Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja, oczyszczanie i identyfikacja Bacillus licheniformis wytwarzających bacytracynę ze świeżych odchodów zdrowych świń

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66777

⸱

31 maja 2024

 , 
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza kompletny i wyczerpujący opis szczegółowego procesu izolacji, oczyszczania i identyfikacji Bacillus licheniformis wytwarzających bacytracynę ze zdrowych odchodów świń.

Streszczenie

Bacillus licheniformis i bacytracyna mają ogromny rynek zastosowań i wartość w dziedzinach medycyny, chemii, akwakultury, rolnictwa i produktów ubocznych. Dlatego wybór B. licheniformis o wysokiej produkcji bacytracyny ma ogromne znaczenie. W tym protokole eksperymentalnym Bacillus z wysoką wydajnością bacytracyny został wyizolowany, oczyszczony i zidentyfikowany ze świeżych odchodów zdrowych świń. Badano również hamujący wpływ wtórnego metabolitu bacytracyny na Micrococcus luteus. Chromatografię cienkowarstwową i wysokosprawną chromatografię cieczową zastosowano do jakościowego i ilościowego wykrywania bacytracyny. Fizjologiczne i biochemiczne cechy B. licheniformis określono za pomocą odpowiednich zestawów. Powiązania filogenetyczne B. licheniformis określono i skonstruowano za pomocą detekcji sekwencji genów. Protokół ten opisuje i wprowadza standardowy proces izolacji, oczyszczania i identyfikacji B. licheniformis ze świeżych odchodów zwierzęcych z wielu perspektyw, zapewniając metodę wykorzystania B. licheniformis i bacytracyny na dużą skalę w fabrykach.

Wprowadzenie

Bacillus licheniformis to gatunek Bacillus z rodziny Firmicutes, który jest szeroko rozpowszechniony w różnych środowiskach, takich jak woda, gleba i jelita zwierząt1. B. licheniformis ma krótką i grubą strukturę przypominającą pręt i porusza się indywidualnie2. Kolonia jest prawie okrągła i matowa, z centralnym wybrzuszeniem i zgrabnymi krawędziami szarobiałego3. Ma silną zdolność wzrostu i reprodukcji oraz może wchłaniać i wykorzystywać składniki odżywcze z różnych źródeł węgla, takich jak cukrów prostych, polisacharydów, ketozy i kwasy organiczne4. W późniejszej fazie wzrostu i rozwoju B. licheniformis może istnieć w postaci uśpionych zarodników i wytwarzać substancje przeciwbakteryjne, takie jak bacytracyna, lichenysyna i surfaktyna. Może również wytrzymać niedobory żywieniowe i ekstremalne środowisko zewnętrzne5. Nie ma oczywistej preferencji kodonów, a wydajny system wydzielania determinuje wydzielanie heterologicznych białek B. licheniformis, które jest dwukrotnie większe niż w przypadku Bacillus subtilis6. Jest często używany do produkcji preparatów enzymatycznych, takich jak proteaza, amylaza i celulaza7. Ze względu na brak endogennych toksyn jest certyfikowany jako szczep bezpieczny dla żywności i wymieniony na liście QPS przez EFSA8. W związku z tym istnieje kilka potencjalnych zastosowań, w tym produkcja związków bioaktywnych, które mają szeroki zakres zastosowań w akwakulturze, rolnictwie, żywności, biomedycynie i przemyśle farmaceutycznym. Ponadto B. licheniformis jest ważnym składnikiem flory jelitowej zwierząt, który może sprzyjać zwierzętom w poprawie wydajności produkcyjnej, poprawie równowagi flory jelitowej i zapobieganiu chorobom. Cały genom B. licheniformis ATCC14580 został przeanalizowany w 2004 roku, a podstawowe informacje na temat translacji transkrypcji, fałdowania białek i mechanizmu wydzielania zostały stopniowo zrozumiane9. Ta informacja genetyczna sprzyja modyfikacji genetycznej na poziomie molekularnym, przyczyniając się do ułatwienia produkcji B. licheniformis na dużą skalę.

Bacytracyna to dwunastocykliczny antybiotyk peptydowy wytwarzany przez nierybosomalną syntetazę peptydową przez wtórny metabolizm u B. subtilis i B. licheniformis. Bacytracyna to mieszanina złożona z różnych składników, takich jak bacytracyna A, B i C, w której jeden lub dwa aminokwasy różnią się między każdym składnikiem; wśród nich bacytracyna A ma najsilniejszą aktywność biologiczną10. Bacytracyna może hamować bakterie Gram-dodatnie, takie jak Staphylococcus i Micrococcus luteus oraz niektóre bakterie Gram-ujemne poprzez hamowanie tworzenia ściany komórkowej i interakcję z białkami wiążącymi błonę11. Tymczasem bacytracyna jest bezpieczna i stabilna, niełatwa do wytworzenia oporności na leki i może być kompatybilna z innymi lekami przeciwbakteryjnymi12. Dlatego bacytracyna jest stosowana w praktyce medycznej i weterynaryjnej. Ponadto, ze względu na szybki stopień eliminacji i niski współczynnik wchłaniania, może być również stosowany jako dodatek do pasz dla zwierząt13.

B. licheniformis może kolonizować jelito i poprawiać mikrośrodowisko przewodu pokarmowego. Zdolność adhezyjna i reprodukcyjna oraz związane z nimi funkcje fizjologiczne Bacillus z różnych źródeł w przewodzie pokarmowym różnych zwierząt są różne. B. licheniformis pochodzący od świń bardziej sprzyja kolonizacji w jelitach świń i innych zwierząt gospodarskich. Istnieje ścisły związek między względną obfitością probiotyków jelitowych a statusem zdrowotnym host14. Suplementacja diety mieszanką B. licheniformis u prosiąt odsadzonych od maciory poprawia ekosystem jelitowy poprzez zmianę składu mikrobioty i aktywności metabolicznej, a także wpływa na błonę śluzową jelit15. Kał zwierzęcy może odzwierciedlać rodzaj i ilość flory jelitowej zwierząt. Protokół ten opisuje izolację i oczyszczanie Bacillus spp. wytwarzających bacytracynę ze zdrowych odchodów świń. Kał pochodzi od loch Taihu, które nie są karmione mieszankami paszowymi i mają doskonałą wydajność produkcyjną na fermach trzody chlewnej. Izolaty zostały zidentyfikowane jako B. licheniformis na podstawie ich cech morfologicznych, właściwości fizykochemicznych i identyfikacji biochemicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały udokumentowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Technicznego w Nankinie. Kał pochodził od loch Taihu w wieku około 2 lat (patrz tabela materiałów), które były hodowane na profesjonalnych i standardowych fermach trzody chlewnej.

1. Przygotowanie mediów

  1. Płynna pożywka Luria-Bertani (LB): Do stożkowej butelki dodać 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego w proszku i 10 g tryptonu, do 1 l dodać wodę destylowaną, wymieszać i rozpuścić szklaną pałeczką. Przenieś 100 ml podłoża do stożkowej butelki o pojemności 500 ml i mocno zawiąż ją oddychającą folią uszczelniającą. Sterylizować w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 20 minut (patrz tabela materiałów).
  2. LB stałe podłoże: Dodać 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego w proszku, 10 g tryptonu, 20 g agaru w proszku do stożkowej butelki, dodać wodę destylowaną do 1 l, rozpuścić szklaną pałeczką i mocno zawiązać oddychającą folią uszczelniającą. Sterylizować w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 20 min. Gdy pożywka zostanie schłodzona do temperatury 50 °C, wlej 20 ml pożywki na szalki Petriego, pozwól im ostygnąć, a następnie przechowuj je do góry nogami.
  3. Pożywka fermentacyjna bacytracyny: Dodać 8 g śruty sojowej, 4 g skrobi rozpuszczalnej, 0,1 g (NH4)2SO4, 0,6 g CaCO3 i 100 ml wody destylowanej do stożkowej butelki o pojemności 500 ml, wymieszać szklaną pałeczką do całkowitego rozpuszczenia i mocno zawiązać oddychającą folią uszczelniającą. Sterylizować w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 20 minut (patrz tabela materiałów).
  4. Zawiesina M. luteus: Wybierz pierścień M. luteus i zaszczepij na płytce hodowlanej LB, przygotowanej w kroku 1.2 (patrz Tabela materiałów). Hodowla w inkubatorze o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C przez 16 godzin (patrz tabela materiałów). Dodaj 5 ml soli fizjologicznej do płytki i delikatnie wstrząśnij, aby wymyć kolonie. Zmierz OD600 i rozcieńczyć roztwór w probówce, aby uzyskać zawiesinę z OD600 0,3-0,7. Zawiesinę M. luteus należy przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
  5. Pożywka do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej: Dodać 1 ml zawiesiny M. luteus, przygotowanej w kroku 1.4, do 100 ml płynnego podłoża stałego LB przygotowanego w kroku 1.2 i lekko wstrząsnąć. Natychmiast weź 5 ml tego roztworu zawierającego M. luteus i rozprowadź go równomiernie na płytce hodowlanej LB.

2. Izolacja i oczyszczanie Bacillus ze świeżych odchodów zdrowych świń

  1. Dodać 9 ml soli fizjologicznej i 1,0 g świeżych odchodów świńskich do kolby Erlenmeyera o pojemności 150 ml. Mieszać mieszadłem magnetycznym (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przy 60 obr./min przez 15 minut.
  2. Umieść ekstrakt kałowy w łaźni wodnej termostatycznej o temperaturze 80 °C (patrz tabela materiałów) na 20 minut, aby zabić bakterie niewytwarzające przetrwalników.
  3. Dodać zawiesinę do 100 ml płynnego podłoża LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i wyhodować w wytrząsarce (patrz tabela materiałów) przy 180 obr./min w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
  4. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie wyhodowanego roztworu bakteryjnego zwykłą solą fizjologiczną od 10-1 do 10-8. Nałóż 0,1 ml rozcieńczalnika bakteryjnego 10-6, 10-7 i 10-8 na poszczególne płytki hodowlane LB i pozostaw do wyschnięcia. Po 10 minutach umieścić płytki do góry nogami w inkubatorze o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C na 48 godzin.
  5. Użyj pierścienia zaszczepiającego, aby wybrać kolonie, które wyglądają podobnie do B. licheniformis (kremowo-biały kolor, miękka konsystencja, śluzowaty wygląd, wypukłe i płaskie wzniesienie oraz nieregularny kształt)16i rozprowadź je za pomocą zygzakowatego wzoru na pożywce do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej przygotowanej w kroku 1.5 (patrz Rysunek 1).
  6. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 48 godzin i obserwować, czy wokół kolonii znajduje się strefa inhibicji.

3. Badania przesiewowe pod kątem zahamowania aktywności M. luteus

  1. Wybierz pojedynczą kolonię, która wytworzyła strefę hamującą i dodaj do 100 ml płynnego podłoża LB, hoduj w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 180 obr./min przez 12 godzin.
  2. Wprowadzić 5 ml pożywki do pożywki fermentacyjnej bacytracyny przygotowanej w kroku 1.3 i hodować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
  3. Zebrać bulion fermentacyjny do probówki wirówkowej i odwirować w temperaturze 13 400 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, a następnie przefiltrować za pomocą mikroporowatej membrany filtracyjnej 0,22 μm (patrz tabela materiałów).
  4. Dodać kubek Oxford do świeżej płytki z podłożem do oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej, a następnie dodać 50 μl filtratu (supernatantu fermentacyjnego) do kubka Oxford (patrz tabela materiałów). Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Po inkubacji zmierzyć średnicę strefy hamującej suwmiarką z noniuszem (patrz tabela materiałów).
  5. Do kolejnych doświadczeń należy wybrać szczepy i odpowiadający im supernatant fermentacyjny o średnicy strefy hamującej większej niż 15 mm.

4. Identyfikacja bacytracyny metodą chromatografii cienkowarstwowej

  1. Dodać 60 mg wzorca bacytracyny i rozpuścić w 1% EDTA-2Na (patrz tabela materiałów) w butelce miarowej o pojemności 10 ml, aby uzyskać roztwór bacytracyny o stężeniu 6,0 mg/ml.
  2. Rozcieńczyć 1 ml supernatantu fermentacyjnego do 10 ml 1% EDTA-2Na. Umieścić 5 μl próbki i 5 μl roztworu wzorcowego bacytracyny na płytce cienkowarstwowej z aktywowanego żelu krzemionkowego (patrz tabela materiałów).
  3. Dodać 100 ml kwasu n-butanolo-octowego-wody-pirydyny-etanolu (60:15:10:6:5) do komory chromatograficznej (patrz tabela materiałów). Umieścić cienkowarstwową płytkę żelu krzemionkowego w zbiorniku chromatograficznym. Przykryj i odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  4. Wyjąć płytkę cienkowarstwową z żelu krzemionkowego, rozpylić roztwór butanolu i pirydyny (99:1) zawierający 1% ninhydryny (patrz Tabela Materiałów) i podgrzewać w temperaturze 105 °C przez 5 minut, aż pojawią się brązowawo-czerwone plamy. Obliczyć Rf (wartość współczynnika retencji) dla wzorca i próbki zgodnie z następującym wzorem:
    Rf = Odległość przesuwu punktowego/Odległość podróży rozpuszczalnika.

5. Wykrywanie bacytracyny przez HPLC

  1. Dodać 0,3 ml supernatantu fermentacyjnego i 1,2 ml 50% etanolu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, wstrząsać ręcznie przez 5 minut i odstawić w temperaturze 4 °C na 12 godzin.
  2. Wirować przy 13 400 x g przez 15 minut i przefiltrować do butelki na próbkę oznaczonej jako S1 z mikroporowatą membraną filtracyjną 0,22 μm (patrz tabela materiałów).
  3. Przygotowanie roztworu matki bacytracyny: Dodać 0,4 g wzorca bacytracyny (60 j./mg; patrz tabela materiałów), 100 ml 40 g/l EDTA-2Na (patrz tabela materiałów) do kolby miarowej o pojemności 100 ml w celu przygotowania 240 j./ml roztworu macierzystego bacytracyny.
  4. Dodaj 3 ml roztworu matki bacytracyny i 21, 9, 3, 1 i 0 ml ultraczystej wody do probówek oznaczonych odpowiednio A1, B1, C1, D1 i E1. Po filtracji za pomocą mikroporowatej membrany filtracyjnej 0,22 μm należy umieścić filtrat w butelkach na próbki oznaczonych A2, B2, C2, D2 i E2.
    UWAGA: Stężenia roztworu wzorcowego bacytracyny wynoszą 30, 60, 120, 180 i 240 U/ml.
  5. Umieścić A2, B2, C2, D2, E2 i S1 na tacy testowej przyrządu HPLC. Umieścić 1000 ml 50 mM/l mrówczanu amonu i 1000 ml acetonitrylu w ruchomej tacce fazowej i ustawić je odpowiednio jako fazy ruchome A i B.
    UWAGA: pH mrówczanu amonu należy dostosować do 4,0 za pomocą kwasu mrówkowego.
  6. Zainstalować kolumnę HPLC C18 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm) w kierunku wskazanym na kolumnie (patrz Tabela materiałów).
  7. Ustawić parametry fazy ruchomej jako 0 min, 77% A i 23% B; 30 min, 70% A i 30% B; 40 min, 60% A i 40% B; 50 min, 60% A i 40% B; 51 min, 77% A i 23% B; 58 min, 77% A i 23% B. Ustawić wielkość próbki na 100 μl; Natężenie przepływu, 1,0 ml/min; Temperatura kolumny, 30 °C.
  8. Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić program.

6. Identyfikacja morfologiczna

  1. Rozcieńczyć i pokryć szczep najwyższym mianem bacytracyny na płytce hodowlanej LB i wyhodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Wybarwić i obserwować morfologię kolonii, jak opisano poniżej.
  2. Dodaj kroplę sterylnej oczyszczonej wody do szkiełka, zbierz niewielką ilość kolonii i dodaj do kropli wody. Rozsmaruj równomiernie, pozwól szkiełku wyschnąć naturalnie, a następnie przymocuj do płomienia.
  3. Dodaj fiolet krystaliczny przez 1 minutę, aby zabarwić próbkę, a następnie spłucz wodą z kranu. Dodaj jod na 1 minutę, aby zabarwić próbkę, a następnie spłucz wodą destylowaną.
  4. Dodaj 95% alkoholu, potrząśnij szkiełkiem do odbarwienia przez 1 minutę, a następnie spłucz wodą destylowaną.
  5. Dodaj szafran na 1 minutę, aby zabarwić próbkę, a następnie spłucz wodą destylowaną. Pozostaw szkiełko do naturalnego wyschnięcia i obserwuj morfologię kolonii pod mikroskopem z zanurzeniem w oleju (patrz tabela materiałów).

7. Identyfikacja fizjologiczna i biochemiczna

  1. Dodaj 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki i zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki do sterylnego roztworu soli fizjologicznej za pomocą pierścienia zaszczepiającego w celu uzyskania zawiesiny bakteryjnej.
  2. Dodaj 100 μl zawiesiny bakteryjnej do każdego otworu w celu zmierzenia V-P, cytrynianu, żelatyny, 7% chlorku sodu, pH 5,7, redukcji azotanów i hydrolizy skrobi na biochemicznym pasku identyfikacyjnym Bacillus (patrz tabela materiałów).
  3. Użyj pierścienia inokulacyjnego, aby wybrać kolejną pojedynczą kolonię i ułóż je w zygzakowaty wzór na biochemicznej probówce wzrostu beztlenowego biochemicznego paska identyfikacyjnego Bacillus.
  4. Użyj pierścienia inokulacyjnego, aby wybrać inne kolonie i nakłuć je pionowo w porach w celu identyfikacji propionianu, D-ksylozy, L-arabinozy i D-mannitolu na biochemicznym pasku identyfikacyjnym Bacillus.

8. Określenie sekwencji genów szczepu

  1. Ekstrahować DNA szczepu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA bakterii (patrz tabela materiałów): Dodać 2 ml płynu nasiennego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 5 ml i odwirować przy 11 500 x g przez 1 min. Odrzucić supernatant i dodać 110 μl buforu (zawierającego 20 mM Tris, pH 8,0; 2 mM Na2-EDTA, i 1,2% Triton) i 70 μl roztworu lizozymu o stężeniu 50 mg/ml do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Dodaj 4 μl 100 mg/ml RNazy A na 15 s i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 20 μl roztworu proteinazy K i dobrze wymieszać.
  3. Dodać 220 μl buforu GB, wstrząsać przez 15 s, aż osad się zawiesi, umieścić w temperaturze 70 °C na 10 minut, aby roztwór był klarowny, i wykonać krótkie wirowanie, aby usunąć kulki wodne ze ścianki probówki.
  4. Dodać 220 μl bezwodnego etanolu, wstrząsnąć całkowicie przez 15 s, krótka separacja. Przenieść roztwór i wytrącić flokulację do kolumny adsorpcyjnej CB3 probówki zbiorczej, odwirować przy 13 400 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
  5. Dodać 500 μl buforu GD do kolumny adsorpcyjnej, wirować przez 30 s przy 13 400 x g i odrzucić supernatant. Dodać 600 μl PW do kolumny, wirować przez 30 s przy 13 400 x g i odrzucić supernatant.
  6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną z powrotem w probówce zbiorczej, odwirować przez 2 minuty przy 13 400 x g i wyrzucić supernatant.
  7. Umieść kolumnę adsorpcyjną w temperaturze pokojowej na 10 minut do wyschnięcia. Przenieść kolumnę do probówki wirówkowej i dodać 100 μl buforu eluującego TE do środka membrany adsorpcyjnej.
  8. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby zebrać przepływ do probówki wirówkowej i wirować przez 2 minuty przy 13 400 x g.
  9. Dodać 25 μl 2x mieszanki wzorcowej (patrz tabela materiałów), 2,5 μl próbki DNA otrzymanej w kroku 8.8, 2 μl startera 27F do przodu, 2 μl startera odwrotnego 1492R i 18,5 μl podwójnie destylowanego H2O do probówki PCR o pojemności 0,1 ml.
    UWAGA: Sekwencje genów starterów to 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' i 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. Umieścić probówkę do PCR w maszynie do PCR (patrz Tabela Materiałów) w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, denaturacja w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 90 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 minut. Uruchomić denaturację, wyżarzanie i wydłużenie trzystopniowego cyklu dla 32x.
  11. Pobrać 5 μl produktu i przeprowadzić elektroforezę z 1% żelem agarozowym przy napięciu 120 V przez 30 min.
    1. Rozpuścić 500 mg agarozy w 50 ml 1x buforu TAE. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez 1-2 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Dodać 5 μl barwnika barwiącego DNA, a następnie wlać do tacki na żel i włożyć kryzę. Odstawić w temperaturze pokojowej na 30 minut, aż stwardnieje; włóż żel do zbiornika do elektroforezy i dodaj 1x bufor TAE, aby zanurzyć żel. Dodać 2 μl drabinki DNA o wielkości 2 kb (10 mg/μl) do pierwszego dołka i 5 μl produktu PCR zmieszanego z 1 μl barwnika ładującego do pozostałych studzienek w żelu.
  12. Umieść żel w systemie obrazowania żelu i zrób zdjęcie. Szybko przetnij paski DNA w świetle ultrafioletowym i zważ.
  13. Dodaj paski do probówki mikrowirówkowej i dodaj równą objętość roztworu PN. Przechowywać probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C aż do całkowitego rozpuszczenia żelu.
  14. Dodać 500 μl cieczy równowagi BL do kolumny adsorpcyjnej CA2, odwirować przy 13 400 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant.
  15. Dodać rozpuszczony roztwór żelu do kolumny adsorpcyjnej CA2 i umieścić go w temperaturze pokojowej na 2 minuty, odwirować przy 13 400 x g przez 30 s i wyrzucić supernatant.
  16. Dodać 600 μl PW do kolumny adsorpcyjnej CA2, odwirować przy 13 400 x g przez 1 min, odrzucić supernatant i powtórzyć 1x.
  17. Umieścić kolumnę adsorpcyjną CA2 w probówce zbiorczej, odwirować przy 13 400 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
  18. Umieść kolumnę adsorpcyjną CA2 w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby dokładnie wyschła, a następnie umieść ją w czystej probówce wirówkowej.
  19. Dodać 50 μl buforu eluującego EB do folii adsorpcyjnej zawieszonej w temperaturze pokojowej na 2 minuty i zebrać roztwór DNA przez odwirowanie w temperaturze 13 400 x g przez 2 min.
    UWAGA: Wyżej wymienione roztwory lub odczynniki znajdują się w zestawie oczyszczającym (patrz tabela materiałów).
    1. Wyślij pobrany roztwór DNA do profesjonalnej firmy zajmującej się sekwencjonowaniem (patrz Tabela materiałów) w celu sekwencjonowania. Porównaj wyniki sekwencjonowania przez Blast w bazie danych GenBank NCBI. Zgodnie z homologią sekwencji, wybierz różne szczepy i skonstruuj drzewa filogenetyczne metodą maksymalnego prawdopodobieństwa w MEGA-X, aby określić pokrewieństwo gatunkowe szczepów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym eksperymencie wyizolowano 48 szczepów Bacillus ze świeżych odchodów zdrowych świń, ponumerowanych od 1001 do 1048. Wśród nich 15 szczepów wykazywało działanie przeciwbakteryjne przeciwko M. luteus. Spośród 15 szczepów miana bacytracyny mierzono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, jak pokazano w Tabeli 1. Wśród nich B. licheniformis nr 1026 miał najwyższe miano bacytracyny, 456,35 ± 21,75 U/ml, dlatego do kolejnych eksperymentów wybrano nr 1026.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

B. licheniformis rośnie szybko przy prostych warunkach hodowli i szybkim zużyciu cukru, a dojrzała technologia fermentacji jest pomocna w obniżaniu kosztów produkcji przemysłowej13. Szerokie zastosowanie B. licheniformis i jego wydzielin, bacytracyny, określiło jego obiecującą wartość rynkową. W rolnictwie B. licheniformis jest stosowany jako bionawóz w celu poprawy wzrostu roślin i pobierania składników odżywczych poprzez zwiększenie żyzności gleby, wspomaganie rozwoju ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2022YFC2104800) oraz Projekt Six Talent Peaks w prowincji Jiangsu (nr 2019-NY-058).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 i razy; Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, ChinyP252-01
2kb Marker DNABeijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Pekin, ChinyBM121-01
AcetonitrylShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA104443
Agar w proszkuShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA104062
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Szanghaj, Chiny10002917
Sterylizator autoklawuZealway Instrument Inc., Xiamen, ChinyGI36DWS
Biochemiczny pasek identyfikacyjny BacillusQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinyHBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyB65740
Zestaw do ekstrakcji DNA bakteriiTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, ChinyDP209
Oddychająca folia uszczelniającaBeijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
ButanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyB433378
C18 (5 μ m, 4,6 i razy; 250 mm) Kolumna HPLCRizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, ChinyC1805-462510
Węglan wapnia (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Szanghaj, Chiny10005717
WirówkaNew Brunswick Scientific Co., Inc., Wielka Brytania5452
Zbiornik chromatograficzny Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, ChinyP-1
Butelka stożkowaSichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, Chiny18012
Inkubator o stałej temperaturzeTaist Instrument Co., Ltd., Tianjin, ChinyGH4500
Fosforan dipotasowy (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, ChinyXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyE397526
Waga elektronicznaMettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
Alkohol etylowyShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyE130059
Zestaw do oczyszczania żelu MidiTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, ChinyDP302
Pręt szklanyChengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
GlucoseShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyD823520
Zestaw roztworu barwiącego GramQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinyHB8278
Wysokosprawny chromatograf cieczowyAgilent Technologies, Inc., Kalifornia, Ameryka1260
Aparaturado elektroforezy poziomejBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Pekin, ChinyDYCP-31DN BIOMATE
Pierścień inokulacyjnyShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny3171026
Mieszadło magnetyczneWiggens GmbH Co., Ltd., NiemcyWH220 PLUS
Alkohol metylowyShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyM116115
Probówka do mikrowirówekShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, Suzhou, ChinyBNCC102589
Mikroporowata membrana filtracyjnaNantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
NinhydrinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyN105629
Mikroskop optycznyFabryka przyrządów optycznych, Szanghaj, ChinyDYS-108
Kał świńNanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, Chiny
Wzmacniacz reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, ChinyETC811
Profesjonalna firma zajmująca się sekwencjonowaniemGeneral Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, Chiny
PirydynaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny
Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, ChinyPłytka
GF254Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, ChinyHPT-HSGF5025023
Chlorek sodu (NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyS805275
Cytrynian soduSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Szanghaj, ChinyC39197100001
Skrobia rozpuszczalnaShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyS817547
Termostat kąpieli wodnejShanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Szanghaj, ChinyDK-8D
TryptonShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, ChinyT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, ChinyGR501-01
Ultra czysty instrument do wodyMerck KGaA Co., Ltd., NiemcyMilli Myjka ultradźwiękowa Direct-Q8
Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, ChinySB-100DT
Suwmiarka z noniuszem Sanfeng Company, JaponiaN20P
w proszkuVicbio Biotechnology Co., Ltd., Pekin, ChinyLP0021
Wytrząsarka P111516 cienkowarstwowa z żelem krzemionkowym HYL-C Ekstrakt drożdżowy

Bibliografia

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A. Biotechnological applications of Bacillus licheniformis. Crit. Rev. Biotechnol. 41 (4), 609-627 (2021).
  3. He, H., et al. Biotechnological and food synthetic biology potential of platform strain: Bacillus licheniformis. Syn Syst Biotechno. 8 (2), 281-291 (2023).
  4. Sun, Y., et al. Enhanced β-mannanase production by Bacillus licheniformis by optimizing carbon source and feeding regimes. Prep Biochem Biotech. 52 (7), 845-853 (2022).
  5. Trunet, C., et al. Suboptimal Bacillus licheniformis and Bacillus weihenstephanensis spore incubation conditions increase heterogeneity of spore outgrowth time. Appl Environ Microb. 86 (6), e02061-e02119 (2020).
  6. Lee, N. K., Kim, W. S., Paik, H. D. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 28 (5), 1297-1305 (2019).
  7. Yi, W., et al. Dietary novel alkaline protease from Bacillus licheniformis improves broiler meat nutritional value and modulates intestinal microbiota and metabolites. Anim Microbiome. 6 (1), 1-16 (2024).
  8. Vasileios, B., et al. Safety and efficacy of Bacillus licheniformis DSM 32457 as a silage additive for all animal species. EFSA Journal. 17 (8), e05787(2019).
  9. Birgit, V., et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol Microb Biotech. 7 (4), 204-211 (2004).
  10. Zhu, J., et al. Microbial synthesis of bacitracin: Recent progress, challenges, and prospects. Synth Syst Biotechnol. 8 (2), 314-322 (2023).
  11. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  12. Willdigg, J. R., et al. The Bacillus subtilis cell envelope stress-inducible ytpAB operon modulates membrane properties and contributes to bacitracin resistance. J Bacteriol. 206 (3), e0001524(2024).
  13. Silva, K. G. S., et al. Effects of bacterial direct-fed microbial mixtures offered to beef cattle consuming finishing diets on intake, nutrient digestibility, feeding behavior, and ruminal kinetics/fermentation profile. J Anim Sci. 102, skae003 (2024).
  14. Jia, D., et al. Probiotic Bacillus licheniformis ZW3 alleviates DSS-induced colitis and enhances gut homeostasis. Int J Mol Sci. 25 (1), 561(2024).
  15. Wang, X., et al. Dietary supplementation with Bacillus mixture modifies the intestinal ecosystem of weaned piglets in an overall beneficial way. J Appl Microbiol. 130 (1), 233-246 (2021).
  16. James, N., et al. Unravelling the potential plant growth activity of halotolerant Bacillus licheniformis NJ04 isolated from soil and its possible use as a green bioinoculant on Solanum lycopersicum L. Environ. Res. 216 (2), 114620(2024).
  17. Shen, P., et al. Exploitation of ammonia-inducible promoters for enzyme overexpression in Bacillus licheniformis. J Ind Microbiol Biot. 48 (5-6), kuab037 (2021).
  18. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  19. Fan, B., Chen, T. Y., Zhang, S., Wu, B., He, B. F. Mining of efficient microbial UDP-glycosyltransferases by motif evolution cross plant kingdom for application in biosynthesis of salidroside. Sci Rep. 7 (1), 463(2017).
  20. Hugo, R. O., Bernardo, R. B., Alejandra, C. S. R. Potential application of the probiotic Bacillus licheniformis as an adjuvant in the treatment of diseases in humans and animals: A systematic review. Front Microbiol. 13, 993451(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Produkcja bacyt racemicizolacja z kałumikrobiota świńoczyszczanie bacyt racemicchromatografia cienkowarstwowawysokosprawna chromatografia cieczowahamowanie wzrostu Micrococcus luteusanaliza filogenetycznacharakterystyka biochemiczna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.