Ten protokół opisuje wykonanie kraniektomii przy użyciu szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej na 3-miesięcznej duńskiej świni rasy Landrace. Dostęp odbywa się przez kość czołową i odsłania brzuszną oponę twardą i leżące poniżej półkule mózgowe. Procedura ta pozwala na dostęp do dużej części mózgu świni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostęp do mózgu świni za pomocą szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej Kraniektomia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie świń jako eksperymentalnego modelu zwierzęcego jest szczególnie istotne w badaniach neurobiologicznych, ponieważ ośrodkowy układ nerwowy (OUN) u świń i człowieka ma wiele ważnych właściwości funkcjonalnych i architektonicznych. W związku z tym oczekuje się, że świnie będą odgrywać coraz ważniejszą rolę w przyszłych badaniach nad różnymi chorobami neurologicznymi. W tym miejscu opisano metodę wykonywania kraniektomii przedniej przez kość czołową świni. Po nacięciu linii środkowej, a następnie odsłonięciu kości czołowej świni, stosuje się anatomiczne punkty orientacyjne, aby zapewnić optymalną lokalizację kraniektomii. Poprzez staranne i stopniowe ścieńczenie kości czołowej za pomocą zaokrąglonego wiertła uzyskuje się prostokątny otwór do opony twardej i leżących poniżej półkul mózgowych. Przedstawiona metoda wymaga pewnych materiałów chirurgicznych, w tym pneumatycznej wiertarki szybkoobrotowej, oraz pewnego doświadczenia chirurgicznego. Potencjalne powikłania obejmują niezamierzone uszkodzenia opony twardej lub grzbietowej zatoki strzałkowej. Metoda jest jednak prosta, efektywna czasowo i oferuje badaczom wysoki stopień odtwarzalności. Jeśli technika ta zostanie wykonana prawidłowo, duża część zdrowego mózgu świni zostanie poddana różnym neuromonitorowaniu lub analizom.
Wprowadzenie
Generalnie, modele zwierzęce są używane, gdy praktyczne i/lub etyczne ograniczenia zabraniają korzystania z ludzkich pacjentów do badania chorób lub testowania metod chirurgicznych. Nowatorskie modele zwierzęce są na ogół tworzone w celu dostarczenia nowej wiedzy o wartości translacyjnej dla warunków ludzkich. Gryzonie są często wykorzystywane ze względów praktycznych i finansowych, ale mają ograniczoną wartość translacyjną dla ludzi, zwłaszcza ze względu na znaczne różnice anatomiczne1. Świnie mają jednak kilka zalet w porównaniu z gryzoniami. Nie tylko świnie mają kilka kluczowych cech anatomicznych, fizjologicznych, metabolicznych i genetycznych z ludźmi, ale rozmiar układów narządów świń może być dopasowany wagowo, aby przypominał ludzkie narządy2,3. Daje to świniom wyjątkową rolę wśród chirurgicznych modeli zwierzęcych i w treningu proceduralnym4. Chociaż wykorzystanie modeli świń wymaga pewnych zdolności praktycznych i finansowych w porównaniu z wykorzystaniem gryzoni, świnie stanowią zarówno finansową, jak i etycznie bardziej akceptowalną opcję w porównaniu z wykorzystaniem naczelnych.
Mózg świni jest szczególnie interesujący w translacyjnych badaniach neurologicznych. Po pierwsze, architektura mózgu świni jest podobna do architektury mózgu ludzkiego, ponieważ oba są zdominowane przez istotę białą i gyrencephalic3,5,6. Po drugie, większy rozmiar mózgu u świń w porównaniu z gryzoniami pozwala na użycie sprzętu chirurgicznego i różnych metod obrazowania równoważnych z tymi stosowanymi w warunkach klinicznych7,8. W związku z tym różne modele świń były szeroko stosowane w badaniach neurobiologicznych w ostatnich dziesięcioleciach9. Większość tych modeli ośrodkowego układu nerwowego świń wymaga jednak bezpośredniej analizy tkanki mózgowej, którą można uzyskać na różne sposoby (np. implantacja cewników lub elektrod, biopsje tkanek itp.)10. Ponieważ większość z tych metod wymaga pewnego stopnia instrumentalizacji i bezpośredniego dostępu do mózgu, należy rozważyć różne podejścia do dostępu chirurgicznego.
Ta metoda polega na wykonaniu kraniektomii przedniej przez kość czołową u 3-miesięcznej samicy duńskiej świni rasy Landrace, której podawano środki uspokajające. Ogólnym celem tego manuskryptu jest opisanie metody odsłaniania dużej części brzusznego mózgu świni przez kraniektomię przy użyciu pneumatycznej wiertarki szybkoobrotowej. Pierwszym krokiem jest ustawienie obiektu w odpowiedniej pozycji z uniesioną głową. Ponieważ czaszka świni znacznie różni się od czaszki człowieka, drugi krok polega na zaplanowaniu umiejscowienia kraniektomii przy użyciu różnych anatomicznych punktów orientacyjnych. Trzecim krokiem jest uzyskanie dostępu do leżącej pod spodem opony twardej pokrywającej obie półkule bez jej uszkodzenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w Szpitalu Uniwersyteckim w Aalborgu w Danii, zgodnie z istniejącymi przepisami i za zgodą Duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach (licencja nr 2020-15-0201-00401). Do badań wykorzystano świnie domowe, samice o wadze około 40 kg i wieku 3 miesięcy. Szczegóły dotyczące stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Mieszkanie podmiotu
- Pacjenci przebywający w domu w grupach z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności w zatwierdzonych kojcach przez co najmniej 7 dni przed zabiegiem chirurgicznym, aby zapewnić aklimatyzację.
2. Znieczulenie i monitorowanie
- Uspokoić zwierzę wstrzyknięciem domięśniowym 2 ml/10 kg mieszaniny zawierającej tyletyminę 6,25 mg/ml, ketaminę 6,25 mg/ml, zolazepam 6,25 mg/ml, butorfanol 1,25 mg/ml i ksylazynę 6,25 mg/ml.
- Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na kocu grzewczym, aby zapewnić optymalną termoregulację.
- Zaintubuj pacjenta rurką o rozmiarze 6,57 i przewietrz go mechanicznie nienawilżonym powietrzem, o objętości oddechowej 8 ml / kg i częstości oddechów 16-20 oddechów / min zgodnie z wydechowymi stężeniami CO2 na końcu oddechu <6,0 kPa.
UWAGA: Zapewnia to również prawidłowe umieszczenie rurki w tchawicy. - Utrzymuj znieczulenie przez wdychanie 1% do 2% sewofluranu.
- Ostrożnie nałóż maść okulistyczną na oba oczy pacjenta, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Upewnij się, że stopień znieczulenia jest znieczulony, sprawdzając odruchy rzęskowe i odpowiednio dostosowując sewofluran.
- Wprowadź cewnik do pęcherza moczowego z termometrem do pęcherza pacjenta przez cewkę moczową, aby monitorować temperaturę i zbierać mocz w worku cewnikowym.
- Monitoruj parametry życiowe zwierzęcia przez cały czas trwania zabiegu.
UWAGA: Parametry życiowe obejmują puls, ciągłe ciśnienie tętnicze krwi, temperaturę i CO2 w końcówce oddechu. - Wprowadzić centralny cewnik żylny (osłonka 6 Fr) do prawej żyły szyjnej przez przezskórne nakłucie i używać go do ciągłego wlewu soli fizjologicznej (NaCl, 0,9%), wlewu leku i eutanazji pod koniec badania.
3. Pozycjonowanie zwierząt
- Ułóż osobę w pozycji leżącej z uniesioną głową i ustabilizowaj ją workami z piaskiem, aż kość czołowa znajdzie się prawie poziomo, aby zapewnić optymalną pozycję.
UWAGA: Upewnij się, że głowa jest nieco unieruchomiona, aby zapobiec niepożądanym ruchom. - Ogol włosy z pola operacyjnego za pomocą trymera lub maszynki do golenia.
4. Przygotowanie sprzętu chirurgicznego
- Przygotuj sprzęt chirurgiczny zgodnie z listą w tabeli materiałów.
5. Odsłanianie kości czołowej
- Zidentyfikuj wypukłość karkową i ogonowy aspekt każdego górnego grzebienia oczodołu (Rysunek 1), aby określić oczekiwaną strzałkową linię środkową.
- Rozpocznij od nacięcia linii środkowej za pomocą skalpela nr 24, aby przeciąć zarówno skórę, jak i galea aponeurotica na okostnej kości czołowej.
- Zetrzyj krew wacikami chirurgicznymi.
- Stopniowo oddzielaj galea aponeurotica od leżącej poniżej kości czołowej wokół nacięcia za pomocą 12 mm spłaszczonego rongeur.
- Użyj retraktora chirurgicznego, aby oddzielić galea aponeurotica i odsłonić leżącą pod spodem kość czołową (Ryc. 2).
6. Rozpoznawanie anatomicznych punktów orientacyjnych odsłoniętej kości czołowej
- Zidentyfikuj szew strzałkowy jako odniesienie dla anatomicznej linii środkowej i szwu koronalnego (Ryc. 2).
- Zidentyfikuj trzy struktury kostne za pomocą ręcznego badania palpacyjnego: wypukłość karkową i ogonowy aspekt obu górnych grzebieni oczodołu (Rysunek 1 i Rysunek 3).
UWAGA: Te punkty orientacyjne tworzą trójkąt, w obrębie którego wykonywana jest kraniektomia (Rysunek 1 i Rysunek 4A).
7. Dostęp do opony twardej
- Za pomocą szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej z zaokrąglonym zadziorem pokrytym diamentem (Rysunek 3A), zdefiniuj każdy róg prostokąta w granicach wcześniej zdefiniowanego trójkąta.
- Połącz każdy róg za pomocą zaokrąglonego diamentowego zadzioru o średnicy 4 mm, aby zapewnić prawidłowe położenie otworu ( Rysunek 4B).
- Stopniowo rozrzedzaj kość czołową za pomocą zaokrąglonego diamentowego zadzioru o średnicy 4 mm, aż opona twarda zostanie odsłonięta.
UWAGA: Unikaj pierwszego punktu kontaktu z oponą twardą w linii środkowej, odpowiadającego szwowi strzałkowemu (Ryc. 1), ponieważ tutaj znajduje się duża grzbietowa zatoka strzałkowa. Perforacja w tym miejscu może spowodować znaczny krwotok żylny. - Użyj pierwszego punktu kontaktu z oponą twardą, aby wizualnie ocenić grubość pozostałej kości czołowej.
- Kontynuuj ostrożne przerzedzanie kości czołowej w zdefiniowanym prostokącie za pomocą zaokrąglonego frezu diamentowego o średnicy 4 mm.
UWAGA: Pył kostny należy zachować na późniejszą hemostazę krwawienia z żył lub odsłoniętą gąbczastą kość czołową. - Wsuń 3 mm dysektor pod wystarczająco cieńszą kość wokół płytki kostnej i odłup go delikatnym ręcznym naciskiem, aby rozszerzyć otwór do opony twardej.
UWAGA: Naprzemiennie wiercić i odłupywać kość, aż odsłoniętych zostanie wiele punktów opony twardej wokół płytki kostnej. - Nałóż sterylną sól fizjologiczną za pomocą strzykawki, aby oczyścić widok.
8. Usunięcie płytki kostnej
- Włożyć 3 mm dysektor pod płytkę kostną i stopniowo naciskać w dół na jego uchwyt, aby odłamać płytkę kostną.
UWAGA: Leżąca pod spodem opona twarda powinna być teraz odsłonięta, odsłaniając kontury obu półkul mózgowych (Ryc. 5 i Ryc. 6). - Oceń integralność opony twardej, dokonując oględzin pod kątem wycieków płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
UWAGA: Obie półkule wzniosą się w pulsacji synchronicznej, jeśli nie ma znaczących defektów w oponie twardej. - Zatrzymać drobne krwawienia żylne za pomocą zaoszczędzonego pyłu kostnego lub ostrożnie stosując koagulację monopolarną lub bipolarną z kauteryzacją pod niskim napięciem.
UWAGA: Spodziewane są niewielkie krwawienia żylne z żył emisariuszy lub diploicznych.
9. Ochrona odsłoniętej opony twardej
- Przykryj odsłoniętą oponę twardą sterylnym wacikiem chirurgicznym nasączonym sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu tkanki znajdującej się pod spodem.
10. Zakładanie cewników do mikrodializy (MDC)
- Użyj grzbietowej zatoki strzałkowej jako odniesienia dla linii środkowej. Umieścić cewnik do mikrodializy (MDC) w świetle jednorazowej igły 18 G. Przebić oponę twardą 10 mm bocznie od grzbietowej zatoki strzałkowej igłą pod kątem 10°-15° w kierunku czaszkowo-rostralnym, aż 20 mm igły znajdzie się w tkance.
- Powoli wycofaj igłę, upewniając się, że MDC pozostaje w tym samym miejscu w powierzchownej korze mózgowej.
- Bezpiecznie przymocuj cewnik do pobliskiej skóry, aby zapobiec zwichnięciu MDC.
UWAGA: Upewnij się, że końcówka MDC nie styka się z ostrą końcówką igły, aby uniknąć uszkodzenia. - Powtórz procedurę, używając grzbietowej zatoki strzałkowej jako odniesienia linii środkowej. Umieścić MDC w igle, jak opisano powyżej, i przebić oponę twardą na przeciwległej półkuli 15 mm od linii środkowej z igłą prostopadłą (kąt 90°).
- Wbić igłę na 20 mm przed jej powolnym wycofaniem zgodnie z opisem, pozostawiając MDC w podkorowej tkance mózgowej. Zabezpiecz MDC zgodnie z powyższym opisem.
- Przygotuj jednorazową plastikową strzykawkę o pojemności 2 ml z jednorazową igłą 18 G. Napełnij strzykawkę 0,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
- Wbić oponę twardą 20 mm w bok od linii środkowej, trzymając igłę pod kątem 45° skierowaną w stronę linii środkowej. Powoli wprowadzaj igłę po 1 mm na raz, delikatnie zasysając przy każdym kroku wprowadzania.
- Strzykawkę należy obserwować podczas każdej aspiracji, aż do uzyskania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
- Oddzielić igłę od strzykawki, trzymając igłę w tym samym anatomicznym miejscu. Wprowadzić MDC przez igłę do komory bocznej, aż do wyczucia oporu.
- Bezpiecznie przymocuj MDC taśmą chirurgiczną, jak opisano powyżej.
11. Mikrodializa (MD)
- Podłącz każdy cewnik do mikrodializy (MDC) do oddzielnej pompy do mikrodializy.
- Rozpocznij proces mikrodializy, przepompowując sterylną sól fizjologiczną przez MDC i zbierając ją do odpowiedniej próbki. Zapewnić przepływ przez każdy MDC, obserwując zawartość soli fizjologicznej w każdej próbce.
- Rozpocznij okres kalibracji tkanek trwający 30 minut ciągłej mikrodializy przy natężeniu przepływu 1 μl/min.
12. Eutanazja
- Podać bolus pentobarbitalu dożylnie (50 mg/kg) przez centralny cewnik żylny (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
- Obserwuj krzywe pulsu, ciśnienia krwi i końcowej krzywej CO2 na respiratorze pod kątem płaskiej linii jako potwierdzenia zatrzymania akcji serca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pozycja głowy świni na brzuchu zapewnia chirurgowi optymalny dostęp podczas procedury, a zastosowanie stabilizujących worków z piaskiem zmniejsza ryzyko niezamierzonych przesunięć głowy świni podczas wiercenia.
W trakcie tego pokazania wykorzystano powierzchowne punkty orientacyjne anatomiczne górnej części czaszki świni (obie górne grzebienie oczodołowe oraz grzebień karkowy) (Rysunek 1 i Rysunek 3), aby precyzyjnie zidentyfikować śr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zademonstrowana procedura składa się z kilku kluczowych etapów. Po pierwsze, dokładne zaplanowanie lokalizacji kraniektomii ma kluczowe znaczenie ze względu na skład czaszki świni. Ponieważ grubość kości czołowej świni zwiększa się na krawędziach bocznych, umieszczenie otworu zbyt bocznie11 może utrudnić dotarcie do opony twardej podczas wiercenia. Dodatkowo prawidłowe zlokalizowanie otworu w linii środkowej jest ważne, aby zmniejszyć ryzyko niezamierzonego uszkodzenia leżącej poniżej grzbietowej ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną wyrazić naszą wdzięczność za wsparcie i doświadczenie techniczne, którym podzielił się personel Laboratorium Biomedycznego Szpitala Uniwersyteckiego w Aalborgu, Dania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Plastikowe strzykawki 10 ml | Becton, Dickinson and Company | 303219 | |
| 107 Pompa do mikrodializy | M Dializa | P000127 | 107 Pompa do mikrodializy |
| 2 ml plastikowe strzykawki | Becton, Dickinson and Company | 300928 | |
| 25 mm, igły 18 G | Becton, Dickinson and Company | 304100 | |
| Podgrzewacz Bair Hugger | 3M | B5005241003 | |
| Bair Hugger Koc grzewczy | 3M | B5005241003 | |
| Baterytka do pompy do mikrodializy | M 8001788 | dializyBateria 6V, 106 i Dysekcja pompy MD | |
| Karl Storz | 223535 | Flif 3 mm dysekcja | |
| Rurka dotchawicza rozmiar 6,5 | DVMed | DVM-107860 | Mankiet dotchawiczy |
| Euthasol Vet | Dechra Veterinary Products A/S | 380019 | fentobarbital do eutanazji, 400 mg/ml |
| Farabeuf Rougine | Mahr Chirurgiczny | rougine z płaską główką (12 mm) | |
| Foley Cewnik 12 F | Becton, Dickinson and Company | D175812E | Kotter z wbudowanym czujnikiem |
| termicznym Osłonka dożylna | Coris Avanti | Avanti Cordis Pochewka udowa 6 F | |
| Mikrodializy cewniki mózgu | M Dializa | P000050 | długość membrany 10 mm -trzonek 100 mm 4/szt |
| Strzykawka do mikrodializy | M Dializa | 8010191 | 106 Pompa Strzykawka 20/pkg |
| Mikrofiolki do pobierania próbek mikrodializy | M Dializa | P000001 | Microfiolki 250/pkg |
| Stół | |||
| Pneumatyczna wiertarka szybkoobrotowa | Wiertarka Medtronic | Medtronic Midas Rex 7 | |
| Respirator Primus Drä ger | Respirator z wbudowanym parownikiem do dodatkowego znieczulenia Sevofluran | ||
| Zaokrąglone wiertło diamentowe | Medtronic | 7BA40D-MN | |
| Zwijacz samozabezpieczający | Światowe instrumenty precyzyjne | 501722 | Zwijacz Weitlandera, samonastawny, 14 cm |
| Sterylna sól fizjologiczna | Fresnius Kabi | 805541 | 1000 ml |
| Sterylne wymienniki | |||
| Skalpel chirurgiczny nr 24 | Swann Morton | 5.03396E+12 | Swann Morton Sterylny skalpel jednorazowy nr 24 |
| Zoletil | Vet Virbac | Mieszanka medyczna do indukcji znieczulenia |
Bibliografia
- Mariager, T., Bjarkam, C., Nielsen, H., Bodilsen, J. Experimental animal models for brain abscess: a systematic review. Br J Neurosurg. , 1-8 (2022).
- Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clin Appl. 8, 715-731 (2014).
- Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: A model for human infectious diseases. Trends Microbiol. 20 (1), 50-57 (2012).
- Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Vet Pathol. 49 (2), 344-356 (2012).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31 (5), 728-751 (2007).
- Hoffe, B., Holahan, M. R. The use of pigs as a translational model for studying neurodegenerative diseases. Front Physiol. 10, 838(2019).
- Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the göttingen minipig: Intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. 222 (5), 2093-2114 (2017).
- Hou, N., Du, X., Wu, S. Advances in pig models of human diseases. Animal Model Exp Med. 5 (2), 141-152 (2022).
- Munk, M., Poulsen, F. R., Larsen, L., Nordström, C. H., Nielsen, T. H. Cerebral metabolic changes related to oxidative metabolism in a model of bacterial meningitis induced by lipopolysaccharide. Neurocrit Care. 29 (3), 496-503 (2018).
- Kyllar, M., et al. Radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging of craniofacial structures in pig. J Vet Med C: Anat Histol Embryol. 43 (6), 435-452 (2014).
- Mariager, T., et al. Continuous evaluation of single-dose moxifloxacin concentrations in brain extracellular fluid, cerebrospinal fluid, and plasma: A novel porcine model. J Antimicrobial Chemother. , (2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
