Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tkanka pępowiny jest bogatym, łatwo dostępnym, nieinwazyjnym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). W tym protokole przedstawiono szczegółowe kroki izolacji i charakteryzacji ludzkich galaretek Whartona (WJ-MSC), a następnie prosty, krótki protokół izolujący ich pochodne egzosomy lub małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.
W dziedzinie medycyny regeneracyjnej szczególną uwagę wzbudziły mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). MSC z tkanki pępowiny (UC), zwane galaretą Whartona, zostały szczególnie dobrze ugruntowane w różnych zastosowaniach. W porównaniu z innymi źródłami MSC, galarety MSC Whartona (WJ-MSC) oferują szereg korzyści i są izolowane od UC, który zazwyczaj jest usuwany jako odpady medyczne. WJ-MSC zatem nie poruszają kwestii etycznych podobnych do tych dotyczących embrionalnych komórek macierzystych. Zastosowano prostą i powtarzalną technikę eksplantacji do izolacji WJ-MSC z tkanki UC. W ciągu pięciu do dziesięciu dni izolacji WJ-MSC wyłaniają się jako komórki przylegające o kształcie fibroblastycznym. Po izolacji komórki osiągają około 80% konfluencji w ciągu 14-18 dni. Następnie, w fragmencie 3, izolowane WJ-MSC zostały w pełni scharakteryzowane poprzez indukcję ich różnicowania wzdłuż linii mezenchymalnej adipogenicznej, osteogennej i chondrogennej. Dodatkowo testowano immunofenotypizację pod kątem ujemnych markerów powierzchniowych klastrów różnicowania (CD), w tym CD34, CD14 i HLA-DR, a także charakterystycznych markerów powierzchniowych MSC, takich jak CD105, CD90, CD73 i CD44. Ponadto odczynnik wydzielający został użyty w prostym podejściu do izolacji egzosomów/małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) z warunkowanego ośrodka tych WJ-MSC. Po izolacji egzosomy/sEV obserwowano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym, a do obliczenia ich średniego rozmiaru zastosowano analizę rozmiaru cząstek. Podsumowując, WJ-MSC zapewniają łatwo dostępny, nieinwazyjny, odnawialny zasób komórek macierzystych, które mogą być wykorzystywane jako fabryki do produkcji egzosomów/sEV. Te WJ-MSC oraz ich pochodne egzosomy/sEV mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań terapeutycznych i dalszych badań.
Jeszcze kilka lat temu uważano, że komórki macierzyste odgrywają wiodącą rolę w medycynie 1,2. Jednak obawy etyczne związane z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC) stanowiły ogromną przeszkodę utrudniając szybki postęp w tej dziedzinie3. To wzbudziło duże zainteresowanie poszukiwaniem alternatywnych, odnawialnych źródeł komórek macierzystych, zwłaszcza tych, które można izolować poporodowo z pępowiny (UC)4. UC naturalnie łączy się z łożyskiem i płodem wewnątrz ciężarnej matki. Wrodzoną rolą UC jest odżywianie rosnącego płodu ciągłym i wystarczającym ukrwie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie eksperymenty i procedury były przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i zatwierdzone przez Komitety Etyczne zarówno Wydziału Farmaceuticznego Uniwersytetu Ain Shams w Kairze, Egipt (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) oraz Wydziału Farmacji Brytyjskiego Uniwersytetu w Egipcie w Kairze (CL-2309). UC uzyskano po uzyskaniu podpisanej, świadomej zgody rodzica/rodziców.
1. Izolacja WJ-MSC od ludzkiej pępowiny
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Izolacja i charakterystyka WJ-MSC
Jak pokazano na Rysunku 3, małe komórki przypominające fibroblasty pojawiły się początkowo pod i otaczające tkanki roślin WJ w ciągu 5-10 dni po zasiewaniu tych roślin (Rysunek 3A). Te uwolnione WJ-MSC nadal się mnożą i zwykle osiągają około 80% konfluencji w ciągu 14-18 dni po izolacji. Warto zauważyć, że tkanki roślin.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W tym protokole mogliśmy przedstawić szczegółowe kroki izolujące WJ-MSC z ludzkiej tkanki UC oraz izolować ich pochodzące egzosomy/sEV. UC to łatwo dostępne, nieinwazyjne źródło do pozyskiwania MSC i nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt do zbierania lub przetwarzania 11,15,30,32,48. Stosowane są różne protokoły do izolacji WJ-MSC z tkanki UC. Zasadniczo, w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszyscy współautorzy deklarują brak konfliktu interesów związanych z tą pracą.
Prace te zostały częściowo sfinansowane przez Uniwersytet Ain Shams – Strategic Plan Research Support Grant (2024/2025) w Egipcie oraz Nanotechnology Research Center (NTRC) – Access Award (2019/2020), The British University in Egypt (BUE), Kair, Egipt.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Wodorotlenek amonu | Fisher Scientific, Niemcy | 1336-21-6 | |
| Przeciwciała dla ludzkiego CD-105, FITC | R& D systems Inc., MN, USA | FAB10971F | |
| Przeciwciało dla ludzkiego CD-14, PE | Beckman Coulter, USA | IM0650U | |
| Przeciwciało dla ludzkiego CD-34, PE | Beckman Coulter, USA | IM1420 | |
| Przeciwciała dla ludzkiego CD-44, PE | Beckman Coulter, USA | A32537 | |
| Przeciwciało dla ludzkiego CD-73, PE | R& D systems Inc., MN, USA | FAB5795P | |
| Przeciwciało dla ludzkiego CD-90, PE | R& D systems Inc., MN, USA | FAB2067P | |
| Przeciwciało dla człowieka HLA-DR, FITC | Beckman Coulter, USA | IM1638U | |
| Zestaw do ilościowania białka z kwasem bicinchoninowym (BCA) | Thermofisher | 23227 | |
| Szafa na bezpieczeństwo biologiczne, przepływ laminarny, MSC Advantage | Thermo Scientific, USA | ||
| CO2 Inkubator, Direct Forma | Thermo Scientific, USA | ||
| Wirówka chłodząca | Sigma, Niemcy | ||
| Wirówka chłodząca | Eppendorf, Niemcy | ||
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter, FL, USA | ||
| Dimetylsulfotlenek (DMSO) | Fisher Scientific, Niemcy | BP231-100 | |
| DMEM - Niska glukoza 1 g/L | Lonza, Szwajcaria | 12-707F | |
| DMEM/F12 | Lonza, Szwajcaria | 12-719F | |
| Woda wolna od DNAse/RNAse | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Etanol absolutny, klasa biologii molekularnej | Sigma-Aldrich, Niemcy | 24103 | |
| ExoQuick-TC | System Biosciences (SBI), USA | EXOTC50A-1 | Czynnik wytrącający |
| Serum bydła płodu (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazylia | 10270-106 | |
| Formaldehyd 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Kwas octowy lodowcowy | Sigma Aldrich, Niemcy | A38S-500 | |
| Roztwór glutaraldehydu | Sigma | G7776 | |
| Kwas solny (HCl) | Fisher Scientific, Niemcy | A144-212 | |
| Mikroskop odwrócony | Olympus, Japonia | ||
| L-Glutamina | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Mezenchymalny zestaw do funkcjonalnej identyfikacji komórek macierzystych | R& D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Czytnik mikropłyt | Chromate, Awareness Technologies, USA | ||
| Barwa olejowa | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicylina-Streptomycyna-Amfocerycyna | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x, bez Ca/Mg | Lonza, Szwajcaria | BE17-516F | |
| Kąpiel wodna z trzęseniem | Daihan Wisebath, Korea | ||
| Filtr strzykawkowy, 0,2 mikrona | Corning, USA | 431224 | |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | JEM-1200EX II, Jeol, Niemcy | ||
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsyna-Versene-EDTA, 1x | Lonza, Szwajcaria | CC-5012 | |
| Roztwór octana uranilu (2%) | Elektronon Microsopy Sciences, USA | 22400-2 | |
| Spektrofotometr UV-widzialny | Shimadzu, Japonia | ||
| Wir | SciLogex | ||
| Zeta-sizer Nano ZN | Malvern Panalytical Ltd, Wielka Brytania | Analizator rozmiarów cząstek |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny