Opracowanie małoinwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi

Podsumowanie

Opisano szczegółową metodologię tworzenia minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Podano również dodatkowe metody ilościowego określania obszaru zawału i wizualizacji drzewa tętnicy płucnej.

Streszczenie

Zatorowość płucna (PE) jest jedną z głównych przyczyn zgonów z przyczyn sercowo-naczyniowych, powodując znaczne obciążenie społeczno-ekonomiczne. Chociaż obecne metody leczenia koncentrują się przede wszystkim na antykoagulacji i trombolizie, istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia jej patofizjologii i opracowania nowych strategii leczenia. Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu PW i opracowywaniu nowych terapii tej choroby, przy czym gryzonie są powszechnie stosowane ze względów etycznych i kosztowych. Jednak istniejące modele gryzoni dla PE są ograniczone przez brak ustandaryzowanych procedur, co utrudnia odtwarzalność i porównania między badaniami. Badanie to ma na celu ustanowienie minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu PE przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Model charakteryzuje się minimalnie inwazyjną techniką pobierania krwi, standaryzowaną procedurą generowania skrzepliny i minimalnie inwazyjnym dostępem do żył. Dodatkowo dostępne są protokoły ilościowego oznaczania obszarów zawału i wizualizacji drzewa tętnic płucnych. Procedury te mają na celu poprawę wiarygodności modeli gryzoni do badania progresji PW i ułatwienie opracowania nowych metod leczenia.

Wprowadzenie

Zatorowość płucna (PE) jest główną przyczyną zgonów wewnątrzszpitalnych i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z przyczyn sercowo-naczyniowych. Pomimo wysokiej częstości występowania, zapobieganie i szybka diagnoza nadal stanowią wyzwanie^1,2. Terapie przeciwzakrzepowe i trombolityczne mają kluczowe znaczenie w leczeniu P, jednak głębsze zrozumienie progresji choroby i nowatorskich podejść terapeutycznych jest niezbędne do poprawy zarządzania chorobą³.

W nowoczesnych badaniach biomedycznych, modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu mechanizmów chorób człowieka i opracowywaniu nowych terapii^4,5. Myszy, szczury, chomiki i króliki są często wykorzystywane w modelowaniu PE ze względów etycznych i opłacalności^6,7,8,9,10. Podejścia do modelowania PE ogólnie dzielą się na trzy kategorie: tworzenie skrzeplin in vivo, wstrzykiwanie skrzepów krwi in vitro oraz podawanie cząstek niezakrzepowych. Wybór gatunków zwierząt i techniki modelowania zależy od konkretnych celów badawczych, ponieważ żaden pojedynczy model nie jest odpowiedni dla wszystkich celów. Na przykład badania koncentrujące się na odkrywaniu nowych terapii trombolitycznych często wykorzystują modele obejmujące autologiczne skrzepy krwi zamiast cząstek niezakrzepowych.

Obecne metody modelowania PE u gryzoni napotykają wyzwania z powodu braku szczegółowych, ustandaryzowanych metodologii. Wpływa to na kluczowe procesy, takie jak pobieranie próbek krwi, tworzenie skrzepów krwi i późniejsza embolizacja, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia powtarzalnych wyników we wszystkich badaniach. Dodatkowo istnieje znaczna luka w możliwości ilościowego określenia obszaru zatoru i dokładnego odwzorowania rozkładu zatorów po embolizacji. Wyeliminowanie tych niedociągnięć ma zasadnicze znaczenie dla zwiększenia niezawodności i użyteczności modeli gryzoni w badaniach PE.

W tym badaniu opisano szczegółowe protokoły tworzenia szczurzego modelu PE przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Model ten charakteryzuje się minimalnie inwazyjną techniką pobierania krwi, standaryzowaną procedurą generowania skrzepliny i minimalnie inwazyjnym dostępem do żył. Dodatkowo zapewnione są protokoły ilościowego oznaczania obszarów zawału w płucach i wizualizacji drzewa tętnic płucnych, co może ułatwić dalsze odkrycia badawcze.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Chińskiej Akademii Nauk Medycznych i Peking Union Medical College (numer zatwierdzenia: IRM/2-1ACUC-2311-015). W badaniu wykorzystano samce szczurów rasy Sprague-Dawley w wieku 6 tygodni i ważące około 250 g. Zwierzęta były trzymane w specyficznym środowisku wolnym od patogenów, z dostępem ad libitum do zbilansowanej diety i wody. Trzymano je w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze pokojowej 22 °C ± 2 °C. Zwierzętom pozwolono przystosować się do środowiska przez 1 tydzień przed poddaniem się jakimkolwiek zabiegom chirurgicznym. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Sprzęt i materiały

1. Sprzęt do znieczulenia: Użyj urządzenia do znieczulenia gazowego dla małych zwierząt i izofluranu.
2. Materiały chirurgiczne: Przygotuj waciki, płyn dezynfekujący powidon-jod, mikroskop stereoskopowy, golarkę, taśmę medyczną, strzykawkę 1 ml z igłą 27 G, strzykawkę 5 mL, strzykawkę 10 mL, sterylną sól fizjologiczną, gazę, 8-0 Sterylne szwy nylonowe, sterylny szew nylonowy 6-0 z igłą do szwów, zaciski mikrohemostatyczne, mikro pęseta i cienkie nożyczki.
3. Inne materiały: Zaopatrz się w igły dozujące 19 G i 18 G kompatybilne ze strzykawkami medycznymi, silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 1,2 mm i długości 10 cm, rurkę infuzyjną o średnicy wewnętrznej 3,0 mm i długości 20 cm, probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml, pipetę i końcówki do pipet.
4. Samodzielnie wykonany generator skrzepliny i wstrzykiwacz skrzepów krwi (Rysunek 1): Podłącz silikonową rurkę do igły dozującej 19 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml, aby utworzyć generator skrzepliny. Podłączyć jeden koniec rurki infuzyjnej do igły dozującej 18 G, a drugi koniec podłączyć do strzykawki o pojemności 5 ml, aby utworzyć wstrzykiwacz skrzepu.

2. Autologiczne przygotowanie zakrzepów krwi

1. znieczulenie
   1. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej znieczulenia i podawać mieszaninę 4% izofluranu z powietrzem w pomieszczeniu o natężeniu przepływu 2 l/min przez 2-3 minuty (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
   2. Ustaw zwierzę na platformie operacyjnej w pozycji leżącej. Utrzymuj znieczulenie, podając 2,5% izofluranu o natężeniu przepływu 0,4 l/min. Sprawdź odruch pedałowania, aby upewnić się, że uzyskano odpowiednie znieczulenie.
   3. Wyciągnij obie kończyny przednie poziomo od ciała i wyprostuj kończyny tylne, aby odpowiednio odsłonić obszar pachwiny. Zabezpiecz zwierzę w tej pozycji za pomocą taśmy medycznej (Rysunek 2A).
2. Pobieranie krwi przez żyłę główną czaszki (CVC)
   1. Usuń włosy wokół rękojeści za pomocą golarki i kremu do depilacji. Zdezynfekuj skórę 3x powidonem-jodem.
   2. Wprowadzić igłę 27 G dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml pionowo na głębokość 8 mm, aby nakłuć lewy lub prawy CVC, jak pokazano na Rysunek 2A.
      UWAGA: Wystająca powierzchnia ciała CVC jest 5 mm boczna w stosunku do manubrium. Można użyć obu stron, a wybór nie ma wpływu na kolejne kroki.
   3. Trzymać strzykawkę i delikatnie odciągnąć tłok, aby wytworzyć podciśnienie w cylindrze. Stopniowo wycofuj igłę, aż zacznie napływać krew, a następnie utrzymuj tę pozycję, aż do pobrania 0,3 ml krwi (Rysunek 2B).
3. Przygotowanie zakrzepów krwi
   1. Wepchnij pobraną krew do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków.
   2. Wciągnij krew do silikonowej rurki samodzielnie wykonanego generatora skrzepliny, aż kolumna krwi osiągnie 10 cm długości.
      UWAGA: Wykonaj te dwa kroki szybko, ponieważ koagulacja rozpocznie się i rozprzestrzeni w probówce wirówkowej, obniżając jakość zebranych skrzepów krwi.
   3. Odczekaj 30 minut, aż krew zostanie całkowicie zakrzepiona. W tym czasie przygotuj kolumny krwi dla innych zwierząt w ten sam sposób.
   4. Przepłukać zakrzepioną kolumnę krwi na sterylną szalkę Petriego zawierającą sterylną normalną sól fizjologiczną i przemyć kolumnę skrzepliny zwykłą solą fizjologiczną trzy razy (Rysunek 2C).
   5. Użyj cienkich nożyczek, aby pociąć kolumnę skrzepliny na jednolite skrzepliny, każdy o długości 4 mm (Rysunek 2D). Pobrać 15-25 skrzepów do samodzielnie wykonanego wstrzykiwacza wstępnie napełnionego 2 ml soli fizjologicznej.
      UWAGA: Długość skrzepów krwi nie powinna przekraczać 1 cm, w przeciwnym razie zostaną one uwięzione w prawej komorze.

3. Przygotowanie dostępu do żył

1. Odsłanianie powierzchownych naczyń nadbrzusza
   1. Znieczulić i naprawić to samo zwierzę zgodnie z opisem w kroku 2.1.
   2. Ogol włosy otaczające lewą okolicę pachwiny. Nałóż krem do depilacji na te obszary, odczekaj 1 minutę, a następnie zetrzyj krem gazą. Zdezynfekuj skórę 3x powidonem-jodem.
   3. Wykonaj 5 mm nacięcie skóry powyżej początku powierzchownych naczyń nadbrzusza w okolicy pachwiny. Zwykle pochodzenie powierzchownych naczyń nadbrzusza można prześledzić, obserwując niewielką pulsację w okolicy pachwiny.
   4. Używając mikroskopu stereoskopowego z 10-krotnym powiększeniem, oddziel cienką warstwę podskórnej tkanki tłuszczowej, aby odsłonić powierzchowne naczynia w nadbrzuszu (Ryc. 3A). Zszyj nacięcie, zatrzymaj przepływ izofluranu i umieść zwierzę w ciepłym pudełku w celu odzyskania zdrowia.
2. Izolowanie powierzchownej żyły nadbrzusza
   1. Ostrożnie odizoluj powierzchowną żyłę nadbrzusza od tętnicy, nerwu i tkanki tłuszczowej. Wykonaj to zarówno proksymalnie, aż do punktu, w którym spływa do żyły udowej, jak i dystalnie, aż do pierwszego rozwidlenia żyły.
   2. Liguj dystalną stronę z 8-0 Sterylny szew i zacisnąć szew za pomocą mikrozacisku. Kontroluj bliższą stronę za pomocą 8-0 sterylna pętla do szwów przymocowana do innego mikrozacisku (Rysunek 3B).
   3. Wykonaj małe poprzeczne nacięcie po dystalnej stronie izolowanej żyły. Kontroluj stronę proksymalną, aby uniknąć krwawienia. Przepłucz pozostałą krew w świetle żyły zwykłą solą fizjologiczną. Gdy żyła jest oczyszczona, użyj mikropęsety, aby powiększyć nacięcie żylne.

4. Embolizacja

1. Kaniulacja żył
   1. Delikatnie wprowadzić igłę samodzielnie wykonanego wstrzykiwacza do żyły przez nacięcie żyły. Zabezpiecz igłę trzecim zaciskiem, aby zapobiec jej wysunięciu się z żyły.
2. Procedura embolizacji
   1. Powoli naciskać tłok, aby podać niewielką ilość soli fizjologicznej. Pełnia żyły bez oporu wskazuje na niezakłócony dostęp do żyły (Rysunek 3D).
   2. Kontynuować naciskanie tłoka, aby podać skrzepy do żyły udowej przez powierzchowny dostęp do żyły w nadbrzuszu. Kontroluj prędkość embolizacji przy 5 zatorach na minutę. Monitoruj oddychanie zwierzęcia; pojawiająca się i nasilająca duszność wskazuje na udaną embolizację.
   3. Po wstrzyknięciu określonej ilości skrzepów krwi należy wyjąć igłę i podwiązać bliższą stronę powierzchownej żyły nadbrzusza.
   4. Zszyj nacięcie i umieść zwierzę w ciepłym pudełku. Po przebudzeniu przenieś zwierzę do klatki i monitoruj oddychanie i zachowanie zwierzęcia.

5. Kwantyfikacja obszaru zawału

1. Eutanazja i perfuzja serca
   1. Dodaj 25 000 j. heparyny sodowej do 250 ml soli fizjologicznej i dokładnie wymieszaj. Podłącz butelkę do urządzenia infuzyjnego i zawieś butelkę do góry nogami na wysokości 80 cm. Zamknąć zawór urządzenia infuzyjnego.
   2. Poddać zwierzęta eutanazji z przedawkowaniem izofluranu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
   3. Przetnij żebra dużymi nożyczkami i otwórz klatkę piersiową, unikając uszkodzenia płuc i dużych naczyń.
   4. Wprowadzić igłę urządzenia infuzyjnego do lewej komory. Otworzyć zawór urządzenia infuzyjnego, aby umożliwić infuzję soli fizjologicznej w postaci heparyny. Użyj nożyczek, aby przeciąć żyłę główną dolną i lewy wyrostek, aby umożliwić drenaż. Kontroluj prędkość perfuzji przy 50 ml/min.
      UWAGA: Podczas tej procedury normalna tkanka płucna zmieni kolor na biały, podczas gdy strefa embolizacji pozostanie zardzewiała.
   5. Po zakończeniu perfuzji heparynizowaną solą fizjologiczną należy nakłuć pień tętnicy płucnej przez prawą komorę za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej 4% roztworem paraformaldehydu. Napraw tkankę płucną, wykonując 4% perfuzję paraformaldehydu przez płuca do całkowitej objętości 30 ml.
2. Przedstawiamy wskaźnik zwany współczynnikiem zawału
   1. Po utrwaleniu wytnij płuca, serce, tchawicę, przełyk, grasicę i duże naczynia jako całość z kręgosłupa i przepony¹¹.
   2. Ostrożnie usuń przełyk, grasicę i tkankę tłuszczową z początkowej masy, pozostawiając tylko serce, płuca i duże naczynia.
   3. Pozostałą część zanurzyć w odpowiedniej objętości 4% roztworu paraformaldehydu na co najmniej 48 godzin.
   4. Użyj wagi analitycznej, aby zważyć całe płuca. Użyj cienkich nożyczek, aby oddzielić część płuc z zawałem i zważyć tkankę zawału z tą samą wagą. Oblicz współczynnik zawału za pomocą następującego równania:
      
      i to masa tkanki po zawale, w to masa całych płuc, I oznacza współczynnik zawału.
   5. Po ilościowym określeniu obszaru zawału, przyciąć tkankę płucną utrwaloną paraformaldehydem w celu zatopienia parafiny¹¹.

6. Wizualizacja drzewa tętnic płucnych

1. Odlewanie tętnicy płucnej
   1. Poddaj zwierzę eutanazji i wykonaj perfuzję serca zgodnie z opisem w kroku 5.1.
   2. Dodać równą ilość (wagowo) rozcieńczalnika do silikonowej masy odlewniczej, wymieszać mieszaninę, a następnie dodać 5% (wagowo lub objętościowo) utwardzacza. Ponownie zmiksuj mieszaninę.
   3. Pobrać 1 ml mieszaniny do strzykawki o pojemności 1 ml, wypuścić powietrze i wprowadzić igłę do pnia tętnicy płucnej przez prawą komorę. Przymocuj igłę do tętnicy płucnej, aby zapobiec poślizgowi i przepływowi wstecznemu.
   4. Delikatnie nacisnąć tłok, aby mieszanina odlewu silikonowego wypełniła drzewo tętnicy płucnej. Normalne obszary płuc zostaną zabarwione przez mieszankę odlewniczą, podczas gdy obszary po zawale pozostaną rdzawoczerwone.
      UWAGA: Odlew tętnicy płucnej powinien być stosowany tylko do nienaruszonej tkanki płucnej. Zazwyczaj 0,6-0,8 ml mieszaniny odlewniczej wystarcza do wypełnienia drzewa tętnicy płucnej. Nadmierne wstrzyknięcie mieszaniny odlewniczej może prowadzić do odlewania żyły płucnej, co wpływa na wizualizację drzewa tętnicy płucnej. Mieszaninę odlewniczą należy zużyć w ciągu 20 minut po dodaniu utwardzacza, ponieważ po tym czasie ulegnie ona krystalizacji.
   5. Po odlaniu perfuzji należy wyjąć strzykawkę, podwiązać pień tętnicy płucnej i pobrać płuca, serce i duże naczynia krwionośne, jak opisano w kroku 5.2. Umieścić całą masę na szalce Petriego i przechowywać ją przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C, aby umożliwić krystalizację mieszaniny odlewniczej.
2. Czyszczenie i wizualizacja
   1. Usuń serce i duże naczynia z płuc nożyczkami, a następnie usuń resztki utwardzającej mieszaniny z powierzchni płuc.
   2. Zanurzaj płuca kolejno w roztworach alkoholu etylowego 25%, 50%, 75%, 95% i 100%, każdy na 24 godziny. Ta procedura całkowicie odwodni płuca.
   3. Zanurz odwodnione płuca w salicylanie metylu na 24 godziny. Po tym procesie oczyszczania drzewo tętnicy płucnej będzie widoczne, a także można zobaczyć zator , ponieważ salicylan metylu nie usuwa hemoglobiny (Rysunek 4B, D).

Wyniki

Objawy i patologia modelu PE
Podczas embolizacji szczury odczuwały duszność, a klatka piersiowa wykazywała poszerzone wahania. Prawie wszystkie zwierzęta przeżyły epizod zatorowości płucnej, gdy podano mniej niż 10 cm skrzepów krwi (14 z 15 modelowanych zwierząt). Po powrocie do klatek zwierzęta zwijały się w kłębek w kątach i wykazywały zmniejszone zainteresowanie jedzeniem i wodą. Jednak objawy te szybko ustąpiły i w ciągu kilku godzin zwierzęta zachowywały się normalnie. Nie stwierdzono istotnej różnicy w masie ciała między wartością wyjściową a 24 godzinami po embolizacji (341,8 ± 10,4 vs. 343,3 ± 8,5, p = 0,25).

Duża patologia wykazała, że obszary embolizowane (z zawałem) miały kształt klina, głównie zlokalizowane w dolnej części płuc, z wyraźnymi granicami. Zatory znaleziono na wierzchołku obszarów zawału, blokując pierwszą i wtórną odnogę tętnicy płucnej. Patologia mikroskopowa z użyciem barwienia hematoksyliną-eozyną potwierdziła embolizację gałęzi tętnicy płucnej (Ryc. 4F).

Obciążenie skrzepami krwi i obszar zawału
We wstępnym badaniu wpływu obciążenia skrzepami krwi na zawał płuc przetestowaliśmy zarówno niskie obciążenie skrzepami krwi (kolumna skrzepliny 6 cm, 15 skrzepów), jak i wysokie obciążenie skrzepami krwi (10 cm kolumna skrzepliny, 25 skrzepów). Zgodnie z oczekiwaniami, większe obciążenie zatorem skutkowało większym obszarem zawału płuc (Ryc. 5A-C).

Wewnętrzna fibrynoliza w ciągu 24 h
W porównaniu z próbkami płuc pobranymi natychmiast po embolizacji, próbki płuc pobrane 24 godziny po embolizacji wykazały znacznie zmniejszone obszary zawału, co wskazuje na silny wewnętrzny potencjał fibrynolizy u szczurów (Ryc. 5D).

Rysunek 1: Budowa generatora skrzepliny i wstrzykiwacza skrzepów krwi. (A) Generator skrzepliny został zmontowany poprzez podłączenie silikonowej rurki do igły dozującej 18 G (średnica zewnętrzna 12 mm) i strzykawki o pojemności 1 ml wstępnie napełnionej 0,5 ml soli fizjologicznej. (B) Wstrzykiwacz skrzepów krwi został skonstruowany poprzez podłączenie igły dozującej 19 G (średnica wewnętrzna 0,84 mm, średnica zewnętrzna 1,08 mm) do rurki infuzyjnej (pojemnika na skrzep) i strzykawki o pojemności 5 ml wstępnie napełnionej 2 ml soli fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pobieranie próbek krwi i przygotowanie skrzepu. (A) Szczur został znieczulony i unieruchomiony w pozycji leżącej. Białe kółko z przerywaną linią wskazuje manubrium, służąc jako znacznik powierzchni ciała. Czerwone kropki obok białego koła wskazują miejsca nakłucia, w których można uzyskać dostęp do obustronnych żył czaszkowych (CVC). Dolna część rysunku przedstawia ilustrację autopsji względnego położenia manubrium, CVC i miejsc nakłucia. (B) Pomyślne pobranie krwi przez prawy CVC. (C) Zakrzepiona kolumna krwi wypłukiwana z samodzielnie wykonanego generatora skrzepliny. (D) Skrzepy krwi pochodzące z zakrzepowej kolumny krwi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dostęp do żył i embolizacja. (A) Odsłonięcie powierzchownych naczyń nadbrzusza przez 5 mm nacięcie skóry, z niebieską strzałką wskazującą powierzchowną żyłę nadbrzusza, a czerwoną strzałką wskazującą powierzchowną tętnicę nadbrzusza. (B) Izolacja powierzchownej żyły nadbrzusza od otaczającej tkanki i kontrola żyły za pomocą szwów nylonowych. (C) Wstrzykiwacz własnej produkcji zawierający skrzepy krwi. (D) Kaniulacja żyły za pomocą igły dozującej samodzielnie wykonanego wstrzykiwacza i podawanie skrzepów krwi przez dostęp żylny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Patologia zatorowości płucnej. (A) Normalne płuca po perfuzji soli fizjologicznej serca i 4% utrwaleniu paraformaldehydu. (B) Normalne płuca uwidocznione za pomocą silikonowej mieszaniny odlewniczej i oczyszczania salicylanu metylu, pokazując opatentowane drzewo tętnicy płucnej i mikrokrążenie. (C) Płuca bezpośrednio po embolizacji z autologicznymi skrzepami krwi, z zaznaczonymi obszarami wskazującymi na zawał płuc spowodowany embolizacją. (D) Chore płuca uwidocznione przez odlewanie mieszaniny silikonu i oczyszczanie salicylanu metylu, z czarnymi strzałkami wskazującymi zator blokujący gałęzie tętnicy płucnej i białymi przerywanymi okręgami wskazującymi ich dotknięte obszary, które są zawałowe. (E) Rozwarstwienie lewego płata płuca z widocznymi zatorami (czerwonymi strzałkami) w odgałęzieniach tętnicy płucnej. (F) Obrazy mikroskopowe embolizacji skrzepów krwi w odgałęzieniu tętnicy płucnej przy użyciu barwienia hematoksyliną i eozyną. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Kwantyfikacja współczynnika zawału płuc. (A) Płuca natychmiast pobrane od szczura po embolizacji z 10 cm skrzepów krwi (całkowita długość). (B) Płuca natychmiast pobrane od szczura po embolizacji 6 cm skrzepliny. (C) Płuca natychmiast pobrane od szczura po embolizacji z 8 cm skrzepów krwi. (D) Płuca pobrane od szczura 24 godziny po embolizacji z 8 cm skrzepów krwi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym badaniu udało się ustalić minimalnie inwazyjny szczurzy model PE przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Po opanowaniu tej procedury modelowania można ją wykonać w ciągu 30 minut. Model skutecznie oddaje kluczowe cechy klinicznego PE, potwierdzone badaniami patomorfologicznymi. W związku z tym stanowi cenne narzędzie do wyjaśniania zmian hemodynamicznych i patogenezy powikłań po zatorowości płucnej, opracowywania nowych biomarkerów diagnostycznych i celów terapeutycznych oraz testowania nowych metod leczenia zakrzepowego.

Przez kilka dziesięcioleci włożono znaczne wysiłki w celu opracowania modelu zwierzęcego PE, jednak żadna pojedyncza metoda nie została zidentyfikowana jako optymalna do modelowania PE¹². W tym artykule zmodyfikowany model PE wykazuje kilka odrębnych cech: (1) Pobieranie krwi z centralnego cewnika żylnego (CVC): U gryzoni CVC łączy się ze zbiegiem żył podobojczykowych i wewnętrznych żył szyjnych i rozciąga się doogonowo do jamy piersiowej¹³. Lewy i prawy kod CVC są prawie symetryczne. CVC ma większe światło niż żyły szyjne, znajduje się blisko brzucha i leży poniżej mięśnia piersiowego większego. Te cechy anatomiczne pozwalają na precyzyjne nakłucie żyły, większą objętość pobierania krwi i szybką hemostazę, co skutkuje wysokim wskaźnikiem sukcesu. Ponadto pobieranie krwi z CVC jest mniej podatne na zanieczyszczenie w porównaniu z innymi drogami pobierania krwi, a powikłania, takie jak krwiak, zakrzepica i odma opłucnowa, są mniej prawdopodobne. Hemostaza jest zwykle osiągana automatycznie lub szybko pod ciśnieniem. (2) Wstrzyknięcie przez powierzchowną żyłę nadbrzusza: Zazwyczaj zewnętrzne żyły szyjne są używane do wstrzykiwania skrzepów krwi w celu wywołania PE ^6,8,9, a nacięcie skóry w celu odsłonięcia może być minimalne. Jednak kaniulacja żyły szyjnej zewnętrznej często prowadzi do niedrożności żyły, co może negatywnie wpłynąć na późniejsze eksperymenty, ponieważ żyła szyjna zewnętrzna jest głównym odpływem czaszkowym u szczurów po urodzeniu¹⁴, a kaniulacja drugiej żyły szyjnej zewnętrznej jest potrzebna do pomiaru ciśnienia w prawej komorze ^6,8,10. W tym zmodyfikowanym modelu poświęcenie powierzchownej żyły nadbrzusza ma minimalny wpływ na organizm. Dodatkowo ta droga wstrzykiwania skrzepów krwi naśladuje kliniczny PE, w którym większość zatorów pochodzi z żył kończyn dolnych. Dokładna lokalizacja powierzchownej tętnicy nadbrzusza ma kluczowe znaczenie dla małego nacięcia. Pulsację powierzchownej tętnicy nadbrzusza można zwykle zauważyć na powierzchni skóry pachwiny, co pomaga w identyfikacji naczynia. (3) Indywidualne obciążenie zatorem: Obciążenie zatorem zależy od średnicy i całkowitej długości kolumny krwi. Generator skrzepliny zastosowany w tym badaniu pozwala na standardowe i dostosowane do potrzeb przygotowanie obciążenia zatoru. Naukowcy mogą dostosować te parametry w zależności od swoich potrzeb badawczych. W takim przypadku obciążenie zatorem wywołuje zauważalne objawy i oznaki, ale jest mniej prawdopodobne, że doprowadzi do śmierci. Ogólnie rzecz biorąc, jest bezpieczny, jeśli wstrzykuje się mniej niż 10 cm skrzepów krwi. W przypadku wystąpienia bezdechu należy natychmiast przerwać wstrzykiwanie. Eksperymentator powinien następnie trzymać klatkę piersiową zwierzęcia palcami umieszczonymi na bocznej i przedniej ścianie klatki piersiowej i wykonywać rytmiczne uciśnięcia klatki piersiowej; Po tych manewrach zwierzę może odzyskać oddech. (4) Perfuzja płuc i kwantyfikacja obszarów po zawale: W tym badaniu przedstawiono szczegółowe techniki perfuzji płuc w celu lepszej wizualizacji zawału płuc po indukcji PE. Na tej podstawie opracowano wskaźnik do ilościowego określania obszaru zawału, zwany współczynnikiem zawału. Obecne wyniki wskazują, że wskaźnik ten może reagować na obciążenie zatorem i trombolizę wewnętrzną, co sugeruje jego potencjalną przydatność do porównań międzygrupowych w badaniach nad nowymi terapiami przeciwzakrzepowymi.

W porównaniu z modelowaniem PE, modelowanie przewlekłego zakrzepowo-zatorowego nadciśnienia płucnego (CTEPH), ciężkiego, długotrwałego powikłania PE, jest trudniejsze ze względu na wysoką aktywność fibrynolityczną u gryzoni. Potencjalne rozwiązania obejmują wielokrotną embolizację i podawanie kwasu traneksamowego (TXA), inhibitora fibrynolizy 7,10,12,15. Jednak uszkodzenie dostępu do żył i szybki klirens plazmowy TXA nadal utrudniają modelowanie CTEPH. Przedstawiony tutaj model i towarzyszące mu protokoły wizualizacji mogą dostarczyć informacji na temat ustanowienia wiarygodnego modelu CTEPH.

Należy również odnieść się do ograniczeń tego manuskryptu. Po pierwsze, brakuje pomiarów hemodynamicznych dla tego modelu, takich jak ciśnienie w prawej komorze i echokardiografia. Nie neguje to jednak słuszności modelu, ponieważ został on patologicznie zwalidowany. Badacze mogą zapoznać się z inną literaturą w celu uzyskania szczegółowych metodologii pomiarów hemodynamicznych¹⁶. Po drugie, nie uwzględniono grupy leczonej w celu oceny odpowiedzi na leki w tym modelu PE, takiej jak podawanie warfaryny i urokinazy, co mogłoby dodatkowo wykazać użyteczność modelu.

Podsumowując, udało się stworzyć zmodyfikowany model PE u gryzoni, charakteryzujący się minimalnie inwazyjnym podejściem. Przedstawiono również metody ilościowego określania obszarów po zawale i wizualizacji drzewa tętnic płucnych. Model ten jest obiecujący, jeśli chodzi o odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zapobiegania i leczenia powikłań PW.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Waga analityczna	METTLER TOLEDO	MA55/A	Brak
Igła dozująca	Elektronika Jinrong	Brak	19 G i 18 G
Cienkie nożyczki	Mocniejsze	XGJ1300	Brak Sól
sodowa heparyny	Solarbio	01-08-9041	140U/mg
Izofluran	RWD	R510-22-10	Brak
Salicylan metylu	Macklin	M813577	AR, 99%
Mikrozacisk	JZ	W40160	Brak Mikro
pęseta	Mocniejszy	XGN1310	Brak
Silikonowa masa odlewnicza	Flow Tech	MV-130	Brak
Szczury Sprague-Dawley	Vital River	SD-IGS	Brak
Mikroskop stereoskopowy	Murzider	MSD204	Brak