Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek macierzystych mezenchymalnych galarety Whartona i ich pochodnych egzosomów/małych pęcherzyków zewnętrznych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66778

⸱

11 listopada 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

W tym artykule

Podsumowanie

Tkanka pępowiny jest bogatym, łatwo dostępnym, nieinwazyjnym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). W tym protokole przedstawiono szczegółowe kroki izolacji i charakteryzacji ludzkich galaretek Whartona (WJ-MSC), a następnie prosty, krótki protokół izolujący ich pochodne egzosomy lub małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.

Streszczenie

W dziedzinie medycyny regeneracyjnej szczególną uwagę wzbudziły mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). MSC z tkanki pępowiny (UC), zwane galaretą Whartona, zostały szczególnie dobrze ugruntowane w różnych zastosowaniach. W porównaniu z innymi źródłami MSC, galarety MSC Whartona (WJ-MSC) oferują szereg korzyści i są izolowane od UC, który zazwyczaj jest usuwany jako odpady medyczne. WJ-MSC zatem nie poruszają kwestii etycznych podobnych do tych dotyczących embrionalnych komórek macierzystych. Zastosowano prostą i powtarzalną technikę eksplantacji do izolacji WJ-MSC z tkanki UC. W ciągu pięciu do dziesięciu dni izolacji WJ-MSC wyłaniają się jako komórki przylegające o kształcie fibroblastycznym. Po izolacji komórki osiągają około 80% konfluencji w ciągu 14-18 dni. Następnie, w fragmencie 3, izolowane WJ-MSC zostały w pełni scharakteryzowane poprzez indukcję ich różnicowania wzdłuż linii mezenchymalnej adipogenicznej, osteogennej i chondrogennej. Dodatkowo testowano immunofenotypizację pod kątem ujemnych markerów powierzchniowych klastrów różnicowania (CD), w tym CD34, CD14 i HLA-DR, a także charakterystycznych markerów powierzchniowych MSC, takich jak CD105, CD90, CD73 i CD44. Ponadto odczynnik wydzielający został użyty w prostym podejściu do izolacji egzosomów/małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) z warunkowanego ośrodka tych WJ-MSC. Po izolacji egzosomy/sEV obserwowano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym, a do obliczenia ich średniego rozmiaru zastosowano analizę rozmiaru cząstek. Podsumowując, WJ-MSC zapewniają łatwo dostępny, nieinwazyjny, odnawialny zasób komórek macierzystych, które mogą być wykorzystywane jako fabryki do produkcji egzosomów/sEV. Te WJ-MSC oraz ich pochodne egzosomy/sEV mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań terapeutycznych i dalszych badań.

Wprowadzenie

Jeszcze kilka lat temu uważano, że komórki macierzyste odgrywają wiodącą rolę w medycynie 1,2. Jednak obawy etyczne związane z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC) stanowiły ogromną przeszkodę utrudniając szybki postęp w tej dziedzinie3. To wzbudziło duże zainteresowanie poszukiwaniem alternatywnych, odnawialnych źródeł komórek macierzystych, zwłaszcza tych, które można izolować poporodowo z pępowiny (UC)4. UC naturalnie łączy się z łożyskiem i płodem wewnątrz ciężarnej matki. Wrodzoną rolą UC jest odżywianie rosnącego płodu ciągłym i wystarczającym ukrwieniem przez naczynia krwionośne oraz zapewnienie ochrony tych naczyń poprzez unikanie ewentualnego skręcania, ucisku lub zaginania płodu podczas jego ruchu5. Anatomicznie ludzki UC składa się z dwóch tętnic i żyły, które są osadzone w tkance śluzowej łącznej i zamknięte w zewnętrznej warstwie nabłonka owodniowego6. Macierz UC, czyli tkanka śluzowa otacająca trzy naczynia pępowinowe, znana jest jako "galaretka Whartona" (WJ) i składa się głównie z proteoglikanów oraz kolagenu7.

Ostatnio komórki macierzyste mezenchymalne (MSC) przyciągają dużą uwagę, będąc skuteczną nowatorską metodą terapeutyczną dla szerokiego zakresu zastosowań medycyny regeneracyjnej 7,8,9,10,11,12. Najbardziej intrygujące w MSC jest ich łatwość izolacji, a także wykazane działania immunomodulacyjne i multipotencja 13,14,15. Inne zalety MSC ogólnie i tych pochodzących z WJ w szczególności to brak teratomów po przeszczepieniu, w przeciwieństwie do ESC, oraz fakt, że zachowują właściwości macierzyste nawet po kilku przejściach komórkowych16,17. Dlatego obecnie uważa się, że MSC rzeczywiście mogą zapewnić rewolucyjne interwencje terapeutyczne w różnych chorobach 8,18,19. Warto podkreślić, że w 2006 roku Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) zdefiniowało konkretne minimalne kryteria właściwej charakterystyki MSC20. Po pierwsze, gdy są uprawiane/hodowane w standardowych warunkach hodowlanych, MSC powinny być przylegające do plastiku. Po drugie, MSC muszą wyrażać charakterystyczny klaster markerów powierzchniowych różnicujących (CD), takich jak CD90, CD105 i CD73, i nie mogą wykazywać ekspresji innych, takich jak CD14, CD34 i CD45. Po trzecie, MSC muszą rozróżnić się na linie osteogenne, adipogeniczne i chondrogeniczne in vitro20. Do dziś MSC izolowano z wielu źródeł, w tym z tkanek dorosłych, takich jak szpik kostny (BM), tkanka tłuszczowa21, a także z źródeł płodowych/okołoporodowych, takich jak łożysko, krew UCB i macierz UC22,23. Warto zauważyć, że przy porównaniu wskaźnika sukcesu pobierania MSC odnotowano, że osiąga on prawie 100% z tkanki WJ w porównaniu do zaledwie około 6% z UCB24,25. Tak więc, chociaż UCB jest rzeczywiście bogatym źródłem hematopoetycznych komórek macierzystych, jest również uważane za dobre źródło MSC, choć znacznie niższym niż WJ 26,27,28.

WJ-MSC są wyjątkowe w porównaniu z innymi typami MSC, ponieważ choć są prawdziwymi (typowymi) MSC, posiadającymi podobne właściwości jak ich dorosłe odpowiedniki, posiadają również ekspresję różnych markerów pluripotentności/ESC17,29. W związku z tym uważa się, że WJ-MSC znajdują się gdzieś pomiędzy dorosłymi a embrionalnymi komórkami macierzystymi17. Co ciekawe, wykazano, że WJ-MSC wykazują zarówno ludzkie markery MSC, jak i ESC, i są w stanie utrzymać stemowość przez kilka fragmentów16. Na szczęście po przeszczepieniu nie tworzą w nich teratomów17. Można to wyjaśnić na podstawie ich unikalnego profilu transkryptomicznego w porównaniu z ESC oraz innymi MSC29,30. WJ-MSC oferują różne zalety w porównaniu z dorosłymi MSC, a nawet ogólnie nad innymi typami komórek macierzystych. Ich środki izolacji są łatwo dostępne dzięki UC, które rutynowo jest odrzucane przy urodzeniu, przez co jest uważane za odpady medyczne. Dlatego w przeciwieństwie do ESC, WJ-MSC nie mają wątpliwości etycznych, a w przeciwieństwie do BM-MSC, są one izolowane techniką inwazyjną31. Ponadto, podobnie jak inne typy MSC, WJ-MSC nie posiada ekspresji ludzkiego antygenu leukocytowego związanego z D-powiązanym (HLA-DR), a szczególnie wykazano, że wykazują ekspresję ludzkiego antygenu leukocytarnego G (HLA-G), co zapewnia im dodatkową odporność32. Sugeruje to, że WJ-MSC wykazują rolę immunosupresyjną, symulującą to, co zwykle występuje na styku płod-matka in vivo 33,34,35. Wreszcie, podobnie jak ich analogi odizolowane od UCB, WJ-MSC mają duży potencjał do bankowania36. Biorąc pod uwagę wszystkie te zalety, WJ-MSC są tym promowane jako nowy złoty standard dla terapii opartych na MSC30.

Co ciekawe, wiele badań wykazało, że MSC wykazują swoje działanie terapeutyczne głównie poprzez sygnalizację parakryno. W wielu przypadkach takie efekty zgłaszano jako reakcję na egzosomy/małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) wydzielane przez MSC37. Egzosomy/sEV są znane jako bioaktywne pęcherzyki o rozmiarze nano, które są pozyskiwane z układu endobłonowego komórki. Działają jak wahadłowce przenoszące określone ładunki białek, mRNA, a także niekodujące RNA, takie jak mikroRNA i długie niekodujące RNA (LncRNA), jako wiadomość w butelce38. W konsekwencji mogą one przeprogramować komórki biorce i są określane jako "sygnalogy" manipulujące kluczowymi funkcjami komórkowymi39. Egzosomy/sEV pochodzące z MSC wykazały swoją przewagę nad terapiami MSC, stanowiąc możliwą alternatywę wolną od komórek. Podobnie jak ich macierzyste MSC, egzosomy/sEV wykazano jako wywołujące efekty terapeutyczne i regenerację komórkową w wielu chorobach. Jednak w przeciwieństwie do komórek macierzystych, łatwiej przekraczają bariery biologiczne. Co więcej, są pozbawione krytycznych zagrożeń bezpieczeństwa; nie stwarzają ryzyka odrzucenia układu odpornościowego ani długotrwałego powstawania guzów40. Ponadto egzosomy/sEV mogą być wykorzystywane w terapiach genowych jako system dostarczania leków, naturalnie wyposażone w przekazywanie informacji genetycznej41. W ten sposób egzosomy/sEV rzeczywiście otworzyły ekscytujące nowe możliwości dla nowych interwencji terapeutycznych w różnych chorobach 42,43,44.

W tym protokole przedstawiony jest szczegółowy, stopniowo oparty na eksplantacji oparty na izolacji i charakteryzacji WJ-MSC z tkanek UC. Następnie zostanie opracowany zwięzły protokół izolacji egzosomów/sEV od warunkowanych mediów tych WJ-MSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i procedury były przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i zatwierdzone przez Komitety Etyczne zarówno Wydziału Farmaceuticznego Uniwersytetu Ain Shams w Kairze, Egipt (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) oraz Wydziału Farmacji Brytyjskiego Uniwersytetu w Egipcie w Kairze (CL-2309). UC uzyskano po uzyskaniu podpisanej, świadomej zgody rodzica/rodziców.

1. Izolacja WJ-MSC od ludzkiej pępowiny

  1. Umieść około 30-40 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do pojemnika (szczelnie zamkniętego worka zbiorowego), aby pobrać pępowinę (UC) (około 15 cm długości) natychmiast po dostawie. Utrzymuj zebrane UC w lodzie i przetwarzaj je maksymalnie w ciągu 4-5 godzin od pobrania.
    UWAGA: Próbka nie może być przetwarzana po 4-5 godzinach, ponieważ znacznie zmniejszy to wydajność MSC. Upewnij się, że PBS i pojemnik są sterylne.
  2. Przygotować kompletne pożywki hodowlane dla WJ-MSC składające się z Zmodyfikowanego Medium Orła Dulbecco o niskiej zawartości glukozy (LG-DMEM) uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła (FBS), 100 U/mL penicylinę, 100 μg/mL streptomycynę, 2 mM L-glutaminy oraz 0,25 μg/mL amfotericynę B.
  3. Umieść 3 mL kompletnego medium na odwiert w płytkach 6-dołkowa, a następnie umieść te 6-dołkowe płytki z podłożem w inkubatorzeCO2 ustawionym na 37 °C i 5%CO2 , aby się podgrzały i przygotowały.
  4. W szafce biobezpieczeństwa przygotuj osiem pomieszczeń do hodowli komórek o średnicy 10 cm, z których każda wypełniona jest 10 ml sterylnego PBS.
  5. Ostrożnie, używając sterylnych kleszczy, przelej UC z zamkniętego plastikowego woreczka do pierwszej szalki Petriego zawierającej PBS, aby wypłukać krew (powtarzaj ten krok, aż cała krew zostanie wypłukana z próbki).
  6. Spryskaj 70% etanolem sterylny wymazek i użyj go do przetarcia UC przez 30 sekund.
  7. Przenieś UC do nowej szalki Petriego wypełnionej sterylnym PBS, aby usunąć resztki etanolu.
  8. Przełóż UC do innej szalki Petriego, wcześniej wypełnionej sterylnym PBS i używając sterylnych nożyczek, pokrój UC na mniejsze kawałki (około 3 cm każda). Następnie przenieś te 3-cm kawałki do innej miski Petriego z świeżym, sterylnym PBS, aby uniknąć uwolnienia krwi podczas cięcia.
    UWAGA: Od tego momentu elementy UC muszą być utrzymywane na lodzie, podobnie jak wszystkie kolejne etapy przetwarzania. Jest to bardzo ważne, aby uniknąć uwalniania żelatynowej materii i zapewnić sukces procedury izolacji WJ-MSC z tkanki UC. Przetworzenie zebranego UC w maksymalnie 4-5 godzinach jest kluczowe dla powodzenia procesu izolacji. Wcześniej UC był przetwarzany w dłuższych okresach po pobraniu, ale niestety zabieg nie przyniósł efektów pomyślnych (dane nie pokazano).
  9. Zacznij przetwarzać kawałki UC pojedynczo (na lodzie) w szalce Petriego wypełnionej sterylnym PBS. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby odciąć naczynia krwionośne i wyizolować tkankę galarety Whartona (WJ). Następnie włóż przezroczyste kawałki WJ do kolejnej szalki Petriego wypełnionej sterylnym PBS na lodzie.
    UWAGA: Podczas izolacji tkanki WJ od części UC pierwsze nacięcie wykonuje się po przezroczystej stronie części UC, z dala od naczyń krwionośnych, aby uniknąć przecięcia naczynia. Następnie naczynia krwionośne są zaciskane, przecinane i odrywane.
  10. Powtórz poprzedni krok na wszystkich fragmentach UC, aby uzyskać przezroczystą tkankę WJ bez naczyń krwionośnych.
    UWAGA: Zmień szalkę Petriego PBS, jeśli jest to konieczne, podczas przetwarzania fragmentów UC i usuwania naczyń krwionośnych, jeśli roztwór PBS stanie się krwawy lub nieprzezroczysty podczas izolacji tkanek WJ.
  11. Przemyj zebrane kawałki WJ PBS, przenosząc je do świeżej misy do hodowli komórek o średnicy 10 cm wypełnionej sterylnym PBS.
  12. Użyj sterylnego, ostrego skalpela i kleszczy, aby pociąć zebrane tkanki WJ na małe, 10-mm długie kawałki.
  13. Przenieś kawałki WJ do wcześniej przygotowanych płytek 6-dołkowych w kroku 1.3. Umieść 5-6 kawałków WJ w dołku, następnie inkubuj 6-dołkowe płytki zawierające wysadzenia z tkanek WJ w nawilżonej atmosferze z 5%CO2 w 37 °C w inkubatorzeCO2 i pozostawić niezakłócone przez 3 dni.
  14. Czwartego dnia od umieszczenia ekstabinetów WJ ostrożnie dodaj 1 mL podłoża na dołek, uważając, by nie ruszyć eksplantów.
    UWAGA: Unikaj dotykania lub rysowania dolnej części płyty, gdzie przymocowane są elementy WJ.
  15. Powtórz poprzedni krok 6. dnia po założeniu WJ tissue explant.
  16. Ósmego dnia po umieszczeniu wszczepów tkankowych (czyli prawie tydzień po umieszczeniu implantów) zacznij zmieniać połowę podłoża w dołku co drugi dzień, aż do12-14 dnia po umieszczeniu implantów. Wymień połowę podłoża hodowlanego z każdego odwiertu, usuwając około 2,5 mL z każdego odwiertu i dodając świeże 2,5 mL kompletnego ciepłego medium (37 °C).
    UWAGA: Wyjmij medium z powierzchni studni i unikaj dotykania lub rysowania dna płyty, gdzie przymocowane są elementy WJ. WJ-MSC zwykle pojawiają się pod i wokół wychodów tkanek WJ w ciągu 5-10 dni po ich umieszczeniu.
  17. Rutynowo obserwuj płytki z 6 dołkami pod mikroskopem odwróconym (10x powiększenie), a jeśli uwolnione komórki się mnożą, a ich konfluencja rośnie, osiągając 50-60%, przejdź do kolejnego kroku; Jeśli nie, powtórz krok 1.16. znów. Utwory WJ znacznie się zmniejszają z czasem.
  18. Delikatnie wyjmij rośliny WJ przymocowane do dna studni i usuń wszystkie podłoża. Usuwanie kawałków WJ explantów zwykle odbywa sięw dniach 12-14 od pierwszego umieszczenia.
    UWAGA: Lekko pochyl płytki pod kątem 45° podczas wyjmowania nośnika, aby upewnić się, że wszystkie media zostaną usunięte.
  19. Każdą dołek umyj 2 mL PBS, delikatnie zamieszaj talerz, a następnie wyrzuć PBS. Powtórz ten krok mycia dwa razy.
    UWAGA: Delikatnie dodaj PBS do ściany dołka i unikaj dotykania dna dołków, aby zapobiec żadnemu zakłóceniu komórek.
  20. Delikatnie dodaj 2 mL ciepłego kompletnego medium na odwiert (medium o dokładnym składzie opisanym w kroku 1.2) i inkubuj płytki 6-dołkowe w warunkach nawilżonych z 5%CO2 w temperaturze 37 °C.
  21. Całkowicie zmieniaj podłoże co drugi dzień (2 mL kompletnego medium na dołek), aż komórki osiągną około 80% konfluencji.
  22. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, należy przepuścić komórki za pomocą trypsyny-EDTA do kolb hodowli komórek T25 (cała liczba komórek uzyskana z jednej płytki 6-dołkowa może być przeniesiona do jednej piersiówki hodowli T25, używaj 8-9 ml kompletnego nośnika na kolbę T25). Te komórki WJ-MSC oznaczane są jako komórki P1.
    UWAGA: Nie zostawiaj komórek zbyt długo z trypsyną-EDTA, aby uniknąć toksycznych efektów; Zazwyczaj 3 minuty wystarczają na odłączenie komórek. Różni dostawcy mogą dostarczać Trypsin-EDTA o zmiennej mocy. W związku z tym należy to uwzględnić przy określaniu czasu inkubacji.
  23. Zmieniaj media co drugi dzień. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, należy przepuścić komórki za pomocą trypsyny-EDTA do kolb hodowlanych komórek T75 (całość komórek uzyskanych z jednej kolby T25 można przepuścić do jednej kolby T75; użyj 15-18 mL kompletnego nośnika na kolbę T75); te WJ-MSC oznaczane są jako komórki P2.
  24. Zmieniaj media co drugi dzień. Gdy komórki osiągną około 80% konfluentności, odłącz je za pomocą Trypsin-EDTA, a następnie zasiewa WJ-MSC o gęstości około 0,75 x 106-10 x 10 komórek na kolbkę T75. Te komórki WJ-MSC oznaczane są jako komórki P3.
    UWAGA: Używaj komórek pomiędzy P3 a P5 do przyszłych eksperymentów opisanych w tym protokole.
  25. Kriokonserwować izolowane WJ-MSC w ciekłym azocie za pomocą mediów kriokonserwacyjnych składających się z 80% FBS, 10% kompletnego medium (jak opisano w kroku 1.2) oraz 10% dimetylosulfoxidu (DMSO).
    UWAGA: Schemat wszystkich kroków izolacji WJ-MSC przedstawiono na Rysunku 1.

2. Charakterystyka izolowanych WJ-MSC za pomocą immunofenotypowania z wykorzystaniem analizy cytometrycznej przepływu dla różnych markerów powierzchni CD

  1. Odłącz komórki za pomocą trypsyny-EDTA w przejściu 4. Przemyj komórki PBS dwukrotnie i policz ich liczbę za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Minimalny czas inkubacji (przez 3 minuty) podczas trypsynizacji jest kluczowy, aby komórki skutecznie odłączyć bez wywołania uszkodzeń. Długotrwała inkubacja trypsyną-EDTA może skutkować uszkodzeniem markerów powierzchni komórek i negatywnie wpływać na wyniki testu immunofenotypowania.
  2. Inkubować około 100 000 komórek (w ciemnych warunkach) przez 20 minut w temperaturze 4 °C z ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi fykoerytryną (PE) lub izotiocianianianem fluoresceiny (FITC) w następujący sposób: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE oraz Anti-HLA-DR FITC, a także używać komórek niebarwionych jako kontroli
  3. Przepłucz komórki PBS i ponownie zawiesij je w 500 μL buforu FACS; Analizuj za pomocą cytometrii przepływowej45.

3. Ocena potencjału różnicowania izolowanych WJ-MSC wobec różnych linii mezenchymalnych

  1. Różnicowanie adipogeniczne
    1. Ponownie zawiesijcie komórki w pełnym ośrodku proliferacyjnym (jak opisano w kroku 1.2). Następnie należy hodować komórki o gęstości 3,7 x 104 komórek /dołek (0,5 mL medium/dołek) na 24-dołkowej płycie do hodowli tkankowej. Następnie inkubuj w wilgotnych warunkach z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie, co drugi dzień, zmieniaj ośrodki, aż komórki osiągną prawie 100% spójności; Zazwyczaj zajmuje to około 3-4 dni.
    2. Usuń podłoże proliferacyjne i zastąp je adipogenicznym ośrodkiem różnicującym, aby wywołać adipogenezę. Uzupełnij medium LG-DMEM o 100 μg/mL streptomycyny, 100 U/mL penicyliny, 0,25 μg/mL amfotericyny B oraz suplement adipogenny dostępny w zestawie funkcjonalnej identyfikacji komórek macierzystych mezenchymalnych. Następnie delikatnie zmieniaj podłoże (0,5 mL/well) co 3 dni, unikając zakłóceń lipidowych wakuoli.
    3. Po około 21 dniach, za pomocą mikroskopowego badania, barw lipidowe wakuole Oil Red, aby ocenić różnicowanie adipogenne.
    4. Przygotuj świeży roztwór wywaru Oil Red; rozpuść 30 mg barwy Oil Red w 10 mL izopropanolu i odpocząć przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór roboczy, mieszając 2 części podwójnie destylowanej wody (ddH2O) z 3 częściami roztworu wywarowego, dobrze je wymieszając i pozostawiając na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie filtruj filtrem 0,22 lub 0,45 μm.
      UWAGA: Dla najlepszych efektów barwienia przygotuj świeżo bejcę Oil Red.
    5. Aby skutecznie dokumentować różnicowanie adipogeniczne, należy dwukrotnie przemyć komórki PBS i utrwalić je neutralnie buforowanym 10% formaliną (0,75 mL/dołek) przez 15 minut. Następnie przemyj komórki dwukrotnie PBS przy użyciu 1 mL/well (przed wyrzuceniem PBS po każdym myciu inkubuj komórki przez około 5 minut).
      UWAGA: Komórki utrzymywane w ośrodku proliferacyjnym (opisane w kroku 1.2) są wykorzystywane jako komórki kontrolne, nieindukowane. Dodaj formalinę z neutralnym buforem powoli do ścianek, a nie bezpośrednio na komórki, aby uniknąć uszczerzeń komórkowych. Po końcowym praniu PBS niezbędne jest pełne aspirowanie PBS przed dodaniem roztworu Oil Red do bejcowania, aby uniknąć nieefektywnego barwienia.
    6. Po końcowym przemyciu barw komórki (1 mL/dołek) roztworem roboczym Oil Red i inkubuj je przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Następnie wyjmij i wyrzuć roztwór barwnika, a następnie delikatnie dwukrotnie przepłucz komórki PBS. Następnie pod mikroskopem obserwuj zabarwione krople lipidowe.
  2. Różnicowanie osteogeniczne
    1. Ponownie zawiesijcie komórki w pełnym ośrodku proliferacyjnym (jak opisano w kroku 1.2). Następnie na 24-dołkowej płycie do hodowli tkankowej zasiać 7,4 x 10komórek na dołek (dodać 0,5 mL medium/dołek) i inkubować przez 3 dni w wilgotnych warunkach przy stężeniu 5%CO2 w 37 °C, aby osiągnąć prawie 70% konfluencję.
    2. Przy około 70% zbieżności zastąpić media proliferacyjne mediami różnicowania-indukcyjnymi zawierającymi suplement osteogenny – dostępny w zestawie funkcjonalnej identyfikacji komórek macierzystych mezenchymalnych – w ośrodkach LG-DMEM uzupełnionych o 10% FBS, wraz ze 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL Streptomycyny, 2 mM L-glutaminy oraz 0,25 μg/mL Amfotericyny B.
    3. Wymieniaj ośrodek różnicujący raz na 3 dni i kontynuuj indukcję osteogenną przez około 21 dni.
    4. Przygotuj roztwór roboczy barwnika Alizarin Red S; przynieś 9 ml ddH2O i rozpuścić w nim 200 mg barwnika Alizarin Red S, a następnie użyj wodorotlenku amonu i HCl, aby dostosować pH do 4,1-4,3. Następnie uzupełnij objętość do 10 mL przy ddH2O. Następnie przefiltruj roztwór filtrem (0,22 lub 0,45 μm), aby usunąć wszelkie osady.
    5. Po zakończeniu okresu indukcji przepłukaj komórki dwukrotnie PBS, a następnie utraż je neutralnie buforowanym 10% formaliną (0,75 mL/well) i odpocząć przez 15 minut. Następnie dwukrotnie przepłucz komórki PBS (1 mL/dołek) i upewnij się, że komórki wybiją się przez 5 minut przy każdym płukaniu.
      UWAGA: Komórki utrzymywane w ośrodku proliferacyjnym (opisane w kroku 1.2) są wykorzystywane jako komórki kontrolne, nieindukowane.
    6. Dodaj 2% roztwór roboczy Alizarin-Red S przygotowany w kroku 3.2.4 do tych ustalonych komórek z poprzedniego etapu i inkubuj w ciemności przez około 45-60 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Następnie odrzuć roztwór barwnika, przepłukać komórki ddH2O dwukrotnie, a następnie raz PBS, a następnie ocenić skuteczną różnicację osteogenową pod mikroskopem, obserwując zabarwioną, wapniową macierz zewnątrzkomórkową.
  3. Różniczkowanie chondrogenowe
    1. Ponownie zawiesijcie komórki w pełnym ośrodku proliferacyjnym (jak opisano w kroku 1.2). Następnie w 24-dołkowej płycie do hodowli tkankowej zasiać 7,4 x 103 komórek /dołek (dodać 0,5 mL podłoża/dołka) i inkubować je w wilgotnych warunkach przy stężeniu 5%CO2 w 37 °C przez 3 dni, aby osiągnąć prawie 90% konfluencję.
    2. Przy około 90% zbiegu rozpocznij indukcję różnicowania chondrogeniczną za pomocą bezsurowicowego DMEM/F12 uzupełnionego insulinowotransferynowym selenem (ITS) oraz suplementem chondrogenicznym – wyposażonym w zestaw do identyfikacji funkcjonalności komórek macierzystych mezenchymalnych – wraz z 0,25 μg/mL amfoterycyny B, 100 U/mL penicyliny, 2 mM L-glutaminy oraz 100 μg/mL Streptomycyny46.
      UWAGA: Kompletne ośrodki indukacyjne różnicowania chondrogenicznego są przechowywane w ciemności w temperaturze 2-8 °C.
    3. Kontynuuj indukcję różnicowania chondrogennego przez około 21 dni; Tymczasem zmieniaj media co 3 dni.
    4. Przygotuj roztwór do barwienia błękitu alkowego w następujący sposób: Najpierw przygotuj 3% kwasu octowego lodowca w ddH2O (dodaj 3 mL kwasu octowego lodowca i napełnij do 100 mL ddH2O). Następnie przygotuj roztwór roboczy błękitu alcjanskiego, dodając 20 mg do 20 ml 3% roztworu kwasu lodowcowego, utrzymując go stojącą przez około 30 minut, a następnie filtruj za pomocą filtra 0,22 μm lub 0,45 μm, aby usunąć wszelkie osady.
    5. Po zakończeniu okresu indukcji przepłucz komórki dwukrotnie PBS, następnie utrwal je za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny (0,75 mL/dołek) i odstaw przez 15 minut. Następnie umyj komórki dwukrotnie za pomocą PBS (1 mL/well). Upewnij się, że komórki inkubują przez 5 minut za każdym razem.
      UWAGA: Komórki utrzymywane w ośrodkach proliferacyjnych (jak opisano w kroku 1.2) są wykorzystywane jako komórki kontrolne, nieindukowane.
    6. Inkubuj ustalone komórki w roztworze roboczym o stężeniu 0,1% błękitu alcjanu przez około 60 minut w temperaturze 37 °C. Przepłukuj komórki ddH2O dwa razy i raz PBS, aby usunąć pozostałe barwniki. Następnie, za pomocą mikroskopowego badania, obserwuj barwione siarczanowe proteoglikany.

4. Izolacja egzosomów/sEV od mediów warunkowanych przez WJ-MSC

  1. Ponownie zawiesić WJ-MSC w ośrodku do pełnej proliferacji (zgodnie z krokiem 1.2) i zasiać płytki 6-dołkowe z tymi WJ-MSC o gęstości 150 000 komórek/dołek (2 mL media/dołek) i inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnych warunkach przy stężeniu 5%CO2.
  2. Przygotuj środki do zbierania egzosomów wolnych od surowicy (SF) w następujący sposób: Niskoglukozowy Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) uzupełniony 2 mM L-glutaminą, 100 U/mL penicyliną, 100 μg/mL streptomycyną oraz 0,25 μg/mL amfotericyną B.
    UWAGA: Ośrodek kolekcji egzosomów ma taki sam skład jak całkowite medium proliferacyjne (opisane w kroku 1.2), ale bez FBS.
  3. Postępuj według płytek z 6 dołkami (przygotowanych w kroku 4.1) i wymieniaj media co drugi dzień, używając medium proliferacyjnego (jak opisano w kroku 1.2). Obserwuj komórki pod mikroskopem, aż osiągną około 75-80% konfluentności.
  4. Gdy osiągniesz 70% konfluencję, przemyj komórki dwukrotnie PBS (1 mL/dołek), następnie dodaj medium zbiorcze egzosomów wolnych od surowicy (SF) (1,5 mL/dołek) (opisane w kroku 4.2) i inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnych warunkach przy 5%CO2.
  5. Po 48 godzinach pobierz kondicjonowane media WJ-MSC z 6-dołkowych płytek hodowli tkanek umieszczonych w poprzednim etapie w probówkach do wirówek o pojemności 15 mL. Następnie wykonaj następujące sekwencyjne kroki wirowania i filtracji, aby oczyścić zebrane kondicjonowane medium47.
    UWAGA: Używając barwnika wykluczającego trypan, a następnie licząc komórki za pomocą hemocytometru, należy oceńcie procentowej żywotności komórek początkowo użytych do uzyskania pobranych podłoży warunkowanych; Żywotne komórki powinny idealnie przekraczać 90%. Następnie przechowuj zebrany pellet komórkowy w temperaturze -80 °C na wypadek ewentualnych przyszłych badań.
    1. Wirówkuj zebrane kondycjonowane medium w dawce 300 x g przez 10 minut w 4 °C, aby pozbyć się zawieszonych komórek. Następnie zbiera się supernatant i wykonuje kolejny krok wirowania dla tego zebranego supernatantu (ośrodka kondicjonalnego).
    2. Wiruj podłoże kondycjonowane z kroku 4.5.1 w 3000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby pozbyć się martwych komórek oraz zanieczyszczenia komórkowych.
      UWAGA: Etapy wirowania najlepiej przeprowadza się w temperaturze 4 °C, ale można je również wykonywać w temperaturze pokojowej, co daje podobne rezultaty.
    3. Przefiltruj supernatant uzyskany w poprzednim etapie, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm do nowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 mL, aby pozbyć się resztek zanieczyszczeń komórkowych i dużych EV.
      UWAGA: Filtrowane medium kondycjonowane może być natychmiast użyte do kolejnych kroków izolacji egzosomów/sEV, przechowywane w lodówce w temperaturze 4 °C i używane nie dłużej niż 3 dni, lub przechowywane w -80 °C do długotrwałego przechowywania do czasu wyizolowania egzosomów/sEV. Oczyszczone, kondycjonowane nośniki przechowywane w temperaturze -80 °C preferowane są przetwarzane w maksymalnym czasie 1-3 miesięcy; Im szybciej, tym lepiej.
  6. Włóż 7,5 mL oczyszczonego podłoża kondycjonowanego (uzyskanego z etapu 4,5) do rurki wirówki o pojemności 15 mL i dodaj 1,5 mL odczynnika. Dodaj odczynnik do ośrodka w proporcji 1:5 (czyli 1 mL odczynnika wydzielającego Exoquick-TC na każde 5 mL ośrodka). Następnie odwracaj rurkę w górę i w dół i potrząśnij nią kilkakrotnie, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie odczynnika wytrącającego z podłożem.
    UWAGA: Odczynnikiem wytrącającym jest ciężki, lepki odczynnik. W związku z tym wymagana objętość powinna być pobierana powoli i ostrożnie, aby zapewnić pełne przekazanie zamierzonej objętości.
  7. Przechowuj tubkę z medium z odczynnikiem wytrącającym 4 °C w pozycji stojącej przez noc przez około 16 godzin (co najmniej 12 godzin).
  8. Następnego dnia wiruj mieszankę odczynników z medium i wytrącającym w 1500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu pellet egzosomów/sEVs pojawia się jako bardzo mały, biały lub beżowy pellet, który osiadł na dnie rurki.
    UWAGA: Ten etap wirowania można również wykonać w temperaturze pokojowej, z podobnymi efektami. Jeśli pelet egzosomu/sEVs nie jest widoczny na końcu tego etapu wirowania, można dodać dodatkowy czas wirowania w dawce 3000 x g , co daje dodatkowe 20-30 minut w temperaturze 4 °C. Czasami pelet egzosomów/EV pozostaje niewidoczny nawet po dłuższym czasie wirowania, co oznacza, że egzosomów/EV jest niewielka. W takim przypadku należy kontynuować procedurę, pozostawiając dolne 5-10 μL rurki.
  9. Aspiruj supernatant i wiruj w redukcji resztkowego medium/mieszaniny odczynników wytrącających w ilości 1500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Następnie bardzo ostrożnie aspiruj pozostałe ślady płynu, nie zakłócając wytrąconych egzosomów/sEV pelletu.
  10. Zawiesz egzosomy/sEV w 100-300 μL sterylnego PBS, zgodnie z rozmiarem i widocznością pelletu. Następnie egzosomy/sEV mogą być natychmiast wykorzystane lub przechowywane w ultrazamrażarce w temperaturze -80 °C do kolejnych eksperymentów.
    UWAGA: W przypadku rozpoczęcia od więcej niż jednej rurki wirówki dla tego samego ośrodka (opisanego w kroku 4.9), gdy granulki egzosomów/sEV (uzyskane w kroku 4.10) są niewidoczne, egzosomy/sEV zebrane ze wszystkich mogą być zgrupowane przy użyciu około 100-300 μL sterylnego PBS, aby zawiesić je wszystkie razem.
  11. Ilościowo określ zebrane egzosomy/sEV względem ich zawartości białek za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu do ilościowania białek z kwasem bicinchoninowym (BCA), zgodnie z zaleceniami producenta.
    UWAGA: Schematyczne przedstawienie wszystkich kroków izolacji egzosomów/sEV wyprowadzonych z WJ-MSC znajduje się na Rysunku 2.

5. Obrazowanie izolowanych egzosomów/sEV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

  1. Zawiesz świeżo izolowane egzosomy/sEV w 100-300 μL sterylnego PBS zgodnie z rozmiarem i widocznością pelletu (jak opisano wcześniej w kroku 4.11).
    UWAGA: Znacznie lepiej używać świeżo izolowanych egzosomów/sEV do obrazowania TEM
  2. Pipetą zawiesz 20 μL egzosomów/sEV na kratę pokrytą węglem i pozostawij do wyschnięcia przez 10 minut.
  3. Napraw umieszczone egzosomy/sEV za pomocą roztworu glutaraldehydu (2% w wodzie destylowanej) przez około 15 minut.
  4. Następnie barw stałe egzosomy/sEV 2% acetanem uranylu i pozostawiaj na około 3 minuty w ciemności, a następnie obejrzyj je pod mikroskopem elektronowym transmisyjnego (TEM) (powiększenie 20000) według domyślnych ustawień TEM.

6. Określenie średniego rozmiaru izolowanych egzosomów/sEV za pomocą analizatora rozmiarów cząstek

  1. Rozcieńczaj świeżo wyizolowane egzosomy/sEV z jałowym pH PBS 7,4 w stosunku 1:250.
  2. Zmierz średni rozkład rozmiarów cząstek izolowanych egzosomów/sEV za pomocą analizatora rozmiarów cząstek w temperaturze 25 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja i charakterystyka WJ-MSC

Jak pokazano na Rysunku 3, małe komórki przypominające fibroblasty pojawiły się początkowo pod i otaczające tkanki roślin WJ w ciągu 5-10 dni po zasiewaniu tych roślin (Rysunek 3A). Te uwolnione WJ-MSC nadal się mnożą i zwykle osiągają około 80% konfluencji w ciągu 14-18 dni po izolacji. Warto zauważyć, że tkanki roślin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole mogliśmy przedstawić szczegółowe kroki izolujące WJ-MSC z ludzkiej tkanki UC oraz izolować ich pochodzące egzosomy/sEV. UC to łatwo dostępne, nieinwazyjne źródło do pozyskiwania MSC i nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt do zbierania lub przetwarzania 11,15,30,32,48. Stosowane są różne protokoły do izolacji WJ-MSC z tkanki UC. Zasadniczo, w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy współautorzy deklarują brak konfliktu interesów związanych z tą pracą.

Podziękowania

Prace te zostały częściowo sfinansowane przez Uniwersytet Ain Shams – Strategic Plan Research Support Grant (2024/2025) w Egipcie oraz Nanotechnology Research Center (NTRC) – Access Award (2019/2020), The British University in Egypt (BUE), Kair, Egipt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Wodorotlenek amonuFisher Scientific, Niemcy1336-21-6
Przeciwciała dla ludzkiego CD-105, FITCR& D systems Inc., MN, USAFAB10971F
Przeciwciało dla ludzkiego CD-14, PEBeckman Coulter, USAIM0650U
Przeciwciało dla ludzkiego CD-34, PEBeckman Coulter, USAIM1420
Przeciwciała dla ludzkiego CD-44, PEBeckman Coulter, USAA32537
Przeciwciało dla ludzkiego CD-73, PER& D systems Inc., MN, USAFAB5795P
Przeciwciało dla ludzkiego CD-90, PER& D systems Inc., MN, USAFAB2067P
Przeciwciało dla człowieka HLA-DR, FITCBeckman Coulter, USAIM1638U
Zestaw do ilościowania białka z kwasem bicinchoninowym (BCA)Thermofisher23227
Szafa na bezpieczeństwo biologiczne, przepływ laminarny, MSC AdvantageThermo Scientific, USA
CO2 Inkubator, Direct FormaThermo Scientific, USA
Wirówka chłodzącaSigma, Niemcy
Wirówka chłodzącaEppendorf, Niemcy
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter, FL, USA
Dimetylsulfotlenek (DMSO)Fisher Scientific, NiemcyBP231-100
DMEM - Niska glukoza 1 g/LLonza, Szwajcaria12-707F
DMEM/F12 Lonza, Szwajcaria12-719F
Woda wolna od DNAse/RNAseGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Etanol absolutny, klasa biologii molekularnejSigma-Aldrich, Niemcy24103
ExoQuick-TCSystem Biosciences (SBI), USAEXOTC50A-1Czynnik wytrącający
Serum bydła płodu (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazylia10270-106
Formaldehyd 37%Fisher ScientificBP531-500
Kwas octowy lodowcowySigma Aldrich, NiemcyA38S-500
Roztwór glutaraldehydu  SigmaG7776
Kwas solny (HCl)Fisher Scientific, NiemcyA144-212
Mikroskop odwróconyOlympus, Japonia
L-GlutaminaGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Mezenchymalny zestaw do funkcjonalnej identyfikacji komórek macierzystych  R& D systems Inc., MN, USASC006
Czytnik mikropłytChromate, Awareness Technologies, USA
Barwa olejowaSigma-Aldrich, USAO0625
Penicylina-Streptomycyna-AmfocerycynaGibco Thermo Fisher, USA15240062
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x, bez Ca/MgLonza, SzwajcariaBE17-516F
Kąpiel wodna z trzęseniemDaihan Wisebath, Korea
Filtr strzykawkowy, 0,2 mikronaCorning, USA431224
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEM-1200EX II, Jeol, Niemcy
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsyna-Versene-EDTA, 1xLonza, SzwajcariaCC-5012
Roztwór octana uranilu (2%)Elektronon Microsopy Sciences, USA22400-2
Spektrofotometr UV-widzialnyShimadzu, Japonia
WirSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Wielka Brytania Analizator rozmiarów cząstek

Bibliografia

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MSC z galaretki Whartonowiizolacja egzosom wtkanka p powinytechnika eksplantacjiimmunofenotypowaniemarkery powierzchniowetransmisyjna mikroskopia elektronowaanaliza wielko ci cz stek
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.