Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Streszczenie

Próbki ludzkich nowotworów zawierają mnóstwo informacji o swoim mikrośrodowisku i repertuarze immunologicznym. Skuteczna dysocjacja próbek tkanek ludzkich na żywe zawiesiny komórkowe jest wymaganym wkładem do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq). W przeciwieństwie do masowego sekwencjonowania RNA, scRNAseq pozwala nam wywnioskować niejednorodność transkrypcji w próbkach guza na poziomie pojedynczej komórki. Włączenie tego podejścia w ostatnich latach doprowadziło do wielu odkryć, takich jak identyfikacja stanów immunologicznych i nowotworowych oraz programów związanych z odpowiedziami klinicznymi na immunoterapie i inne rodzaje leczenia. Co więcej, technologie jednokomórkowe stosowane w tkankach zdysocjowanych mogą być wykorzystywane do identyfikacji dostępnych regionów chromatyny, repertuaru receptorów komórek T i B oraz ekspresji białek za pomocą przeciwciał kodowanych kodami kreskowymi DNA (CITEseq).

Żywotność i jakość zdysocjowanej próbki są kluczowymi zmiennymi podczas korzystania z tych technologii, ponieważ mogą one dramatycznie wpłynąć na zanieczyszczenie krzyżowe pojedynczych komórek otaczającym RNA, jakość danych i interpretację. Co więcej, długie protokoły dysocjacji mogą prowadzić do eliminacji wrażliwych populacji komórek i zwiększenia sygnatury genu odpowiedzi na stres. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy szybki uniwersalny protokół dysocjacji, który został zweryfikowany na wielu typach nowotworów ludzkich i mysich. Proces rozpoczyna się od dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej, po której następuje filtracja, liza czerwonej krwi i wzbogacanie żywych zmarłych, odpowiednie dla próbek o niskim wkładzie komórek (np. biopsje rdzenia igłowego). Protokół ten zapewnia czystą i żywotną zawiesinę jednokomórkową, która ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego generowania emulsji żelowych (GEM), kodów kreskowych i sekwencjonowania.

Wprowadzenie

Chociaż wiele postępów w badaniach nad rakiem doprowadziło do opracowania i zatwierdzenia przez FDA środków ukierunkowanych na receptory hamujące wyrażane na komórkach immunologicznych i nowotworowych, znanych jako inhibitory blokady punktów kontrolnych, oporność na terapię i identyfikacja mechanizmów, które kierują reakcją pacjenta, nadal stanowią wyzwanie¹. Złożone wyzwanie polegające na scharakteryzowaniu heterogeniczności guza na podstawie jego różnorodności molekularnej i skomplikowanej interakcji między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem immunologicznym wymaga nowych podejść do analizy tego złożonego ekosystemu w rozdzielczości pojedynczej komórki. Zrozumienie zawiłości molekularnych w obrębie nowotworów i ich mikrośrodowisk ma kluczowe znaczenie dla rozwoju strategii terapeutycznych i rozszyfrowania złożonej biologii leżącej u podstaw progresji raka². Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) staje się coraz bardziej popularne, ponieważ zapewnia analizę w wysokiej rozdzielczości pojedynczych komórek w złożonych próbkach guza^3,4.

Niejednorodność nowotworów, obejmująca różnorodność genetyczną, epigenetyczną i fenotypową, stanowi wyzwanie w odkrywaniu zawiłości biologii nowotworów⁵. Konwencjonalne metody masowego sekwencjonowania RNA mają tendencję do ukrywania unikalnych profili ekspresji i fenotypów heterogenicznych populacji komórek obecnych w nowotworach, ponieważ metody te uśredniają sygnały w całych populacjach komórek⁴. W przeciwieństwie do tego, scRNA-seq pozwala na rozbiór poszczególnych typów komórek, ujawniając różnorodną ekspresję genów, wzorce represji i stany komórkowe, które w przeciwnym razie zostałyby przeoczone^4,6. Założeniem scRNA-seq jest jego zdolność do dekodowania sygnatur genetycznych i molekularnych poszczególnych komórek, co daje ogromną nadzieję na odkrycie nowych metod leczenia raka⁷.

Rozszyfrowując profile ekspresji genów komórek nowotworowych oraz otaczających je komórek zrębu i układu odpornościowego, naukowcy mogą identyfikować nowe cele terapeutyczne i opracowywać precyzyjne strategie medycyny genetycznej dostosowane do indywidualnych pacjentów⁶. Co więcej, analiza repertuaru immunologicznego w mikrośrodowisku guza dostarcza kluczowych informacji na temat wzajemnych oddziaływań między komórkami nowotworowymi a efektorami immunologicznymi, torując drogę do interwencji immunoterapeutycznych³. Pomimo postępów w stosowaniu scRNAseq na próbkach klinicznych, kilka wyzwań na etapach przetwarzania może zaszkodzić integralności RNA komórki, żywotności i jakości generowanych danych. Co więcej, przetwarzanie tkanki o niskiej żywotności komórek może zwiększyć poziom RNA w kropelkach powstających podczas enkapsulacji poszczególnych komórek, powodując zanieczyszczenie krzyżowe i nieprawidłową adnotację typów komórek, podczas gdy długie protokoły dysocjacji wykonywane w temperaturze 37 °C mogą prowadzić do regulacji w górę sygnatury genu odpowiedzi na stres w wielu typach komórek8^{, 9,10}.

Procedura krokowa (Rysunek 1A) opisana w tym protokole rozpoczyna się od szybkiej mechanicznej i enzymatycznej dysocjacji guzów, po której następuje filtracja i usunięcie martwych komórek, w zależności od żywotności każdej próbki guza. Obecnie procedura ta została zweryfikowana w próbkach czerniaka¹¹, colorectal¹², rak płaskonabłonkowy głowy i szyi¹³, próbki guza trzustki i płuc (dane niepublikowane). Techniki te zapewniają generowanie wysokiej jakości żywotnych zawiesin komórkowych, które mają kluczowe znaczenie dla dalszych analiz¹⁴. Warto zauważyć, że usunięcie czerwonych krwinek, pozbawionych zsyntetyzowanego RNA, staje się konieczne do oczyszczenia próbki¹⁵. Późniejsza ocena liczby komórek i eliminacja martwych komórek stanowią warunek wstępny pomyślnego generowania 10-krotnej emulsji perełkowej (GEM) Genomics Gel Bead-in Emuls, kodów kreskowych i zwiększenia odzysku transkryptów i zsekwencjonowanych komórek bez narażania na ryzyko wykluczenia wrażliwych populacji (np. neutrofili i komórek nabłonkowych)¹⁶. Kroki te mają zasadnicze znaczenie dla uwolnienia potencjału analizy rozdzielczości pojedynczej komórki w próbkach nowotworowych^9,10, odkrywając nowe profile ekspresji genów i sygnatury immunologiczne niezbędne do prowadzenia innowacyjnych interwencji terapeutycznych oraz identyfikując nowe podatności guza.

Protokół

To badanie było zgodne ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi pobierania próbek tkanek ludzkich. Uzyskano świadomą zgodę od pacjentów, a możliwe do zidentyfikowania dane próbki zostały zanonimizowane. Próbki są pobierane na sali operacyjnej, umieszczane w roztworze RPMI, soli fizjologicznej lub PBS i potwierdzane jako rakowe przez oddział patologii przed użyciem w badaniach. Wszystkie czynności, z wyjątkiem przypadków, gdy są one wskazane, powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Pracuj wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego podczas przetwarzania tkanek ludzkich. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie próbki

1. Uzyskaj stałą próbkę guza w probówce z pożywką i umieść ją na lodzie.
   1. Poinstruuj personel sali operacyjnej, aby przetransportował próbkę w probówce zawierającej wystarczającą ilość RPMI, soli fizjologicznej lub PBS, aby całkowicie zanurzyć tkankę, aby uniknąć odwodnienia próbki.
      UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że próbka nie jest wysuszona, ponieważ zmniejszy to żywotność.
2. Schłodzić wszystkie wirówki do temperatury 4 °C i doprowadzić mieszalnik termiczny do temperatury 37 °C.
3. Wyjąć przygotowane enzymy dysocjacji guza ludzkiego lub mysiego (tabela materiałów), rozmrozić w mieszalniku termicznym o temperaturze 37 °C i przenieść do lodu po rozmrożeniu.
4. Pobrać 20 ml porcji RPMI.
5. Zapisz odpowiednie informacje o próbce (np. identyfikator pacjenta, de-identyfikator, rodzaj próbki).
6. Przenieść próbkę do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm (umieszczonego na lodzie), kilkakrotnie odwracając probówkę i wlewając zawartość do naczynia, aby upewnić się, że cały materiał próbki został przeniesiony. Jeśli próbka nie została dostarczona w pożywce po przybyciu, dodaj do naczynia świeżą pożywkę RPMI.
   1. Jeżeli próbka jest rozdrobniona, obracać probówkę zawierającą próbkę w temperaturze 450 × g, 4 °C przez 5 minut, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić próbkę w 420 μl RPMI i przejść do sekcji 2.

2. Trawienie mechaniczne i enzymatyczne

1. Odpipetować 420 μl pożywki z naczynia na próbkę o średnicy 60 mm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Spróbuj dołączyć wszelkie fragmenty próbki zawieszone w podłożu.
2. Przenieść tkankę próbki z szalki o średnicy 60 mm do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę za pomocą pęsety. Pokrój próbkę czystymi nożyczkami wewnątrz probówki tak, aby kawałki miały maksymalną średnicę 2-3 mm.
3. Dodać do próbki enzymy wytrawiające przygotowane zgodnie ze specyfikacją producenta (tabela materiałów) w następujących objętościach: 42 μl enzymu H (proteazy niespecyficzne) dla próbek ludzkich, enzymu D (proteazy niespecyficzne) dla próbek mysich, 21 μl enzymu R (proteazy niespecyficzne) i 5 μl enzymu A (nukleazy).
4. Dodaj kolejne 420 μl pożywki z naczynia lub do oznaczenia 1 ml na probówce. Nie przekraczać 420 μl podłoża.
5. Obracaj rurkę przez 5 sekund i umieść ją w mieszalniku termicznym ustawionym pionowo na boku (Rysunek 1B). Inkubować w temperaturze 37 °C, 450 obr./min, przez 15 min.
   UWAGA: Podczas inkubacji wyjmij wszystkie 10x materiały genomiczne potrzebne do wytworzenia GEM, ponieważ wymagają one 30 minut, aby zrównoważyć się do temperatury pokojowej

3. Filtrowanie próbek

1. Umieść filtr komórkowy 50 μm na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i zalej filtr, przepuszczając przez niego 1 ml świeżego podłoża RPMI do probówki.
2. Po roztrawieniu przenieść próbkę do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szerokiej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i niskiej retencji. Umyj probówkę o pojemności 1,5 ml 1 ml świeżym podłożem i przenieś pożywkę do filtra, aby upewnić się, że cały materiał próbki przeszedł przez filtr.
3. Zaopatrzyć się w plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml i wyjąć tylko tłok (wyrzucić pozostałą część strzykawki). Używając tylnej części tłoka strzykawki, zmielić i docisnąć próbkę do filtra ruchem obrotowym.
4. Umyć filtr 5 ml pożywki i wszelkie pozostałe media z naczynia, w którym znajdowała się próbka (sekcja 1), w celu zebrania wszelkich komórek, które mogły oderwać się od tkanki.
5. Umieść filtr komórkowy 30 μm na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, zalej filtr 1 ml pożywki i przenieś zawartość probówki zawierającej zdysocjowaną próbkę przez filtr.
   UWAGA: Ten krok usunie duże zanieczyszczenia, które mogą się zatkać lub spowodować awarię zwilżania podczas uruchamiania próbki przy użyciu 10x chipów mikroprzepływowych Genomics.

4. Liza czerwonych krwinek

1. Odwirować próbkę w temperaturze 450 × g, 4 °C przez 5 minut. Zassać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.
2. Ponownie zawiesić w buforze ACK Lysis w celu usunięcia czerwonych krwinek (RBC) i zapisać zużytą objętość. Objętość będzie zależeć od wielkości osadu i stopnia obecności erytrocytów w granulce.
   UWAGA: Ponownie zawieszony roztwór próbki ACK powinien być bezbarwny po dodaniu wystarczającej ilości buforu ACK Lysis, ponieważ spowoduje to usunięcie czerwonych krwinek z próbki.
3. Odwirować probówkę z próbką o masie 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant.
4. W razie potrzeby powtarzaj kroki 4.2-4.3, aż osad próbki nie będzie miał widocznego czerwonego koloru po odwirowaniu (Rysunek 2). Zapisz wszelkie dodatkowe woluminy buforu ACK Lysis użyte w tym kroku.
5. Zawiesić osad próbki w świeżym pożywce w celu przygotowania do liczenia.

5. Zliczanie komórek

1. Umieść 10 μl błękitu trypanowego w probówce o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszać zdysocjowane komórki, pobrać 10 μl próbki i wymieszać (1:1) z błękitem trypanowym. Załaduj po 10 μl z każdej strony hemocytometru i policz komórki.
2. Rejestruj stężenie komórek, całkowitą liczbę żywych komórek, procent żywotności i końcową objętość nośnika po zliczeniu.
3. Upewnij się, że liczba komórek wynosi od 700 do 1,200 komórek/μl (7 × 10 5-1,2 × 10⁶/ml), aby uzyskać optymalny 10-krotny przebieg genomiki.
   1. Jeśli próbka jest zbyt zagęszczona, rozcieńczyć ją pożywką i ponownie przeliczyć.
   2. Jeżeli próbka jest zbyt rozcieńczona, należy ją odwirować w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić w mniejszej objętości pożywki.
   3. Jeśli żywotność komórek jest niższa niż 80%, wykonaj procedurę żywego martwego ciała, aby usunąć martwe komórki.
   4. Jeśli jest mniej niż milion komórek, patrz punkt 6.
   5. Jeśli liczba komórek przekracza milion, a żywotność wynosi > 10%, patrz punkt 6.
   6. Jeśli liczba komórek przekracza milion, a żywotność < 10%, patrz punkt 7.
   7. Jeśli żywotność komórek przekracza 80%, utrzymuj przetworzone komórki na lodzie i natychmiast przystąp do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Usuwanie martwych komórek - Zestaw 1

UWAGA: Pracuj wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego podczas używania odczynników do usuwania martwych komórek, ponieważ mogą one łatwo ulec skażeniu.

1. Odwirować próbkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
2. Przygotuj pożywkę izolacyjną w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej: 9,8 ml PBS, 10 μl CaCl₂ i 200 μl inaktywowanego termicznie FCS (dodanego w kapturze bezpieczeństwa biologicznego).
3. Po odwirowaniu odessać pożywkę z osadu i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki izolacyjnej.
4. Ponownie odwirować probówkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl pożywki izolacyjnej.
5. Przenieść 100 μl próbki w pożywce izolacyjnej do jednego dołka w probówce paskowej o pojemności 0,2 ml do PCR.
6. W okapie bezpieczeństwa biologicznego dodać 10 μl koktajlu Annexin V i 10 μL koktajlu selekcyjnego biotyny do studzienki zawierającej 100 μl próbki w pożywce izolacyjnej. Odpipetować roztwór i odstawić go na 4 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Po 4 minutach należy wirować cząstki magnetyczne pokryte dektranem przez 30 s. Do próbki dodać 20 μl kulek i 60 μl pożywki izolacyjnej (całkowita objętość 200 μl). Jeśli żywotność jest niższa niż 40%, należy zwiększyć ilość kulek do 40 μl, dostosowując objętość pożywki izolacyjnej (do 40 μl), zachowując całkowitą objętość 200 μl. Odpipetować mieszać i pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej na 3 minuty.
8. Umieść probówkę z paskiem na 10-krotnym separatorze magnetycznym Genomics (na wysokim ustawieniu) na 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Przenieś płyn z probówki z paskiem, nie naruszając kulek, do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z lo-bindem. Nie wyjmuj rurki paskowej z magnesu.
10. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą próbkę w temperaturze 450 × g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki RPMI w zależności od wielkości osadu i liczby komórek, jak opisano w sekcji 5. Powtórz procedurę usuwania martwych komórek, jeśli żywotność pozostaje poniżej 80% (Rysunek 3 i Rysunek 4).
    UWAGA: Nie należy ponownie zawieszać komórek w pożywce izolacyjnej w celu dalszego wytwarzania GEM, ponieważ chlorek wapnia będzie zakłócał proces enkapsulacji i etap odwrotnej transkrypcji (RT).
11. Utrzymuj przetworzone komórki na lodzie, jeśli żywotność komórek przekracza 80% i natychmiast przystąp do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Usuwanie martwych komórek - Zestaw 2

UWAGA: Pracuj w kapturze bezpieczeństwa biologicznego podczas korzystania z zestawu odczynników.

1. Umieść mikrogranulki i 20-krotny roztwór podstawowy buforu wiążącego w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Odwirować zawiesinę próbki w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
3. Przygotować 1x roztwór buforowy w sterylnych warunkach, używając 1 ml 20x roztworu podstawowego buforu wiążącego pipetowanego do 19 ml wody destylowanej wolnej od DNAzy i RNAzy.
4. Po zakończeniu wirowania odessać supernatant, dodać mikrogranulki, delikatnie wymieszać próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   1. Gdy liczba komórek wynosi 10⁷ lub mniej, dodaj 100 μl mikrogranulek.
   2. W przypadku liczby większej niż 10⁷ wszystkich komórek, dostosuj mikrogranulki do końcowego stężenia 100 μl na 10⁷ żywych komórek.
5. Podczas inkubacji należy uzyskać jedną kolumnę pozytywnej selekcji MACS, wielostanowiskowe MACS i odpowiedni separator magnetyczny. Upewnij się, że separator jest wypoziomowany na stojaku wielofunkcyjnym i żaden inny metalowy lub magnetyczny przedmiot nie znajduje się w pobliżu stojaka, ponieważ siła magnetyczna jest silna i może wpływać na skuteczność usuwania martwych komórek. Umieść kolumnę ciasno w uchwycie separatora ze skrzydłami skierowanymi na zewnątrz.
6. Po inkubacji próbki, jeśli całkowita objętość zawiesiny jest mniejsza niż 500 μl, dodać 1x bufor wiążący, aż całkowita objętość wyniesie 500 μl.
7. Umieść stożkową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną i zalej kolumnę 3 ml 1x buforu wiążącego.
8. Zastąp rurkę stożkową nową stożkową o pojemności 15 ml do pobierania próbki z komórek i dodaj próbkę do kolumny, pozwalając jej całkowicie przepłynąć przez kolumnę.
9. Przemyć kolumnę 4 x 3 ml 1x buforu wiążącego, dodając tylko jedno płukanie na raz po tym, jak poprzednie płukanie całkowicie przepłynęło przez kolumnę.
10. Po czwartym przepłukaniu odwirować stożkową probówkę zawierającą wyizolowane komórki przez 5 minut w temperaturze 450 × g, 4 °C. Odrzucić kolumnę i pozostałą ilość 1x bufor wiążący.
11. Ponownie zawiesić roztwór próbki w odpowiedniej ilości pożywki RPMI w zależności od wielkości osadu i policzyć izolowane komórki metodą opisaną w sekcji 5 (Rysunek 3 i Rysunek 5).
    1. Jeśli żywotność utrzymuje się poniżej 80%, a całkowita liczba komórek wynosi 10⁶ lub mniej, powtórz sekcję 6.
    2. Jeśli żywotność komórek przekracza 80%, przechowuj przetworzone komórki na lodzie i natychmiast przystąp do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

Biopsja czerniaka zawieszona w RPMI została wykonana i natychmiast umieszczona na lodzie. Próbkę przeniesiono do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 420 μl RPMI i enzymów wytrawiających, zmielono na małe kawałki za pomocą nożyczek i poddano późniejszej trawieniu enzymatycznej przez 15 minut w pionowo ustawionym mieszaczu termicznym o temperaturze 37 °C (Rysunek 1). Po mineralizacji próbka została przefiltrowana przez sterylny jednorazowy filtr o wielkości 50 μm, a filtr został przemyty świeżym RPMI w celu zwiększenia wydajności komórek (Rysunek 1). Pozostałe części tkanki pozostałe po płukaniu zostały wyrzucone, ponieważ są to niechciane materiały biologiczne (np. tkanka tłuszczowa).

Na podstawie koloru powstałej granulki komórek, do usunięcia czerwonych krwinek potrzebne było 15 ml buforu do lizy ACK (Rysunek 2). Po ponownym zaciśnięciu w 3 ml pożywki RPMI, całkowita liczba komórek wynosiła 1 × 10⁶/ml, przy żywotności wynoszącej <80% (Rysunek 3A). Wskazywało to, że przed przystąpieniem do ><10-krotnego ładowania Genomics potrzebny był jeden cykl wzbogacania żywych komórek przy użyciu Zestawu 1 (sekcja 6 protokołu). Gdyby ta próbka miała ponad 1 milion komórek i miała żywotność mniejszą niż 10%, zamiast tego użyto by zestawu do usuwania martwych komórek - Zestaw 2 (Rysunek 5). Próbkę przemyto pożywką izolacyjną i dodano 10 μl aneksyny V i koktajlu selekcyjnego biotyny, a następnie 20 μl kulek magnetycznych i 60 μl pożywki izolacyjnej, jak opisano w sekcji 6 protokołu (Rysunek 4). Po tej procedurze próbkę zawieszono ponownie w 500 μl pożywki i ponownie przeliczono. Liczba żywych komórek wynosiła 4,9 × 10⁵/ml przy żywotności powyżej 90% (Rysunek 3B), a próbka natychmiast przeszła do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

Rysunek 1: Przegląd przetwarzania próbek nowotworów. (A) Ilustracja procesu krok po kroku protokołu dysocjacji tkanek. (B) Roztwarzanie próbki przy użyciu pionowo umieszczonego mieszalnika termicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Leczenie przed ACK i po ACK próbki czerniaka o łagodnym zabarwieniu. (A) Obraz przedstawia próbkę czerniaka, która została przefiltrowana i granulowana po etapie trawienia przed lizą czerwonych krwinek (RBC) przy użyciu ACK. (B) Obraz przedstawia tę samą próbkę czerniaka po usunięciu RBC przy użyciu buforu ACK. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Widok komórek na hemocytometrze pod trypanem niebieskim powiększonych przy 200-krotnym powiększeniu. (A) Obraz przedstawiający wygląd niebieskich komórek przed wzbogaceniem żywych komórek, reprezentujących martwe komórki, o żywotności niższej niż 80%. (B) Obraz przedstawiający próbkę po wzbogaceniu żywych komórek przy użyciu protokołu Kit 1 (krok 6 protokołu), wykazujący zwiększoną żywotność powyżej 90%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przegląd izolacji żywych i martwych komórek próbki za pomocą Zestawu 1. Ten krok jest wykonywany, gdy po zliczeniu komórek wykryto mniej niż milion lub ponad milion komórek o żywotności >10% (krok protokołu 5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przegląd izolacji żywych i martwych komórek za pomocą mikrokulek do usuwania martwych komórek w Zestawie 2. Ten krok jest wykonywany, gdy jest ponad milion komórek i żywotność <10%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Walidacja analizy pojedynczej komórki niemanipulowanej próbki po jednym cyklu wzbogacania żywych komórek przy użyciu zmodyfikowanego protokołu Zestawu 1. Górna część przedstawia analizę UMAP wykazującą spójność grup i typów komórek przed i po wzbogaceniu żywych komórek. Dolna część podsumowuje wyniki sekwencjonowania generowane przez Cell Ranger. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje dysocjację ludzkich lub mysich próbek nowotworów w zawiesinę pojedynczej komórki w celu sekwencjonowania scRNA przy użyciu systemu mikroprzepływowego 10x Genomics. Podczas przetwarzania tkanek, które często pochodzą z rzadkich nowotworów lub są częścią trwających badań klinicznych lub długich eksperymentów dotyczących guzów myszy, próbka musi być optymalnie i starannie zachowana między wszystkimi etapami. Wszystkie kroki powinny być przeprowadzane szybko na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zachować natywne profile komórkowego RNA i zapobiec degradacji, ponieważ praca w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas wpłynie na jakość transkryptomiczną^17,18.

Należy podjąć kilka kroków, aby zapewnić, że utrata komórek podczas całej procedury jest minimalna, zwłaszcza podczas przetwarzania biopsji gruboigłowych^{małymi igłami 17}. Zapewnienie, że wszystkie fragmenty próbki guza zostaną włączone do trawienia, doprowadzi do najbardziej pomyślnego wyniku, ponieważ więcej komórek wyekstrahowanych z próbki poprawi przyszłą enkapsulację i sekwencjonowanie 10x Genomics oraz całkowitą liczbę komórek i transkryptów odzyskanych do analizy. Jeśli próbka utknie w probówce, do której dociera, można dodać pożywkę, odwrócić probówkę i przenieść do naczynia w celu przetworzenia. Jeżeli próbka początkowa jest rozdrobniona lub roztwór jest mętny, co wskazuje na obecność komórek w zawiesinie, należy upewnić się, że cała próbka została zebrana do mineralizacji enzymatycznej poprzez odwirowanie próbki z roztworem, w którym przybyła, i ponowne zawieszenie jej w objętości pożywki do mineralizacji (sekcja 1 protokołu).

Podczas zasysania należy upewnić się, że osad nie jest naruszony przez cały czas trwania zabiegu. Podczas zasysania pozostaw dodatkową objętość, którą można usunąć za pomocą pipety P200. Jeśli osad zostanie zakłócony, objętość można dozować z powrotem do probówki i ponownie odwirować. Po lizie ACK lub po usunięciu żywych trupów próbka może mieć objętości tak niskie, jak 25 μl. Dlatego tak ważne jest, aby nie stracić żadnego supernatantu zawierającego komórki. Prawidłowe trawienie mechaniczne jest niezbędne, aby zapewnić, że komórki będące przedmiotem zainteresowania są narażone na trawienie enzymatyczne. W przypadku próbek o większych rozmiarach ^9,19,20 może być konieczne dłuższe trawienie enzymatyczne przy użyciu odpowiednich enzymów i mieszalnika termicznego. Chociaż konkretne nazwy enzymów są zastrzeżone, producent zauważa enzym A jako nukleazę, a enzymy H, D i R jako niespecyficzne proteazy. Przepuszczenie jak największej ilości próbki guza przez filtr ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia najwyższej możliwej wydajności komórek. Pomyślne filtrowanie spowoduje, że filtr nie będzie miał złapanej żadnej lub tylko niewielka widoczna próbka. Niektóre fragmenty próbki mogą nie być w stanie zostać przefiltrowane, jeśli zawiera dużą ilość tkanki tłuszczowej lub łącznej. Jeśli na górze filtra znajdują się widoczne kawałki próbki, kontynuuj używanie tylnej części tłoka strzykawki do zmielenia i przepchnięcia całej próbki za pomocą ruchu skręcającego, jednocześnie myjąc górną część filtra większą ilością mediów.

Powodzenie etapu lizy krwinek czerwonych określa się poprzez obejrzenie próbki pod mikroskopem po załadowaniu próbki do hemocytometru w celu zliczenia i żywotności^15,21. Jeśli do próbki zostanie dodana wystarczająca ilość ACK, aby usunąć czerwone krwinki, w granulce nie będzie czerwonych krwinek ani widocznego zaczerwienienia. Jeżeli w próbce widoczne są czerwone krwinki, należy dodać dodatkowy ACK i ponownie odwirować próbkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po zakończeniu supernatant powinien zostać zasysany, a osad komórek może zostać ponownie zawieszony w pożywce RPMI w celu wizualizacji i zliczenia.

Aby zapewnić optymalny przebieg 10x Genomics, liczba komórek powinna wynosić od 700 do 1200 komórek/μl (7 × 10 5-1,2 × 10⁶/ml). Wysokie stężenie zwiększy szybkość dubletową (dwie komórki w jednej kropli) podczas tworzenia kropel. Jeśli liczba jest zbyt wysoka, do próbki można dodać odpowiednią ilość pożywki i ponownie załadować ją do hemocytometru w celu ponownego przeliczenia. Jeżeli stężenie jest zbyt niskie, próbkę można ponownie odwirować w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie zassać supernatant i ponownie zawiesić w mniejszej objętości pożywki przed ponownym przeliczeniem. Próbka jest gotowa do załadowania do 10x Genomics, jeśli żywotność żywej komórki przekracza 80% (ryc. 3).

Jeśli żywotność próbki jest niższa niż 80%, przed 10-krotnym załadowaniem Genomics¹⁶ potrzebna jest procedura żywego martwego zwierzęcia. Jeśli jedna runda usuwania żywych trupów nie przyniosła procentu żywotności powyżej 80%, należy przeprowadzić kolejną rundę, jeśli łącznie jest ponad 1 × 10⁵ komórek. Wyższa żywotność zapobiegnie zatykaniu się w kolejnym protokole 10x Genomics, zwiększy regenerację komórek i zmniejszy obecność RNA w otoczeniu. Protokół Kit 1 został zoptymalizowany i zminiaturyzowany pod kątem szybkiej dysocjacji mniejszych próbek tkanek o mniejszej liczbie komórek. Zmniejszona objętość odczynników i skrócony czas inkubacji zwiększają wydajność komórek i zapobiegają powstawaniu sygnatury genów odpowiedzi na stres (FOS, JUN i JUNB) na różnych komórkach ^9,22. Alternatywne metody wzbogacania żywych komórek obejmują barwienie i sortowanie. Skutkowałoby to jednak zmniejszoną wydajnością komórek, przedłużoną inkubacją barwienia, która mogłaby wpływać na stany komórkowe (np. przeciwciała aCD3e aktywują limfocyty T) oraz stresem wywołanym naciskiem maszyny na komórki podczas sortowania ^9,22. Przykład pokazany na rysunku 6 ilustruje UMAP wygenerowany po sekwencjonowaniu 10X Genomics Gene Expression (GEX) i konwersji wygenerowanych kodów kreskowych komórek na pliki FASTQ, które zostały następnie połączone i wyrównane za pomocą CellRanger. Kolejne wyniki sekwencjonowania i porównania usuwania żywych i martwych komórek zostały wykreślone, demonstrując populacje komórek w próbce przed i po usunięciu żywych żywych ciał oraz poprawiając jakość sekwencjonowania. Próbka płuc pokazana na rycinie 6 wskazywała na problem z ułamkiem odczytów, ponieważ wynosiła ona poniżej 70%. To ostrzeżenie zostało wygenerowane z powodu wysokiego poziomu otaczającego RNA w populacji zlizowanych lub martwych komórek. Jednak po usunięciu martwych komórek błąd ten nie był już obecny i skutkował wyższym odsetkiem odczytów frakcji w komórkach²³.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest kosztownym i niepewnym procesem, który znacznie rozwinął dziedzinę immunologii nowotworów i badań nad rakiem. Pozwala na dalsze badanie genów, stanów komórkowych i programów wyrażanych i represjonowanych w określonych typach komórek, ujawniając więcej na temat zachowania i heterogeniczności nowotworów. Tkanka nieoptymalna lub o niskiej żywotności jest bardziej skłonna do generowania danych niskiej jakości, które mogą tworzyć artefakty, które odciągają od rzeczywistości biologii guza, podkreślając krytyczne znaczenie prawidłowej dysocjacji guza i przygotowania próbki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x Pipeta	Corning	21-040-CV
10 ml	Corning	357551
1000 μ L Końcówki do pipet o niskiej retencji	Rainin	30389213
1000 μ L Szerokie końcówki do pipet o niskiej retencji	Rainin	30389218
1000 μ L końcówki do pipet	Rainin	30389212
10x Separator magnetyczny	10x Genomics	120250
15 mL probówki stożkowe	Corning	430052
2 mL pipeta aspiracyjna	Corning	357558
20 μ L końcówki do pipet o niskiej retencji	Rainin	30389226
20 μ L końcówki do pipet	Rainin	30389225
200 μ L Końcówki do pipet o niskiej retencji	Rainin	30389240
200 μ L końcówki do pipet	Rainin	30389239
50 ml polipropylenowa rurka stożkowa	Falcon	352098
60 x 15 mm Naczynie do hodowli tkankowych	Falcon	353004
ACK Bufor do lizowania	Gibco	A10492-1
BD 1 ml	Becton, Dickinson and Company	3090659
Hemocytometr Bright-Line	Hausser Scientific	551660
Roztwór chlorku wapnia	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Szkiełka do liczenia komórek do licznika komórek TC20	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μ m sterylne filtry jednorazowe	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μ m sterylne filtry jednorazowe	Sysmex	04-004-2327
Zestaw do usuwania martwych komórek	Miltenyi Biotec	130-090-101	Przechowywać przy -20 stopniach; C; zestaw 2
kleszczy preparacyjnych, cienka końcówka	VWR	82027-386
Probówki do mikrowirówek DNA LoBind, 1,5 ml	Eppendorf	22431021
EasySepTM Zestaw do usuwania martwych komórek (Annexin V) Zestaw	STEMCELL Technologies	17899	Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C; Zestaw 1
Wirówka Eppendorf 5425R	Eppendorf	5406000640
Wirówka Eppendorf 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Elektroniczny kontroler pipet	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w kapturze biologicznym
Niemieckie nożyczki ze stali nierdzewnej	Fine Science Tools	14568-12
Mikroskop Leica Dmi1	Kolumna Leica Microsystems	454793
LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Przechowywać w 4 stopniach; C
TempAssure 0,2 ml PCR 8-tubkowe	paski USA Scientific	1402-4700
Trypan niebieska plama 0,4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Zestaw do dysocjacji nowotworów, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Przechowywać w temperaturze -20 ° C, przygotuj enzymy zgodnie z instrukcją zestawu: Rozpuść liofilizowaną fiolkę enzymu H w 3 ml RPMI 1640 Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem R w 2,7 ml RPMI 1640 Rozpuścij liofilizowaną fiolkę enzymu A w 1 ml buforu A dostarczonej z zestawem.
Zestaw do dysocjacji guza, mysz	Miltenyi Biotec	130-096-730	Przechowywać pod adresem -20 ° C, przygotuj enzymy zgodnie z instrukcją zestawu: Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem D w 3 ml RPMI 1640 Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem R w 2,7 ml RPMI 1640 Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem A w 1 ml buforu A dostarczonego z zestawem.
UltraPure Woda Destylowana	Invitrogen	10977-015	Przechowywać w 4 stopniach; Z