Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny do pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych w celu oceny dawki ekspozycji wewnętrznej na poziomie indywidualnej ekspozycji na cząstki stałe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi płucne wykazują zależny od dawki wzór w cząsteczkach fagocytyzujących. Po pochłonięciu makrofagi te są następnie wydalane z plwociną, dzięki czemu makrofagi i cząstki stają się widoczne i możliwe do zmierzenia pod mikroskopem świetlnym. Warto zauważyć, że węgiel elementarny w ciele ssaków pochodzi wyłącznie z zanieczyszczeń zewnętrznych. W związku z tym zawartość węgla w makrofagach dróg oddechowych (CCAM) służy jako ważny biomarker narażenia, dokładnie szacujący indywidualne narażenie na cząstki stałe (PM) zawierające węgiel. W tym artykule przedstawiono protokół obejmujący pobieranie, konserwację, przetwarzanie, przygotowywanie i barwienie szkiełka, a także pozyskiwanie i analizę zdjęć makrofagów. Po usunięciu jąder makrofagów obliczono proporcję obszaru cytoplazmy zajmowanego przez cząstki węgla (PCOC) w celu ilościowego określenia zawartości węgla w każdym makrofagu. Wyniki wskazują na podwyższony poziom CCAM po ekspozycji na PM zawierający węgiel. Podsumowując, ta nieinwazyjna, precyzyjna, niezawodna i ustandaryzowana metoda umożliwia bezpośredni pomiar cząstek węgla w komórkach docelowych i jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania na dużą skalę poszczególnych CCAM za pomocą indukowanej plwociny.
Wprowadzenie
Zanieczyszczenie powietrza atmosferycznego wiąże się ze zgonami z powodu chorób układu oddechowego i sercowo-naczyniowego, stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego1,2. Dane epidemiologiczne wskazują, że przewlekłe narażenie na pył zawieszony o średnicy mniejszej lub równej 2,5 μm (PM2,5) jest odpowiedzialne za przedwczesne zgony od 4 do 9 milionów ludzi na całym świecie. PM2,5 został uznany za piąty najważniejszy czynnik ryzyka globalnej śmiertelności w badaniu Global Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study (GBD) z 2015 r.3,4,5,6. Badania wykazały, że przestrzeganie wytycznych WHO dotyczących zanieczyszczenia powietrza może zapobiec 51 213 zgonom rocznie z powodu narażenia na PM2,53. Obecnie w większości badań brakuje oceny narażenia wewnątrzosobniczego i opierają się one jedynie na surowych ocenach w większych regionalnych punktach monitorowania, które są dalekie od indywidualnych poziomów narażenia. Dostępne biomarkery narażenia wewnętrznego, takie jak WWA z moczem i benzo(a)piren, nie odzwierciedlają związku między narażeniem na cząstki stałe a skutkami zdrowotnymi7,8,9. Prowadzi to do niemożności ustalenia dokładnej zależności od skutków zdrowotnych. W związku z tym poszukiwanie markerów, które odzwierciedlają poziom narażenia na pył zawieszony u danej osoby, jest jednym z kluczy do dokładnej oceny narażenia u danej osoby.
Cząsteczki wdychane do oskrzeli mogą być wydalane wraz z plwociną poprzez oscylacje rzęskowe w oskrzelach. Brak systemu transportu przepływu śluzu rzęskowego w pęcherzykach płucnych oznacza, że główną drogą klirensu dla cząstek dostających się do pęcherzyków płucnych jest fagocytoza i translokacja przez makrofagi10,11. Opierając się na budowie anatomicznej płuc, usuwanie nierozpuszczalnych cząstek obcych jest powolne. Dzięki temu cząstki stałe mogą wchodzić w interakcje z komórkami płuc przez dłuższy czas i inicjować różne efekty biologiczne, powodując uszkodzenia tkanki płucnej i innych narządów12,13. Stymulacja przez cząstki stałe prowadzi do aktywacji makrofagów, wywołując kaskadę czynników zapalnych w płucach, które mogą powodować ogólnoustrojową reakcję zapalną14. Biorąc pod uwagę kluczową rolę cytofagii makrofagów w wywoływaniu burz cytokin w płucach, teoretyzuje się, że cząsteczki węgla z makrofagów płucnych mogą odzwierciedlać biologicznie skuteczną dawkę ekspozycji na cząstki stałe w powietrzu jądrzaste węglem15. Ponadto, ponieważ w komórkach ssaków nie dochodzi do agregacji węgla elementarnego, a cząstki zawierające węgiel można obserwować jako czarne cząstki stałe pod mikroskopem świetlnym, zbiór makrofagów pęcherzykowych i oskrzelowych oraz pomiar zawartości węgla w nich może służyć jako marker do oceny narażenia na cząstki stałe16.
To badanie zidentyfikowało metodę dokładnej oceny indywidualnych poziomów narażenia na pył zawieszony, znaną jako Zawartość Węgla w Makrofagach Dróg Oddechowych (CCAM). W szczególności próbki plwociny populacyjnej pobrano po tym, jak uczestnicy wdychali hipertoniczną sól fizjologiczną generowaną przez nebulizator ultradźwiękowy. Próbki te zostały następnie zakonserwowane za pomocą roztworu utrwalającego. Makrofagi dróg oddechowych wyizolowano, zabarwiono i sfotografowano pod mikroskopem świetlnym w celu zidentyfikowania makrofagów zawierających cząstki zawierające węgiel, które następnie określono ilościowo. Metoda ta zapewnia biologiczny marker do dokładnej oceny indywidualnych poziomów narażenia na pył zawieszony. Ustanawia on podstawy metodologiczne do badania związku między narażeniem na pył zawieszony a skutkami zdrowotnymi, służąc jako podstawa badawcza do badania powiązań między narażeniem na pył zawieszony a skutkami zdrowotnymi, takimi jak choroby płuc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie otrzymało zgodę Komisji Etyki Medycznej Instytutu Zdrowia Zawodowego i Kontroli Zatruć, Chińskiego Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (NIOHP201604), z pisemną świadomą zgodą uzyskaną od wszystkich uczestników przed badaniem i pobraniem próbek biologicznych. Do tego badania wybrano osoby pakujące sadzę, które pracowały w fabryce sadzy przez ponad 1 rok i były narażone na działanie aerozoli sadzy. Pracownicy wodociągów w fabryce wodociągów, którzy nie byli narażeni znacząco zawodowo na czynniki szkodliwe, zostali zrekrutowani z okolicy jako populacja kontrolna w celu przeprowadzenia badania. Dla badanej populacji wybrano następujące kryteria włączenia i wyłączenia: Kryteria włączenia dla pakowaczy sadzy obejmowały bezpośredni kontakt z sadzą podczas większości zmian oraz minimum roczną pracę w obszarze ekspozycji na sadzę. Uwzględniono pracowników wodociągów, którzy nie byli narażeni zawodowo na sadzę lub inne zanieczyszczenia w swoim środowisku pracy. Kryteria wykluczenia obejmowały pracowników cierpiących na choroby przewlekłe, takie jak rak, osoby, które zostały poddane ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie w ciągu ostatnich trzech miesięcy, osoby z historią gruźlicy płuc, chirurgii płuc, wirusowego zapalenia mięśnia sercowego, wrodzonej wady serca, niedawnej gorączki lub stanu zapalnego oraz pracownicy, którzy niedawno przyjmowali antybiotyki. Odczynniki i sprzęt używany w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Konserwacja plwociny
- Przygotuj roztwór utrwalający, wykonując poniższe czynności:
- Rozpuść 2% glikolu polietylenowego (PEG1500) w łaźni wodnej. Weź 20 ml stopionego PEG1500 do probówki wirówkowej. Dodaj 20 ml 50% etanolu do probówki wirówkowej i dokładnie wstrząśnij mieszaniną, aby uzyskać ług macierzysty.
- Stopniowo wlewać 40 ml roztworu macierzystego do 960 ml 50% etanolu. Dobrze wstrząsnąć roztworem, aby powstał roztwór utrwalający Saccomanno. Roztwór należy przechowywać w chłodnym, ciemnym miejscu.
- Dodać 20-30 ml przygotowanego roztworu utrwalającego do probówki wirówkowej zawierającej około 2 ml plwociny. Dokładnie wymieszaj zawartość.
UWAGA: Upewnij się, że całkowita objętość nie przekracza 40 ml. - Uszczelnij probówkę wirówkową folią uszczelniającą. Przechowuj go w chłodnym, ciemnym miejscu. Przetransportuj probówkę do laboratorium w celu dalszego przetwarzania, gdy będzie gotowa.
UWAGA: Zawsze rozpuść PEG1500 w łaźni wodnej i stosuj zgodnie z przepisaną dawką.
2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej w plwocinie
- Przygotuj roztwór trawienny, rozpuszczając 0,1 g ditiotreitolu w 100 ml soli fizjologicznej zgodnie z rzeczywistą dawką. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin.
- Odwirować probówkę zawierającą plwocinę o stężeniu 1,998 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant. Dodać równą objętość trawionej plwociny do osadu. Zmieszaj i dokładnie wstrząśnij mieszaniną.
- Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego upłynnienia (10-15 min).
UWAGA: Ciągle potrząsaj rurką podczas procesu skraplania.
- Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego upłynnienia (10-15 min).
- Przefiltrować płynną mieszaninę za pomocą membrany filtracyjnej o średnicy 70 μm.
- Odwirować przefiltrowany roztwór o sile 500 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant, zatrzymując osad komórkowy.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze fosforanowym Duchenne'a. Odwirować ponownie zawieszony roztwór o sile 500 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania czystego osadu komórkowego.
3. Przygotowanie rozmazu komórkowego
- Dodać 200-600 μl buforu fosforanowego do osadu komórkowego. Dokładnie wymieszaj zawartość; Dostosuj objętość bufora na podstawie wyników zliczania komórek (celuj w >1.0 × 105 komórek).
- Weź 20 μl zawiesiny komórkowej i utwórz rozmaz komórkowy za pomocą metody hematokrytu17.
- Pozostaw rozmazany do naturalnego wyschnięcia na powietrzu (w ciągu 48 godzin). Utrwal rozmaz dostępnym w handlu roztworem barwiącym na 10 s.
- Zanurz rozmaz w roztworze barwiącym na 8 sekund. Podczas barwienia delikatnie podnieś szkiełko w górę i w dół, a nadmiar plamy spłucz pod bieżącą wodą.
- Plamić rozmaz w roztworze barwiącym B przez 8 s. Podczas barwienia podnieść szkiełko i spłukać nadmiar plamy pod bieżącą wodą.
UWAGA: Roztwory barwiące A i B są dostępne w dostępnym na rynku zestawie do barwienia. - Zanurz szkiełko w bezwodnym etanolu dwukrotnie, za każdym razem na 2-3 s.
- Po wyschnięciu nałóż odpowiednią ilość neutralnej gumy. Uszczelnij szkiełko za pomocą szkiełek nakrywkowych.
4. Analiza ilościowa CCAM
- Użyj mikroskopu świetlnego z obiektywem z soczewką olejową 100x. Uchwyć obrazy losowo wybranych, dobrze wybarwionych i morfologicznie nienaruszonych makrofagów. Wykonaj losowo 50 zdjęć makrofagów dla każdej próbki.
- Przeprowadź analizę obrazu w oprogramowaniu Image J, wykonując poniższe czynności:
- Zmierz skalę i określ rzeczywistą długość oraz konwersję piksel na piksel (282 piksele = 10 μm). Ustaw skalę w Obraz J (Analizuj > Ustaw skalę), wprowadź Odległość w pikselach, Długość rzeczywista, Jednostka długości (μm) i zaznacz Globalny.
- Użyj nieregularnego kształtu, aby obrysować komórki. Usuń tło (zaznaczenia odręczne, Edycja > Wyczyść na zewnątrz). Zmierz całkowitą powierzchnię komórek (Analizuj > pomiar).
- Wytnij jądro (Edytuj > Wytnij). Konwertuj obraz w skali szarości na czarno-biały (Typ obrazu > > 8 bitów).
- Dostosuj wartość skali szarości specyficzną dla każdego barwienia komórek, aby uzyskać dokładne zliczanie cząstek węgla (Obraz > Dostosuj próg >> Zastosuj, Analizuj >> pomiarze).
- Oblicz zawartość węgla w 50 makrofagach na próbkę na podstawie zmierzonego obszaru i analizy obrazu w oprogramowaniu Image J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Plwocina, utrwalona i przetworzona za pomocą roztworu utrwalającego, wykazała nienaruszoną morfologię makrofagów podczas badania morfologicznego pod mikroskopem optycznym. Makrofagi posiadały wyraźne, okrągłe lub nerkowate, łatwo barwiące się jądra komórkowe. Po barwieniu jądra komórkowe miały kolor niebiesko-fioletowy, natomiast cytoplazma była jasnoróżowa lub jasnoniebieska. W polu widzenia mikroskopu występowały minimalne zanieczyszczenia, co ułatwiło identyfikację komórek. Wewnątrz komórek wyraźnie widoczne były czar...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dotyczący wykorzystania indukowanego CCAM pochodzącego z plwociny jako markera biologicznego wewnętrznego narażenia na pył zawieszony w atmosferze. CCAM można wykryć i określić ilościowo za pomocą mikroskopii optycznej, służąc jako precyzyjny biomarker ekspozycji wewnętrznej odzwierciedlający związek ze skutkami zdrowotnymi. W związku z tym istnieje potrzeba ustanowienia i optymalizacji wygodnej, niezawodnej i wydajnej metody indukowanego przechowywania plwociny ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była finansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82273669, 82241086, 42207488), Program Stypendialny Taishan w prowincji Shandong (nr tsqn202211121) oraz Program Innowacji i Technologii dla Doskonałych Młodych Stypendystów Szkolnictwa Wyższego Prowincji Shandong (2022KJ295).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3 ml sterylne słomki | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 84202ES03 | |
| Probówka wirówkowa 50 ml | Thermo Fisher Scientific, USA | 339652 | |
| Bezwzględny alkohol etylowy | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 64-17-5 | |
| Olejek cedrowy | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD | C805296 | |
| Szybkie barwienie rozwiązanie | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 40748ES76 | |
| Dithiothreitol | Solebo Bio Co., LTD | D8220 | |
| Bufor fosforanowy Duchenne'a (DPBS) | Thermo Fisher Scientific, USA | 14190144 | |
| Kamera mikroskopowa | Olympus Corporation of Japan | DP72 | |
| Neutralna guma drzewna | Solebo Bio Co., LTD | G8590 | |
| Nylonowa membrana filtracyjna 70um | BD Falcon Bioscience, USA | 211755 | |
| Mikroskop optyczny | Olympus Corporation of Japan | BX60 | |
| Glikol polietylenowy | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 25322-68-3 | |
| Ultrawirówka | Thermo Fisher Scientific, USA | SL40R | |
| Szkiełko wiskotyczne | Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co., LTD |
Bibliografia
- Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
- Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
- Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
- Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
- Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
- Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
- Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007(2019).
- Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects. , Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010).
- Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
- Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055(2021).
- Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
- Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119(2022).
- Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487(2020).
- Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242(2021).
- Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
- Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
- Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
- Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282(2021).
- Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172(2021).
- Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
- Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
- Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
- Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
- Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
- Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
- Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
- Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
- Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
- Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
- Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
- Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
