Artykuł metodologiczny

Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66765

⸱

31 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego szczęki pełnią znaczące funkcje w różnorodnym różnicowaniu, samoodnawianiu i modulacji immunologicznej. Stały się one kluczowym rezerwuarem komórek prekursorowych w terapii genowej, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy unikalną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczęki u szczurów.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMMSC) to rodzaj komórek macierzystych o wielokierunkowym potencjale różnicowania. W porównaniu z BMMSC pochodzącymi z kości wyrostka robaczkowego, BMMSC pochodzące ze szczęki mają większą zdolność różnicowania proliferacyjnego i osteogennego, stopniowo stając się ważnymi komórkami nasiennymi do naprawy wad szczęki. Jednak żuchwa ma złożoną strukturę kostną i mniejszą zawartość gąbczastą niż kości wyrostka robaczkowego. Trudno jest pozyskać dużą liczbę wysokiej jakości mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku szczękowego przy użyciu tradycyjnych metod. W niniejszym badaniu przedstawiono "niszowe podejście do macierzystości" do izolowania i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczura (JBMMSC). Pierwotne JBMMSC szczurów wyizolowano i wyhodowano przy użyciu metody przylegania całego szpiku kostnego w połączeniu z metodą trawienia w plasterkach kości. Izolowane komórki zidentyfikowano jako JBMMSC poprzez obserwację morfologii komórek, wykrywanie markerów powierzchniowych komórek i wielokierunkową indukcję różnicowania. Komórki wyekstrahowane tą metodą mają kształt wrzeciona przypominający fibroblast. Komórki są długie, wrzecionowate i podobne do fibroblastów. Analiza cytometrii przepływowej pokazuje, że komórki te są dodatnie dla CD29, CD44 i CD90, ale ujemne dla CD11b / c, CD34 i CD45, co jest zgodne z charakterystyką BMMSC. Komórki wykazują dużą zdolność proliferacji i mogą ulegać różnicowaniu osteogennemu, adipogennemu i chondrogennemu. Badanie to zapewnia skuteczną i stabilną metodę uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości JBMMSC o silnej zdolności różnicowania w krótkim czasie, co może ułatwić dalsze badania nad eksploracją funkcji biologicznych, medycyną regeneracyjną i powiązanymi zastosowaniami klinicznymi.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały po raz pierwszy odkryte w szpiku kostnym, co wykazało zdolność do tworzenia adhezyjnych kolonii w hodowli i silny potencjał osteogenny1. Pittinger i wsp.2 odkryli ponadto ich wielokierunkowy potencjał różnicowania w kierunku kości, tłuszczu i chrząstek. Chociaż wszystkie mezenchymalne komórki macierzyste z różnych źródeł mają potencjał do wielokierunkowego różnicowania, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego mają najsilniejszy potencjał różnicowania chondrogennego w porównaniu z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z innych tkanek, co czyni je uważanymi za najlepsze komórki kandydujące do inżynierii tkanki kostnej3. Jednak wiele badań dowiodło, że BMMSC o różnym pochodzeniu wykazują cechy i właściwości specyficzne dla danego miejsca, takie jak zdolność różnicowania osteogennego i aktywność proliferacyjna komórek4,5. Może to być spowodowane różnymi listkami zarodkowymi między kośćmi szczęki i wyrostka robaczkowego lub grzebieniem biodrowym6.

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (JBMMSC) pochodzą z komórek grzebienia nerwowego neuroektodermy, podczas gdy BMMSC pochodzące z kości udowej pochodzą z mezodermy7. W porównaniu z BMMSC wywodzącymi się z kości długich i grzebienia biodrowego, JBMMSC mają wyższy wskaźnik proliferacji, aktywność ALP i potencjał osteogenny8. Poza tym efekt stosowania BMMSC w tkankach i narządach może się różnić w zależności od różnych typów komórek i środowiska9. Naprawa ubytków szczęki zależy głównie od rekrutacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szczęki. W związku z tym badanie JBMMSC może stanowić eksperymentalną podstawę do jego klinicznego zastosowania w inżynierii tkankowej kości szczęki10. Jednak badania podstawowe i zastosowania kliniczne koncentrują się głównie na BMMSC pochodzących z kości wyrostka robaczkowego i osiowego11. Badania nad JBMMSC są ograniczone, co może wynikać z niskiej zawartości kości gąbczastej w żuchwie oraz faktu, że szczęki szczurów mają jeszcze mniejszą zawartość kości gąbczastej12. W związku z tym trudno jest oddzielić mezenchymalne komórki macierzyste szpiku pochodzącego z kości szczęki przy użyciu zwykłej metody płukania szpiku kostnego, która jest powszechnie stosowana do izolowania BMMSC od kości wyrostka robaczkowego lub grzebienia biodrowego13. Opierając się na metodach Hong et al.14 oraz Cheng et al.15, postawiliśmy hipotezę, że połączenie gęstego trawienia kości i metody płukania szpiku kostnego może skutecznie izolować szczurze JBMMSC.

To badanie ma na celu opracowanie skutecznej metody izolowania szczurzych JBMMSC i zapewnienie wystarczających źródeł komórek nasiennych do inżynierii tkankowej szczęki.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Chińskiego Szpitala Ogólnego ChALW. Do eksperymentu wykorzystano trzynastotygodniowe samce szczurów rasy Wistar. Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki okulistyczne, pęsety i kości rongeur, w wysokiej temperaturze i ciśnieniu.
  2. Przygotuj wcześniej pożywki hodowlane.
    1. Przygotować kompletną pożywkę α-MEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
    2. Przygotować 0,1% kolagenazę typu II w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Przygotować 50 ml PBS z 1% penicyliną-streptomycyną w jednorazowej sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.

2. Izolacja i hodowla szczurów JBMMSC

  1. Odizoluj żuchwę szczura, wykonując poniższe czynności:
    UWAGA: Aby zachować sterylność próbki, wszystkie metalowe narzędzia chirurgiczne muszą być dezynfekowane w wysokiej temperaturze na płomieniu lampy alkoholowej przez co najmniej trzy sekundy przed użyciem.
    1. Znieczulić szczura 2% pentobarbitalem sodu (2 ml / kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
    2. Poświęć znieczulonego szczura przez zwichnięcie kręgów szyjnych (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) po tym, jak jego częstość oddechów spadnie, a mięśnie całkowicie się rozluźnią.
    3. Zanurz szczura w 75% etanolu na 30 minut, aby go zdezynfekować, a następnie przenieś go na ultra czysty stół.
    4. Umieść szczura na jednorazowej sterylnej szmatce lub w sterylnym pojemniku i trzymaj go w pozycji leżącej.
    5. Przeciąć i oddzielić skórę i mięsień od mięśnia łamaczkowego do stawu wzdłuż ramusa, a następnie oddzielić kłykieć od dołu panewkowego, przecinając krążek stawu skroniowo-żuchwowego i obustronne więzadła obwodowe poziomo nożyczkami okulistycznymi.
      UWAGA: Określ położenie stawu skroniowo-żuchwowego, poruszając żuchwą i obserwując położenie kłykcia na zewnątrz.
    6. Przetnij i oddziel mięśnie i tkanki łączne bocznej żuchwy za pomocą nożyczek z rowka przedsionkowego po stronie policzkowej dolnych siekaczy po lewej i prawej stronie.
    7. Naciąć mięśnie językowe żuchwy od wędzidełka językowego do tylnej części żuchwy.
    8. Usuń żuchwę z czaszki.
    9. Podziel żuchwę na połowy, przecinając spojenie między dolnymi siekaczami za pomocą nożyczek okulistycznych.
    10. Ostrożnie usuń pozostałe przyczepione mięśnie, powięź i inne tkanki miękkie żuchwy za pomocą nożyczek okulistycznych i kleszczy.
  2. Odizolować JBMMSC.
    1. Umieść dziób rongeura na styku siekaczy i mezjalnej części pierwszego zęba trzonowego, odetnij połączenie między dolnymi siekaczami a żuchwą z rongeurem i całkowicie wyciągnij dolne siekacze.
    2. Usuń wszystkie zęby trzonowe za pomocą rongeura kostnego.
    3. Usuń ramus żuchwy za pomocą rongeura kostnego i odsłoń jamę szpiku, oddzielając środkową część żuchwy wzdłuż dystalnej krawędzi ostatniego zęba trzonowego16.
    4. Odssać kompletną pożywkę α-MEM za pomocą jednorazowej sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Wprowadzić igłę do jamy szpiku kostnego i kilkakrotnie przepłukać szpik kostny do naczynia hodowlanego za pomocą kompletnej pożywki α-MEM, aż kość stanie się biała.
    5. Zebrać roztwór do płukania szpiku kostnego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować go przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki α-MEM i umieścić je w nowym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
    7. Podziel zaczerwienioną żuchwę na plastry kości o pojemności 1-3 mm³ za pomocą rongeur i traw je 3 ml 0,1% kolagenazy typu II przez 90 minut w wytrząsarce o prędkości 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
    8. Odwirować strawioną żuchwę o stężeniu 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
    9. Wyhodować pobrane komórki i strawione plastry kości za pomocą kompletnego podłoża α-MEM w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5%CO2
      10. .
    10. Po 72 godzinach należy wymienić połowę pożywki na świeżą, a następnie całkowicie zmieniać ją co 2 dni.
      UWAGA: Nie przesuwaj naczynia hodowlanego przez pierwsze trzy dni.
    11. Przejdź przez przylegające komórki w stosunku 1:2, gdy osiągną 80%-90% zbieżności. Usuń plastry kości podczas drugiej subkultury. Użyj komórek generacji P2 lub P3 do eksperymentów.

3. Cytometria przepływowa do identyfikacji markerów powierzchni komórek

  1. Zawiesić JBMMSC generacji P2 w buforze cytometrii przepływowej. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie do 3 × 106 komórek/ml.
  2. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej i 2 μl przeciwciał monoklonalnych (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 i CD90) do każdej probówki do mikrowirówki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C17,18.
  3. Przemyć próbkę dwukrotnie 200 μl buforu cytometrii przepływowej i odwirować ją przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
  4. Do każdej probówki dodać 100 μl buforu cytometrii przepływowej i 2 μl fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego znakowanego PE. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Powtórz krok 3.3.
  6. Zawiesić JBMMSC w 300-500 μl buforu cytometrii przepływowej na probówkę.
  7. Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego.
    UWAGA: Stosować przeciwciała homologiczne jako kontrole ujemne w celu wyeliminowania barwienia tła spowodowanego niespecyficzną kombinacją przeciwciał.

4. Oznaczanie proliferacji komórek

  1. Zasiać JBMMSC generacji P3 na 96-dołkową płytkę o gęstości 5 × 103 komórek na dołek.
  2. Dodać 10 μl roztworu CCK-8 do każdej studzienki.
  3. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze na 2 godziny i zmierzyć absorbancję (wartość OD przy 450 nm) za pomocą czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Wykonuj test o tej samej porze każdego dnia przez siedem kolejnych dni.

5. Zdolność do tworzenia kolonii

  1. Wysiać 1000 JBMMSC z przejścia 3 na 10 cm szalkach hodowlanych i wyhodować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Zmieniaj pożywkę co 3 dni.
  3. Barwienie na fiolet krystaliczny należy wykonać po ciągłej uprawie przez 15 dni.
  4. Następnie utrwal komórki metanolem przez 5 minut i barwić 2% fioletem krystalicznym przez 5 minut.

6. Wieloliniowe różnicowanie JBMMSC

UWAGA: Użyj JBMMSC generacji P3 do różnicowania wielolinii. Grupę kontrolną hodowano z kompletną pożywką α-MEM.

  1. Wykonaj różnicowanie osteogenne.
    1. Zaszczepić 1 × 105 JBMMSC na dołek w sześciodołkowej płytce.
    2. Gdy konfluencja komórek osiągnie 70%, zmień pożywkę na osteogenną pożywkę indukcyjną.
      UWAGA: Zmieniaj osteogenną pożywkę indukcyjną co 3 dni.
    3. Wykonaj barwienie fosfatazą alkaliczną (ALP) po 7 dniach indukcji osteogennej.
    4. Usuń pożywkę z płytki sześciodołkowej, utrwal komórki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie umyj je trzykrotnie PBS.
    5. Zabarwić komórki roztworem barwiącym ALP w temperaturze pokojowej przez 30 minut i chronić je przed światłem.
    6. Opłucz komórki, aż nie pozostanie roztwór barwiący i obserwuj próbki pod mikroskopem.
    7. Wykonaj barwienie czerwienią alizaryny po 21 dniach indukcji osteogennej.
    8. Barwić komórki roztworem barwiącym na czerwono Alizarynę przez 5 minut po utrwaleniu komórek 4% paraformaldehydem przez 30 minut.
    9. Przemyć komórki PBS, aż nie pozostanie roztwór barwiący w czerwieni alizarynowej.
    10. Obserwuj liczbę guzków wapnia pod mikroskopem.
  2. Wykonaj różnicowanie adipogenne.
    1. Zaszczepić 1 × 105 JBMMSC na dołek w sześciodołkowej płytce.
    2. Gdy zbieg komórek osiągnie 70%, zmień pożywkę na pożywkę indukcyjną adipogenną.
      UWAGA: Zmieniaj adipogenną pożywkę indukcyjną co trzy dni.
    3. Wykonaj barwienie czerwienią olejową O po 14 dniach indukcji adipogennej.
    4. Wyjmij pożywkę z płytki sześciodołkowej, utrwal komórki roztworem utrwalającym czerwień olejową O przez 20-30 minut, a następnie umyj je trzykrotnie PBS.
    5. Usuń roztwór utrwalający i dwukrotnie umyj komórki wodą destylowaną.
    6. Zanurz ogniwa w 60% izopropanolu na 20-30 s.
    7. Usuń 60% izopropanolu i zabarwij komórki barwnikiem O czerwonym olejem przez 20-30 min.
    8. Usuń roztwór barwiący, płucz komórki 60% izopropanolem przez 20-30 s, a następnie umyj je wodą destylowaną.
    9. Zabarwić jądro roztworem hematoksyliny przez 1-2 min.
    10. Usuń roztwór hematoksyliny i umyj komórki 2-3 razy wodą destylowaną. Dodaj czerwony bufor O oleju na 1 minutę i wyjmij go.
    11. Obserwuj liczbę kropelek lipidów pod mikroskopem.
  3. Przeprowadź różnicowanie chondrogenne.
    1. Zaszczepić 1 × 105 JBMMSC na dołek w sześciodołkowej płytce.
    2. Gdy zbieg komórek osiągnie 70%, zmień pożywkę na pożywkę do indukcji chondrogennej.
      UWAGA: Zmieniaj pożywkę do indukcji chondrogenicznej co 3 dni.
    3. Wykonaj barwienie niebieskim Alcian po 21 dniach indukcji chondrogennej.
    4. Usuń pożywkę z płytki sześciodołkowej, utrwal komórki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie umyj je trzykrotnie PBS.
    5. Wybarwić komórki błękitem alckim w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    6. Opłucz komórki, aż nie pozostanie roztwór barwiący i obserwuj je pod mikroskopem.

7. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Ekstrahuj całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA i zmierz stężenie RNA za pomocą markera enzymatycznego (zgodnie z instrukcjami producenta).
  2. Zsyntetyzuj cDNA przy użyciu 500 ng RNA19.
  3. Wykonaj qRT-PCR w systemie czasu rzeczywistego z 10 μl mieszanki qRT-PCR zawierającej 1 μl cDNA, 3,5 μl podwójnie destylowanej wody, 5 μl SYBR i 0,5 μl mieszanki starterów (0,1 μM).
    UWAGA: Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 1. Warunki cykli termicznych są następujące: 50 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 2 minuty, następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 2 minuty, a następnie przyrosty o 0,5 °C przez 5 s od 60 °C do 95 °C dla krzywej topnienia.
  4. Użyj GAPDH jako kontroli wewnętrznej16.

Wyniki

Po 72 h od inokulacji komórek większość z nich znajdowała się w zawiesinie i miała okrągły kształt, a tylko nieliczne przylegały do ścianki (Rycina 1B). W piątym dniu pojawiły się kolonie komórek adherentnych o wrzecionowatym kształcie lub kształcie przypominającym fibroblasty (Rycina 1C). Do siódmego dnia komórki adherentne osiągnęły 90% konfluencji, tworząc strukturę przypominającą „ławicę ryb” z niewielką liczbą przerywająco rozmieszczonych komórek w zawiesinie (Rycina 1D). Komórki po pasażowaniu rosły szybko i były pasażowane co 3 dni. Morfologia komórek była stosunkowo jednorodna, z przewagą kształtu wrzecionowatego, a po osiągnięciu konfluencji układały się w wzór przypominający wir (Rycina 1E-G).

Analiza cytometrii przepływowej wykazała wysoki poziom ekspresji markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych CD90, CD29 i CD44, z odsetkami pozytywnymi wynoszącymi odpowiednio 97,2%, 97,7% i 95,7%. Przeciwnie, markery powierzchniowe hematopoetycznych komórek macierzystych CD45, CD34 i CD11b/c wykazały niską ekspresję, z odsetkami pozytywnymi wynoszącymi odpowiednio 1,37%, 0,66% i 1,49% (Rycina 2A). Po 2 tygodniach hodowli komórki JBMMSCs wykazały zdolność do kolonizacji, co potwierdzono barwieniem fioletem krystalicznym (Rycina 2B). Wykazały one stabilną zdolność do ekspansji in vitro, a krzywa wzrostu komórek miała typowy kształt litery „S” (Rycina 2C). Proces proliferacji komórek obejmował okres latentny, fazę wzrostu logarytmicznego oraz fazę plateau. Szybki wzrost rozpoczął się po dwóch dniach, a następnie spowolnił po sześciu dniach. Pojedyncze komórki wykazywały cechy autoreplikacji i proliferacji.

W 7ym dniu komórki wykazały niebiesko-fioletowe cząstki barwione na ALP, a w 21ym dniu czerwone zmineralizowane guzki. Ponadto po 14 dniach indukcji adipogennej w komórkach pojawiły się czerwone, koralikowate krople lipidów, natomiast indukcja różnicowania chondrogennego doprowadziła do powstania niebieskiej tkanki przypominającej chrząstkę (Rycina 3A). Co więcej, po 7 dniach indukcji osteogennej poziomy ekspresji mRNA dla ALP, OCN i Runx2 w JBMMSCs uległy podwyższeniu15 (Rycina 3B).

Izolacja szpiku kostnego z żuchwy szczura, schemat trawienia; obrazy mikroskopowe przedstawiają proces hodowli komórek.
Rycina 1: Izolacja i hodowla JBMMSCs. (A) Przegląd protokołu. (B-D) Obrazy komórek hodowanych odpowiednio przez 3 dni, 5 dni i 7 dni w hodowli pierwotnej. (E-G) Obrazy komórek odpowiednio w pasażach P1, P2 i P3. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Markery cytometrii przepływowej CD11b/c, CD90, CD45, CD29, CD34, CD44; mikroskopia hodowli komórkowych; wykres wzrostu OD.
Rysunek 2: Identyfikacja JBMMSCs. (A) Wyniki analizy cytometrii przepływowej szczurzych JBMMSCs. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że komórki te były dodatnie dla CD29, CD44 i CD90, co jest zgodne z charakterystyką BMMSCs. Z kolei były one ujemne dla CD11b/c, CD34 i CD45. (B) Reprezentatywne obrazy kolonii JBMMSCs barwionych fioletem krystalicznym (paski skali: 100 µm). (C) Krzywa wzrostu komórek przedstawia tempo proliferacji komórek. Dane i słupki błędów oznaczają średnią ± odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test indukcji osteogennej; mikroskopia barwionych komórek, wykres słupkowy ekspresji dla analizy ALP, OCN, Runx2.
Rysunek 3: Różnicowanie wieloliniowe (osteogenne, adipogenne i chondrogenne) JBMMSCs. (A) Po 7 dniach indukcji osteogennej zaobserwowano zwiększoną aktywność ALP. W 21. dniu po indukcji osteogennej liczne zmineralizowane guzki zostały zabarwione na czerwono metodą barwienia Alizariną czerwoną. Barwienie Oil Red O ujawniło znaczną liczbę kropel lipidowych. Barwienie błękitem Alcyjanem uwydatniło komórki zindukowane do chondrocytów po indukcji chondrogennej. (B) Ekspresja mRNA genów związanych z osteogenezą: ALP, OCN i Runx2 w JBMMSCs po 7 dniach indukcji osteogennej. (***P < 0.001, vs. grupa kontrolna). Dane i słupki błędów oznaczają średnią ± odchylenie standardowe, n = 3. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Gensekwencje starterów (5'-3')
GAPDHF: ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R: CACATTGGGGGTAGGAACAC
ALPF: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF: GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R: GCAACACATGCCCTAAACGG
Runx2F: GCACCCAGCCCATAATAGA
R: TTGGAGCAAGGAGAACCC

Tabela 1: Primery użyte w Real-time PCR.

Dyskusja

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMMSC) reprezentują podzbiór niehematopoetycznych komórek macierzystych znajdujących się w szpiku kostnym, charakteryzujących się zdolnościami do samoodnawiania, wielokierunkowym potencjałem różnicowania i funkcjami wspomagającymi hematopoezę. Komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych, takich jak regeneracja tkanek, angiogeneza i regulacja aktywności komórkowej20. W związku z tym BMMSC są często wykorzystywane w naprawie tkanek i inżynierii regeneracyjnej jako optymalne źródło komórek nasiennych21.

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego szczęki (JBMMSC), początkowo wyizolowane z aspiratów ludzkiego szpiku kostnego szczęki w 2005 r. przez Matsubara i wsp.22, wykazują charakterystyczne cechy różnicujące wynikające z unikalnego pochodzenia i ścieżek rozwojowych szczęki w porównaniu z innymi miejscami szkieletowymi 4,23. Biorąc pod uwagę odrębne mechanizmy rozwojowe i patologiczne rządzące kością twarzoczaszki, priorytetowe traktowanie JBMMSC w naprawie ubytków kości twarzoczaszki wydaje się konieczne ze względu na ich homologiczne cechy rozwojowe23. Ponadto JBMMSC wykazują zwiększoną zgodność tkankową z mikrośrodowiskiem jamy ustnej ze względu na ich wspólne pochodzenie z tkanek embrionalnych24,25. Pomimo tych zalet, ustandaryzowany i bezpieczny protokół izolacji dla JBMMSC pozostaje nieuchwytny, a badania nad JBMMSC pozostają stosunkowo ograniczone.

Izolacja i hodowla BMMSC nie są obecnie ustandaryzowane, a powszechnie stosowane metody obejmują sortowanie kulek immunomagnetycznych, sortowanie cytometrią przepływową, wirowanie w gradionym spadku gęstości i hodowlę przylegającą do całego szpiku kostnego26. Wśród nich metoda kulek immunomagnetycznych i metoda sortowania metodą cytometrii przepływowej izolują komórki poprzez rozpoznawanie określonych antygenów na powierzchni komórki. Jednak metody te wiążą się z uciążliwymi operacjami, wymagają specjalistycznych narzędzi i mogą wpływać na aktywność komórek pomimo uzyskania komórek o wysokiej czystości27. Metoda wirowania w gradiacji gęstości oddziela komórki poprzez wirowanie i stratyfikację, co może zmienić mikrośrodowisko komórki, prowadząc do wolniejszego wzrostu komórek i przyspieszonego starzenia się komórek28. I odwrotnie, metoda hodowli przylegającej do szpiku kostnego całej części oddziela i oczyszcza BMMSC poprzez okresową wymianę pożywki i pasażowanie w oparciu o różne zdolności przylegania między różnymi typami komórek w szpiku kostnym. Ta metoda powoduje minimalne uszkodzenia komórek i jest prosta do wykonania16.

W porównaniu z kością udową szczęka jest mniejsza i ma węższą jamę szpiku kostnego, z interferencją komórek w zębie lub więzadle przyzębia. Metoda płukania i adhezji szpiku kostnego wymaga stosunkowo większej ilości szpiku kostnego i jest odpowiednia dla dużych zwierząt i ludzi29. JBMMSC u szczurów ekstrahowanych tradycyjną metodą płukania szpiku kostnego są rzadkie, wolno się namnażają i są złej jakości30,31. Zawartość JBMMSC w szpiku kostnym jest bardzo niska i znajdują się one głównie w zbitej kości i śródmieściu. Bu-Kyu Lee i wsp.32 użyli aspiratów żuchwy do wyizolowania JBMMSC, podczas gdy całkowity czas aspiracji 10 ml krwi szpikowej dla żuchwy był pięciokrotnie dłuższy niż dla grzebienia biodrowego, a początkowa wydajność MSCs z żuchwy była trzykrotnie niższa niż z grzebienia biodrowego. Samo płukanie szpiku kostnego nie jest w stanie skutecznie wyizolować komórek w zbitej kości i śródmieściu.

W ostatnich latach badania wykazały, że zwarta kość jest nowym i niezawodnym źródłem BMMSC, a także opracowano stosunkowo prostą metodę izolacji BMMSC, metodę hodowli trawienia w plasterkach kości33. BMMSC wyizolowane tą metodą mają wysoką czystość34. Guo i wsp.35z powodzeniem wyizolowali mezenchymalne komórki macierzyste kości z kości udowych myszy przy użyciu metody hodowli trawienia w plasterkach kostnych. Yamazaet wsp.12 i Cheng i wsp.15 zastosowali metodę hodowli trawienia wycinków kostnych do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku kostnego myszy i zweryfikowali właściwości MSC na podstawie proliferacji komórek, immunofenotypu i różnicowania wieloliniowego. W tym eksperymencie wykorzystano kombinację przepłukanej adhezji całego szpiku kostnego i trawienia w plasterkach kości w celu wyizolowania i hodowli pierwotnych JBMMSC szczurów. Szpik kostny został dokładnie wypłukany z jamy bez filtracji, aby zachować pierwotny skład komórkowy i czynniki wzrostu w szpiku kostnym. Następnie plastry kości pocięto na małe kawałki i strawiono za pomocą kolagenazy typu II, aby ułatwić komórkom wydostanie się z fragmentów kości. Na koniec wycinki kości zaszczepiono na szalce hodowlanej i wyhodowano, aby umożliwić komórkom wypełzanie z wycinków kości. Metoda skojarzona sprawia, że system hodowli komórki pierwotnej zawiera jednocześnie składniki hematopoetycznych komórek macierzystych, kości gąbczastej i kości korowej, co może lepiej symulować mikrośrodowisko mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego w organizmie i bardziej sprzyja zachowaniu pierwotnych cech biologicznych komórek. Metodę tę nazywa się zatem "podejściem niszowym do macierzystw"36. Luet wsp.37 podkreślił również znaczenie nisz komórek macierzystych w izolacji BMMSC, ale dotyczyły one tylko mikrośrodowiska w szpiku kostnym bez kości korowej. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego ze szczękimyszy 38.

Z powodzeniem wyizolowaliśmy również i wyhodowaliśmy szczurze JBMMSC dzięki temu niszowemu podejściu. Po pierwsze, wyizolowane komórki wykazywały kształt podobny do fibroblastów i przylegały do plastikowych płytek hodowlanych in vitro. Po drugie, komórki wykazywały dodatnią ekspresję markerów powierzchniowych CD90, CD29 i CD44 oraz ujemną ekspresję CD45, CD34 i CD11b / c. Po trzecie, komórki mogą różnicować się w osteocyty, adipocyty i chondrocyty. Uzyskane komórki charakteryzowały się dobrą morfologią, szybkim tempem proliferacji i zdolnością różnicowania, co spełniało minimalne kryteria identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia ludzkiego zaproponowane przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej17.

Izolacja JBMMSC została opracowana i wykorzystana do izolacji komórek u ludzi. Matsubara i wsp.22 byli pierwszymi, którzy wyizolowali JBMMSC z próbek ludzkiego szpiku kostnego pęcherzyków płucnych podczas chirurgii jamy ustnej. Podczas procesu aspiracji żuchwy mogą wystąpić możliwe powikłania, w tym uszkodzenie sąsiednich tkanek, zakażenie spowodowane zanieczyszczeniem bakteryjnym jamy ustnej itp. Zong i wsp.39 przepłukali jamę szpiku kostnego fragmentów próbki kości gąbczastej, aby uzyskać ludzkie JBMMSC. Park i wsp.40 wyizolowali ludzkie JBMMSC z wyrostka zębodołowego uzyskanego podczas wiercenia implantu przy użyciu metody sekwencyjnego trawienia. Mason i wsp.41 bezpośrednio wyizolowali ludzkie JBMMSC z rdzeni szpiku kostnego szczęki i aspiratu pacjentów poddawanych rutynowemu wszczepianiu implantów dentystycznych. Stwierdzono wysoki wskaźnik sukcesu izolowania komórek z aspiratów lub rdzenia oraz wyższy wskaźnik powodzenia kombinacji. Jednakże, mimo że powyższe metody z powodzeniem wyizolowały JBMMSC od ludzi, należy porównać różnice w skuteczności między metodami. Obecnie przedstawiona metoda była stosowana tylko u myszy i szczurów i nie ma badań nad zastosowaniem tej metody do izolacji ludzkich JBMMSC. Istnieją ograniczenia tej metody, zwłaszcza gdy jest ona stosowana u ludzi. Po pierwsze, ta metoda łączenia płukania szpiku kostnego i trawienia w plasterkach kości jest stosunkowo skomplikowana i wymaga więcej kroków. Po drugie, złożone procesy stawiają wyższe wymagania dotyczące sterylności operacji, co ma kluczowe znaczenie dla protokołu. Po trzecie, niemożliwe jest przepłukanie całej jamy szpiku kostnego ludzkiej szczęki, dlatego konieczne jest zbadanie niektórych równoważnych metod, takich jak płukanie fragmentów kości gąbczastej.

Podsumowując, w tym badaniu udało się wyizolować i wyhodować szczurze JBMMSC przy użyciu kombinacji płukania szpiku kostnego i trawienia w plasterkach kości w oparciu o zasadę "niszy komórek macierzystych". Wyniki identyfikacji komórek potwierdziły, że metoda ta może wyizolować wystarczającą ilość JBMMSC o wysokiej czystości, zapewniając wystarczające źródła komórek do inżynierii tkanki szczęki, szczególnie w naprawie ubytków kostnych. co ma ogromne znaczenie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Projekty Opieki Zdrowotnej Departamentu Logistyki Komisji Wojskowej (19BJZ22), Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (7232154) oraz Fourth Mil Med Univ. badania kliniczne (2021XB025).

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alizarin Red S Solution 0,2%SolarbioG1450
BCIP/NBT Zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznejBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 System czasu rzeczywistegoBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Naczynie do hodowli komórkowych 10 cmWirówka
Eppendorf5810R
Probówka wirówkowa 15 ml Corning430790
Probówka wirówkowa 50 ml 
Thermo Fisher3111
Oscylator stałej temperaturyShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Surowica bydlęca płodowaBI04-001-1ACS
Cytometr przepływowyBDFACS C6 
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowymOlympusCKX41 
Zestaw do wykrywania markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych (szczurów) OricellRAXMX-09011
Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldehyd 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
penicylina-streptomycyna 0,25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
PrimeScript RT Master Mix TakaraRR036A
Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego szczura Zestaw do różnicowania adipogennegoOricellRAXMX-90031
Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego szczura Zestaw do różnicowania chondrogennegoOricellRAXMX-90041
Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego szczura Zestaw do różnicowania osteogennegoOricellRAXMD-90021
Zestaw do ekstrakcji RNATIANGENDP419
Super czysta ławkaBeijing Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Trypsyna-EDTA  0,25%MACGENECC012
Kolagenaza typu IISolarbioC8150
Wistar ratPekin Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.
&pożywka hodowlana alfa;-MEM GibcoC12571500BT
do 353003 Corning Inkubator CO Corning 430828

Bibliografia

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja uchwy szczuratrawienie plasterk w kostnychszpik kostny z ca ej ko cimarkery powierzchniowe kom rekcytometria przep ywowar nicowanie osteogenner nicowanie adipogenner nicowanie chondrogenne
Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.