 104 komórek).
      UWAGA: Ze względu na właściwości fizyczne BME (wysoka lepkość, polimeryzacja zależna od temperatury), znaczna ilość materiału może zostać utracona podczas pipetowania (objętość martwa).
  17. Umieść probówkę lub zbiorniczek zawierający zawiesinę kolonoidów w BME w sterylnym pojemniku na lodzie wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Przechowywanie komórek w lodzie podczas wysiewu zapobiega przedwczesnej polimeryzacji podłoża komórkowego.
  18. Korzystając z przeinkubowanej płytki mikrotitracyjnej z 96 dołkami (z kroku 2.3), nanieść metodą odwrotnego pipetowania 10 µL roztworu kolonoidów/BME na dołek. Należy upewnić się, że końcówka pipety znajduje się tuż nad powierzchnią dołka i pipetować w jego centrum, aby uniknąć uderzenia w ściankę. Zawiesinę kolonoidów/BME należy regularnie mieszać, aby zapobiec nierównomiernemu wysiewowi.
    UWAGA: Nie wysiewać kolonoidów do studzienek znajdujących się na zewnętrznej krawędzi płytki mikrotitracyjnej.
    1. Aby wykonać pipetowanie odwrotne:
      1. Ustaw pipetę, a następnie naciśnij tłok, mijając pierwszy stopień, aż do drugiego stopnia.
      2. Utrzymując tę pozycję, zanurz końcówkę w zawiesinie kolonoidów/BME i powoli zwolnij tłok do pozycji górnej.
      3. Należy nanieść zawiesinę, naciskając tłok powoli i jednostajnie do pierwszego stopnia. W przypadku zasiewania większej liczby dołków, należy utrzymać tę pozycję i powtórzyć kroki 2.18.1.2–2.18.1.3.
      4. Po zakończeniu procesu usunąć niewielką ilość pozostałej zawiesiny, naciskając tłok do drugiego stopnia zatrzymania.
        UWAGA: Ze względu na wysoką lepkość BME zaleca się stosowanie techniki pipetowania odwrotnego.
  19. Powoli i miarowo odwróć płytkę i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO22 przez 20 min.
  20. Wyjmij płytkę z inkubatora. Upewnij się, że BME uległo całkowitej polimeryzacji, a następnie pokryj kopułki warstwą 200 µL podgrzanego medium do proliferacji organoidów. W przypadku użycia płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej z otaczającym rowkiem (ograniczającym parowanie), należy wypełnić każdy zbiornik 2 ml medium do płukania organoidów.
  21. Inkubować kolonoidy w 37 °C, 5% CO22 przez 3 dni, przeprowadzając raz dziennie kontrolę mikroskopową w celu upewnienia się, że kolonoidy regenerują się i proliferują.

3. Preparacja kolonoidów do analizy śmierci komórek

  1. Przygotuj 2,5 µM roztwór fluorescencyjnego barwnika śmierci komórkowej (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) oraz roztwór DMSO, dodając barwnik lub DMSO do uprzednio ogrzanego pożywki do proliferacji organoidów (Organoid Proliferation Media) (Tabela 2).
    UWAGA: Należy chronić roztwór treściwy oraz rozcieńczony roztwór fluorescencyjnego barwnika śmierci komórkowej przed światłem. SYTOX Green Nucleic Acid Stain jest rozpuszczony w DMSO; roztwór DMSO jest stosowany do przygotowania warunków bez barwnika (No Dye) w celu kontroli wpływu rozpuszczalnika.
  2. Wykorzystaj 2,5 µM roztwór fluorescencyjnego barwnika śmierci komórkowej oraz roztwór DMSO z kroku 3.1 do przygotowania preparatów zgodnie z Tabelą 2.
  3. Ostrożnie usuń pożywkę z 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej z wysianymi kolonoidami, przechylając płytkę i pipetując z krawędzi dołków, a następnie dodaj 200 µL pożywki z preparatem do każdego dołka. Należy pamiętać o przygotowaniu dodatkowych dołków kontrolnych z PBS/BSA dla warunku(ów) maksymalnej toksyczności (Max Toxicity) (patrz Tabela 2 w celu uzyskania schematu rozmieszczenia na płytce).
  4. Inkubuj kolonoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez wymagany czas traktowania, aż do momentu rozpoczęcia obrazowania.
  5. Co najmniej 2 h przed obrazowaniem przygotuj 10% v/v roztwór Triton-X 100 w sterylnej wodzie jakości hodowlanej i dodaj 22 µL 10% Triton-X 100 bezpośrednio do pożywki w dołkach kontrolnych dla warunku(ów) maksymalnej toksyczności (Max Toxicity) do stężenia końcowego 1% v/v na 1 h przed obrazowaniem.
    UWAGA: Zastosowanie 10% roztworu ogranicza błędy pipetowania, które mogą wystąpić ze względu na wysoką lepkość surfaktantu.

4. Pozyskiwanie obrazów

  1. Wyjmij z inkubatora 96-dołkową płytkę mikrotitracyjną z wysianymi kolonoidami i umieść ją na stoliku cyfrowego odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Pozostaw płytkę do osiągnięcia temperatury pokojowej.
  2. Potwierdź, że kolonoidy w warunkach Max Toxicity uległy całkowitej lizie, badając je pod mikroskopem (Rysunek 1Biii).
  3. Wybierz odpowiedni obiektyw, np. obiektyw fluorescencyjny 40x o dużej odległości roboczej. Przed rozpoczęciem zoptymalizuj ustawienia obrazowania mikroskopu.
    1. Korzystając z kanału transmisyjnego, ustaw ostrość na kolonoid z komórkami dodatnimi dla SYTOX, przełącz na kanał zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)
      (488 nm) i dostosuj natężenie światła oraz czas ekspozycji, aby zmaksymalizować sygnał fluorescencyjny przy jednoczesnym zminimalizowaniu tła. Najpierw wypróbuj niskie natężenie światła, a następnie stopniowo zwiększaj czas ekspozycji; jeśli czas ekspozycji stanie się niepraktyczny, lekko zwiększ natężenie światła.
      UWAGA: Zwiększenie czasu ekspozycji zamiast natężenia światła zmniejszy fototoksyczność i fotoblaknięcie próbek19. Eksponuj próbki na światło fluorescencyjne tylko wtedy, gdy jest to konieczne.
  4. Używając zoptymalizowanych ustawień obrazowania dla kanału GFP, zaobserwuj warunki No Dye oraz Max Toxicity, aby upewnić się, że próbki nie są przeeksponowane ani niedoeksponowane. Po sfinalizowaniu ustawień zachowaj ich spójność pomiędzy wszystkimi warunkami.
  5. Nabywaj obrazy stosując metodę losowania: wybieraj pola widzenia (FOV) zgodnie ze stałym wzorem siatki obejmującym kopułę kolonoidu. Nabywaj obrazy kolonoidów z co najmniej 10 FOV. Upewnij się, że płaszczyzna centralna kolonoidu jest w ostrości i nabywaj obrazy w kanale transmisyjnym oraz GFP.
    1. Zastosuj następujące kryteria wykluczenia.
      1. Nie nabywaj obrazów, jeśli w FOV nie ma kolonoidów.
      2. Nie nabywaj obrazów, jeśli w FOV znajdują się jedynie kolonoidy nakładające się na siebie w tej samej płaszczyźnie ogniskowania (Rysunek 1Biv).
      3. Nie nabywaj obrazów, jeśli w FOV znajdują się jedynie szczątki kolonoidów (Rysunek 1Bv). Nie uwzględniaj szczątków kolonoidów w analizie.
  6. Zapisz obrazy w formacie portable network graphic i wyeksportuj je.
  7. Jeśli planowane jest obrazowanie w kolejnych punktach czasowych, zwróć 96-dołkową płytkę mikrotitracyjną z kolonoidami do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

5. Analiza obrazu

  1. Otwórz program Fiji ImageJ i zaimportuj zestaw obrazów, przeciągając i upuszczając pliki na pasek narzędzi ImageJ lub przechodząc do File | Open i wybierając pliki. Po otwarciu połącz pliki w stos obrazów, klikając Image| Stacks| Images to Stack. Konwertuj stos obrazów na format 8-bitowy, klikając Image| Type| 8 -bit.
  2. Dla każdego zestawu obrazów wybierz narzędzie Freehand Selections na pasku narzędzi ImageJ i ręcznie zaznacz obszar zainteresowania (ROI) na obrazie transmisyjnym za pomocą myszy komputerowej; ROI stanowi obrys kolonoidu. Następnie przełącz stos obrazów do odpowiadającego mu obrazu z kanału GFP.
  3. Kliknij Analyze| Set Measurements; w oknie dialogowym Set Measurements zaznacz pole Mean Grey Value, a pozostałe pola pozostaw niezaznaczone. Przy wybranym obrazie GFP kliknij Analyze | Measure. Powtórz tę analizę dla każdego kolonoidu w stosie obrazów. Po przeanalizowaniu zestawu danych skopiuj wszystkie dane z okna Results i wklej je do arkusza kalkulacyjnego.

6. Obliczanie % maksymalnej toksyczności

  1. Oblicz średnią z powtórzeń technicznych dla średnich wartości szarości (MGV) dla każdego stanu, korzystając z równania (1).
    diagram równowagi statycznej ΣFx=0; koncepcja fizyczna; analiza równowagi sił; zastosowanie edukacyjne (średnia dla grupy badawczej a) = Równanie służące do obliczenia średniej wartości genu; suma MGV podzielona przez całkowitą liczbę powtórzeń; wyniki statystyczne     (1)
  2. Wyraź średnią dla każdego stanu jako procent w stosunku do średniej dla stanu maksymalnej toksyczności (MT), korzystając z równania (2).
    %MTa = Równanie służące do obliczenia wydajności reakcji, przedstawiające wzór procentowy, diagram edukacyjny.     (2)

7. Obliczanie CPI

  1. Znormalizuj (NORM) dane w następujący sposób: korzystając z wartości średnich obliczonych w kroku 6.1, odejmij średnią z warunku nieleczonego (UT) od każdego warunku traktowania oraz od warunku maksymalnej toksyczności (MT) (aby usunąć tło śmierci komórkowej występującej niezależnie od traktowania cytokinami). Następnie podziel każdą wartość z warunków traktowania przez średnią warunku maksymalnej toksyczności (MT) po odjęciu tła, zgodnie z równaniem (3).
    NORMa = Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, wzór do celów edukacyjnych.     (3)
  2. Odejmij znormalizowane wartości obliczone w kroku 7.1 od 1; otrzymane wartości reprezentują żywotność komórek (V) po traktowaniu (zgodnie z poniższym równaniem (4)).
    Va = 1 −NORMa     (4)
  3. Oblicz współczynnik interakcji perturbagenów (CPI) za pomocą równania (5):
    CPI = Równanie równowagi statycznej, Vab/(VaxVb), wzór matematyczny istotny dla obliczeń fizycznych.     (5)
    Gdzie a oznacza pierwsze traktowanie; b oznacza drugie traktowanie; a ab traktowanie łączone. Wartości CPI wskazują na relacje synergistyczne (<1), addytywne (=1) lub antagonistyczne (>1).

Wyniki

Korzystając z niniejszego protokołu, zademonstrowaliśmy, w jaki sposób kolonoidy jelita grubego pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna (CD) mogą być wykorzystywane do badania cytotoksycznych efektów cytokin IFN-γ i TNF-α, istotnych w przebiegu nieswoistych zapaleń jelit (IBD), na pierwotny nabłonek. Użyliśmy dostępnego komercyjnie fluorescencyjnego barwnika śmierci komórkowej (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), który może przenikać jedynie do komórek o uszkodzonej błonie komórkowej, gdzie ulega aktywacji poprzez wiązanie z kwasami nukleinowymi. Kolonoidy poddano jednoczesnej inkubacji z cytokinami oraz fluorescencyjnym barwnikiem śmierci komórkowej, a następnie wykonano obrazowanie żywych komórek po 8 h i 24 h za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Reprezentatywne nałożone obrazy transmisyjne/fluorescencyjne po 8 h wskazują, że jedynie kolonoidy traktowane IFN-γ + TNF-α wykazują dodatni sygnał fluorescencyjny; jednak liczba fluorescencyjnych komórek jest niewielka (Rycyna 2A). W warunkach zastosowania IFN-γ + TNF-α można również zaobserwować pęcherzykowanie błony komórkowej (blebbing), będące morfologicznym wskaźnikiem śmierci komórki20. Po 24 h kolonoidy traktowane IFN-γ + TNF-α wykazują rozległe obszary z dodatnim sygnałem fluorescencyjnym (Rycyna 2A). Widoczny jest również wyraźny rozpad morfologii kolonoidu – światło centralne nie jest już widoczne, a bariera nabłonkowa została całkowicie zniszczona.

Aby ilościowo określić sygnał barwnika śmierci komórkowej, wykorzystaliśmy otwartoźródłowe oprogramowanie do analizy obrazu w celu obliczenia intensywności fluorescencji każdego kolonoidu. Następnie znormalizowano dane, wyrażając średnią dla każdego warunku jako procent traktowania Max Toxicity. Po 8 h homeostatyczna lub tła śmierć komórek w kolonoidach kontrolnych BSA była stosunkowo niska (7,7% Max Toxicity) (Rycina 2B). W tym punkcie czasowym nie odnotowano statystycznie istotnych zmian w poziomie śmierci komórek; jednak w warunkach traktowanych TNF-α zaobserwowano niewielki wzrost cytotoksyczności (Rycina 2B). Po 24 h poziomy śmierci komórek wzrosły we wszystkich warunkach traktowanych cytokinami. Niemniej jednak, w przypadku warunku kontrolnego BSA, zmiana poziomu śmierci komórek między punktami czasowymi była minimalna (7,5% Max Toxicity po 24 h). Kolonoidy traktowane IFN-γ + TNF-α wykazały największy wzrost poziomu śmierci komórek w porównaniu do kontroli BSA (29,4% Max Toxicity). Różnica w poziomach śmierci komórek między traktowaniem łączonym a traktowaniem pojedynczymi cytokinami (IFN-γ, TNF-α) była wysoce istotna. Wyniki te sugerują możliwość cytotoksycznej interakcji synergistycznej między IFN-γ a TNF-α po 24 h.

W celu ilościowego określenia interakcji cytotoksycznych między stosowanymi cytokinami oraz ustalenia, czy wykazują one działanie synergistyczne, wykorzystaliśmy wskaźnik CPI. Interakcje między cytokinami uznaje się za synergistyczne, gdy wartość CPI jest <1, addytywne, gdy =1, lub antagonistyczne, gdy >1. Wartości CPI obliczono dla poszczególnych punktów czasowych (Rysunek 2C). Po 8 h wartość CPI wskazywała na niewielki synergizm (0,99), natomiast po 24 h wartość CPI uległa znacznemu obniżeniu (0,83). Analiza ta potwierdziła, że interakcja między IFN-γ a TNF-α po 24 h miała charakter synergistyczny. Co więcej, ilustruje ona, że w tym kontekście synergizm między IFN-γ a TNF-α jest zależny od czasu.

Schemat hodowli kolonoidów, traktowanie cytokinami, proces obrazowania żywych komórek, wyniki mikroskopowe.
Rycina 1: Schemat przebiegu eksperymentu i rozwiązywania problemów. (A) Schematyczny przegląd protokołu. (B) Reprezentatywne obrazy. (Bi) Obraz mikroskopii świetlnej ilustrujący optymalną gęstość hodowli i optymalny rozmiar kolonoidów przed pasażowaniem do analizy. Pasek skali = 500 µm. (Bii) Obraz mikroskopii świetlnej ilustrujący optymalny rozmiar fragmentów kolonoidów po dysocjacji; fragmenty zaznaczone na czerwono. Pasek skali = 100 µm. (Biii) Obraz mikroskopii świetlnej morfologii martwiczej kolonoidów po traktowaniu MT (z Triton X-100). Pasek skali = 25 µm. (Biv) Obraz mikroskopii świetlnej dwóch kolonoidów nakładających się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Pasek skali = 25 µm. (Bv) Obraz mikroskopii świetlnej detrytusu komórkowego kolonoidów obecnego po pasażowaniu; detrytus zaznaczony na czerwono. Pasek skali = 25 µm. Skróty: ROI = obszar zainteresowania; MFI = średnia intensywność fluorescencji; MT = maksymalna toksyczność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza toksyczności komórkowej przedstawiająca mikroskopię i wykresy słupkowe; efekty IFN-γ po 8 h/24 h z BSA, TNF-α.
Rycina 2: Analiza ilościowa indukowanej cytokinami śmierci komórek w ludzkich kolonoidach CD. (A) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii żywych komórek kolonoidów CD traktowanych barwnikiem SYTOX Green Nucleic Acid Stain (fluorescencyjny barwnik śmierci komórkowej) oraz cytokinami po 8 h i 24 h; nałożone kanały transmisji i GFP (kolor zielony). Kolonoidy traktowano w następujący sposób: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL IFN-γ, 3) 10 ng/mL TNF-α, 4) 10 ng/mL IFN-γ + 10 ng/mL TNF-α. Paski skali = 25 µm. (B) Analiza ilościowa kolonoidów CD traktowanych fluorescencyjnym barwnikiem śmierci komórkowej i cytokinami po 8 i 24 h; dane wyrażone jako % warunku MT. N = 2 linie kolonoidów CD, obrazowano 11-16 kolonoidów na warunek. (C) CPI obliczony dla każdego punktu czasowego przy użyciu zestawu danych z B, N = 2 linie kolonoidów CD. Dane wyrażone jako średnie ± SE. W B przeprowadzono analizę dwuczynnikową ANOVA, a następnie testy post-hoc Bonferroniego, *P < 0.05, ***P < 0.001 zgodnie z oznaczeniem. Skróty: CD = choroba Leśniowskiego-Crohna; GFP = zielone białko fluorescencyjne; CPI = współczynnik interakcji perturbagenu; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanowo; BSA = albuminy surowicy bydlęcej; TNF-α = czynnik martwicy nowotworu alfa; IFN-γ = interferon gamma; MT = maksymalna toksyczność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Skład pożywek hodowlanych dla protokołu. Aby przygotować pożywkę do proliferacji organoidów (Organoid Proliferation Media), należy połączyć pożywkę kondycjonowaną L-WRN oraz pożywkę bezsurowiczą (Serum-free Media) w stosunku 1:1, a następnie dodać suplementy. Pożywka do proliferacji organoidów powinna zostać zużyta w ciągu 2 tygodni od przygotowania. Należy pamiętać, że wszystkie gotowe pożywki powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Układ eksperymentalnej płytki 96-dołkowej oraz traktowanie cytokinami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opracowano kilka metod analiz ilościowych śmierci komórek w organoidach jelitowych. Badanie zaburzeń morfologii organoidów jelitowych za pomocą mikroskopii świetlnej jest prostym podejściem do ilościowego określania skutków substancji cytotoksycznych11. Jednak zmiany morfologiczne nie są bezpośrednim pomiarem śmierci komórki, a metoda jest tylko półilościowa. Inną metodą jest ocena aktywności metabolicznej organoidów za pomocą testu MTT lub ATP10,11. Ważne jest, aby pamiętać, że testy te mogą jedynie określać zmiany w żywotności komórek i muszą być zatwierdzone za pomocą testu śmierci komórki. Inne fluorometryczne testy śmierci komórki przy użyciu barwników wiążących DNA zostały zgłoszone12,13. Możliwe jest podejście bez obrazowania z wykorzystaniem fluorescencyjnego czytnika mikropłytek, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości12. Jednak ta metoda mierzy średni sygnał całej studni, co czyni ją nieodpowiednią dla heterogenicznych populacji. Wymaga również użycia czytnika mikropłytek z regulacją wysokości Z. Techniki obrazowania fluorescencyjnego mogą być wykorzystywane do analizy pojedynczych organoidów i przechwytywania danych komórkowych/subkomórkowych i morfologicznych. Zautomatyzowane systemy obrazowania konfokalnego o wysokiej zawartości (HCI) mogą generować duże ilości danych przy dużej przepustowości13. Niestety, konfokalna HCI wymaga specjalistycznego sprzętu, wykorzystuje złożone protokoły, zazwyczaj wymaga komercyjnego oprogramowania do analizy obrazu i jest droga.

Nasz protokół analizy ilościowej śmierci komórki okrężnicy w wielu punktach czasowych jest prosty, prosty i niedrogi. Jednak w porównaniu ze zautomatyzowanymi systemami HCI i czytnikami płyt jest to czasochłonne i ma zmniejszoną przepustowość. Kolejnym ograniczeniem naszej metody jest zastosowanie mikroskopii szerokokątnej, w przeciwieństwie do mikroskopii konfokalnej. Mikroskopia konfokalna jest bardziej odpowiednia do obrazowania grubych próbek 3D, takich jak organoidy, ponieważ redukuje nieostry sygnał i może rejestrować szeregowe sekcje optyczne (stosy Z). Jednak obrazowanie konfokalne zazwyczaj wymaga dłuższego czasu akwizycji i laserów o wysokiej intensywności, które zwiększają fototoksyczność/fotowybielanie. Bardzo ważne jest, aby pamiętać, że fluorescencyjne barwniki śmierci komórek, takie jak SYTOX Green, nadają się tylko do pomiaru form śmierci komórki, w których dochodzi do utraty integralności błony komórkowej, takich jak martwica, wtórna martwica związana z późną apoptozą, nekroptoza i pyroptoza21. Istnieją pewne formy regulowanej śmierci komórki, w których błona komórkowa pozostaje nieprzepuszczalna przynajmniej we wczesnych fazach śmierci komórki, takie jak apoptoza zależna od kaspazy. Jednak protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić również obrazowanie fluorescencyjnego reportera o aktywności kaspazy 3/722. Dostarczyłoby to dodatkowych danych, które pomogłyby scharakteryzować specyficzną modalność śmierci komórki.

Użyliśmy naszego protokołu, aby zademonstrować cytotoksyczne synergiczne oddziaływanie między cytokinami IFN-γ i TNF-α (Figura 2C), które wcześniej opisaliśmy w organoidach pochodzących od pacjentów z CD 9,10. Fizjologiczne znaczenie tej formy synergizmu wykazano również w mysich modelach limfohistiocytozy hemofagocytarnej i sepsy23. Wdrożono kilka matematycznych modeli referencyjnych i podejść do ilościowego określania synergii między kombinacjami czynników biologicznych24,25. Różnią się one pod względem złożoności, liczby czynników, które biorą pod uwagę, oraz progu, od którego należy uznać interakcję za synergiczną24,25. Niektóre modele wymagają wcześniejszej wiedzy na temat badanych czynników biologicznych, przyjmują pewne założenia dotyczące aktywności czynników i mogą wymagać kompleksowych krzywych dawka-odpowiedź dla każdego leczenia pojedynczego i skojarzonego25. Metoda, którą wybraliśmy do pomiaru synergii, jest modyfikacją modelu współczynnika interakcji leków (CDI), który wcześniej był używany do pomiaru hamującego wpływu kombinacji leków stosowanych w chemioterapii na proliferację linii komórek nowotworowych26. CDI jest modelem niezależności Bliss; Obliczając przewidywany łączny efekt dwóch perturbagenów Bliss Independence zakłada, że są one ukierunkowane na odrębne szlaki i mają niezależne mechanizmy działania27. Aby interakcja między zaburzeniami była synergistyczna, rzeczywisty łączny efekt musi być większy niż przewidywany efekt. Ten model jest odpowiedni dla naszej konfiguracji eksperymentalnej, ponieważ wiadomo, że IFN-γ i TNF-α mają różne receptory i dalsze komponenty sygnalizacyjne. Co więcej, niezależność Bliss pozwala na obliczenie współczynnika interakcji w celu ilościowego określenia synergizmu i nie wymaga zestawów danych dawka-odpowiedź.

Istnieje kilka kluczowych czynników, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić optymalne wyniki dla tego protokołu. Ważne jest, aby kolonoidy były rozmnażane do dużej gęstości (ryc. 1Bi), aby miały średnicę około 25-50 μm i aktywnie rozmnażały się przed próbą wysiewu komórek. Stosowanie nieoptymalnych kultur kolonoidów do testów może skutkować niewystarczającą liczbą komórek, niską regeneracją okrężnicy i niespójnymi eksperymentami. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest również, aby konsekwentnie zasiewać gęstość kolonoidów między eksperymentami. Wcześniej wykazano, że na odpowiedź in vitro na cytokiny zapalne może wpływać gęstość wysiewu komórek28,29. Innym częstym problemem jest tworzenie się pęcherzyków powietrza w kopule BME, co może wpływać na obrazowanie. Można temu zapobiec, stosując technikę odwróconego pipetowania. Ta technika zapewnia również bardziej konsekwentny siew.

Ponadto, jeśli obrazujesz wiele punktów czasowych, przygotuj warunek maksymalnej toksyczności dla każdego punktu czasowego. Triton-X 100, niejonowy środek powierzchniowo czynny, jest powszechnie stosowany jako kontrola pozytywna (warunek maksymalnej toksyczności) do testów cytotoksyczności. Dodatek Triton-X 100 powoduje lizę i zabijanie kolonoidów, umożliwiając fluorescencyjnemu barwnikowi śmierci komórki przedostanie się do komórek. Użycie warunku maksymalnej toksyczności z wcześniejszego punktu czasowego spowoduje niedokładną i niespójną normalizację danych z powodu zaniku sygnału fluorescencyjnego w czasie.

Ostatnią kwestią do rozważenia jest wybór BME stosowanego do hodowli okrężnicy. Istnieje kilku komercyjnych producentów BME; jednak w naszym protokole przetestowaliśmy tylko markę zawartą w Tabeli Materiałów. Niedawne badanie z wykorzystaniem organoidów raka trzustki pochodzących od pacjentów wykazało, że komercyjne źródło BME zmieniło tempo proliferacji komórek, ale nie miało znaczącego wpływu na odpowiedź na leki chemioterapeutyczne lub ekspresję genów30. Mając to na uwadze, spodziewamy się, że trend wyników będzie podobny między markami BME dla naszego protokołu, ale zalecamy konsekwentne używanie tej samej marki.

Pokazaliśmy, w jaki sposób ten protokół można wykorzystać do analizy śmierci komórek indukowanej przez IFN-γ i TNF-α przy użyciu kolonoidów pochodzących od pacjenta z CD. Organoidy jelitowe pochodzące od pacjentów są potężnym narzędziem do badania CD, ponieważ zachowują wiele cech choroby, w tym zwiększoną wrażliwość na cytotoksyczne działanie TNF-α31. Jednak protokół można łatwo zmodyfikować w celu zbadania cytotoksycznego wpływu zaburzeń innych niż cytokiny lub stanów chorobowych innych niż IBD, takich jak rak jelita grubego (z powodzeniem przetestowaliśmy protokół przy użyciu kolonoidów innych niż IBD). Uważamy, że ta metoda jest przydatna we wszystkich obszarach badawczych związanych z mechanizmami śmierci komórek, funkcją bariery nabłonkowej lub immunologią błony śluzowej jelit.

Oświadczenia

W czasie zakończenia prac firma K.N. otrzymywała fundusze na badania od firmy AbbVie Inc. Finansowanie to zostało przyznane w ramach nagrody centrum badawczego (SFI-14/SP/2710) dla APC Microbiome Ireland.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować pacjentom za ich świadomą zgodę i udział w badaniu naukowym, a personelowi klinicznemu za doskonałą pomoc. Rysunek 1A został stworzony z BioRender.com. Ta praca była wspierana przez granty od Science Foundation Ireland - a mianowicie nagrodę za rozwój kariery (CDA) dla K.N. (SFI-13/CDA/2171), grant centrum badawczego (SFI-12/RC/2273) oraz nagrodę dla centrum badawczego (SFI-14/SP/2710) dla APC Microbiome Ireland. P.F. otrzymał również dofinansowanie z SFI/20/RP/9007.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowane rozwiązanie DMEM/F12Gibco12634010
Amfoterycyna BSigma-MerckA2942
A-83-01Sigma-MerckSML0788
BioRenderScience Suite Inc.Nie dotyczyoprogramowania do ilustracji naukowych
Albumina surowicy bydlęcejSigma-MerckA2058Zasadniczo wolny od IgG, niski poziom endotoksyny
B27 SuplementInvitrogen17504-044
CHIR-99021Sigma-MerckSML1046
Costar 48-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, indywidualnie pakowane, sterylneCorning3548
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex, typ 2, PathclearR& D Systems3532-010-02Ekstrakt z błony podstawnej
DimetylosulfotlenekSigma-MerckD2650
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-MerckD8537
EVOS FL Cyfrowy mikroskop fluorescencji odwróconejInvitrogenAMF4300Cyfrowy mikroskop odwróconej epifluorescencji
EVOS 40x Obiektyw, fluoryt, LWD, kontrast fazowyThermoFisher ScientificAMEP4683Duża odległość robocza 40-krotny obiektyw fluorescencyjny
Fidżi/ImageJ (wersja Windows)Oprogramowanie typu open sourceNie dotyczyOprogramowanie do analizy obrazu
Surowica bydlęca płoduSigma-MerckF9665
Roztwór gentamycynySigma-MerckG1397
Odczynnik do delikatnej dysocjacji komórekSTEMCELL Technologies100-0485Bezenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek
GlutaMAX-1Gibco35050061Suplement dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy
GraphPad Prism 5 (wersja Windows)DotmaticsN/A Oprogramowaniegrafiki danych i statystyk
Greiner 15 ml Polipropylenowa probówka wirówkowa, sterylna ze stożkowym dnem i ZakrętkaCruinn188261CI
HEPES 1 MGibco15630080
Rekombinowany ludzki EGF (bez zwierząt)PeprotechAF-100-15
N-acetylocysteinaSigma-MerckA9165
NikotynamidSigma-MerckN0636
NormocinInvivoGenANT-NR-05Szeroki zakres odczynnik przeciwbakteryjny
Nunc Edge 96-Well, Nunclon traktowany Delta, płaskodenna mikropłytkaThermoFisher Scientific15543115
Suplement N2Invitrogen17502-048
Rekombinowane ludzkie białko IFN-gammaR& Systemy D285-IFZawiesić w sterylnym, przefiltrowanym 0,1% PBS/BSA
Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfaR& D Systems210-TAZawiesić w sterylnym, przefiltrowanym 0,1% PBS/BSA
SB202190Sigma-MerckS7067
Snap Cap Probówki do mikrowirówek o niskiej retencjiThermoFisher Scientific3451
SYTOX Zielone barwienie kwasami nukleinowymi - 5 mM Roztwór w DMSOInvitrogenS7020Barwnik śmierci komórek fluorescencyjnych, chronić przed światłem
Triton X-100Sigma-Merck93420
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-MerckT8154
Tryple ExpressGibco12604013Odczynnik dysocjacji enzymatycznej
Y-27632MedChemExpressHY-10071Inhibitor ROCK-I i ROCK-II
do

Bibliografia

  1. Patankar, J. V., Becker, C. Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).
  2. Zeissig, S., et al. Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment. Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).
  3. Bartee, E., Mcfadden, G. Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity. Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).
  4. Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function. Gut. 45 (2), 191-198 (1999).
  5. Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease. Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).
  6. Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations. Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).
  7. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury. Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).
  8. Lee, C., et al. Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids. J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).
  9. Woznicki, J. A., et al. TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells. Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).
  10. Flood, P., et al. DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).
  11. Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).
  12. Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids. Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).
  13. Mertens, S., et al. Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer. Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).
  14. Vandussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  15. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Woznicki, J. A., et al. Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells. Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).
  18. Edgar, R. D., et al. Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).
  19. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic. Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).
  20. Ziegler, U., Groscurth, P. Morphological features of cell death. News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).
  21. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).
  22. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  23. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  24. Geary, N. Understanding synergy. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).
  25. Duarte, D., Vale, N. Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology. Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).
  26. Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways. PLoS One. 8 (10), e78021(2013).
  27. Ryall, K. A., Tan, A. C. Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations. J Cheminform. 7, 7(2015).
  28. Sukho, P., et al. Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study. Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).
  29. Vaughan-Jackson, A., et al. Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages. Front Immunol. 13, 895488(2022).
  30. Lumibao, J. C., et al. The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).
  31. Lee, C., et al. TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nieswoiste zapalenia jelitkom rki nab onka jelitowegoTNF alfainterferon gammakwantyfikacja mierci kom rkowejanaliza w programie ImageJcytotoksyczno organoid w
Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.