Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66766

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Streszczenie

Próbki ludzkich nowotworów zawierają mnóstwo informacji o swoim mikrośrodowisku i repertuarze immunologicznym. Skuteczna dysocjacja próbek tkanek ludzkich na żywe zawiesiny komórkowe jest wymaganym wkładem do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq). W przeciwieństwie do masowego sekwencjonowania RNA, scRNAseq pozwala nam wywnioskować niejednorodność transkrypcji w próbkach guza na poziomie pojedynczej komórki. Włączenie tego podejścia w ostatnich latach doprowadziło do wielu odkryć, takich jak identyfikacja stanów immunologicznych i nowotworowych oraz programów związanych z odpowiedziami klinicznymi na immunoterapie i inne rodzaje leczenia. Co więcej, technologie jednokomórkowe stosowane w tkankach zdysocjowanych mogą być wykorzystywane do identyfikacji dostępnych regionów chromatyny, repertuaru receptorów komórek T i B oraz ekspresji białek za pomocą przeciwciał kodowanych kodami kreskowymi DNA (CITEseq).

Żywotność i jakość zdysocjowanej próbki są kluczowymi zmiennymi podczas korzystania z tych technologii, ponieważ mogą one dramatycznie wpłynąć na zanieczyszczenie krzyżowe pojedynczych komórek otaczającym RNA, jakość danych i interpretację. Co więcej, długie protokoły dysocjacji mogą prowadzić do eliminacji wrażliwych populacji komórek i zwiększenia sygnatury genu odpowiedzi na stres. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy szybki uniwersalny protokół dysocjacji, który został zweryfikowany na wielu typach nowotworów ludzkich i mysich. Proces rozpoczyna się od dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej, po której następuje filtracja, liza czerwonej krwi i wzbogacanie żywych zmarłych, odpowiednie dla próbek o niskim wkładzie komórek (np. biopsje rdzenia igłowego). Protokół ten zapewnia czystą i żywotną zawiesinę jednokomórkową, która ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego generowania emulsji żelowych (GEM), kodów kreskowych i sekwencjonowania.

Wprowadzenie

Chociaż wiele postępów w badaniach nad rakiem doprowadziło do opracowania i zatwierdzenia przez FDA środków ukierunkowanych na receptory hamujące wyrażane na komórkach immunologicznych i nowotworowych, znanych jako inhibitory blokady punktów kontrolnych, oporność na terapię i identyfikacja mechanizmów, które kierują reakcją pacjenta, nadal stanowią wyzwanie1. Złożone wyzwanie polegające na scharakteryzowaniu heterogeniczności guza na podstawie jego różnorodności molekularnej i skomplikowanej interakcji między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem immunologicznym wymaga nowych podejść do analizy tego złożonego ekosystemu w rozdzielczości pojedynczej komórki. Zrozumienie zawiłości molekularnych w obrębie nowotworów i ich mikrośrodowisk ma kluczowe znaczenie dla rozwoju strategii terapeutycznych i rozszyfrowania złożonej biologii leżącej u podstaw progresji raka2. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) staje się coraz bardziej popularne, ponieważ zapewnia analizę w wysokiej rozdzielczości pojedynczych komórek w złożonych próbkach guza3,4.

Niejednorodność nowotworów, obejmująca różnorodność genetyczną, epigenetyczną i fenotypową, stanowi wyzwanie w odkrywaniu zawiłości biologii nowotworów5. Konwencjonalne metody masowego sekwencjonowania RNA mają tendencję do ukrywania unikalnych profili ekspresji i fenotypów heterogenicznych populacji komórek obecnych w nowotworach, ponieważ metody te uśredniają sygnały w całych populacjach komórek4. W przeciwieństwie do tego, scRNA-seq pozwala na rozbiór poszczególnych typów komórek, ujawniając różnorodną ekspresję genów, wzorce represji i stany komórkowe, które w przeciwnym razie zostałyby przeoczone4,6. Założeniem scRNA-seq jest jego zdolność do dekodowania sygnatur genetycznych i molekularnych poszczególnych komórek, co daje ogromną nadzieję na odkrycie nowych metod leczenia raka7.

Rozszyfrowując profile ekspresji genów komórek nowotworowych oraz otaczających je komórek zrębu i układu odpornościowego, naukowcy mogą identyfikować nowe cele terapeutyczne i opracowywać precyzyjne strategie medycyny genetycznej dostosowane do indywidualnych pacjentów6. Co więcej, analiza repertuaru immunologicznego w mikrośrodowisku guza dostarcza kluczowych informacji na temat wzajemnych oddziaływań między komórkami nowotworowymi a efektorami immunologicznymi, torując drogę do interwencji immunoterapeutycznych3. Pomimo postępów w stosowaniu scRNAseq na próbkach klinicznych, kilka wyzwań na etapach przetwarzania może zaszkodzić integralności RNA komórki, żywotności i jakości generowanych danych. Co więcej, przetwarzanie tkanki o niskiej żywotności komórek może zwiększyć poziom RNA w kropelkach powstających podczas enkapsulacji poszczególnych komórek, powodując zanieczyszczenie krzyżowe i nieprawidłową adnotację typów komórek, podczas gdy długie protokoły dysocjacji wykonywane w temperaturze 37 °C mogą prowadzić do regulacji w górę sygnatury genu odpowiedzi na stres w wielu typach komórek8, 9,10.

Procedura krokowa (Rysunek 1A) opisana w tym protokole rozpoczyna się od szybkiej mechanicznej i enzymatycznej dysocjacji guzów, po której następuje filtracja i usunięcie martwych komórek, w zależności od żywotności każdej próbki guza. Obecnie procedura ta została zweryfikowana w próbkach czerniaka11, colorectal12, rak płaskonabłonkowy głowy i szyi13, próbki guza trzustki i płuc (dane niepublikowane). Techniki te zapewniają generowanie wysokiej jakości żywotnych zawiesin komórkowych, które mają kluczowe znaczenie dla dalszych analiz14. Warto zauważyć, że usunięcie czerwonych krwinek, pozbawionych zsyntetyzowanego RNA, staje się konieczne do oczyszczenia próbki15. Późniejsza ocena liczby komórek i eliminacja martwych komórek stanowią warunek wstępny pomyślnego generowania 10-krotnej emulsji perełkowej (GEM) Genomics Gel Bead-in Emuls, kodów kreskowych i zwiększenia odzysku transkryptów i zsekwencjonowanych komórek bez narażania na ryzyko wykluczenia wrażliwych populacji (np. neutrofili i komórek nabłonkowych)16. Kroki te mają zasadnicze znaczenie dla uwolnienia potencjału analizy rozdzielczości pojedynczej komórki w próbkach nowotworowych9,10, odkrywając nowe profile ekspresji genów i sygnatury immunologiczne niezbędne do prowadzenia innowacyjnych interwencji terapeutycznych oraz identyfikując nowe podatności guza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie było zgodne ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi pobierania próbek tkanek ludzkich. Uzyskano świadomą zgodę od pacjentów, a możliwe do zidentyfikowania dane próbki zostały zanonimizowane. Próbki są pobierane na sali operacyjnej, umieszczane w roztworze RPMI, soli fizjologicznej lub PBS i potwierdzane jako rakowe przez oddział patologii przed użyciem w badaniach. Wszystkie czynności, z wyjątkiem przypadków, gdy są one wskazane, powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Pracuj wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego podczas przetwarzania tkanek ludzkich. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie próbki

  1. Uzyskaj stałą próbkę guza w probówce z pożywką i umieść ją na lodzie.
    1. Poinstruuj personel sali operacyjnej, aby przetransportował próbkę w probówce zawierającej wystarczającą ilość RPMI, soli fizjologicznej lub PBS, aby całkowicie zanurzyć tkankę, aby uniknąć odwodnienia próbki.
      UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że próbka nie jest wysuszona, ponieważ zmniejszy to żywotność.
  2. Schłodzić wszystkie wirówki do temperatury 4 °C i doprowadzić mieszalnik termiczny do temperatury 37 °C.
  3. Wyjąć przygotowane enzymy dysocjacji guza ludzkiego lub mysiego (tabela materiałów), rozmrozić w mieszalniku termicznym o temperaturze 37 °C i przenieść do lodu po rozmrożeniu.
  4. Pobrać 20 ml porcji RPMI.
  5. Zapisz odpowiednie informacje o próbce (np. identyfikator pacjenta, de-identyfikator, rodzaj próbki).
  6. Przenieść próbkę do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm (umieszczonego na lodzie), kilkakrotnie odwracając probówkę i wlewając zawartość do naczynia, aby upewnić się, że cały materiał próbki został przeniesiony. Jeśli próbka nie została dostarczona w pożywce po przybyciu, dodaj do naczynia świeżą pożywkę RPMI.
    1. Jeżeli próbka jest rozdrobniona, obracać probówkę zawierającą próbkę w temperaturze 450 × g, 4 °C przez 5 minut, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić próbkę w 420 μl RPMI i przejść do sekcji 2.

2. Trawienie mechaniczne i enzymatyczne

  1. Odpipetować 420 μl pożywki z naczynia na próbkę o średnicy 60 mm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Spróbuj dołączyć wszelkie fragmenty próbki zawieszone w podłożu.
  2. Przenieść tkankę próbki z szalki o średnicy 60 mm do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę za pomocą pęsety. Pokrój próbkę czystymi nożyczkami wewnątrz probówki tak, aby kawałki miały maksymalną średnicę 2-3 mm.
  3. Dodać do próbki enzymy wytrawiające przygotowane zgodnie ze specyfikacją producenta (tabela materiałów) w następujących objętościach: 42 μl enzymu H (proteazy niespecyficzne) dla próbek ludzkich, enzymu D (proteazy niespecyficzne) dla próbek mysich, 21 μl enzymu R (proteazy niespecyficzne) i 5 μl enzymu A (nukleazy).
  4. Dodaj kolejne 420 μl pożywki z naczynia lub do oznaczenia 1 ml na probówce. Nie przekraczać 420 μl podłoża.
  5. Obracaj rurkę przez 5 sekund i umieść ją w mieszalniku termicznym ustawionym pionowo na boku (Rysunek 1B). Inkubować w temperaturze 37 °C, 450 obr./min, przez 15 min.
    UWAGA: Podczas inkubacji wyjmij wszystkie 10x materiały genomiczne potrzebne do wytworzenia GEM, ponieważ wymagają one 30 minut, aby zrównoważyć się do temperatury pokojowej

3. Filtrowanie próbek

  1. Umieść filtr komórkowy 50 μm na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i zalej filtr, przepuszczając przez niego 1 ml świeżego podłoża RPMI do probówki.
  2. Po roztrawieniu przenieść próbkę do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szerokiej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i niskiej retencji. Umyj probówkę o pojemności 1,5 ml 1 ml świeżym podłożem i przenieś pożywkę do filtra, aby upewnić się, że cały materiał próbki przeszedł przez filtr.
  3. Zaopatrzyć się w plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml i wyjąć tylko tłok (wyrzucić pozostałą część strzykawki). Używając tylnej części tłoka strzykawki, zmielić i docisnąć próbkę do filtra ruchem obrotowym.
  4. Umyć filtr 5 ml pożywki i wszelkie pozostałe media z naczynia, w którym znajdowała się próbka (sekcja 1), w celu zebrania wszelkich komórek, które mogły oderwać się od tkanki.
  5. Umieść filtr komórkowy 30 μm na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, zalej filtr 1 ml pożywki i przenieś zawartość probówki zawierającej zdysocjowaną próbkę przez filtr.
    UWAGA: Ten krok usunie duże zanieczyszczenia, które mogą się zatkać lub spowodować awarię zwilżania podczas uruchamiania próbki przy użyciu 10x chipów mikroprzepływowych Genomics.

4. Liza czerwonych krwinek

  1. Odwirować próbkę w temperaturze 450 × g, 4 °C przez 5 minut. Zassać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  2. Ponownie zawiesić w buforze ACK Lysis w celu usunięcia czerwonych krwinek (RBC) i zapisać zużytą objętość. Objętość będzie zależeć od wielkości osadu i stopnia obecności erytrocytów w granulce.
    UWAGA: Ponownie zawieszony roztwór próbki ACK powinien być bezbarwny po dodaniu wystarczającej ilości buforu ACK Lysis, ponieważ spowoduje to usunięcie czerwonych krwinek z próbki.
  3. Odwirować probówkę z próbką o masie 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant.
  4. W razie potrzeby powtarzaj kroki 4.2-4.3, aż osad próbki nie będzie miał widocznego czerwonego koloru po odwirowaniu (Rysunek 2). Zapisz wszelkie dodatkowe woluminy buforu ACK Lysis użyte w tym kroku.
  5. Zawiesić osad próbki w świeżym pożywce w celu przygotowania do liczenia.

5. Zliczanie komórek

  1. Umieść 10 μl błękitu trypanowego w probówce o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszać zdysocjowane komórki, pobrać 10 μl próbki i wymieszać (1:1) z błękitem trypanowym. Załaduj po 10 μl z każdej strony hemocytometru i policz komórki.
  2. Rejestruj stężenie komórek, całkowitą liczbę żywych komórek, procent żywotności i końcową objętość nośnika po zliczeniu.
  3. Upewnij się, że liczba komórek wynosi od 700 do 1,200 komórek/μl (7 × 10 5-1,2 × 106/ml), aby uzyskać optymalny 10-krotny przebieg genomiki.
    1. Jeśli próbka jest zbyt zagęszczona, rozcieńczyć ją pożywką i ponownie przeliczyć.
    2. Jeżeli próbka jest zbyt rozcieńczona, należy ją odwirować w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić w mniejszej objętości pożywki.
    3. Jeśli żywotność komórek jest niższa niż 80%, wykonaj procedurę żywego martwego ciała, aby usunąć martwe komórki.
    4. Jeśli jest mniej niż milion komórek, patrz punkt 6.
    5. Jeśli liczba komórek przekracza milion, a żywotność wynosi > 10%, patrz punkt 6.
    6. Jeśli liczba komórek przekracza milion, a żywotność < 10%, patrz punkt 7.
    7. Jeśli żywotność komórek przekracza 80%, utrzymuj przetworzone komórki na lodzie i natychmiast przystąp do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Usuwanie martwych komórek - Zestaw 1

UWAGA: Pracuj wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego podczas używania odczynników do usuwania martwych komórek, ponieważ mogą one łatwo ulec skażeniu.

  1. Odwirować próbkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  2. Przygotuj pożywkę izolacyjną w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej: 9,8 ml PBS, 10 μl CaCl2 i 200 μl inaktywowanego termicznie FCS (dodanego w kapturze bezpieczeństwa biologicznego).
  3. Po odwirowaniu odessać pożywkę z osadu i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki izolacyjnej.
  4. Ponownie odwirować probówkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl pożywki izolacyjnej.
  5. Przenieść 100 μl próbki w pożywce izolacyjnej do jednego dołka w probówce paskowej o pojemności 0,2 ml do PCR.
  6. W okapie bezpieczeństwa biologicznego dodać 10 μl koktajlu Annexin V i 10 μL koktajlu selekcyjnego biotyny do studzienki zawierającej 100 μl próbki w pożywce izolacyjnej. Odpipetować roztwór i odstawić go na 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Po 4 minutach należy wirować cząstki magnetyczne pokryte dektranem przez 30 s. Do próbki dodać 20 μl kulek i 60 μl pożywki izolacyjnej (całkowita objętość 200 μl). Jeśli żywotność jest niższa niż 40%, należy zwiększyć ilość kulek do 40 μl, dostosowując objętość pożywki izolacyjnej (do 40 μl), zachowując całkowitą objętość 200 μl. Odpipetować mieszać i pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej na 3 minuty.
  8. Umieść probówkę z paskiem na 10-krotnym separatorze magnetycznym Genomics (na wysokim ustawieniu) na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Przenieś płyn z probówki z paskiem, nie naruszając kulek, do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z lo-bindem. Nie wyjmuj rurki paskowej z magnesu.
  10. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą próbkę w temperaturze 450 × g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki RPMI w zależności od wielkości osadu i liczby komórek, jak opisano w sekcji 5. Powtórz procedurę usuwania martwych komórek, jeśli żywotność pozostaje poniżej 80% (Rysunek 3 i Rysunek 4).
    UWAGA: Nie należy ponownie zawieszać komórek w pożywce izolacyjnej w celu dalszego wytwarzania GEM, ponieważ chlorek wapnia będzie zakłócał proces enkapsulacji i etap odwrotnej transkrypcji (RT).
  11. Utrzymuj przetworzone komórki na lodzie, jeśli żywotność komórek przekracza 80% i natychmiast przystąp do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Usuwanie martwych komórek - Zestaw 2

UWAGA: Pracuj w kapturze bezpieczeństwa biologicznego podczas korzystania z zestawu odczynników.

  1. Umieść mikrogranulki i 20-krotny roztwór podstawowy buforu wiążącego w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Odwirować zawiesinę próbki w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  3. Przygotować 1x roztwór buforowy w sterylnych warunkach, używając 1 ml 20x roztworu podstawowego buforu wiążącego pipetowanego do 19 ml wody destylowanej wolnej od DNAzy i RNAzy.
  4. Po zakończeniu wirowania odessać supernatant, dodać mikrogranulki, delikatnie wymieszać próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    1. Gdy liczba komórek wynosi 107 lub mniej, dodaj 100 μl mikrogranulek.
    2. W przypadku liczby większej niż 107 wszystkich komórek, dostosuj mikrogranulki do końcowego stężenia 100 μl na 107 żywych komórek.
  5. Podczas inkubacji należy uzyskać jedną kolumnę pozytywnej selekcji MACS, wielostanowiskowe MACS i odpowiedni separator magnetyczny. Upewnij się, że separator jest wypoziomowany na stojaku wielofunkcyjnym i żaden inny metalowy lub magnetyczny przedmiot nie znajduje się w pobliżu stojaka, ponieważ siła magnetyczna jest silna i może wpływać na skuteczność usuwania martwych komórek. Umieść kolumnę ciasno w uchwycie separatora ze skrzydłami skierowanymi na zewnątrz.
  6. Po inkubacji próbki, jeśli całkowita objętość zawiesiny jest mniejsza niż 500 μl, dodać 1x bufor wiążący, aż całkowita objętość wyniesie 500 μl.
  7. Umieść stożkową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną i zalej kolumnę 3 ml 1x buforu wiążącego.
  8. Zastąp rurkę stożkową nową stożkową o pojemności 15 ml do pobierania próbki z komórek i dodaj próbkę do kolumny, pozwalając jej całkowicie przepłynąć przez kolumnę.
  9. Przemyć kolumnę 4 x 3 ml 1x buforu wiążącego, dodając tylko jedno płukanie na raz po tym, jak poprzednie płukanie całkowicie przepłynęło przez kolumnę.
  10. Po czwartym przepłukaniu odwirować stożkową probówkę zawierającą wyizolowane komórki przez 5 minut w temperaturze 450 × g, 4 °C. Odrzucić kolumnę i pozostałą ilość 1x bufor wiążący.
  11. Ponownie zawiesić roztwór próbki w odpowiedniej ilości pożywki RPMI w zależności od wielkości osadu i policzyć izolowane komórki metodą opisaną w sekcji 5 (Rysunek 3 i Rysunek 5).
    1. Jeśli żywotność utrzymuje się poniżej 80%, a całkowita liczba komórek wynosi 106 lub mniej, powtórz sekcję 6.
    2. Jeśli żywotność komórek przekracza 80%, przechowuj przetworzone komórki na lodzie i natychmiast przystąp do generowania GEM zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Uzyskano biopsję czerniaka zawieszoną w medium RPMI, którą niezwłocznie umieszczono w lodzie. Próbkę przeniesiono do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL zawierającej 420 µL medium RPMI oraz enzymy trawienne, posiekano na małe kawałki za pomocą nożyczek, a następnie poddano trawieniu enzymatycznemu przez 15 min w mieszalniku termicznym ustawionym pionowo w temperaturze 37 ˚C (Rysunek 1). Po trawieniu próbkę przefiltrowano przez sterylny jednorazowy filtr o oczkach 50 µm, a następnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje dysocjację ludzkich lub mysich próbek nowotworów w zawiesinę pojedynczej komórki w celu sekwencjonowania scRNA przy użyciu systemu mikroprzepływowego 10x Genomics. Podczas przetwarzania tkanek, które często pochodzą z rzadkich nowotworów lub są częścią trwających badań klinicznych lub długich eksperymentów dotyczących guzów myszy, próbka musi być optymalnie i starannie zachowana między wszystkimi etapami. Wszystkie kroki powinny być przeprowadzane szybko na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zachowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

M.S-F. otrzymał dofinansowanie od Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology i był konsultantem Galvazine Therapeutics.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Adelson Medical Research Foundation (AMRF), Melanoma Research Alliance (MRA) i U54CA224068. Rysunki 1, Rysunki 4 i Rysunki 5 zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PipetaCorning21-040-CV
10 mlCorning357551
1000 μ L Końcówki do pipet o niskiej retencjiRainin30389213
1000 μ L Szerokie końcówki do pipet o niskiej retencjiRainin30389218
1000 μ L końcówki do pipetRainin30389212
10x Separator magnetyczny10x Genomics120250
15 mL probówki stożkoweCorning430052
2 mL pipeta aspiracyjnaCorning357558
20 μ L końcówki do pipet o niskiej retencjiRainin30389226
20 μ L końcówki do pipetRainin30389225
200 μ L Końcówki do pipet o niskiej retencjiRainin30389240
200 μ L końcówki do pipetRainin30389239
50 ml polipropylenowa rurka stożkowaFalcon352098
60 x 15 mm Naczynie do hodowli tkankowychFalcon353004
ACK Bufor do lizowaniaGibcoA10492-1
BD 1 mlBecton, Dickinson and Company3090659
Hemocytometr Bright-LineHausser Scientific551660
Roztwór chlorku wapniaSigma Aldrich2115-100ML
Cell Ranger 10x GenomicsN/Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Szkiełka do liczenia komórek do licznika komórek TC20Bio-Rad1450015
CellTrics 30μ m sterylne filtry jednorazoweSysmex04-004-2326
CellTrics 50μ m sterylne filtry jednorazoweSysmex04-004-2327
Zestaw do usuwania martwych komórek Miltenyi Biotec130-090-101Przechowywać przy -20 stopniach; C; zestaw 2
kleszczy preparacyjnych, cienka końcówkaVWR82027-386
Probówki do mikrowirówek DNA LoBind, 1,5 mlEppendorf22431021
EasySepTM Zestaw do usuwania martwych komórek
(Annexin V) Zestaw		STEMCELL Technologies17899Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C; Zestaw 1
Wirówka Eppendorf 5425REppendorf5406000640
Wirówka Eppendorf 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3 Elektroniczny kontroler pipetEppendorfEP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384EppendorfEP5384000012
FBSGibco26140-079Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w kapturze biologicznym
Niemieckie nożyczki ze stali nierdzewnejFine Science Tools14568-12
Mikroskop Leica Dmi1Kolumna Leica Microsystems454793
LSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+Rainin17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+Rainin17014391
Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+Rainin17014392
Quadro MACS MagnetMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco21870-076Przechowywać w 4 stopniach; C
TempAssure 0,2 ml PCR 8-tubkowepaski USA Scientific1402-4700
Trypan niebieska plama 0,4%Thermo Fisher ScientificT10282
Zestaw do dysocjacji nowotworów, HumanMiltenyi Biotec130-095-929Przechowywać w temperaturze -20 ° C, przygotuj enzymy zgodnie z instrukcją zestawu:
Rozpuść liofilizowaną fiolkę enzymu H w 3 ml RPMI 1640
Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem R w 2,7 ml RPMI 1640
Rozpuścij liofilizowaną fiolkę enzymu A w 1 ml buforu A dostarczonej z zestawem.
Zestaw do dysocjacji guza, myszMiltenyi Biotec130-096-730Przechowywać pod adresem -20 ° C, przygotuj enzymy zgodnie z instrukcją zestawu:
Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem D w 3 ml RPMI 1640
Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem R w 2,7 ml RPMI 1640
Rozpuść liofilizowaną fiolkę z enzymem A w 1 ml buforu A dostarczonego z zestawem.
UltraPure Woda DestylowanaInvitrogen10977-015Przechowywać w 4 stopniach; Z
serologiczna PBS

Bibliografia

  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dysocjacja tkanki nowotworowejprzygotowanie zawiesiny komórkowejludzkie próbki nowotworowemysie próbki nowotworowedysocjacja mechanicznadysocjacja enzymatycznahemoliza krwinek czerwonychwzbogacanie frakcji żywych i martwych komórekliczenie komórek za pomocą hemocytometru
Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.