To badanie przedstawia ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oparty na wewnątrzpłucnej inokulacji wielokomórkowych sferoid fluorescencyjnych komórek A549-iRFP. Model podsumowuje kliniczne stadia niedrobnokomórkowego raka płuca i reaguje na cisplatynę, zgodnie z dynamicznym monitorowaniem in vivo fluorescencji na długich falach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) jest wysoce śmiertelną chorobą o złożonym i niejednorodnym mikrośrodowisku nowotworowym. Obecnie powszechne modele zwierzęce oparte na podskórnej inokulacji zawiesin komórek nowotworowych nie oddają mikrośrodowiska guza w NSCLC. W niniejszym artykule opisujemy mysi ortotopowy model ksenoprzeszczepu raka płuc, który wykorzystuje inokulację wewnątrzpłucną trójwymiarowych wielokomórkowych sferoid (MCS). W szczególności fluorescencyjne ludzkie komórki NSCLC (A549-iRFP) hodowano w 96-dołkowych mikropłytkach o niskim przyczepie z kolagenem przez 3 tygodnie w celu utworzenia MCS, które następnie zaszczepiono międzyżebrowo w lewym płucu nagich myszy atymicznych w celu ustalenia ortotopowego modelu raka płuc.
W porównaniu z oryginalną linią komórkową A549, MCS linii komórkowej A549-iRFP reagował podobnie na leki przeciwnowotworowe. Sygnał fluorescencyjny o dużej długości fali komórek A549-iRFP silnie korelował z powszechnymi markerami wzrostu komórek rakowych, w tym objętością sferoidalną, żywotnością komórek i poziomem białek komórkowych, umożliwiając w ten sposób dynamiczne monitorowanie wzrostu raka in vivo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Po inokulacji myszom ksenoprzeszczep MCS A549-iRFP niezawodnie przechodził przez fazy bardzo przypominające stadia kliniczne NSCLC, w tym ekspansję guza pierwotnego, pojawienie się sąsiednich guzów wtórnych i przerzuty komórek rakowych do przeciwległego prawego płuca i odległych narządów. Co więcej, model zareagował na wzorcowy lek przeciw rakowi płuc, cisplatynę, z przewidywaną toksycznością i wolniejszym postępem nowotworu. W związku z tym ten mysi ortotopowy model ksenoprzeszczepu NSCLC posłużyłby jako platforma do podsumowania postępu choroby i ułatwienia opracowania potencjalnych leków przeciwnowotworowych.
Wprowadzenie
Wśród wszystkich zaburzeń onkologicznych, rak płuc nie tylko powoduje największą liczbę ofiar śmiertelnych, ale także generuje drugą co do wielkości liczbę nowych pacjentów każdego roku w USA1. Ten niszczycielski nowotwór złośliwy stanowi główną przeszkodę we współczesnej opiece zdrowotnej, domagając się głębszego zrozumienia jego skomplikowanej biologii i bardziej skutecznych metod terapeutycznych2. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) stanowi 85% przypadków raka płuc i ma tendencję do przekształcania się w guzy lite3. Jednym z największych wyzwań w raku płuc jest dynamiczne i niejednorodne mikro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie na zwierzętach zostało przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na University of the Pacific (protokoły dotyczące zwierząt 19R10 i 22R10). W niniejszym badaniu wykorzystano osiem samców atypowych myszy nudes w wieku 5–6 tygodni, o masie ciała 20–25 g, karmionych wskazaną dietą dla gryzoni i utrzymywanych w warunkach wolnych od patogenów (SPF). Klatki, ściółkę i wodę pitną autoklawowano i regularnie wymieniano. Schemat inokulacji guza u myszy przedstawiono na Rysunku 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole znajdują się w
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Charakterystyka linii A549-iRFP MCS
Sferoidy A549-iRFP (MCS) zostały pomyślnie wyhodowane w mikropłytkach do sferoidów przy zastosowaniu kolagenu i wirowania. Gdy MCS osiągnęły średnicę około 500 µm Po 1 tygodniu zarówno MCS A549, jak i MCS A549-iRFP poddano działaniu różnych leków przeciwnowotworowych i ich formulacji przez 3 dni, a następnie utrzymywano w pożywce wzrostowej wolnej od leków przez kolejne 4 dni. MCS A549-iRFP wykazały wzorzec odpowiedzi ściśle odzwierciedlający odpowiedź komórek maci.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Konstrukcja MCS A549-iRFP jest prostą i wysoce powtarzalną procedurą laboratoryjną i może być przełożona na tworzenie MCS dla wielu linii komórkowych. MCS wygenerowany za pomocą wirowania i kolagenu wykazuje bardziej integralną i solidną strukturę podobną do guza w ciągu 3-4 dni. Ta metoda zapewnia tworzenie wytrzymałych sferoid, które zachowują swoją integralną strukturę przez dłuższy czas, zwykle 2-3 tygodnie lub nawet dłużej, aż zaczną pojawiać się małe pączki. Stosując wirowanie i kolagen, ustandaryzowaliśmy tworzeni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty SAAG i SEED z Uniwersytetu Pacyfiku. Dziękujemy dr. Williamowi Chanowi za udzielenie dostępu do systemu Odyssey Infrared Imaging 205 oraz dr. Johnowi Liveseyowi za udzielenie dostępu do czytnika płytek SpectraMax iD3. Dziękujemy dr Melanie Felmlee za porady techniczne dotyczące protokołów leczenia zwierząt.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 &mikro; L Szklana strzykawka | Hamilton | Część / REF #80601 | |
| Igła 20 G | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14 826D | |
| 96-dołkowa mikropłytka sferoidalna o bardzo niskim stopniu mocowania | Corning | 15-100-173 | |
| A549-iRFP | Imanis Nauki Przyrodnicze | CL082-STAN | |
| AIN-93M Dieta dla dojrzałych gryzoni | Badania dietetyczne, Inc. | ||
| Atymyczna naga mysz | Charles River Laboratories, Inc. | Kod szczepu: 490; homozygotyczny | |
| BCA | Pierce | 23227 | |
| Chlorowodorek buprenorfiny | Patterson Weterynaryjny | numer NDC: 42023-179-05 | |
| Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | |
| Kolagen | Gibco | A1064401 | |
| DMEM | Corning | MT10013CV | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Cytiva HyClone | SH3039603 | |
| ImageJ | Narzędzie open source (https://imagej.net/ij/) | N/A | |
| Image Studio | LI-COR | Wersja 5.2 | |
| Isoflurane | Patterson Weterynaryjny | numer NDC: 17033-0091-25 | |
| Ketamina | Patterson Weterynaryjny | numer NDC: 50989-0161-06 | |
| Mikroskop | Numer modelu Keyence | : BZ-X710 | |
| Matrigel | Corning | CB-40234 | |
| Odyssey Infrared Imaging 205 System | LI-COR | Numer modelu: 9140 | |
| PBS | |||
| Pearl Trilogy | LI-COR | Numer modelu: 9430 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Corning | MT30002CI | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oprogramowanie ReViSP firmy MATLAB | Narzędzie open source na Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) | Nie dotyczy | |
| klipsów chirurgicznych - AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Xylazine | Patterson Veterinary | NDC Numer: 61133-6017-01 |
Bibliografia
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
