Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66771

⸱

3 maja 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Streszczenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci zgromadzone dowody na istnienie superkompleksów oddechowych (SC) zmieniły nasze rozumienie organizacji mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, dając początek propozycji "modelu plastyczności." Model ten postuluje współistnienie różnych proporcji SC i kompleksów w zależności od tkanki lub stanu metabolicznego komórki. Dynamiczny charakter montażu w SC pozwoliłby komórkom zoptymalizować wykorzystanie dostępnych paliw i wydajność transferu elektronów, minimalizując wytwarzanie reaktywnych form tlenu i sprzyjając zdolności komórek do przystosowania się do zmian środowiskowych.

Ostatnio nieprawidłowości w montażu SC zostały zgłoszone w różnych chorobach, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne (choroba Alzheimera i Parkinsona), zespół Bartha, zespół Leigha lub rak. Rola zmian w składaniu SC w postępie choroby nadal wymaga potwierdzenia. Niemniej jednak dostępność wystarczającej ilości próbek, aby określić status montażu SC, jest często wyzwaniem. Dzieje się tak w przypadku biopsji lub próbek tkanek, które są małe lub muszą zostać podzielone w celu przeprowadzenia wielu analiz, w przypadku kultur komórkowych, które rosną wolno lub pochodzą z urządzeń mikroprzepływowych, z niektórymi hodowlami pierwotnymi lub rzadkimi komórkami, lub gdy trzeba przeanalizować efekt określonych kosztownych zabiegów (w przypadku nanocząstek, bardzo drogich związków itp.). W takich przypadkach wymagana jest wydajna i łatwa w zastosowaniu metoda. W pracy przedstawiono metodę przystosowaną do otrzymywania wzbogaconych frakcji mitochondrialnych z niewielkich ilości komórek lub tkanek w celu analizy struktury i funkcji mitochondrialnych SC za pomocą elektroforezy natywnej, a następnie testów aktywności w żelu lub western blot.

Wprowadzenie

Superkompleksy (SCs) są supramolekularnymi powiązaniami pomiędzy poszczególnymi kompleksami łańcuchów oddechowych1,2. Od czasu wstępnej identyfikacji SC i opisu ich składu przez grupę Schägger2,3, potwierdzonej później przez inne grupy, ustalono, że zawierają one kompleksy oddechowe I, III i IV (odpowiednio CI, CIII i CIV) w różnych stechiometriach. Można zdefiniować dwie główne populacje SC, te zawierające CI (i albo sam CIII, albo CIII i CIV) i o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej (MW, zaczynające się ~1,5 MDa dla mniejszego SC: CI + CIII2) oraz te zawierające CIII i CIV, ale nie CI, o znacznie mniejszym rozmiarze (takie jak CIII2 + CIV o ~680 kDa). Te SC współistnieją w wewnętrznej błonie mitochondrialnej z wolnymi kompleksami, również w różnych proporcjach. Tak więc, podczas gdy CI występuje głównie w powiązanych formach (tj. w SC: ~80% w sercu bydlęcym i ponad 90% w wielu typach komórek ludzkich)3, CIV występuje bardzo obficie w swojej wolnej postaci (ponad 80% w sercu bydlęcym), przy czym CIII wykazuje bardziej zrównoważoną dystrybucję (~40% w bardziej obfitej wolnej formie, jako dimer w sercu bydlęcym).

Chociaż ich istnienie jest obecnie powszechnie akceptowane, ich dokładna rola jest nadal przedmiotem dyskusji4,5,6,7,8,9,10. Zgodnie z modelem plastyczności, mogą istnieć różne proporcje SC i poszczególnych kompleksów w zależności od typu komórki lub statusu metabolicznego1,7,11. Ta dynamiczna natura zespołu pozwoliłaby komórkom regulować wykorzystanie dostępnych paliw i wydajność systemu fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w odpowiedzi na zmiany środowiskowe4,5,7. SC mogą również przyczyniać się do kontrolowania tempa wytwarzania reaktywnych form tlenu oraz uczestniczyć w stabilizacji i obrocie poszczególnych kompleksów4,12,13,14. Modyfikacje statusu zespołu SC zostały opisane w związku z różnymi sytuacjami fizjologicznymi i patologicznymi15,16 oraz procesem starzenia17.

Tak więc, zmiany we wzorcach SC zostały opisane u drożdży w zależności od źródła węgla użytego do wzrostu2 oraz w hodowanych komórkach ssaków, gdy glukoza jest podstawiona przez galaktozę4. Modyfikacje odnotowano również w wątrobie myszy po poście8 oraz w astrocytach, gdy utlenianie mitochondrialnych kwasów tłuszczowych jest zablokowane18. Ponadto stwierdzono spadek lub zmiany w SC i OXPHOS w zespole Bartha19, niewydolność serca20, kilka metabolic21 i neurological22,23,24 zaburzenia i różne nowotwory25,26,27,28. Czy te zmiany w montażu i poziomach SC są główną przyczyną, czy reprezentują wtórne skutki w tych patologicznych sytuacjach, jest nadal badane15,16. Różne metodologie mogą dostarczyć informacji na temat tworzenia i funkcjonowania SC; Należą do nich pomiary aktywności8,29, ultrastructural analysis30,31, oraz proteomics32,33. Użyteczną alternatywą, która jest coraz częściej stosowana i stanowi punkt wyjścia dla niektórych z wcześniej wymienionych metodologii, jest bezpośrednie określenie stanu montażu SC za pomocą elektroforezy Blue native (BN) opracowanej w tym celu przez grupę Schäggera 34,35.

To podejście wymaga powtarzalnych i wydajnych procedur do uzyskania i rozpuszczania błon mitochondrialnych i może być uzupełnione innymi technikami, takimi jak analiza aktywności w żelu (IGA), elektroforeza drugiego wymiaru i western blot (WB). Ograniczeniem w badaniach nad dynamiką SC za pomocą elektroforezy BN może być ilość komórek wyjściowych lub próbek tkanek. Przedstawiamy serię protokołów do analizy składania i funkcji SC, zaadaptowanych z metod grupy Schäggera, które można zastosować do świeżych lub mrożonych próbek komórek lub tkanek już od 20 mg tkanki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Skład wszystkich pożywek hodowlanych i jest określony w Tabeli 1, a szczegóły dotyczące wszystkich materiałów i odczynników użytych w tym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Izolacja mitochondriów od hodowli komórkowej

UWAGA: Minimalna objętość badanych komórek to ~30-50 μL upakowanych komórek (krok 1.4). Może to odpowiadać w przybliżeniu co najmniej dwóm lub trzem płytkom do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm lub jednej płytce o średnicy 150 mm przy 80-90% konfluencji, w zależności od typu komórki (od 5 × 106 do 107 komórek w komórkach pochodzących z L929 lub MDA-MB-468). Skuteczne rozbijanie komórek jest kluczowym krokiem.

  1. Hoduj przylegające komórki do około 80% konfluencji lub zawieszone komórki do odpowiedniej gęstości.
  2. Zbierać komórki przez odwirowanie w ilości 500 × g przez 5 minut (bezpośrednio z zawiesiny komórek w przypadku komórek nieprzylegających lub po standardowej trypsynizacji roztworem trypsyny-EDTA zawierającym 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA w 1x PBS, w przypadku komórek przylegających).
  3. Przemyć komórki 2x zimnym 1x PBS i osadzać je przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 min.
    UWAGA: Od tego momentu wszystkie kroki należy wykonać w temperaturze 4 °C. Dlatego wszystkie odczynniki muszą być zimne, a probówki zawierające komórki lub mitochondria muszą być trzymane na lodzie.
  4. Po drugim odwirowaniu odrzucić supernatant, oszacować objętość osadu komórkowego (cpv) i zamrozić komórki w temperaturze -80 °C przez co najmniej 15 minut, aby ułatwić przerwanie błony w kroku 1.8.
    UWAGA: W tym momencie protokół można zatrzymać, a ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez tygodnie. Zwykle odpowiednie są probówki z podziałką o pojemności 10 lub 15 ml ze stożkowym dnem.
  5. Pozwól komórkom powoli rozmrozić się na lodzie.
  6. Zawiesić upakowane komórki w objętości buforu hipotonicznego równej 7-krotności cpv (10 mM MOPS, 83 mM sacharozy, pH 7,2) (np. 100 μL upakowanych komórek w 700 μl buforu).
    UWAGA: Głośność musi być wystarczająca, aby uzyskać wydajne trzaski (patrz UWAGA w kroku 1.8).
  7. Przenieś zawiesinę komórkową do homogenizatora Potter-Dounce o odpowiedniej wielkości i pozwól komórkom pęcznieć, inkubując je w lodzie przez 2 minuty. Na przykład dla objętości 700-800 μl zawiesiny komórek odpowiedni jest homogenizator o pojemności 1 ml.
  8. Przerwij błony komórkowe, wykonując od ośmiu do dziesięciu uderzeń w homogenizatorze sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem teflonowym obracającym się z prędkością 600 obr./min.
    UWAGA: Podczas wykonywania pociągnięć ważne jest, aby wytworzyć próżnię, która zwiększy skuteczność pękania komórek wraz z działaniem hipotonicznym i zamrażającym odpowiednio w celu pęcznienia i łamliwości błon. Jeśli jest dobrze wykonany, podczas ściągania homogenizatora szybkim ruchem przy każdym pociągnięciu będzie słyszalny dźwięk "trzasku".
  9. Dodaj taką samą objętość buforu hipertonicznego do zawiesiny komórki (7x cpv) (30 mM MOPS, 250 mM sacharozy, pH 7,2), aby wytworzyć środowisko izotoniczne.
  10. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 10-15 ml i odwirować w stałym wirniku o sile 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Do tego celu można użyć oryginalnej probówki zawierającej nieuszkodzone komórki.
  11. Przenieść supernatant, który zawiera frakcję mitochondrialną, do probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml.
  12. OPCJONALNIE: Aby zwiększyć wydajność mitochondriów, należy ponownie zawiesić osad z kroku 1,10 w 7-krotności objętości osadu komórkowego buforu A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sacharozy, pH 7,4) poprzez pipetowanie w górę i w dół i odwirować przy 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przed przejściem do kroku 1.13 połączyć nowy supernatant z poprzednim.
  13. Odwirować w mikrodymie o sile 16 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu zebrania surowej frakcji mitochondrialnej.
  14. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdy osad wzbogacony w mitochondria 0,5 ml buforu A łączącego zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować w takich samych warunkach, jak opisano w kroku 1.13. Powtarzaj ten sam proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.
  15. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić końcowy osad z 300 μl buforu A i określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Ponownie odwirować jak poprzednio i przejść do sekcji 3.

2. Izolacja mitochondriów z małych ilości tkanek zwierzęcych

UWAGA: Minimalna ilość tkanki do zastosowania tego protokołu z pewnym pewnością zależy od typu komórki i jej obfitości mitochondrialnej, ale w większości przypadków może to być ~20-30 mg tkanki. Próbki tkanek mogą być świeżym materiałem lub próbkami zamrożonymi. W tym ostatnim przypadku przed rozpoczęciem procedury należy pozostawić próbki do rozmrożenia w buforze homogenizacyjnym umieszczonym na lodzie.

  1. Zważyć lub oszacować jak najdokładniej ilość (mg) tkanki.
  2. Przeciąć tkankę nożyczkami i wykonać 3-4 prania w buforze homogenizacyjnym za pomocą sitka, uważając, aby nie stracić mniejszych kawałków.
    UWAGA: Ten etap jest ważniejszy w tkankach takich jak mięśnie szkieletowe lub serce niż w mózgu lub tkankach miękkich, których komórki można łatwo zdezagregować bezpośrednio na etapie homogenizacji.
  3. Dodać świeżą pożywkę homogenizacyjną (4 ml na gram wątroby, 10 ml na gram serca, brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) lub mięśni oraz 5 ml na gram mózgu lub nerki; patrz specyficzny skład buforu dla każdego przypadku w tabeli 1).
  4. Przenieś kawałki tkanki z buforem do homogenizatora i postępuj zgodnie z optymalnym protokołem homogenizacji i izolacji mitochondriów w zależności od wybranej tkanki.
  5. Izolacja mitochondriów od wątroby, śledziony i nerek
    1. Homogenizuj czterema do sześciu pociągnięć w górę iw dół w Elvehjem-Potter za pomocą napędzanego silnikiem tłuczka teflonowego przy 600 obr./min.
    2. Przenieść homogenizowaną tkankę do sterylnej probówki wirówkowej. Wirować w wirniku wahliwym o masie 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Napełnij probówki polipropylenowe o pojemności 1,5 ml supernatantem otrzymanym w poprzednim kroku. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 16 000 × g w mikrodyfie w temperaturze 4 °C, a następnie postępować zgodnie z opisem powyżej (kroki od 1.13 do 1.15)
  6. Izolacja mitochondriów od próbek serca i mięśni
    1. Homogenizuj za pomocą sześciu do ośmiu pociągnięć w Elvehjem-Potter za pomocą napędzanego silnikiem tłuczka teflonowego przy 600 obr./min. Przenieść homogenizowaną tkankę do sterylnej probówki wirówkowej.
    2. Wirować w wirniku wahliwym o masie 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umieścić supernatant w czystych probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Drugą homogenizację osadu uzyskaną w kroku 2.6.2 można przeprowadzić za pomocą 4-5 dodatkowych uderzeń i 1/2 objętości buforu homogenizacyjnego w celu zwiększenia wydajności mitochondrialnej. Nowy supernatant (po ponownym odwirowaniu w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) może być połączony z poprzednim supernatantem przed przejściem do etapu 2.6.3. Alternatywą dla zwiększenia surowej wydajności mitochondriów jest dysocjacja próbek tkanki serca i mięśni w roztworze trypsyny przed homogenizacją36,37. W takim przypadku trypsyna musi zostać skutecznie inaktywowana/usunięta, zanim błony mitochondrialne zostaną rozpuszczone za pomocą digitoniny (krok 3.2).
    3. Odwirować przy 16 000 × g w mikrodymie przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu uzyskania surowej frakcji mitochondrialnej.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdy osad wzbogacony w mitochondria 0,5 ml buforu AT, łącząc zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.6.3. Powtarzaj ten sam proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.
    5. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić końcowy osad z 300 μl buforu A (bez BSA) i określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Ponownie odwirować jak poprzednio i przejść do sekcji 3.
  7. Izolacja mitochondriów od mózgu
    1. Homogenizuj fragmenty mózgu za pomocą 10-15 pociągnięć za pomocą homogenizatora szklanego typu Dounce z ręcznie napędzanym szklanym tłuczkiem. Przenieść homogenizowaną tkankę do sterylnej probówki wirówkowej.
    2. Wirować w wirniku wahliwym o masie 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zebrać sklarowany osad do czystej probówki wirówkowej.
    4. Zawiesić osad otrzymany w poprzednim etapie wirowania w tej samej objętości pożywki użytej w pierwszej homogenizacji. Ponownie homogenizować osad, powtarzając proces opisany w kroku 2.7.1 przy użyciu 5-10 przejść i odwirować zawiesinę w wirniku wahliwym o masie 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Usunąć supernatant i dodać go do probówki przygotowanej w kroku 2.7.3. Wirować przy 10 000 × g w wirniku o stałym kącie przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania surowej frakcji mitochondrialnej.
    6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1/2 początkowej objętości homogenizacji (etap 2.7.1) pożywki AT. Rozprowadzić zawiesinę mitochondrialną do czystych probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 16 000 × g w mikrofugach przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdy osad wzbogacony w mitochondria 0,5 ml buforu AT, łącząc zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.7.6. Powtarzaj ten sam proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.
    8. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić końcowy osad z 300 μl buforu A (bez BSA) i określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Ponownie odwirować jak poprzednio i przejść do sekcji 3.
  8. Izolacja mitochondriów od BAT
    1. Homogenizuj za pomocą ośmiu do dziesięciu pociągnięć góra-dół w Elvehjem-Potter za pomocą napędzanego silnikiem tłuczka teflonowego przy 600 obr./min. Przenieść homogenizowaną tkankę do sterylnej probówki wirówkowej.
    2. Wirować w wirniku wahliwym o masie 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Napełnij probówki polipropylenowe o pojemności 1,5 ml supernatantem otrzymanym w poprzednim kroku, unikając górnej warstwy tłuszczu.
      UWAGA: Drugą homogenizację osadu otrzymanego w kroku 2.8.2 można przeprowadzić w celu zwiększenia wydajności mitochondrialnej. Nowy supernatant (po ponownym odwirowaniu w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) może być połączony z poprzednim supernatantem przed przejściem do etapu 2.8.4.
    4. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 16 000 × g przez 2 minuty w mikrodymie w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdy osad wzbogacony w mitochondria 0,5 ml buforu AT2 łączącego zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować w takich samych warunkach, jak opisano w kroku 2.8.4. Powtarzaj ten sam proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.
    6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić końcowy osad z 300 μl buforu A (bez BSA) i określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Ponownie odwirować jak poprzednio i przejść do sekcji 3.

3. Przygotowanie próbek do analizy Blue Native

  1. Zawiesić frakcje mitochondrialne (uzyskane z hodowli komórek lub tkanek ssaków) w buforze próbki BN (50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 5 mM kwas aminokapronowy, 4 mM PMSF) w celu uzyskania stężenia białka około 10 mg/ml. W tabeli 2 przedstawiono oczekiwane plony dla różnych rodzajów próbek.
  2. Rozpuszczaj błony mitochondrialne, dodając digitoninę (10% roztwór podstawowy) w celu uzyskania proporcji 4 g digitoniny/g białka mitochondrialnego (4 μl digitoniny 10% zapasu na 10 μl zawiesiny mitochondrialnej przygotowanej w kroku 3.1).
    UWAGA: Stosunek detergentu do białka (g/g) musi być zoptymalizowany dla każdego rodzaju próbki, aby uzyskać powtarzalne wyniki; Stwierdzono, że 2-8 g digitoniny/g białka mitochondrialnego jest optymalne dla większości tkanek34,35.
  3. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Próbki inkubować na lodzie przez 5 minut
    UWAGA: Po tym etapie zawiesina mitochondrialna powinna stać się bardziej przejrzysta (zmienić się z nieprzezroczystej na półprzezroczystą); W przeciwnym razie może to oznaczać, że ilość detergentu jest niewystarczająca do prawidłowego rozpuszczania membrany.
  4. Wirować z pełną prędkością w mikrodymie (ok. 20 000 × g) przez 25 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.
  5. Zebrać supernatant do świeżej probówki. Dodać do supernatantu objętość 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% w 0,75 M kwasu aminokapronowego) odpowiadającą 1/3 początkowej objętości zawiesiny (etap 3.1, co odpowiada końcowej proporcji 1,6 g Coomassie/g białka) i wymieszać pipetując.
  6. Przechowywać na lodzie przed załadowaniem żelu lub zamrozić porcje w temperaturze -80 °C.

4. Elektroforeza w postaci żelu Blue Native

UWAGA: Elektroforeza jest wykonywana w chłodni (4-8 °C). Jeśli nie ma komory chłodniczej, w zbiorniku do elektroforezy można wprowadzić blok chłodzący. Stosowane są komercyjne 3-13% natywne żele poliakrylamidowe29, ale można również stosować domowe żele o pożądanych stężeniach gradientowych38,39.

  1. Załaduj górną i dolną komorę odpowiednio zimną katodą A i anodowymi. Alternatywnie, należy załadować próbki do studzienek przed ostrożnym napełnieniem górnej komory buforem katodowym A.
    UWAGA: W naszym laboratorium stosowane są komercyjne do elektroforezy, ale można je przygotować zgodnie ze wskazaniami w tabeli 1.
  2. Załaduj od 30 do 100 μg białka mitochondrialnego.
    UWAGA: Zwykle 30-50 μg białka (dla WB) lub 40-100 μg białka (dla IGA) jest ładowane na studzienkę w żelu 10 paskowym (dołki 0,5 x 0,15 cm). Bufor katody A zawiera Coomassie Blue G-250 i ma intensywnie niebieski kolor, który utrudnia dostrzeżenie studzienek żelowych podczas ładowania próbki. Wygodnie jest oznaczyć środek każdej studzienki czerwonym markerem, na przykład aby pomóc w umieszczeniu końcówki pipety na tym etapie. Natywne markery masy cząsteczkowej mogą być przydatne podczas ustawiania techniki BN-PAGE w celu potwierdzenia, że żele gradientowe są prawidłowo uformowane i że wzór kompleksów i SC jest prawidłowy.
  3. Pracuj przy napięciu 80-100 V przez 25-30 min, a następnie przy 160-180 V, ograniczając prąd do 12 mA/żel, aż barwnik dotrze do dna żelu (łącznie ~125-165 min).
  4. Jeśli mają być przeprowadzone testy aktywności w żelu (IGA), należy zastąpić bufor katodowy A buforem katodowym B, gdy czoło barwnika znajduje się w środku żelu (~1 h po rozpoczęciu serii).
    UWAGA: Chociaż żele można udokumentować bez barwienia tuż po przebiegu, ponieważ niektóre prążki są widoczne (głównie kompleks V, który można uznać za "wewnętrzny" wytwórca o MW ~600 kDa) ze względu na ich wiązanie z barwnikiem G-250, zwykle SC i poszczególne kompleksy nie będą widoczne bez barwienia lub testów IGA. Żele przeznaczone do stosowania w testach IGA lub do WB nie powinny być barwione ani utrwalane.
  5. Zdemontuj żel z kasety i kontynuuj barwienie na niebiesko Coomassie (sekcja 5), analiza IGA (sekcja 6) lub immunodetekcja WB (sekcja 7).

5. Barwienie żelem

  1. Żel barwić przez 10-15 min w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą roztworów barwnika Coomassie blue (barwnik Coomassie R-250 o stężeniu 0,25% w 40% metanolu, 10% kwasie octowym; barwieć przez 10-15 min).
  2. Odbarwić kilkoma praniami (zwykle 4-5 x 15 min) w 40% metanolu i 10% kwasie octowym w temperaturze pokojowej.
  3. Udokumentuj żel.

6. W testach aktywności żelowej (IGA)

  1. Przygotuj roztwory IGA do analizy różnych kompleksów oddechowych przed zakończeniem elektroforezy i utrzymuj je w ciemności (na przykład używając ciemnych plastikowych pudełek lub przykrywając je folią aluminiową). Skład każdego bufora jest szczegółowo opisany w tabeli 1.
  2. Umieść żel lub pasy do użycia w plastikowym pudełku tak małym, jak to możliwe, aby je pomieścić.
  3. Dodać wystarczającą objętość odpowiedniego roztworu, aby pokryć żel (zwykle 5 lub 10 ml odpowiednio na 5 lub 10 pasów żelu) i inkubować w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając (60-80 obr./min) i z dala od światła.
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od kompleksu, który ma być poddany analizie, oraz od rodzaju i ilości załadowanej próbki; CI i CIV są najłatwiejsze i najszybsze do uzyskania wyników. Tak więc aktywność CI zwykle zaczyna być widoczna po kilku minutach, podczas gdy CII i CIV potrzebują ~30 minut, aby je zaobserwować, a CV ~1,5-2 h. We wszystkich przypadkach reakcja może trwać godzinami, a szybkość intensyfikacji sygnału można zmniejszyć, przenosząc inkubację do zimnego pomieszczenia (4-6 °C), na przykład na inkubację przez noc (ON). Aktywność CIII działa tylko dla klarownej natywnej elektroforezy (CN), a nie dla klasy BN34.
  4. Gdy rozwiną się odpowiednie prążki, należy zatrzymać reakcje, usuwając roztwory testowe, przemywając 2x wodą destylowaną i utrwalając żel 40% metanolem i 10% kwasem octowym (z wyjątkiem CV, który jest utrwalany tylko metanolem) przez 30 minut.
    1. Aby przeanalizować aktywność CIV po wykryciu CI przez IGA, przemyj żel 2x wodą destylowaną, udokumentuj aktywność CI, inkubuj żel (bez utrwalania go!) z 50 mM buforem fosforanu potasu (pH 7,2) 2x przez 30 min, a następnie z pełnym buforem reakcyjnym CIV do momentu pojawienia się złożonych prążków IV (zwykle przez inkubację ON w temperaturze RT lub 4 °C).
  5. Udokumentuj gels.
    UWAGA: W przypadku aktywności ATPazy, ponieważ rozwinięte prążki są białe, dokumentując żel, umieść go na ciemnym tle, tak aby widoczne były wyraźne prążki.

7. Analiza Western blot

  1. Przygotować bufor transferowy zgodnie z tabelą 1 i utrzymywać w temperaturze 4 °C do końca elektroforezy.
  2. Umieść żel na tacy i dodaj bufor transferowy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
  3. Wytnij kawałek membrany PVDF o tym samym rozmiarze co żel i aktywuj go w metanolu na 10 sekund pod mieszaniem. Umyć kilkakrotnie wodą destylowaną i dodać bufor transferowy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut, delikatnie wstrząsając.
  4. Przygotuj kanapkę transferową, od dołu do góry, unikając pęcherzyków między żelem a membraną, w następującej kolejności: strona kasety-gąbka-bibuła-żel-membrana-bibuła-gąbka-gąbka-przezroczysta strona kasety.
  5. Zamknij i zablokuj kasetę i umieść kanapkę w zbiorniku transferowym we właściwej orientacji do przenoszenia (strona w kierunku bieguna ujemnego).
  6. Napełnić zbiornik transferowy buforem transferowym, dodać mieszadło magnetyczne w celu wymieszania bufora i podłączyć zasilanie prądem 80 V przez 2 godziny lub przy napięciu 100 V przez 1 godzinę. Przeprowadzić transfer w temperaturze od 4 do 8 °C (na przykład w chłodni) i z blokiem chłodzącym w układzie przesyłowym.
  7. Odzyskaj błonę i kontynuuj standardowy protokół western blot, używając specyficznych przeciwciał dla różnych kompleksów oddechowych, które mają zostać wykryte29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność izolacji mitochondriów uzyskanych zgodnie z powyższymi protokołami różni się w zależności od kilku czynników, takich jak linia komórkowa lub rodzaj tkanki, charakter próbek (tj. czy zastosowano tkanki świeże czy zamrożone) lub efektywność procesu homogenizacji. Przewidywane wydajności uzyskania mitochondriów z różnych linii komórkowych i tkanek zestawiono w Tabeli 2. Po otrzymaniu frakcji mitochondrialnych kolejnym krokiem jest analiza wzorca oddechowych SC, którą przeprowadza się po solubiliza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Adaptacje metodologiczne wprowadzone w opisanych tu protokołach mają na celu uniknięcie strat i zwiększenie wydajności przy jednoczesnym utrzymaniu aktywności kompleksu mitochondrialnego (co ma kluczowe znaczenie, gdy dostępność wystarczającej ilości próbek jest zagrożona) oraz odtworzenie oczekiwanego wzorca SC w tkance lub linii komórkowej (patrz rysunek 2C). W tym celu i z uwagi na fakt, że wysoka czystość mitochondriów nie jest wymagana do prawidłowego wykrycia SC, liczba kroków, czasów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant numer "PGC2018-095795-B-I00" od Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) oraz przez granty "Grupo de Referencia: E35_17R" i grant numer "LMP220_21" od Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) dla PF-S i RM-L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyPanReac131008
Kwas aminokapronowyFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Test BradfordaBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrom cSigma-AldrichC2506
Diamin  benzydyna (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninaSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Bez kwasów tłuszczowych BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizator Tłuczek teflonowyDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MetanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini komórka trans-blotBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Przeciwciało monoklonalneInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 do 12% Mini żele białkoweInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Dodatek buforowy katodowy (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Bufor do biegania (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Przeciwciało monoklonalneInvitrogen459100
Sól tetrazolowa nitroniebieskiego (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembranaAmersham10600023
metasiarczan fenazyny (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Przeciwciało monoklonalneInvitrogen459200
Bursztynian soduSigma-AldrichS2378
Streptomycyna/penicylinaPAN biotechP06-07100
SacharozaSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Przeciwciało monoklonalneInvitrogen459140
XCell  SureLock Mini-CellInvitrogen  Numer EI0001

Bibliografia

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. Clinical Bioenergetics. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242(2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452(2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Celis, J. E. Cell Biology (Third Edition). , Academic Press. 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja mitochondriówsuperkompleksy mitochondrialneelektroforeza Blue Nativemałe próbki tkanekmitochondria z hodowli komórkowychmontaż superkompleksówtest aktywności w żeluoznaczanie ilości białek mitochondrialnychłańcuch transportu elektronówsuperkompleksy oddechowe
Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.