Izolacja, oczyszczanie i identyfikacja Bacillus licheniformis wytwarzających bacytracynę ze świeżych odchodów zdrowych świń

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza kompletny i wyczerpujący opis szczegółowego procesu izolacji, oczyszczania i identyfikacji Bacillus licheniformis wytwarzających bacytracynę ze zdrowych odchodów świń.

Streszczenie

Bacillus licheniformis i bacytracyna mają ogromny rynek zastosowań i wartość w dziedzinach medycyny, chemii, akwakultury, rolnictwa i produktów ubocznych. Dlatego wybór B. licheniformis o wysokiej produkcji bacytracyny ma ogromne znaczenie. W tym protokole eksperymentalnym Bacillus z wysoką wydajnością bacytracyny został wyizolowany, oczyszczony i zidentyfikowany ze świeżych odchodów zdrowych świń. Badano również hamujący wpływ wtórnego metabolitu bacytracyny na Micrococcus luteus. Chromatografię cienkowarstwową i wysokosprawną chromatografię cieczową zastosowano do jakościowego i ilościowego wykrywania bacytracyny. Fizjologiczne i biochemiczne cechy B. licheniformis określono za pomocą odpowiednich zestawów. Powiązania filogenetyczne B. licheniformis określono i skonstruowano za pomocą detekcji sekwencji genów. Protokół ten opisuje i wprowadza standardowy proces izolacji, oczyszczania i identyfikacji B. licheniformis ze świeżych odchodów zwierzęcych z wielu perspektyw, zapewniając metodę wykorzystania B. licheniformis i bacytracyny na dużą skalę w fabrykach.

Wprowadzenie

Bacillus licheniformis to gatunek Bacillus z rodziny Firmicutes, który jest szeroko rozpowszechniony w różnych środowiskach, takich jak woda, gleba i jelita zwierząt¹. B. licheniformis ma krótką i grubą strukturę przypominającą pręt i porusza się indywidualnie². Kolonia jest prawie okrągła i matowa, z centralnym wybrzuszeniem i zgrabnymi krawędziami szarobiałego³. Ma silną zdolność wzrostu i reprodukcji oraz może wchłaniać i wykorzystywać składniki odżywcze z różnych źródeł węgla, takich jak cukrów prostych, polisacharydów, ketozy i kwasy organiczne⁴. W późniejszej fazie wzrostu i rozwoju B. licheniformis może istnieć w postaci uśpionych zarodników i wytwarzać substancje przeciwbakteryjne, takie jak bacytracyna, lichenysyna i surfaktyna. Może również wytrzymać niedobory żywieniowe i ekstremalne środowisko zewnętrzne⁵. Nie ma oczywistej preferencji kodonów, a wydajny system wydzielania determinuje wydzielanie heterologicznych białek B. licheniformis, które jest dwukrotnie większe niż w przypadku Bacillus subtilis⁶. Jest często używany do produkcji preparatów enzymatycznych, takich jak proteaza, amylaza i celulaza⁷. Ze względu na brak endogennych toksyn jest certyfikowany jako szczep bezpieczny dla żywności i wymieniony na liście QPS przez EFSA⁸. W związku z tym istnieje kilka potencjalnych zastosowań, w tym produkcja związków bioaktywnych, które mają szeroki zakres zastosowań w akwakulturze, rolnictwie, żywności, biomedycynie i przemyśle farmaceutycznym. Ponadto B. licheniformis jest ważnym składnikiem flory jelitowej zwierząt, który może sprzyjać zwierzętom w poprawie wydajności produkcyjnej, poprawie równowagi flory jelitowej i zapobieganiu chorobom. Cały genom B. licheniformis ATCC14580 został przeanalizowany w 2004 roku, a podstawowe informacje na temat translacji transkrypcji, fałdowania białek i mechanizmu wydzielania zostały stopniowo zrozumiane⁹. Ta informacja genetyczna sprzyja modyfikacji genetycznej na poziomie molekularnym, przyczyniając się do ułatwienia produkcji B. licheniformis na dużą skalę.

Bacytracyna to dwunastocykliczny antybiotyk peptydowy wytwarzany przez nierybosomalną syntetazę peptydową przez wtórny metabolizm u B. subtilis i B. licheniformis. Bacytracyna to mieszanina złożona z różnych składników, takich jak bacytracyna A, B i C, w której jeden lub dwa aminokwasy różnią się między każdym składnikiem; wśród nich bacytracyna A ma najsilniejszą aktywność biologiczną¹⁰. Bacytracyna może hamować bakterie Gram-dodatnie, takie jak Staphylococcus i Micrococcus luteus oraz niektóre bakterie Gram-ujemne poprzez hamowanie tworzenia ściany komórkowej i interakcję z białkami wiążącymi błonę¹¹. Tymczasem bacytracyna jest bezpieczna i stabilna, niełatwa do wytworzenia oporności na leki i może być kompatybilna z innymi lekami przeciwbakteryjnymi¹². Dlatego bacytracyna jest stosowana w praktyce medycznej i weterynaryjnej. Ponadto, ze względu na szybki stopień eliminacji i niski współczynnik wchłaniania, może być również stosowany jako dodatek do pasz dla zwierząt¹³.

B. licheniformis może kolonizować jelito i poprawiać mikrośrodowisko przewodu pokarmowego. Zdolność adhezyjna i reprodukcyjna oraz związane z nimi funkcje fizjologiczne Bacillus z różnych źródeł w przewodzie pokarmowym różnych zwierząt są różne. B. licheniformis pochodzący od świń bardziej sprzyja kolonizacji w jelitach świń i innych zwierząt gospodarskich. Istnieje ścisły związek między względną obfitością probiotyków jelitowych a statusem zdrowotnym host¹⁴. Suplementacja diety mieszanką B. licheniformis u prosiąt odsadzonych od maciory poprawia ekosystem jelitowy poprzez zmianę składu mikrobioty i aktywności metabolicznej, a także wpływa na błonę śluzową jelit¹⁵. Kał zwierzęcy może odzwierciedlać rodzaj i ilość flory jelitowej zwierząt. Protokół ten opisuje izolację i oczyszczanie Bacillus spp. wytwarzających bacytracynę ze zdrowych odchodów świń. Kał pochodzi od loch Taihu, które nie są karmione mieszankami paszowymi i mają doskonałą wydajność produkcyjną na fermach trzody chlewnej. Izolaty zostały zidentyfikowane jako B. licheniformis na podstawie ich cech morfologicznych, właściwości fizykochemicznych i identyfikacji biochemicznej.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały udokumentowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Technicznego w Nankinie. Kał pochodził od loch Taihu w wieku około 2 lat (patrz tabela materiałów), które były hodowane na profesjonalnych i standardowych fermach trzody chlewnej.

1. Przygotowanie mediów

1. Płynna pożywka Luria-Bertani (LB): Do stożkowej butelki dodać 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego w proszku i 10 g tryptonu, do 1 l dodać wodę destylowaną, wymieszać i rozpuścić szklaną pałeczką. Przenieś 100 ml podłoża do stożkowej butelki o pojemności 500 ml i mocno zawiąż ją oddychającą folią uszczelniającą. Sterylizować w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 20 minut (patrz tabela materiałów).
2. LB stałe podłoże: Dodać 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego w proszku, 10 g tryptonu, 20 g agaru w proszku do stożkowej butelki, dodać wodę destylowaną do 1 l, rozpuścić szklaną pałeczką i mocno zawiązać oddychającą folią uszczelniającą. Sterylizować w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 20 min. Gdy pożywka zostanie schłodzona do temperatury 50 °C, wlej 20 ml pożywki na szalki Petriego, pozwól im ostygnąć, a następnie przechowuj je do góry nogami.
3. Pożywka fermentacyjna bacytracyny: Dodać 8 g śruty sojowej, 4 g skrobi rozpuszczalnej, 0,1 g (NH₄)₂SO₄, 0,6 g CaCO₃ i 100 ml wody destylowanej do stożkowej butelki o pojemności 500 ml, wymieszać szklaną pałeczką do całkowitego rozpuszczenia i mocno zawiązać oddychającą folią uszczelniającą. Sterylizować w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 20 minut (patrz tabela materiałów).
4. Zawiesina M. luteus: Wybierz pierścień M. luteus i zaszczepij na płytce hodowlanej LB, przygotowanej w kroku 1.2 (patrz Tabela materiałów). Hodowla w inkubatorze o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C przez 16 godzin (patrz tabela materiałów). Dodaj 5 ml soli fizjologicznej do płytki i delikatnie wstrząśnij, aby wymyć kolonie. Zmierz OD600 i rozcieńczyć roztwór w probówce, aby uzyskać zawiesinę z OD600 0,3-0,7. Zawiesinę M. luteus należy przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
5. Pożywka do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej: Dodać 1 ml zawiesiny M. luteus, przygotowanej w kroku 1.4, do 100 ml płynnego podłoża stałego LB przygotowanego w kroku 1.2 i lekko wstrząsnąć. Natychmiast weź 5 ml tego roztworu zawierającego M. luteus i rozprowadź go równomiernie na płytce hodowlanej LB.

2. Izolacja i oczyszczanie Bacillus ze świeżych odchodów zdrowych świń

1. Dodać 9 ml soli fizjologicznej i 1,0 g świeżych odchodów świńskich do kolby Erlenmeyera o pojemności 150 ml. Mieszać mieszadłem magnetycznym (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przy 60 obr./min przez 15 minut.
2. Umieść ekstrakt kałowy w łaźni wodnej termostatycznej o temperaturze 80 °C (patrz tabela materiałów) na 20 minut, aby zabić bakterie niewytwarzające przetrwalników.
3. Dodać zawiesinę do 100 ml płynnego podłoża LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i wyhodować w wytrząsarce (patrz tabela materiałów) przy 180 obr./min w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
4. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie wyhodowanego roztworu bakteryjnego zwykłą solą fizjologiczną od ^10-1 do ^10-8. Nałóż 0,1 ml rozcieńczalnika bakteryjnego ^10-6, ^10-7 i ^10-8 na poszczególne płytki hodowlane LB i pozostaw do wyschnięcia. Po 10 minutach umieścić płytki do góry nogami w inkubatorze o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C na 48 godzin.
5. Użyj pierścienia zaszczepiającego, aby wybrać kolonie, które wyglądają podobnie do B. licheniformis (kremowo-biały kolor, miękka konsystencja, śluzowaty wygląd, wypukłe i płaskie wzniesienie oraz nieregularny kształt)¹⁶i rozprowadź je za pomocą zygzakowatego wzoru na pożywce do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej przygotowanej w kroku 1.5 (patrz Rysunek 1).
6. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 48 godzin i obserwować, czy wokół kolonii znajduje się strefa inhibicji.

3. Badania przesiewowe pod kątem zahamowania aktywności M. luteus

1. Wybierz pojedynczą kolonię, która wytworzyła strefę hamującą i dodaj do 100 ml płynnego podłoża LB, hoduj w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 180 obr./min przez 12 godzin.
2. Wprowadzić 5 ml pożywki do pożywki fermentacyjnej bacytracyny przygotowanej w kroku 1.3 i hodować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
3. Zebrać bulion fermentacyjny do probówki wirówkowej i odwirować w temperaturze 13 400 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, a następnie przefiltrować za pomocą mikroporowatej membrany filtracyjnej 0,22 μm (patrz tabela materiałów).
4. Dodać kubek Oxford do świeżej płytki z podłożem do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej, a następnie dodać 50 μl filtratu (supernatantu fermentacyjnego) do kubka Oxford (patrz tabela materiałów). Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Po inkubacji zmierzyć średnicę strefy hamującej suwmiarką z noniuszem (patrz tabela materiałów).
5. Do kolejnych doświadczeń należy wybrać szczepy i odpowiadający im supernatant fermentacyjny o średnicy strefy hamującej większej niż 15 mm.

4. Identyfikacja bacytracyny metodą chromatografii cienkowarstwowej

1. Dodać 60 mg wzorca bacytracyny i rozpuścić w 1% EDTA-2Na (patrz tabela materiałów) w butelce miarowej o pojemności 10 ml, aby uzyskać roztwór bacytracyny o stężeniu 6,0 mg/ml.
2. Rozcieńczyć 1 ml supernatantu fermentacyjnego do 10 ml 1% EDTA-2Na. Umieścić 5 μl próbki i 5 μl roztworu wzorcowego bacytracyny na płytce cienkowarstwowej z aktywowanego żelu krzemionkowego (patrz tabela materiałów).
3. Dodać 100 ml kwasu n-butanolo-octowego-wody-pirydyny-etanolu (60:15:10:6:5) do komory chromatograficznej (patrz tabela materiałów). Umieścić cienkowarstwową płytkę żelu krzemionkowego w zbiorniku chromatograficznym. Przykryj i odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
4. Wyjąć płytkę cienkowarstwową z żelu krzemionkowego, rozpylić roztwór butanolu i pirydyny (99:1) zawierający 1% ninhydryny (patrz Tabela Materiałów) i podgrzewać w temperaturze 105 °C przez 5 minut, aż pojawią się brązowawo-czerwone plamy. Obliczyć R_f (wartość współczynnika retencji) dla wzorca i próbki zgodnie z następującym wzorem:
   R_f = Odległość przesuwu punktowego/Odległość podróży rozpuszczalnika.

5. Wykrywanie bacytracyny przez HPLC

1. Dodać 0,3 ml supernatantu fermentacyjnego i 1,2 ml 50% etanolu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, wstrząsać ręcznie przez 5 minut i odstawić w temperaturze 4 °C na 12 godzin.
2. Wirować przy 13 400 x g przez 15 minut i przefiltrować do butelki na próbkę oznaczonej jako S1 z mikroporowatą membraną filtracyjną 0,22 μm (patrz tabela materiałów).
3. Przygotowanie roztworu matki bacytracyny: Dodać 0,4 g wzorca bacytracyny (60 j./mg; patrz tabela materiałów), 100 ml 40 g/l EDTA-2Na (patrz tabela materiałów) do kolby miarowej o pojemności 100 ml w celu przygotowania 240 j./ml roztworu macierzystego bacytracyny.
4. Dodaj 3 ml roztworu matki bacytracyny i 21, 9, 3, 1 i 0 ml ultraczystej wody do probówek oznaczonych odpowiednio A1, B1, C1, D1 i E1. Po filtracji za pomocą mikroporowatej membrany filtracyjnej 0,22 μm należy umieścić filtrat w butelkach na próbki oznaczonych A2, B2, C2, D2 i E2.
   UWAGA: Stężenia roztworu wzorcowego bacytracyny wynoszą 30, 60, 120, 180 i 240 U/ml.
5. Umieścić A2, B2, C2, D2, E2 i S1 na tacy testowej przyrządu HPLC. Umieścić 1000 ml 50 mM/l mrówczanu amonu i 1000 ml acetonitrylu w ruchomej tacce fazowej i ustawić je odpowiednio jako fazy ruchome A i B.
   UWAGA: pH mrówczanu amonu należy dostosować do 4,0 za pomocą kwasu mrówkowego.
6. Zainstalować kolumnę HPLC C18 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm) w kierunku wskazanym na kolumnie (patrz Tabela materiałów).
7. Ustawić parametry fazy ruchomej jako 0 min, 77% A i 23% B; 30 min, 70% A i 30% B; 40 min, 60% A i 40% B; 50 min, 60% A i 40% B; 51 min, 77% A i 23% B; 58 min, 77% A i 23% B. Ustawić wielkość próbki na 100 μl; Natężenie przepływu, 1,0 ml/min; Temperatura kolumny, 30 °C.
8. Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić program.

6. Identyfikacja morfologiczna

1. Rozcieńczyć i pokryć szczep najwyższym mianem bacytracyny na płytce hodowlanej LB i wyhodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Wybarwić i obserwować morfologię kolonii, jak opisano poniżej.
2. Dodaj kroplę sterylnej oczyszczonej wody do szkiełka, zbierz niewielką ilość kolonii i dodaj do kropli wody. Rozsmaruj równomiernie, pozwól szkiełku wyschnąć naturalnie, a następnie przymocuj do płomienia.
3. Dodaj fiolet krystaliczny przez 1 minutę, aby zabarwić próbkę, a następnie spłucz wodą z kranu. Dodaj jod na 1 minutę, aby zabarwić próbkę, a następnie spłucz wodą destylowaną.
4. Dodaj 95% alkoholu, potrząśnij szkiełkiem do odbarwienia przez 1 minutę, a następnie spłucz wodą destylowaną.
5. Dodaj szafran na 1 minutę, aby zabarwić próbkę, a następnie spłucz wodą destylowaną. Pozostaw szkiełko do naturalnego wyschnięcia i obserwuj morfologię kolonii pod mikroskopem z zanurzeniem w oleju (patrz tabela materiałów).

7. Identyfikacja fizjologiczna i biochemiczna

1. Dodaj 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki i zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki do sterylnego roztworu soli fizjologicznej za pomocą pierścienia zaszczepiającego w celu uzyskania zawiesiny bakteryjnej.
2. Dodaj 100 μl zawiesiny bakteryjnej do każdego otworu w celu zmierzenia V-P, cytrynianu, żelatyny, 7% chlorku sodu, pH 5,7, redukcji azotanów i hydrolizy skrobi na biochemicznym pasku identyfikacyjnym Bacillus (patrz tabela materiałów).
3. Użyj pierścienia inokulacyjnego, aby wybrać kolejną pojedynczą kolonię i ułóż je w zygzakowaty wzór na biochemicznej probówce wzrostu beztlenowego biochemicznego paska identyfikacyjnego Bacillus.
4. Użyj pierścienia inokulacyjnego, aby wybrać inne kolonie i nakłuć je pionowo w porach w celu identyfikacji propionianu, D-ksylozy, L-arabinozy i D-mannitolu na biochemicznym pasku identyfikacyjnym Bacillus.

8. Określenie sekwencji genów szczepu

1. Ekstrahować DNA szczepu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA bakterii (patrz tabela materiałów): Dodać 2 ml płynu nasiennego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 5 ml i odwirować przy 11 500 x g przez 1 min. Odrzucić supernatant i dodać 110 μl buforu (zawierającego 20 mM Tris, pH 8,0; 2 mM Na_2-EDTA, i 1,2% Triton) i 70 μl roztworu lizozymu o stężeniu 50 mg/ml do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
2. Dodaj 4 μl 100 mg/ml RNazy A na 15 s i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 20 μl roztworu proteinazy K i dobrze wymieszać.
3. Dodać 220 μl buforu GB, wstrząsać przez 15 s, aż osad się zawiesi, umieścić w temperaturze 70 °C na 10 minut, aby roztwór był klarowny, i wykonać krótkie wirowanie, aby usunąć kulki wodne ze ścianki probówki.
4. Dodać 220 μl bezwodnego etanolu, wstrząsnąć całkowicie przez 15 s, krótka separacja. Przenieść roztwór i wytrącić flokulację do kolumny adsorpcyjnej CB3 probówki zbiorczej, odwirować przy 13 400 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
5. Dodać 500 μl buforu GD do kolumny adsorpcyjnej, wirować przez 30 s przy 13 400 x g i odrzucić supernatant. Dodać 600 μl PW do kolumny, wirować przez 30 s przy 13 400 x g i odrzucić supernatant.
6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną z powrotem w probówce zbiorczej, odwirować przez 2 minuty przy 13 400 x g i wyrzucić supernatant.
7. Umieść kolumnę adsorpcyjną w temperaturze pokojowej na 10 minut do wyschnięcia. Przenieść kolumnę do probówki wirówkowej i dodać 100 μl buforu eluującego TE do środka membrany adsorpcyjnej.
8. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby zebrać przepływ do probówki wirówkowej i wirować przez 2 minuty przy 13 400 x g.
9. Dodać 25 μl 2x mieszanki wzorcowej (patrz tabela materiałów), 2,5 μl próbki DNA otrzymanej w kroku 8.8, 2 μl startera 27F do przodu, 2 μl startera odwrotnego 1492R i 18,5 μl podwójnie destylowanego H₂O do probówki PCR o pojemności 0,1 ml.
   UWAGA: Sekwencje genów starterów to 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' i 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Umieścić probówkę do PCR w maszynie do PCR (patrz Tabela Materiałów) w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, denaturacja w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 90 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 minut. Uruchomić denaturację, wyżarzanie i wydłużenie trzystopniowego cyklu dla 32x.
11. Pobrać 5 μl produktu i przeprowadzić elektroforezę z 1% żelem agarozowym przy napięciu 120 V przez 30 min.
    1. Rozpuścić 500 mg agarozy w 50 ml 1x buforu TAE. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez 1-2 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Dodać 5 μl barwnika barwiącego DNA, a następnie wlać do tacki na żel i włożyć kryzę. Odstawić w temperaturze pokojowej na 30 minut, aż stwardnieje; włóż żel do zbiornika do elektroforezy i dodaj 1x bufor TAE, aby zanurzyć żel. Dodać 2 μl drabinki DNA o wielkości 2 kb (10 mg/μl) do pierwszego dołka i 5 μl produktu PCR zmieszanego z 1 μl barwnika ładującego do pozostałych studzienek w żelu.
12. Umieść żel w systemie obrazowania żelu i zrób zdjęcie. Szybko przetnij paski DNA w świetle ultrafioletowym i zważ.
13. Dodaj paski do probówki mikrowirówkowej i dodaj równą objętość roztworu PN. Przechowywać probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C aż do całkowitego rozpuszczenia żelu.
14. Dodać 500 μl cieczy równowagi BL do kolumny adsorpcyjnej CA2, odwirować przy 13 400 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant.
15. Dodać rozpuszczony roztwór żelu do kolumny adsorpcyjnej CA2 i umieścić go w temperaturze pokojowej na 2 minuty, odwirować przy 13 400 x g przez 30 s i wyrzucić supernatant.
16. Dodać 600 μl PW do kolumny adsorpcyjnej CA2, odwirować przy 13 400 x g przez 1 min, odrzucić supernatant i powtórzyć 1x.
17. Umieścić kolumnę adsorpcyjną CA2 w probówce zbiorczej, odwirować przy 13 400 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
18. Umieść kolumnę adsorpcyjną CA2 w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby dokładnie wyschła, a następnie umieść ją w czystej probówce wirówkowej.
19. Dodać 50 μl buforu eluującego EB do folii adsorpcyjnej zawieszonej w temperaturze pokojowej na 2 minuty i zebrać roztwór DNA przez odwirowanie w temperaturze 13 400 x g przez 2 min.
    UWAGA: Wyżej wymienione roztwory lub odczynniki znajdują się w zestawie oczyszczającym (patrz tabela materiałów).
    1. Wyślij pobrany roztwór DNA do profesjonalnej firmy zajmującej się sekwencjonowaniem (patrz Tabela materiałów) w celu sekwencjonowania. Porównaj wyniki sekwencjonowania przez Blast w bazie danych GenBank NCBI. Zgodnie z homologią sekwencji, wybierz różne szczepy i skonstruuj drzewa filogenetyczne metodą maksymalnego prawdopodobieństwa w MEGA-X, aby określić pokrewieństwo gatunkowe szczepów.

Wyniki

W tym eksperymencie wyizolowano 48 szczepów Bacillus ze świeżych odchodów zdrowych świń, ponumerowanych od 1001 do 1048. Wśród nich 15 szczepów wykazywało działanie przeciwbakteryjne przeciwko M. luteus. Spośród 15 szczepów miana bacytracyny mierzono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, jak pokazano w Tabeli 1. Wśród nich B. licheniformis nr 1026 miał najwyższe miano bacytracyny, 456,35 ± 21,75 U/ml, dlatego do kolejnych eksperymentów wybrano nr 1026.

Wyniki identyfikacji przez TLC są pokazane w Rysunek 2A. Położenie głównych plamek w bulionie fermentacyjnym szczepu nr 1026 i roztworu wzorcowego bacytracyny było takie samo, a wartość R_f wynosiła 0,61. Dla analizy HPLC równanie krzywej standardowej bacytracyny wynosi y = 50,287x - 250,55, a współczynnik korelacji R² = 0,9968 (Rysunek 2B). Szczytowy czas fermentacji supernatantu był zgodny ze standardem bacytracyny (Rysunek 2C), więc substancja bakteriostatyczna została zidentyfikowana jako bacytracyna, a miano bacytracyny wynosiło 456,35 ± 21,75 U/ml.

Kolonia szczepu nr 1026 była hodowana na pożywce LB przez 12 godzin, jak pokazano w Rysunek 3A. Kolonia była okrągła i przezroczysta w kształcie kropelek wody, z pełnymi wypukłościami i zgrabnymi krawędziami. Od 12 h do 24 h bakterie weszły w późniejsze etapy wzrostu. Jak pokazano w Rysunek 3B, kolonie rozprzestrzeniają się w kształcie śliwki, środek jest pofałdowany, a kolor stopniowo pogłębia się do mlecznobiałego. Jest to zgodne z opisem morfologii kolonii B. licheniformis¹⁶. Na brzegu znajdował się przezroczysty śluz. Po barwieniu metodą Grama, szczep nr 1026 został zaobserwowany pod mikroskopem, jak pokazano na Rysunek 3C. Komórki były fioletowymi pręcikami, co wskazuje na bakterie Gram-dodatnie.

Jak pokazano w Tabeli 2, szczep nr 1026 może rosnąć w środowisku beztlenowym. Szczep uzyskał pozytywny wynik testu V-P, wykorzystania cytrynianu, redukcji azotanów i hydrolizy skrobi. Szczep był w stanie rozłożyć się i wykorzystać większość źródeł węgla. Miał takie same cechy fizjologiczne i biochemiczne jak B. licheniformis.

Rozmiar fragmentu 16S rDNA szczepu nr 1026 wynosił około 1400 pz (Rysunek 4A). Wyniki sekwencjonowania szczepu nr 1026 wykazały 99,58% podobieństwo do szczepu B. licheniformis DSM 13 w GenBank. Następnie skonstruowano drzewo filogenetyczne, jak pokazano na rysunku Rysunek 4B. Długość gałęzi ewolucyjnej B. licheniformis DSM 13 wynosi 0,000, co wskazuje, że jest to B. licheniformis.

Na podstawie morfologicznych, fizjologicznych i biochemicznych cech szczepu nr 1026 oraz analizy homologii sekwencji genu 16S rDNA, szczep nr 1026 został zidentyfikowany jako B. licheniformis.

Rysunek 1: Schemat ideowy inokulacji szczepu. Pierścień zaszczepiający został użyty do wybrania kolonii i oznaczenia ich w zygzakowaty wzór na pożywce do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Identyfikacja substancji bakteriostatycznych. (A) Chromatografia cienkowarstwowa. (B) Krzywa wzorcowa HPLC bacytracyny. (C) Chromatogram HPLC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka morfologiczna i barwienie metodą Grama szczepu nr 1026. Morfologia kolonii po (A) 12 h i (B) 24 h. (C) barwienie metodą Grama. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Identyfikacja molekularno-biologiczna szczepu nr 1026. (A) Amplifikacja genu szczepu nr 1026 16S rDNA. (B) Drzewo filogenetyczne szczepu nr 1026. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

TGL

Nie.	Miano bacytracyny (U/ml)	Nie.	Miano bacytracyny (U/ml)
Numer katalogowy 1003	423.57±18.62	Numer katalogowy 1021	317.46±13.46
Numer katalogowy 1004	325.82±13.23	Numer katalogowy 1026	456.35±21.75
Numer katalogowy 1009	326.26±14.52	Numer katalogowy 1027	435.57±19.18
Numer katalogowy 1011	376.65±16.11	Numer katalogowy 1030	382.48±17.64
Numer katalogowy 1015	325.27±12.37	Numer katalogowy 1031	215.37±11.73
Numer katalogowy 1016	256.56±15.37	Numer katalogowy 1039	353.67±16.16
Numer katalogowy 1017	352.47±16.47	Numer katalogowy 1041	342.36±14.36
Numer katalogowy 1018	328.73±16.12

Tabela 1: Miano bacytracyny szczepów o aktywności przeciwbakteryjnej.

Elementy	Wyniki	Elementy	Wyniki
Test wzrostu beztlenowego	+	Test D-mannitolu	+
Test V.P	+	Test na żelatynę	+
Test wykorzystania cytrynianu	+	Test 7% NaCl	+
Test propionianu	+	Test pH 5,7	+
Test D-ksylozy	+	Test redukcji azotanów	+
L-arabinoza	+	Test hydrolizy skrobi	+

Tabela 2: Fizjologiczna i biochemiczna identyfikacja szczepu nr 1026.

Dyskusja

B. licheniformis rośnie szybko przy prostych warunkach hodowli i szybkim zużyciu cukru, a dojrzała technologia fermentacji jest pomocna w obniżaniu kosztów produkcji przemysłowej¹³. Szerokie zastosowanie B. licheniformis i jego wydzielin, bacytracyny, określiło jego obiecującą wartość rynkową. W rolnictwie B. licheniformis jest stosowany jako bionawóz w celu poprawy wzrostu roślin i pobierania składników odżywczych poprzez zwiększenie żyzności gleby, wspomaganie rozwoju korzeni i wspomaganie degradacji materii organicznej¹⁵. Do przemysłowej produkcji enzymów B. licheniformis wytwarza szereg enzymów, takich jak proteazy, amylazy, celulazy i lipazy, co decyduje o jego niezastąpionej wartości rynkowej w przetwórstwie spożywczym, produkcji detergentów, przetwórstwie skóry i przemyśle tekstylnym¹⁶. Ze względu na doskonałą przeciwbakteryjną aktywność farmakologiczną B. licheniformis i bacytracyny, jest on stosowany w medycynie do leczenia różnych chorób zakaźnych wywoływanych przez bakterie i grzyby¹. Tymczasem, biorąc pod uwagę wzrost roślin zielarskich, a także akumulację składników farmakologicznie czynnych w roślinach, B. licheniformis jest potencjalnym wzmacniaczem wzrostu roślin, a także przydatnym do produkcji związków, takich jak salidrozyd pochodzący z różeńca górskiego ^17,18. Powyższe zalety B. licheniformis i bacytracyny sprawiają, że znajdują one szerokie zastosowanie w przemyśle, rolnictwie, akwakulturze, biotechnologii i przemyśle medycznym. Dlatego oddzielenie i oczyszczenie B. licheniformis z wysoką wydajnością bacytracyny jest decydującym czynnikiem zapewniającym późniejszą produkcję i zastosowanie na dużą skalę.

Chociaż bacytracynę można wytworzyć w drodze syntezy chemicznej, etapy te są uciążliwe i istnieje wiele produktów ubocznych. W przemyśle bacytracyna jest wytwarzana głównie w wtórnym procesie metabolicznym mąki kukurydzianej i śruty sojowej fermentowanej przez B. licheniformis. W nowoczesnej przemysłowej produkcji bacytracyny wysoki koszt i niska wydajność utrudniają jej dalsze stosowanie¹⁰. Dlatego badania przesiewowe wysokowydajnych szczepów bacytracyny i poprawa stopnia wykorzystania surowców są kluczem do poprawy produkcji bacytracyny.

Obecnie hodowla wysokowydajnych szczepów bacytracyny odbywa się głównie poprzez naturalną hodowlę z gleby i innych środowisk, hodowlę mutacyjną z wykorzystaniem istniejących szczepów wytwarzających bacytracynę lub hodowlę opartą na inżynierii genetycznej. Naturalna operacja hodowli jest prosta, a przesiewane szczepy mają stabilną zdolność produkcyjną, ale proces ten zajmuje dużo czasu, a obciążenie pracą jest duże. Hodowla mutacyjna charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem mutacji i skraca czas rozrodu, ale mutacja może nie być w stanie być stabilnie dziedziczona w kolejnych pokoleniach¹⁶. Hodowla oparta na inżynierii genetycznej jest bardziej ukierunkowana na uzyskanie szczepów o wysokiej wydajności¹⁰, ale istnieją obawy dotyczące bezpieczeństwa spowodowane wprowadzeniem genów egzogennych. Zdrowe odchody dorosłych zwierząt zawierają obfite zasoby probiotyczne, które mogą utrzymać równowagę flory bakteryjnej.

W niniejszej pracy, w oparciu o charakterystykę B. licheniformis do wytwarzania uśpionych zarodników w ekstremalnych środowiskach¹⁹, rozcieńczenie zdrowych odchodów świń umieszczono w środowisku o wysokiej temperaturze, aby zabić odporne na ciepło bakterie i grzyby niewytwarzające przetrwalników. Ponieważ M. luteus jest wrażliwy na wytwarzanie peptydów bakteriostatycznych przez B. licheniformis w późnym stadium wzrostu i wytwarza żółty pigment ułatwiający obserwację, stosuje się go do badania przesiewowego aktywności przeciwbakteryjnej w oparciu o ocenę strefy hamowania. Zgodnie z morfologią kolonii podobną do morfologii B. licheniformis, morfologia komórki jest krótka w kształcie pręcika, Gram-dodatnie, fizjologiczne i biochemiczne cechy B. licheniformis, 16 s RNA jest ściśle spokrewnione z B. licheniformis, tak aby ustalić, że szczep nr 1026 to B. licheniformis. Substancja bakteriostatyczna została zidentyfikowana za pomocą TLC i HPLC jako bacytracyna. W ten sposób uzyskano B. licheniformis wytwarzający bacytracynę. Ta metoda ma również wady, takie jak proces przesiewowy trwający długo, a operacja wymaga pewnego doświadczenia.

Podsumowując, ten protokół eksperymentalny kompleksowo i szczegółowo przedstawił proces pozyskiwania i rutynowej identyfikacji laboratoryjnej B. licheniformis wytwarzającego bacytracynę, który ma szerokie perspektywy zastosowania i nieocenioną wartość rynkową²⁰. Metody te są proste, wykonalne i łatwe do wdrożenia, a bez wątpienia będą skutecznym punktem odniesienia dla produkcji B. licheniformis na dużą skalę. W artykule przedstawiono również pomysł na badania przesiewowe w kierunku produkcji szczepów dla innych peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 i razy; Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, Chiny	P252-01
2kb Marker DNA	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Chiny	BM121-01
Acetonitryl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A104443
Agar w proszku	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A104062
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	10002917
Sterylizator autoklawu	Zealway Instrument Inc., Xiamen, Chiny	GI36DWS
Biochemiczny pasek identyfikacyjny Bacillus	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Chiny	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	B65740
Zestaw do ekstrakcji DNA bakterii	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, Chiny	DP209
Oddychająca folia uszczelniająca	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	B433378
C18 (5 μ m, 4,6 i razy; 250 mm) Kolumna HPLC	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, Chiny	C1805-462510
Węglan wapnia (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	10005717
Wirówka	New Brunswick Scientific Co., Inc., Wielka Brytania	5452
Zbiornik chromatograficzny	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, Chiny	P-1
Butelka stożkowa	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, Chiny	18012
Inkubator o stałej temperaturze	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, Chiny	GH4500
Fosforan dipotasowy (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, Chiny	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	E397526
Waga elektroniczna	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Alkohol etylowy	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	E130059
Zestaw do oczyszczania żelu Midi	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, Chiny	DP302
Pręt szklany	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	D823520
Zestaw roztworu barwiącego Gram	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Chiny	HB8278
Wysokosprawny chromatograf cieczowy	Agilent Technologies, Inc., Kalifornia, Ameryka	1260
Aparatura	do elektroforezy poziomejBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Chiny	DYCP-31DN BIOMATE
Pierścień inokulacyjny	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	3171026
Mieszadło magnetyczne	Wiggens GmbH Co., Ltd., Niemcy	WH220 PLUS
Alkohol metylowy	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	M116115
Probówka do mikrowirówek	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, Chiny	BNCC102589
Mikroporowata membrana filtracyjna	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	N105629
Mikroskop optyczny	Fabryka przyrządów optycznych, Szanghaj, Chiny	DYS-108
Kał świń	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, Chiny
Wzmacniacz reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, Chiny	ETC811
Profesjonalna firma zajmująca się sekwencjonowaniem	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, Chiny
Pirydyna	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny
	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, Chiny	Płytka
GF254	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, Chiny	HPT-HSGF5025023
Chlorek sodu (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	S805275
Cytrynian sodu	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	C39197100001
Skrobia rozpuszczalna	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	S817547
Termostat kąpieli wodnej	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	DK-8D
Trypton	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, Chiny	GR501-01
Ultra czysty instrument do wody	Merck KGaA Co., Ltd., Niemcy	Milli Myjka ultradźwiękowa Direct-Q8
	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, Chiny	SB-100DT
Suwmiarka z noniuszem	Sanfeng Company, Japonia	N20P
w proszku	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Chiny	LP0021