Opisano szczegółową metodologię tworzenia minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Podano również dodatkowe metody ilościowego określania obszaru zawału i wizualizacji drzewa tętnicy płucnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie małoinwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zatorowość płucna (PE) jest jedną z głównych przyczyn zgonów z przyczyn sercowo-naczyniowych, powodując znaczne obciążenie społeczno-ekonomiczne. Chociaż obecne metody leczenia koncentrują się przede wszystkim na antykoagulacji i trombolizie, istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia jej patofizjologii i opracowania nowych strategii leczenia. Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu PW i opracowywaniu nowych terapii tej choroby, przy czym gryzonie są powszechnie stosowane ze względów etycznych i kosztowych. Jednak istniejące modele gryzoni dla PE są ograniczone przez brak ustandaryzowanych procedur, co utrudnia odtwarzalność i porównania między badaniami. Badanie to ma na celu ustanowienie minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu PE przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Model charakteryzuje się minimalnie inwazyjną techniką pobierania krwi, standaryzowaną procedurą generowania skrzepliny i minimalnie inwazyjnym dostępem do żył. Dodatkowo dostępne są protokoły ilościowego oznaczania obszarów zawału i wizualizacji drzewa tętnic płucnych. Procedury te mają na celu poprawę wiarygodności modeli gryzoni do badania progresji PW i ułatwienie opracowania nowych metod leczenia.
Wprowadzenie
Zatorowość płucna (PE) jest główną przyczyną zgonów wewnątrzszpitalnych i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z przyczyn sercowo-naczyniowych. Pomimo wysokiej częstości występowania, zapobieganie i szybka diagnoza nadal stanowią wyzwanie1,2. Terapie przeciwzakrzepowe i trombolityczne mają kluczowe znaczenie w leczeniu P, jednak głębsze zrozumienie progresji choroby i nowatorskich podejść terapeutycznych jest niezbędne do poprawy zarządzania chorobą3.
W nowoczesnych badaniach biomedycznych, modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu mechanizmów chorób człowieka i opracowywaniu nowych terapii4,5. Myszy, szczury, chomiki i króliki są często wykorzystywane w modelowaniu PE ze względów etycznych i opłacalności6,7,8,9,10. Podejścia do modelowania PE ogólnie dzielą się na trzy kategorie: tworzenie skrzeplin in vivo, wstrzykiwanie skrzepów krwi in vitro oraz podawanie cząstek niezakrzepowych. Wybór gatunków zwierząt i techniki modelowania zależy od konkretnych celów badawczych, ponieważ żaden pojedynczy model nie jest odpowiedni dla wszystkich celów. Na przykład badania koncentrujące się na odkrywaniu nowych terapii trombolitycznych często wykorzystują modele obejmujące autologiczne skrzepy krwi zamiast cząstek niezakrzepowych.
Obecne metody modelowania PE u gryzoni napotykają wyzwania z powodu braku szczegółowych, ustandaryzowanych metodologii. Wpływa to na kluczowe procesy, takie jak pobieranie próbek krwi, tworzenie skrzepów krwi i późniejsza embolizacja, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia powtarzalnych wyników we wszystkich badaniach. Dodatkowo istnieje znaczna luka w możliwości ilościowego określenia obszaru zatoru i dokładnego odwzorowania rozkładu zatorów po embolizacji. Wyeliminowanie tych niedociągnięć ma zasadnicze znaczenie dla zwiększenia niezawodności i użyteczności modeli gryzoni w badaniach PE.
W tym badaniu opisano szczegółowe protokoły tworzenia szczurzego modelu PE przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Model ten charakteryzuje się minimalnie inwazyjną techniką pobierania krwi, standaryzowaną procedurą generowania skrzepliny i minimalnie inwazyjnym dostępem do żył. Dodatkowo zapewnione są protokoły ilościowego oznaczania obszarów zawału w płucach i wizualizacji drzewa tętnic płucnych, co może ułatwić dalsze odkrycia badawcze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Chińskiej Akademii Nauk i Peking Union Medical College (numer zgody: IRM/2-1ACUC-2311-015). W badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley w wieku 6 tygodni o masie ciała około 250 g. Zwierzęta przebywały w środowisku wolnym od swoistych patogenów, z nieograniczonym dostępem do zbilansowanej karmy i wody. Utrzymywano je w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze pokojowej 22 °C ± 2 °C. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek procedur chirurgicznych zwierzęta miały tydzień na adaptację do środowiska. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytych w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Sprzęt i materiały
- Sprzęt do znieczulenia: Należy użyć aparatu do znieczulenia gazowego dla małych zwierząt oraz izofluranu.
- Materiały chirurgiczne: Należy przygotować patyczki bawełniane, środek dezynfekcyjny povidone-iodine, stereomikroskop, golarkę, taśmę medyczną, strzykawkę 1 mL z igłą 27 G, strzykawkę 5 mL, strzykawkę 10 mL, sterylną sól fizjologiczną, gazę, sterylną nicią nylonową 8-0, sterylną nicią nylonową 6-0 z igłą, mikroklipsy hemostatyczne, mikropincety oraz precyzyjne nożyczki.
- Inne materiały: Należy przygotować igły dozujące 19 G i 18 G kompatybilne ze strzykawkami medycznymi, rurkę silikonową o średnicy wewnętrznej 1,2 mm i długości 10 cm, rurkę infuzyjną o średnicy wewnętrznej 3,0 mm i długości 20 cm, probówkę do wirowania 1,5 mL, pipetę oraz końcówki do pipety.
- Własnoręcznie wykonany generator skrzepów i wstrzykiwacz skrzepów krwi (Rysunek 1): Aby stworzyć generator skrzepów, należy połączyć rurkę silikonową z igłą dozującą 19 G przymocowaną do strzykawki 1 mL. Aby stworzyć wstrzykiwacz skrzepów, należy połączyć jeden koniec rurki infuzyjnej z igłą dozującą 18 G, a drugi koniec przyłączyć do strzykawki 5 mL.
2. Przygotowanie autologicznego skrzepu krwi
- Znieczulenie
- Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej do znieczulenia i podać mieszaninę 4% isofluranu z powietrzem pokojowym przy przepływie 2 L/min przez 2-3 min (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
- Ułożyć zwierzę na platformie operacyjnej w pozycji na plecach. Utrzymać znieczulenie, podając 2,5% isofluranu przy przepływie 0,4 L/min. Sprawdzić odruch cofania łapy, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia.
- Odciągnąć obie przednie kończyny poziomo od ciała oraz wyprostować kończyny tylne, aby odpowiednio odsłonić obszar pachwin. Zabezpieczyć zwierzę w tej pozycji za pomocą taśmy medycznej (Rysunek 2A).
- Pobieranie krwi z przedniej żyły głównej (CVC)
- Usunąć włosy wokół rękojeści mostka za pomocą golarki i kremu do depilacji. Zdezynfekować skórę trzykrotnie povidone-jodem.
- Wprowadzić igłę 27 G przymocowaną do strzykawki 1 mL pionowo na głębokość 8 mm, aby nakłuć lewą lub prawą CVC, jak pokazano na Rysunku 2A.
UWAGA: Projekcja powierzchniowa CVC na ciele znajduje się 5 mm bocznie od rękojeści mostka. Można wykorzystać obie strony, a wybór nie wpływa na kolejne kroki. - Trzymając strzykawkę, delikatnie odciągnąć tłok, aby wytworzyć podciśnienie w cylindrze. Stopniowo wycofywać igłę, aż zacznie wpływać krew, a następnie utrzymać tę pozycję do momentu pobrania 0,3 mL krwi (Rysunek 2B).
- Przygotowanie skrzepów krwi
- Przenieść pobraną krew do probówki do wirowania 1,5 mL, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.
- Naciągnąć krew do silikonowej rurki własnej konstrukcji służącej do generowania zakrzepów, aż kolumna krwi osiągnie długość 10 cm.
UWAGA: Te dwa kroki należy wykonać szybko, ponieważ koagulacja rozpocznie się i będzie postępować w probówce do wirowania, co obniży jakość uzyskanych skrzepów krwi. - Odczekać 30 min do pełnego zakrzepnięcia krwi. W tym czasie w ten sam sposób przygotować kolumny krwi dla pozostałych zwierząt.
- Wypłukać zakrzepłą kolumnę krwi do sterylnej szalki Petriego zawierającej sterylną sól fizjologiczną i trzykrotnie przemyć kolumnę zakrzepu solą fizjologiczną (Rysunek 2C).
- Za pomocą precyzyjnych nożyczek pociąć kolumnę zakrzepu na jednolite skrzepy krwi, każdy o długości 4 mm (Rysunek 2D). Naciągnąć 15-25 skrzepów do własnego wtryskiwacza uprzednio napełnionego 2 mL soli fizjologicznej.
UWAGA: Długość skrzepów krwi nie powinna przekraczać 1 cm, w przeciwnym razie mogą one utknąć w prawej komorze serca.
3. Przygotowanie dostępu żylnego
- Odsłanianie naczyń epigastrycznych powierzchownych
- Znieczul i unieruchom zwierzę w sposób opisany w kroku 2.1.
- Ogól włosy wokół lewego pachwiny. Nałóż krem do depilacji na te obszary, odczekaj 1 min, a następnie zetrzyj krem gazą. Zdezynfekuj skórę 3-krotnie povidonem jodowym.
- Wykonaj nacięcie skóry o długości 5 mm powyżej miejsca wypływu naczyń epigastrycznych powierzchownych w okolicy pachwiny. Zazwyczaj miejsce wypływu naczyń epigastrycznych powierzchownych można zlokalizować, obserwując niewielkie tętno w okolicy pachwiny.
- Używając stereomikroskopu z 10-krotnym powiększeniem, oddziel cienką warstwę tkanki tłuszczowej podskórnej, aby odsłonić naczynia epigastryczne powierzchowne (Rysunek 3A). Zaszyj nacięcie, przerwij podawanie izofluranu i umieść zwierzę w ciepłej klatce do wybudzenia.
- Izolacja żyły epigastrycznej powierzchownej
- Ostrożnie odizoluj żyłę epigastryczną powierzchowną od tętnicy, nerwu i tkanki tłuszczowej. Wykonaj to zarówno proksymalnie, aż do miejsca jej odpływu do żyły udowej, jak i dystalnie, aż do pierwszej rozgałęzienia żyły.
- Podwiąż stronę dystalną sterylną nicią 8-0 i zaciśnij szew mikrozaciskiem. Zabezpiecz stronę proksymalną pętlą ze sterylnej nici 8-0 przymocowaną do innego mikrozacisku (Rysunek 3B).
- Wykonaj niewielkie nacięcie poprzeczne na stronie dystalnej wyizolowanej żyły. Zabezpiecz stronę proksymalną, aby uniknąć krwawienia. Wypłucz pozostałą krew z światła żyły solą fizjologiczną. Gdy żyła będzie czysta, użyj mikropincety, aby powiększyć nacięcie żylne.
4. Embolizacja
- Kaniulacja żyły
- Delikatnie wprowadzić igłę wykonanego samodzielnie wstrzykiwacza do żyły poprzez nacięcie. Zabezpieczyć igłę za pomocą trzeciego zacisku, aby zapobiec jej wysunięciu się z żyły.
- Procedura embolizacji
- Powoli pchnąć tłok, aby podać niewielką ilość soli fizjologicznej. Napełnienie żyły bez oporu świadczy o drożności dostępu do żyły (Rysunek 3D).
- Kontynuować pchanie tłoka, aby wprowadzić skrzepy do żyły udowej poprzez dostęp z żyły epigastrycznej powierzchownej. Kontrolować prędkość embolizacji na poziomie 5 zatorów na minutę. Monitorować oddychanie zwierzęcia; pojawienie się i nasilenie duszności świadczy o udanej embolizacji.
- Po wstrzyknięciu określonej ilości skrzepów krwi wyciągnąć igłę i podwiązać proksymalny koniec żyły epigastrycznej powierzchownej.
- Zaszyć nacięcie i umieścić zwierzę w termoboksie. Przenieść zwierzę do klatki po jego wybudzeniu i monitorować jego oddychanie oraz zachowanie.
5. Ilościowe oznaczenie obszaru zawału
- Eutanazja i perfuzja serca
- Dodać 25 000 U heparyny sodowej do 250 mL soli fizjologicznej i dokładnie wymieszać. Podłączyć butelkę do urządzenia infuzyjnego i zawiesić butelkę dnem do góry na wysokości 80 cm. Zamknąć zawór urządzenia infuzyjnego.
- Dokonać eutanazji zwierząt poprzez przedawkowanie izofluranu (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
- Przeciąć żebra dużymi nożyczkami i otworzyć klatkę piersiową, unikając uszkodzenia płuc i dużych naczyń.
- Wprowadzić igłę urządzenia infuzyjnego do lewej komory. Otworzyć zawór urządzenia infuzyjnego, aby umożliwić infuzję soli fizjologicznej z heparyną. Za pomocą nożyczek przeciąć żyłę główną dolną oraz uszko lewe, aby umożliwić drenaż. Kontrolować szybkość perfuzji na poziomie 50 mL/min.
UWAGA: Podczas tej procedury prawidłowa tkanka płucna stanie się biała, natomiast strefa zatorowa pozostanie rdzawa. - Po zakończeniu perfuzji solą fizjologiczną z heparyną, nakłuć pień tętnicy płucnej przez prawą komorę, używając strzykawki 10 mL wypełnionej 4% roztworem paraformaldehydu. Utrwalić tkankę płucną, wykonując perfuzję 4% paraformaldehydem przez płuca do całkowitej objętości 30 mL.
- Wprowadzenie wskaźnika zwanego współczynnikiem zawału (Infarction Ratio)
- Po utrwaleniu wyciąć płuca, serce, tchawicę, przełyk, grasicę i duże naczynia jako całość z kręgosłupa i przepony11.
- Ostrożnie usunąć przełyk, grasicę i tkankę tłuszczową z początkowej masy, pozostawiając jedynie serce, płuca i duże naczynia.
- Zanurzyć pozostałą część w odpowiedniej objętości 4% roztworu paraformaldehydu na co najmniej 48 h.
- Użyć wagi analitycznej do zważenia całych płuc. Za pomocą precyzyjnych nożyczek oddzielić zawałową część płuc i zważyć tkankę zawałową na tej samej wadze. Obliczyć współczynnik zawału (Infarction Ratio) korzystając z następującego równania:
i to masa tkanki zawałowej, w to masa całych płuc, I oznacza współczynnik zawału (Infarction Ratio). - Po ilościowym określeniu obszaru zawału, przyciąć utrwaloną w paraformaldehydzie tkankę płucną do zatopienia w parafinie11.
6. Wizualizacja drzewa tętniczego płuc
- Odlew tętnicy płucnej
- Uśmierć zwierzę i przeprowadź perfuzję serca zgodnie z opisem w kroku 5.1.
- Do silikonowego związku odlewniczego dodaj równą ilość (wagowo) rozcieńczalnika, wymieszaj roztwór, a następnie dodaj 5% (wagowo lub objętościowo) utwardzacza. Ponownie wymieszaj mieszaninę.
- Nabierz 1 mL mieszaniny do strzykawki o pojemności 1 mL, usuń pęcherzyki powietrza i wprowadź igłę do pnia tętnicy płucnej poprzez prawą komorę. Przymocuj igłę do tętnicy płucnej, aby zapobiec jej wysunięciu i cofaniu się cieczy.
- Delikatnie naciśnij tłok, aby silikonowa mieszanina odlewnicza wypełniła drzewo tętnic płucnych. Obszary płuc zdrowe zostaną zabarwione przez mieszaninę odlewniczą, podczas gdy obszary zawałowe pozostaną rdzawoczerwone.
UWAGA: Odlew tętnicy płucnej należy wykonywać wyłącznie na nienaruszonym tkance płucnej. Zazwyczaj 0,6-0,8 mL mieszaniny odlewniczej jest wystarczające do wypełnienia drzewa tętnic płucnych. Nadmierne wstrzyknięcie mieszaniny może doprowadzić do odlewu żył płucnych, co utrudnia wizualizację drzewa tętniczego. Mieszaninę odlewniczą należy zużyć w ciągu 20 min od dodania utwardzacza, ponieważ po tym czasie ulegnie ona krystalizacji. - Po zakończeniu perfuzji odlewniczej wyjmij strzykawkę, podwiąż pień tętnicy płucnej i pobierz płuca, serce oraz duże naczynia zgodnie z opisem w kroku 5.2. Umieść cały kompleks w szalce Petriego i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić krystalizację mieszaniny odlewniczej.
- Przejaśnianie i wizualizacja
- Usuń serce i duże naczynia z płuc za pomocą nożyczek, a następnie oczyść powierzchnię płuc z resztek mieszaniny utwardzającej.
- Zanurzaj płuca kolejno w roztworach alkoholu etylowego o stężeniach 25%, 50%, 75%, 95% i 100%, każdy przez 24 h. Procedura ta spowoduje całkowite odwodnienie płuc.
- Zanurz odwodnione płuca w salicylanie metylu na 24 h. Po tym procesie przejaśniania drzewo tętnic płucnych będzie widoczne; widoczne będą również zatory, ponieważ salicylan metylu nie usuwa hemoglobiny (Rycina 4B,D).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Objawy i patologia modelu PE
Podczas embolizacji u szczurów wystąpiła duszność, a w klatce piersiowej zaobserwowano zwiększone amplitudy ruchów oddechowych. Prawie wszystkie zwierzęta przeżyły epizod zatorowości płucnej, gdy podano mniej niż 10 cm skrzeplin krwi (14 z 15 zwierząt modelowych). Po powrocie do klatek zwierzęta zwijały się w kątach i wykazywały zmniejszone zainteresowanie pokarmem i wodą. Objawy te ustępowały jednak szybko i w ciągu kilku godzin zwierzęta zachowywały się normalnie. Nie s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu udało się ustalić minimalnie inwazyjny szczurzy model PE przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Po opanowaniu tej procedury modelowania można ją wykonać w ciągu 30 minut. Model skutecznie oddaje kluczowe cechy klinicznego PE, potwierdzone badaniami patomorfologicznymi. W związku z tym stanowi cenne narzędzie do wyjaśniania zmian hemodynamicznych i patogenezy powikłań po zatorowości płucnej, opracowywania nowych biomarkerów diagnostycznych i celów terapeutycznych oraz testowania nowych metod leczenia zakr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie jest wspierane przez grant Fundacji Medycznej Wu Jieping (320.6750.19089-36).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Waga analityczna | METTLER TOLEDO | MA55/A | Brak |
| Igła dozująca | Elektronika Jinrong | Brak | 19 G i 18 G |
| Cienkie nożyczki | Mocniejsze | XGJ1300 | Brak Sól |
| sodowa heparyny | Solarbio | 01-08-9041 | 140U/mg |
| Izofluran | RWD | R510-22-10 | Brak |
| Salicylan metylu | Macklin | M813577 | AR, 99% |
| Mikrozacisk | JZ | W40160 | Brak Mikro |
| pęseta | Mocniejszy | XGN1310 | Brak |
| Silikonowa masa odlewnicza | Flow Tech | MV-130 | Brak |
| Szczury Sprague-Dawley | Vital River | SD-IGS | Brak |
| Mikroskop stereoskopowy | Murzider | MSD204 | Brak |
Bibliografia
- Götzinger, F., et al. Interventional therapies for pulmonary embolism. Nat Rev Cardiol. 20 (10), 670-684 (2023).
- Falster, C., et al. Comparison of international guideline recommendations for the diagnosis of pulmonary embolism. Lancet Haematol. 10 (11), e922-e935 (2023).
- Konstantinides, S. V., et al. ESC guidelines for the diagnosis and management of acute pulmonary embolism developed in collaboration with the European Respiratory Society (ERS). Eur Heart J. 41 (4), 543-603 (2020).
- Domínguez-Oliva, A., et al. The importance of animal models in biomedical research: Current insights and applications. Animals (Basel). 13 (7), 1223(2023).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: A review. Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).
- Tang, Z., et al. Gene expression profiling of pulmonary artery in a rabbit model of pulmonary thromboembolism. PLoS One. 11 (10), e0164530(2016).
- Deng, C., et al. Expression of tissue factor and forkhead box transcription factor o-1 in a rat model for chronic thromboembolic pulmonary hypertension. J Thromb Thrombolysis. 42 (4), 520-528 (2016).
- Runyon, M. S., Gellar, M. A., Sanapareddy, N., Kline, J. A., Watts, J. A. Development and comparison of a minimally-invasive model of autologous clot pulmonary embolism in Sprague-Dawley and Copenhagen rats. Thromb J. 8, 3(2010).
- Li, S. Q., et al. Comparative proteomic study of acute pulmonary embolism in a rat model. Proteomics. 7 (13), 2287-2299 (2007).
- Deng, C., et al. Role of FOXO1 and apoptosis in pulmonary vascular remolding in a rat model of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Sci Rep. 7 (1), 2270(2017).
- Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
- Karpov, A. A., Vaulina, D. D., Smirnov, S. S., Moiseeva, O. M., Galagudza, M. M. Rodent models of pulmonary embolism and chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Heliyon. 8 (3), e09014(2022).
- Picazo, M. G., Benito, P. J., García-Olmo, D. C. Efficiency and safety of a technique for drawing blood from the hamster cranial vena cava. Lab Anim (NY). 38 (6), 211-216 (2009).
- Szabó, K. The cranial venous system in the rat: Anatomical pattern and ontogenetic development. Ii. Dorsal drainage. Ann Anat. 177 (4), 313-322 (1995).
- Li, C. Y., et al. The effects and mechanism of ginsenoside rg1 on myocardial remodeling in an animal model of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Eur J Med Res. 18 (1), 16(2013).
- Sullivan, D. M., Watts, J. A., Kline, J. A. Biventricular cardiac dysfunction after acute massive pulmonary embolism in the rat. J Appl Physiol (1985). 90 (5), 1648-1656 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
