Ukosowanie na mokro igieł do mikroiniekcji z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza w celu uzyskania informacji zwrotnej o otwarciu igły

Podsumowanie

Ten protokół opisuje montaż systemu pneumatycznego do dostarczania sprężonego powietrza do igły podczas procesu ukosowania igły. Protokół dalej opisuje proces ukosowania w celu tworzenia ostrych igieł do mikroiniekcji oraz sposób oceny względnego rozmiaru otworu igły.

Streszczenie

Igły do mikroiniekcji są kluczowym narzędziem w dostarczaniu odczynników modyfikujących genom, komponentów CRISPR (przewodnikowe RNA, białko Cas9 i matryca dawcy) oraz składników systemu transpozonów (plazmidy i transpozazy mRNA) do rozwijających się zarodków owadów. Ostre igły do mikroiniekcji są szczególnie ważne podczas dostarczania tych środków modyfikujących, ponieważ pomagają zminimalizować uszkodzenia wstrzykiwanego zarodka, zwiększając w ten sposób przeżywalność tych zarodków w porównaniu z wstrzykiwaniem igłami bez skosu. Co więcej, ukosowanie igieł wytwarza igły, które są bardziej spójne od igły do igły w porównaniu z igłami otwieranymi przez losowe złamanie końcówki igły poprzez ocieranie końcówki o przedmiot (bok szkiełka nakrywkowego, powierzchnia zarodka, który ma zostać wstrzyknięty itp.). Proces ukosowania na mokro igieł do mikroiniekcji powietrzem dostarczanym do igły pod stałym ciśnieniem pozwala osobie fazującej igłę wiedzieć, kiedy igła jest otwarta (obecność pęcherzyków), a także daje względne wskazanie, jak duży otwór igły został utworzony. Względny rozmiar otworu w igle można określić, regulując ciśnienie powietrza dostarczanego do igły, aż do osiągnięcia równowagi i przestania wypływać pęcherzyki z końcówki igły. Im niższe ciśnienie, przy którym osiągana jest równowaga, tym większy rozmiar igły; I odwrotnie, im wyższe ciśnienie, tym mniejszy rozmiar igły.

Wprowadzenie

Modyfikacja genetyczna owadów to proces pierwotnie opracowany u Drosophila przez Rubina i Spradlinga, a z biegiem lat proces ten był modyfikowany w celu stworzenia modyfikacji genetycznych u innych gatunków¹. Proces ten opiera się na precyzyjnym dostarczaniu składników modyfikujących mikrowstrzykiwanych do zarodków w określonym czasie i miejscu w rozwijającym się zarodku^2,3,4. Ostre igły do mikroiniekcji są kluczowym narzędziem w procesie modyfikacji genetycznej niektórych owadów, takich jak komary^4,5,6,7,8,9 i 10 chociaż nie tak ważne dla innych owadów, takich jak jedwabniki¹¹. Ostre igły są często kluczowym czynnikiem decydującym o sukcesie lub porażce podczas próby stworzenia genetycznie zmodyfikowanego owada^2,4. Zazwyczaj igły ze szkła mikrokapilarnego są ciągnięte przez szkło grzewcze do punktu, w którym szkło staje się elastyczne, co pozwala na wciągnięcie kapilary do zwężającej się igły z zamkniętą końcówką. Przed użyciem igły należy ją otworzyć w taki sposób, aby powstała ostra końcówka do wstrzykiwań. Tradycyjnie, igły są otwierane poprzez delikatne otarcie końcówki igły o coś (krawędź szkiełka nakrywkowego/szkiełka nakrywkowego, zarodek itp.), co powoduje oderwanie się niewielkiej ilości szkła od końcówki, losowo tworząc ostrą końcówkę^2,3. Nieco mniej przypadkowym procesem jest ukosowanie na sucho, gdzie igła jest szybko opuszczana na optycznie płaską, wirującą płytę ścierną na krótki okres czasu, powodując ścieranie niewielkiej ilości szkła z końcówki igły, tworząc ostrą końcówkę. Ukosowanie na sucho jest nieco mniej przypadkowe niż ocieranie się o coś końcówką igły. Opisany poniżej protokół idzie o krok dalej w procesie ukosowania, dostarczając sprężone powietrze do fazowanej igły i ukosując ją pod warstwą cieczy, tak aby pęcherzyki były widoczne zaraz po otwarciu igły. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę produkcji niezawodnie ostrych igieł do mikroiniekcji. Ukosowanie pod warstwą cieczy jest ulepszeniem w stosunku do losowego łamania igły, jak opisano powyżej, i ukosowania na sucho, ponieważ użytkownik otrzymuje informację zwrotną na temat procesu ukosowania, dzięki czemu osoba ukosująca wie, kiedy igła jest otwarta i względnie, jak duży jest otwór igły. Znajomość względnego rozmiaru otworu końcówki igły może pozwolić osobie fazującej na tworzenie igieł o różnych rozmiarach otworów. Różne rozmiary otworów igieł mają różne zalety; Na przykład większe rozmiary otworów igieł mogą pomieścić mieszanki iniekcyjne o wysokiej lepkości, podczas gdy mniejsze igły otwierające powodują mniejsze uszkodzenia wstrzykiwanego zarodka.

Powietrze jest dostarczane do igły za pomocą regulatora i systemu rurek uretanowych opartych na zmodyfikowanym systemie wtrysku o regulowanym ciśnieniu powietrza². Podczas gdy powietrze jest dostarczane do igły pod stałym ciśnieniem, igła jest fazowana pod warstwą płynu. Proces ukosowania składa się z powtarzającego się pięcioetapowego procesu: 1) opuszczenie igły na powierzchnię ścierną, 2) pozostawienie igły na ukosowanie przez krótki czas, 3) podniesienie igły z dala od płyty ściernej, utrzymując ją pod powierzchnią warstwy cieczy, 4) zatrzymanie wirowania płyty ściernej w celu sprawdzenia, czy nie pojawiają się pęcherzyki. Jeśli nie ma żadnych bąbelków, kroki od 1 do 4 są powtarzane, aż pojawią się bąbelki; 5) Gdy pojawią się pęcherzyki, ciśnienie powietrza można regulować, aby określić względny rozmiar otworu igły. Im niższe ciśnienie potrzebne do zatrzymania tworzenia się pęcherzyków, tym większy otwór na końcu igły.

Protokół

UWAGA: Protokół opisany poniżej wykorzystuje mikrokapilarny skos Sutter BV-10. Protokół ten można jednak zmodyfikować do użytku z dowolnym modelem mikrokapilarnym fazowanym.

1. Zespół regulatora, manometru i przewodu doprowadzającego powietrze

1. Wyciąć odcinek rurki uretanowej do połączenia od dopływu powietrza do podstawy regulatora (R; Sekcja 1, Rysunek 1). Długość tego odcinka będzie zależała od odległości od dopływu powietrza do regulatora, który będzie znajdował się obok ukosownika.
2. Wsuń wąż clamp na rurkę uretanową, a następnie wepchnij złącze węża do końca rurki. Upewnij się, że złącze węża jest całkowicie włożone, umieszczając złącze węża na twardej powierzchni. Trzymając rurkę blisko złącza węża, mocno wciśnij rurkę w wąż, aż złącze węża zostanie całkowicie włożone. Zacisk węża i złącze węża tworzą razem połączenie HC (Rysunek 1).
3. Przesuń wąż clamp do końca rurki, do którego włożone jest złącze węża. Obróć wąż clamp nad włożonym końcem zadzioru, aby utworzył hermetyczne połączenie.
4. Ręcznie wkręć złącze węża w podstawę regulatora (R), a następnie dokończ dokręcanie połączenia małym kluczem. Upewnij się, że połączenie jest szczelne, ale nie zbyt szczelne.
5. W bocznym porcie regulatora wkręć ręcznie złącze T (T), a następnie użyj małego klucza, aby zakończyć dokręcanie.
6. Wytnij mały kawałek rurki uretanowej (Rysunek 1, sekcja 2), o długości około 3-5 cm. Umieść dwa węże clamps na kawałku rurki, a następnie włóż złącze węża do każdego końca rurki i zakończ połączenia (HC) zgodnie z opisem w krokach 1.2-1.4 dla każdego końca rurki.
7. Wkręć jeden koniec krótkiej rurki w podstawę manometru, a następnie zakończ dokręcanie kluczem, jak w kroku 1.5.
8. Wkręć drugi koniec krótkiej rurki do jednego z portów na złączu T (T) podłączonym do regulatora w kroku 1.5.
9. Wytnij odcinek rurki uretanowej (Rysunek 1, sekcja 3) do połączenia między regulatorem a uchwytem igły (NH). Rozmiar tej sekcji będzie zależał od odległości od ukosowania do lokalizacji regulatora.
10. Umieść wąż clamp na odcinku rurki, a następnie włóż złącze węża zgodnie z opisem w krokach 1.2-1.4.
11. Po drugiej stronie tej sekcji rurki umieść żeńskie złącze luer (LC), które jest dostarczane z uchwytem igły (NH).
12. Zdejmij zacisk mocujący i nylonową podkładkę (Rysunek 2, f) z manipulatora. Zacisk mocujący i podkładka są przeznaczone wyłącznie do utrzymywania szklanej mikrokapilary, nie są przeznaczone do utrzymywania dodatkowego ciężaru uchwytu mikrokapilarnego, pręta gwintowanego i rurki doprowadzającej powietrze.
13. Wytnij prostokątny kawałek gumowego arkusza uszczelniającego o wymiarach 1,5 cm x 2 cm, aby owinąć gwintowany pręt w zacisku błotnika roweru. Pomoże to pewniej utrzymać pręt gwintowany i uchwyt igły w zacisku błotnika roweru. Za pomocą dwóch szczypiec półokrągłych otwórz zacisk błotnika roweru, złóż prostokątny kawałek gumowego arkusza uszczelniającego na pręt gwintowany 3.5 cm od jednego końca pręta, tak aby utworzył literę U nad prętem. Włóż pręt gwintowany pokryty gumową blachą do otwartego błotnika roweru clamp i za pomocą szczypiec zamknij zacisk wokół pręta i arkusza gumy. Zamontuj zacisk rowerowy i zespół pręta gwintowanego na manipulatora, wymień zacisk mocujący bez podkładki nylonowej i dokręć zacisk mocujący, aż bezpiecznie przytrzyma zespół pręta gwintowanego.
14. Nakręcić uchwyt igły na pręt gwintowany. Upewnij się, że złącze luer kończy się w pozycji, która nie zwiąże rurki uretanowej po jej podłączeniu (Rysunek 2, g).
15. Podłącz żeńskie złącze luer do męskiego złącza luer (Rysunek 2, g) uchwytu igły (Rysunek 2, d).
16. Podłącz wolny koniec rurki Rysunek 1, sekcja 1 do źródła powietrza (to połączenie będzie się różnić w zależności od użytego źródła powietrza). Dopływ powietrza powinien być czystym, suchym i wolnym od pozostałości oleju. Dopływ powietrza może pochodzić z domowego źródła powietrza lub butli gazowej, sprężonego powietrza lub azotu.

2. Igły borokrzemianowe do fazowania

1. Wyciągnij igły do mikroiniekcji za pomocą mikrokapilar ze szkła borokrzemianowego z następującymi ustawieniami urządzenia: Heat: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, z czasem pętli 12,24.
2. Montaż zespołu szlifierskiego zgodnie z instrukcjami producenta, składającego się z płyty ściernej i pierścienia ustalającego z magnesami¹².
   UWAGA: Płyta ścierna może wymagać owinięcia cienkim paskiem przezroczystej folii, aby zapobiec przedwczesnemu wyciekowi Photo-Flo (środka zwilżającego) z płyty ściernej. Jest to konieczne tylko wtedy, gdy roztwór środka zwilżającego przedwcześnie wycieknie do oleju na cokole, powodując zatrzymanie obracania się płyty szlifierskiej. Środek zwilżający zmniejsza ryzyko wysuszenia śladów na szklanych igłach po ukosowaniu. Użycie środka zwilżającego nie jest krytyczne dla procesu ukosowania, a woda może zostać zastąpiona.
3. Umieść 10 kropli oleju w cokole na optycznie płaskiej powierzchni cokołu i umieść na nim zestaw szlifierski. Rozpocznij montaż szlifierski.
4. Włącz źródło światła, aby oświetlić powierzchnię. Upewnij się, że źródło światła jest umieszczone za fazowanym i świeci pod kątem 45° do płytki ściernej i igły. Kąt oświetlenia jest niezbędny, aby cień igły był dobrze widoczny. Przy 90-krotnym powiększeniu obróć głowicę mikroskopu w miejscu. Na chwilę zatrzymaj obracanie się płyty ściernej i ustaw ostroskop na powierzchni płyty ściernej.
5. Dodaj 1% środka zwilżającego do, aż będzie całkowicie mokry. Dodaj 1% środka zwilżającego na powierzchnię płyty ściernej. Upewnij się, że środek zwilżający pokrywa powierzchnię ścierną, ale nie przecieka na pierścień ustalający.
6. Umieść wstępnie zwilżony na powierzchni płyty ściernej podczas jej wirowania. Upewnij się, że znajduje się po lewej stronie płyty ściernej (patrząc w dół od góry) i rozciąga się od godziny 11 do godziny 6 (z płytką jako tarczą zegara). Upewnij się, że nie porusza się po czarnej części pierścienia ustalającego.
7. Włóż igłę do uchwytu igły (Rysunek 2, d) i dokręć pierścień ustalający, aby utrzymać igłę na miejscu. Otwórz regulator (Rysunek 1, R) i zwiększ ciśnienie do 24 psi.
8. Podnieś uchwyt igły, obracając pokrętło regulacji kursu (Rysunek 2, a) Upewnij się, że igła jest podniesiona na tyle wysoko, aby znajdowała się wyżej niż powierzchnia obracającej się płyty ściernej, a następnie obróć cały manipulator tak, aby igła wychyliła się na miejsce nad obracającą się płytą ścierną. Igłę, która ma być skośna, powinna być umieszczona na obracającej się płycie ściernej zorientowanej w taki sposób, aby obrót płytki odsunął się od końcówki igły (Rysunek 3A)
9. Obserwując z boku, użyj pokrętła regulacji zgrubnej (Rysunek 2, a), aby opuścić igłę w kierunku powierzchni płyty ściernej. Zatrzymaj się, gdy igła prawie dotyka powierzchni płynu.
10. Użyj zoomu, aby zmniejszyć powiększenie mikroskopu, a następnie przesuń mikroskop tak, aby igła znalazła się w środku pola widzenia. Gdy znajdziesz się w centrum view, zwiększ powiększenie, dostosowując pozycję manipulatora tak, aby końcówka igły pozostała w środku view. Po osiągnięciu maksymalnego powiększenia zatrzymaj płytę szlifierską i ustaw mikroskop na powierzchni płyty ściernej, a następnie natychmiast wznowij obracanie płytki, gdy powierzchnia jest ostrą. W tym momencie igła może nie być widoczna.
11. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej manipulatora opuść igłę w kierunku płyty ściernej. W polu widzenia widoczny będzie obraz igły i cień (cienie) igły. Gdy igła i cień (cienie) igły są bliskie zetknięcia, przełącz się na pokrętło precyzyjnej regulacji manipulatora i kontynuuj opuszczanie igły, aż igła i jej cień (cienie) wydają się stykać. W tym momencie odczytaj suwmiarkę (Rysunek 2, c) i zanotuj odczyt. Powierzchnia tarczy ściernej znajduje się na poziomie lub poniżej tego odczytu suwmiarki.
    UWAGA: Trudno jest zobaczyć, kiedy igła dotyka powierzchni obracającej się płyty ściernej, więc igła może w tym momencie nie dotykać płyty ściernej.
12. Pozwól, aby igła pozostała na tym poziomie odczytu suwmiarki przez 5-10 sekund.
13. Za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji manipulatora podnieś igłę, upewniając się, że pozostaje pod powierzchnią środka zwilżającego. Zatrzymaj obrót płyty ściernej na kilka sekund i obserwuj, czy z końcówki igły wydostają się pęcherzyki. Jeśli obecne są bąbelki, przejdź do kroku 2.15. Jeśli bąbelki nie są obecne, przejdź do kroku 2.14.
14. Przesuń wskazówkę z powrotem do odczytu suwmiarki za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji manipulatora, a następnie przesuń ją nieco niżej i wykonaj nowy odczyt suwmiarki, a następnie powtórz kroki 2.12-2.13.
15. Uruchom ponownie płytę ścierną, aby sprawdzić, czy można zaobserwować tworzenie się pęcherzyków podczas obracania się płyty. Jeśli podczas obracania płytki widoczne są oznaki tworzenia się pęcherzyków, otwór końcówki igły jest prawdopodobnie zbyt duży dla wrażliwych mikroiniekcji zarodków, takich jak zastrzyki z zarodków komarów. Jeśli tworzenie się pęcherzyków nie jest widoczne podczas obracania się płyty ściernej, wówczas otwór igły jest idealny do stosowania w zabiegach wymagających ostrej i małej igły otwierającej.
16. Użyj pokrętła regulacji kursu manipulatora, aby podnieść igłę nad płytą ścierną do pozycji, która jest wystarczająco wysoko nad płytą, aby igła nie uderzyła w nic, ponieważ cały manipulator jest obracany, aby odsunąć igłę od płytki ściernej i mikroskopu.
17. Gdy igła znajdzie się w pozycji, w której można ją wyjąć bez uderzania w cokolwiek, obniż ciśnienie powietrza do zera, wyjmij igłę i umieść ją w pudełku do przechowywania igieł (szalka Petriego z podwójną taśmą samoprzylepną lub plasteliną do przytrzymywania skośnych igieł) do czasu użycia.

3. Określanie względnego rozmiaru otworu igły ze skosem

UWAGA: Określanie względnych rozmiarów otworów igły fazowanej odbywa się w kroku 2.13. Poniższe kroki opisują ten proces dokładniej.

1. Po zaobserwowaniu pęcherzyków w kroku 2.13, gdy płyta ścierna się nie obraca, powoli zmniejszaj ciśnienie powietrza, obracając pokrętło regulacji regulatora (Rysunek 1, R), aż pęcherzyki przestaną wypływać z końcówki igły. Zwróć uwagę na ciśnienie, przy którym bąbelki przestają wypływać z końcówki.
2. Zwiększać ciśnienie powietrza, aż pęcherzyki znów zaczną wypływać z końcówki igły. Im wyższe ciśnienie, tym mniejszy otwór igły.
3. Kontynuuj przesuwanie igły do pozycji, w której można ją bezpiecznie wyjąć, kroki 2.16-2.17.

Wyniki

Opisana powyżej procedura pozwala na uzyskanie powtarzalnie ostrych igieł do mikroiniekcji. Ostre igły charakteryzują się zdolnością do wnikania w miękki chorion embrionów owadów, takich jak embriony komarów, przy minimalnym lub żadnym oporze ze strony błony embrionalnej. Podczas mikroiniekcji embrionów komarów w celu modyfikacji genetycznej, błona embrionalna jest stosunkowo elastyczna. Naciskanie tępą igłą na błonę embrionalną spowoduje jej wgłębienie (Rycina 4B). Po wycofaniu igły błona o...

Dyskusja

Modyfikacja genetyczna komarów polega na precyzyjnym mikrowstrzykiwaniu materiałów modyfikujących (plazmidów, przewodników RNA lub białek) do zarodków przed blastodermą 3,4,5,6,7,8. Kluczowe znaczenie w tym procesie mają ostre igły, które z łatwością przebijają zarodek podczas iniekcji ^2,4

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrokapilary o średnicy zewnętrznej 1,0 mm	World Precision Instruments Olej
do cokołów Beveler	Sutter Instruments	008
Klips na błotnik rowerowy	VeloOrange	R-clip 4-pak	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Mikroskop ze stojakiem na wysięgnik	AmScope		AMScope 3,5X-90X Trójokularowy statyw LED Mikroskop stereoskopowy lub odpowiednik
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamentowa płyta ścierna	Sutter Instruments	104F	Diamentowa płyta ścierna - bardzo drobna (rozmiary końcówek 0,2 i mikro; do 1,0 & mikro)
Uszczelka, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Służy do uszczelniania połączeń na złączach T lub L, jeśli nie są już dołączone do tych elementów
Zacisk węża	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Złącze węża	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 złączy do węży
Uchwyt na igłę do mikroiniekcji	World Precision Instruments	MPH3-10	Uchwyt igły do mikrokapilar o średnicy zewnętrznej 1 mm
P-2000	Sutter Instruments		Dowolny ściągacz igieł
Photo-Flo 200 Solution	B& H Foto, wideo i audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	środek zwilżający
Manometr	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi
miernik Referencyjny	Sutter Instruments	X050300
Uchwyt referencyjnego	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Potrzebujesz portów # 10-32 do połączeń
Gumowy arkusz uszczelniający 6 inx 6 w	Danco	Model # 59849
T pasujący	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Pręt			Pręt gwintowany lub pręt z gwintowanym końcem. Gwinty muszą mieć rozmiary 10-32.
Rurki uretanowe	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050

gwintowany