Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Podsumowanie

Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100 μm) i czułości stanowi odpowiednią nieinwazyjną metodę obrazowania w celu uzyskania kompleksowego jakościowego przeglądu naczyń wątrobowych. UFUS ułatwia również ilościowe pomiary mikrokrążenia, mając na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów chorób naczyniowych.

Streszczenie

Nieinwazyjne obrazowanie in vivo naczyń krwionośnych jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów chorobowych u gryzoni. Aby uzyskać wysoką czułość obrazowania mikrokrążenia za pomocą metod ultrasonograficznych Dopplera, preferowane są metody obrazowania wykorzystujące koncepcję ultraszybkiego obrazowania. Zwiększając liczbę klatek na sekundę skanera ultrasonograficznego do tysięcy klatek na sekundę, możliwe staje się zmniejszenie czułości przepływu krwi do 2 mm/s i uzyskanie funkcjonalnych informacji o mikrokrążeniu w porównaniu z czułością około 1 cm/s w konwencjonalnych trybach Dopplera. Podczas gdy ultraszybkie obrazowanie ultrasonograficzne Dopplera (UFUS) zostało przyjęte w neurobiologii, gdzie może rejestrować aktywność mózgu poprzez sprzężenie nerwowo-naczyniowe, stanowi większe wyzwanie podczas obrazowania unaczynienia narządów jamy brzusznej ze względu na większe ruchy związane z oddychaniem. Wątroba, umieszczona anatomicznie pod przeponą, jest szczególnie podatna na ruchy poza płaszczyzną i oscylacyjne ruchy oddechowe. Artefakty te nie tylko niekorzystnie wpływają na obrazowanie dopplerowskie, ale także komplikują analizę anatomiczną struktur naczyniowych i obliczanie parametrów naczyniowych. W tym miejscu przedstawiamy jakościową i ilościową analizę obrazową naczyń krwionośnych wątroby u myszy za pomocą UFUS. Identyfikujemy główne anatomiczne struktury naczyniowe i dostarczamy graficzne ilustracje makroskopowej anatomii wątroby, porównując ją z dogłębną oceną anatomiczną unaczynienia wątroby na podstawie odczytów dopplerowskich. Dodatkowo opracowaliśmy protokół kwantyfikacji do solidnych pomiarów objętości krwi w wątrobie w mikrokrążeniu w czasie. Aby zastanowić się nad dalszymi badaniami, jakościowa analiza naczyniowa zapewnia kompleksowy przegląd i sugeruje ustandaryzowaną terminologię dla badaczy pracujących z mysimi modelami chorób wątroby. Ponadto daje możliwość zastosowania ultradźwięków jako nieinwazyjnej metody uzupełniającej do kontroli ubytków naczyniowych wątroby in vivo i pomiaru funkcjonalnych zmian mikronaczyniowych głęboko w obrębie narządu przed rozwikłaniem anomalii naczyń krwionośnych na poziomie mikronów za pomocą barwienia ex vivo na skrawkach tkanek.

Wprowadzenie

Przedkliniczne modele myszy są powszechnie używane do badania początku i progresji choroby mikronaczyniowej wątroby^1,2. Obserwacja podłużna jest korzystna, ponieważ zmiany w naczyniach włosowatych krwi występują we wczesnym stadium choroby, zanim pojawi się stan zapalny i zwłóknienie, co z czasem może prowadzić do marskości wątroby¹. Aby zbadać postęp choroby, niezbędne są potężne narzędzia do obrazowania do wizualizacji i pomiaru funkcji naczyń krwionośnych in vivo. Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) stanowią odpowiednią metodę ze względu na niski koszt, przenośność, prostotę i możliwość pracy w czasie rzeczywistym, ale także dlatego, że jest to procedura nieinwazyjna i oszczędzająca czas³. W porównaniu z konwencjonalnym USG Dopplerowskim, które może osiągnąć podobną rozdzielczość przestrzenną, ale jest ograniczone do dużego przepływu krwi, UFUS pozwala na wykrycie powolnego przepływu krwi do 2 mm/s z 1 cm/s, co pozwala na zbadanie udziału znacznie mniejszych naczyń krwionośnych⁴. UFUS poprawia czułość, co jest osiągane poprzez transmisje fal płaskich z dużym polem widzenia w pojedynczej insonifikacji, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę, a tym samym liczbę dostępnych obrazów ultrasonograficznych⁵. Duża liczba próbek czasowych poprawia anulowanie sygnału pochodzącego z tkanki i poprawia wykrywanie echa odbitego od rozpraszaczy krwi, zwiększając czułość bez konieczności stosowania środków kontrastowych⁶. Szacując energię echa rozpraszacza krwi za pomocą oszacowania dopplerowskiego mocy, uzyskuje się ilość, która jest proporcjonalna do objętości krwi w każdym pikselu, nawet jeśli naczynia krwionośne są zbyt małe, aby można je było rozdzielić na obrazie⁷.

UFUS oferuje korzystną kombinację rozdzielczości przestrzennej i czasowej, co czyni go odpowiednim narzędziem do jakościowej oceny architektury naczyń wątroby. Chociaż obsługa skanera ultrasonograficznego jest stosunkowo prosta, kompleksowe zrozumienie anatomii wątroby jest wymagane, aby poruszać się po unaczynieniu wątroby różnych płatów wątroby u myszy. Ostatnie badania koncentrowały się na opisie anatomii mysiej wątroby i drzewa naczyniowego wątroby za pomocą mikrotomografii komputerowej 3D (μ-CT)^8,9. Mimo że niektóre różnice morfologiczne między wątrobą człowieka i myszy są dobrze udokumentowane¹⁰, badania przeprowadzone na gryzoniach często przyjmują terminologię anatomiczną odnoszącą się do ludzi, co prowadzi do pewnego zamieszania w kontekście czworonogów. Nawet uznana znormalizowana nomenklatura, taka jak Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), nie zawiera wystarczających informacji na temat spójnej terminologii dla struktur naczyniowych wątroby u gryzoni¹¹. Oprócz wyzwania, jakim są słabo udokumentowane struktury anatomiczne u gryzoni, pojawiają się jeszcze większe trudności w interpretacji odczytów ultrasonograficznych, zwłaszcza gdy przewiduje się powtarzalne podejście.

Uzyskanie nieinwazyjnych informacji funkcjonalnych o żywych organach w różnych skalach przestrzennych stanowi wyzwanie dla obrazowania in vivo³. Zaawansowane metody obrazowania wątroby, takie jak tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny i angiografia (MRI/MRA) lub konwencjonalne obrazowanie dopplerowskie wykorzystujące skupione fale, są niezbędne do oceny postępu choroby, ale nie są w stanie uchwycić większości dynamiki przepływu krwi, z wyjątkiem obrazowania fotoakustycznego^12,13,14. UFUS ma wysoką czułość i może wykrywać powolny przepływ krwi w małych naczyniach, który nie jest ograniczony do przepływu większego niż centymetr na sekundę^4,15. Niedawno opracowaliśmy niestandardową metodę obrazowania opartą na rozważaniach anatomicznych przy użyciu UFUS, umożliwiającą wiarygodny pomiar objętości krwi w wątrobie w modelu mysim z rozszerzeniem naczyń krwionośnych¹⁶.

W tym protokole opisujemy procedurę nieinwazyjnego obrazowania wątroby metodą UFUS za pomocą dostępnej na rynku platformy ultradźwiękowej, pierwotnie opracowanej do funkcjonalnego obrazowania mózgu. Aby usprawnić proces i usprawnić wyszukiwanie informacji, oferujemy kompleksową ilustrację wątroby myszy z anatomiczną nomenklaturą i kompletną metodą analizy. Dodatkowo zapewniamy szczegółową reprezentację uzyskanych odczytów obrazowych jako odniesienie, wskazując wspólne struktury anatomiczne i punkty orientacyjne, aby pomóc w wyborze płaszczyzny zależnej od operatora. Ponadto zamieszczamy odpowiednią ilustrację zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz naczyń krwionośnych wątroby.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z prawodawstwem europejskim (Dyrektywa 2010/63/UE) oraz wytycznymi rządu holenderskiego i zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie.

1. Przygotowanie myszy do obrazowania UFUS (Czas ~ 10 min)

1. Przygotowanie stanowiska do obrazowania
   1. Odwirować żel transmisyjny ultradźwięków w probówkach o pojemności 50 ml o pojemności 100 x g przez 3-5 minut, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
   2. Włącz poduszkę grzewczą i rozgrzej do 35 °C. Napełnij wydrukowany w 3D zbiornik na wodę wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Pęcherzyki wody lub małe cząstki obecne w wodzie mogą zakłócać pomiar dopplerowski.
2. Znieczulenie zwierzęcia
   1. Zważ zwierzę. Wykorzystano samce i samice z miotu w wieku 8-16 tygodni o masie ciała 19-32 g. Przygotować mieszankę znieczulającą składającą się z ketaminy w dawce 100 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg w 0,9% NaCl. Codziennie przygotowuj mieszaninę sterylną i świeżą, ponieważ mieszanina nie jest stabilna i może stracić moc.
      UWAGA: Preferowana masa ciała zwierzęcia wynosi od 23 do 30 g.
   2. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, tj. dolną prawą lub lewą ćwiartkę brzucha, za pomocą gazy i 70% etanolu. Wstrzyknąć dootrzewnowo (ip) 10 μl/g masy ciała za pomocą igły 27G i jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml lub strzykawki insulinowej 30G.
   3. Umieść zwierzę z powrotem w klatce na poduszce grzewczej bez zamykania pokrywy klatki. Minutnik startowy.
      UWAGA: Głębokie znieczulenie powinno trwać około 40 minut. Jeśli pożądana jest dłuższa sesja obrazowania, należy rozważyć zastosowanie znieczulenia odwracalnego, takiego jak mieszaniny ketaminy 60 mg/kg i medetomidyny 0,4 mg/kg w 0,9% NaCl, a następnie odwrócenie poprzez podskórne wstrzyknięcie Atipamezolu 1 mg/kg. Znieczulenie iniekcyjne jest preferowane w stosunku do znieczulenia wziewnego ze względu na konfigurację obrazowania.
   4. Sprawdź skuteczność znieczulenia. Potwierdź, czy znieczulenie działa, delikatnie szczypiąc tylne łapy po około 5 minutach. Jeśli zwierzę nadal reaguje, odczekaj kolejne 2-3 minuty, aby uzyskać pełne znieczulenie.
   5. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i urazom oczu, gdy zwierzę głęboko śpi. Ponownie sprawdź odruchy i rozpocznij procedurę dopiero wtedy, gdy zwierzę nie wykaże żadnej reakcji na szczypanie.
3. Przygotowanie obszaru obrazowania (Rysunek 1)
   1. Delikatnie przytnij brzuch zwierzęcia trymerem weterynarza, gdy jest umieszczony na poduszce grzewczej. Wykonuj przycinanie bardzo delikatnie, bez uciskania klatki piersiowej lub brzucha.
   2. Krem do depilacji należy stosować nie dłużej niż 2 minuty
      UWAGA: Nie należy wydłużać czasu inkubacji kremu do depilacji, ponieważ może to spowodować stan zapalny skóry. Wpływa to nie tylko na jakość obrazowania, ale także może powodować dyskomfort u zwierzęcia.
   3. Usuń krem do depilacji papierowymi chusteczkami i delikatnie wyczyść ciepłą wodą.
4. Ustaw zwierzę i konfigurację obrazowania do pomiarów dopplerowskich (Rysunek 2A).
   1. Ułóż zwierzę grzbietowo na poduszce grzewczej i delikatnie zabezpiecz łapy taśmą. Nawilż skórę niewielką ilością ciepłej wody.
   2. Odwirowany żel transmisyjny do transmisji ultradźwięków nanieść bezpośrednio na ogoloną skórę za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza mogą wpływać na obrazowanie dopplerowskie i powodować artefakty.
   3. Umieść wydrukowany w 3D zbiornik na wodę wypełniony wodą nad zwierzęciem. Upewnij się, że wysokość zbiornika na wodę jest odpowiednia dla zwierzęcia, około 1 mm nad nim i nie ściska zwierzęcia.
   4. Sprawdź, czy między żelem transmisyjnym do ultradźwięków a termoplastycznym tworzywem z polimetylopentenu (PMP) w zbiorniku na wodę nie ma powietrza.

2. Działanie sondy i wybór płaszczyzny (Czas ~ 10 min)

1. Uruchom oprogramowanie i utwórz sesję eksperymentalną w systemie. Uruchom oprogramowanie do skanowania.
   UWAGA: Oprogramowanie do skanowania jest zintegrowane z systemem.
2. Wyśrodkuj silniki, klikając Tak w wyskakującym okienku. System zmotoryzowany służy do zdalnego sterowania sondą za pomocą oprogramowania skanującego. Centrując silniki, sonda będzie się automatycznie poruszać w trzech kierunkach, czyli pionowo, na boki i obracać. Upewnij się, że żadne przedmioty nie utrudniają trajektorii sondy, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wyśrodkować silniki; Niezastosowanie się do tego może prowadzić do dysfunkcji oprogramowania.
3. Utwórz nową sesję eksperymentalną, wybierając pozycję Sesja z menu. Wypełnij wymagane informacje w panelu sesji, w tym projekt, temat, sesję, nazwę użytkownika, komentarz i tag. Kliknij przycisk Validate.
   UWAGA: Sesja musi zostać utworzona przed pobraniem lub zapisaniem danych obrazowania. Informacje o sesji można zmienić podczas eksperymentu, ale należy pamiętać, że spowoduje to również zmianę miejsca docelowego zapisywania danych.
4. Ustaw sondę. Liniowa sonda ultradźwiękowa 15 MHz ze 128 elementami jest podłączona do systemu poprzez zmotoryzowany układ złożony z czteroosiowego modułu silnika, czyli trzech kierunków ruchu translacyjnego i jednego obrotowego.
   1. Przejdź do menu Przesuń sondę i użyj sterowanego komputerowo systemu pozycjonowania, aby wprowadzić sondę do wody w wydrukowanym w 3D zbiorniku na wodę. Użyj przycisków sterujących wskazanych w pozycji sondy, aby przesunąć silniki, definiując kroki w mm dla ruchu translacyjnego (X, Y i Z) lub w ° dla ruchu obrotowego (R). Aby zapobiec wypadkom w kierunku Z, zdefiniuj granicę Z w Safety.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby elementy sondy miały kontakt z wodą. Należy jednak unikać całkowitego wkładania sondy do wody, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sprzętu. Jeśli silniki nie mogą osiągnąć pozycji, wyświetlane jest ostrzeżenie Poza obszarem roboczym.
   2. Zapisz współrzędne jako pozycję odniesienia, klikając Ustaw punkt początkowy. Nie modyfikuj translacji i obrotów jednocześnie, ponieważ R jest względne w stosunku do X, Y i Z. Zawsze klikaj Ustaw punkt początkowy przed modyfikacją R.
   3. Definiowanie parametrów obrazowania i wizualizacji. Przejdź do menu Podgląd na żywo i kliknij przycisk Odtwórz, aby wybrać płaszczyznę zainteresowania.
      UWAGA: Uruchamiaj podgląd na żywo lub akwizycję tylko wtedy, gdy elementy sondy ultradźwiękowej są otoczone medium dopasowanym do impedancji akustycznej, aby zapewnić żywotność sprzętu i zapobiec przegrzaniu.
5. Wybierz parametry obrazowania w Preset.
   1. Załaduj ultraczułą sekwencję ultradźwiękową Dopplera 10 ms za pomocą przycisku Load Sequence, na przykład 11 złożonych fal płaskich (kąty od -10° do 10°) o napięciu obrazowania 25 V i szybkości odświeżania Dopplera 10 ms.
      UWAGA: Nie ma potrzeby stosowania szybkiej sekwencji dopplerowskiej (np. 10 ms) w celu zobrazowania i przefiltrowania ruchów oddechowych narządu podczas analizy.
   2. Umożliwia zdefiniowanie głębokości obrazowania w zakresie od 1 mm do 50 mm, przy maksymalnej głębokości obrazowania wynoszącej 50 mm. Ustawienie domyślne to głębokość 9 mm od 1 mm do 10 mm, przy zalecanej głębokości od 2 mm do 12 mm.
      UWAGA: W zależności od wielkości zwierzęcia i zbiornika na wodę, głębokość obrazowania może być dostosowana do konkretnych potrzeb.
6. Wybierz parametry wizualizacji.
   1. Wybierz Dopplera, aby zobrazować układ naczyniowy.
      UWAGA: Intensywność pikseli w A.U. reprezentuje objętość krwi i powinna być porównywana tylko w przypadku korzystania z tej samej sondy i sekwencji.
   2. Wybierz opcję Uśrednianie, aby zastosować uśrednianie czasowe w celu zoptymalizowania stosunku sygnału do szumu.
      UWAGA: Czasowe uśrednianie obrazów zwiększa jakość obrazu, ale zmniejsza liczbę klatek na sekundę. W zależności od celu należy dokonać odpowiedniego kompromisu.
   3. Wybierz opcję Kompresja obrazu: logarytmiczna (wysoka), pierwiastek kwadratowy (pośrednia) lub liniowa (niska). Alternatywnie, dostosuj zakres kontrastu automatycznie lub ręcznie za pomocą suwaków dla opcji wysokiego i niskiego kontrastu.
      UWAGA: Wybór kompresji obrazu nie ma wpływu na dane; Ma to wpływ tylko na wyświetlanie obrazowania w czasie rzeczywistym.
   4. Wybierz skalę mapy kolorów od czarnej do białej, zaznaczając opcję Szary, lub od czerwonawo-czarnej do żółtej, zaznaczając opcję Gorący.
7. Wybór płaszczyzny (Rysunek 2B)
   1. Wybierz płaszczyznę obrazowania na anatomicznych punktach orientacyjnych. Przełączaj się między wizualizacją Dopplera a trybem B, aby zapoznać się z anatomią płatów wątroby i naczyń krwionośnych.
   2. Zatrzymaj podgląd na żywo, klikając ikonę Zatrzymaj.
   3. Przejdź do menu Przesuń sondę, aby poruszać się po sondzie i wybierz płaszczyznę, klikając Ustaw punkt początkowy, aby zapisać współrzędne jako pozycję odniesienia. Upewnij się, że drzewo naczyniowe jest dobrze zdefiniowane i widoczne z jak najmniejszym sygnałem poza płaszczyzną.
   4. Wróć do menu Podgląd na żywo i kliknij ikonę Zatrzymaj.

3. Akwizycja skanu dopplerowskiego (Czas ~ 20 min)

1. Uruchom akwizycję dopplerowską z szybkością 10 ms.
   1. Przejdź do menu fUS 2D, aby zobrazować zmiany hemodynamiczne w czasie w określonej pozycji (Rysunek 3). W celu zwiększenia kontrastu należy podać bolus 50 μl dożylnie (iv) wstrzyknięte mikropęcherzyki o stężeniu 2 x 10⁸ mikropęcherzyków na ml do żyły ogonowej.
   2. W kranie Preset (Zaprogramowane polecenie) określ całkowity czas nagrywania w sekundach (30 s). Wybierz tryb ciągły bez przerw między obrazami, ustawiając Czas między obrazami na 0 s.
   3. Naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć akwizycję 2D. Nagrywanie można anulować, naciskając przycisk Stop. Dane mogą zostać utracone, jeśli pobieranie zostanie przerwane przed zakończeniem.
2. Wizualizacja i adaptacja pozyskanego nagrania.
   1. W razie potrzeby zmodyfikuj kontrast i mapę kolorów w obszarze Wizualizacja. W razie potrzeby odtwórz ponownie nagranie, przewijając klatki za pomocą suwaka, który jest zawarty w funkcji Czas.
3. Zapisz dane.
   1. Podaj nazwę uzyskanego nagrania, aby zapisać plik w formacie .scan w folderze sesji. Wyskakujące okienko do zapisania danych jest automatycznie proponowane na końcu każdego nagrania. Dane są zapisywane automatycznie.
4. Uruchom kolejną akwizycję, klikając kartę Preset (Ustawienia wstępne) i powtórz czynność od kroku 3.1.1
.
5. Usuń konfigurację obrazowania i zajmij się zwierzęciem.
   1. Przejdź do menu Przesuń sondę, aby przesunąć sondę w pionie na zewnątrz wydrukowanego w 3D zbiornika na wodę. Usuń zestaw i żel ultradźwiękowy i odczep zwierzę.
   2. Poddaj zwierzę eutanazji, gdy projekt eksperymentalny osiągnie punkt końcowy; w przeciwnym razie przejdź do następujących kroków.
   3. Nałóż trochę kremu nawilżającego na ogolony obszar skóry zwierzęcia, jeśli planowane są pomiary podłużne.
   4. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i pozwól mu obudzić się z narkozy pod lampą grzewczą, aby zapobiec hipotermii. Monitoruj zwierzę podczas rekonwalescencji.
   5. Umieść zwierzę z powrotem w indywidualnie wentylowanym stojaku na klatkę, gdy znów będzie normalnie chodzić. Zakończ eksperymenty laboratoryjne na zwierzętach przed analizą zestawu danych.

4. Analiza ilościowa (Czas ~ 1 h)

1. Otwórz skrypt analizy gui_analysis.m dostępny w pliku uzupełniającym 1.
2. Wybierz skan i ustaw parametry ilościowe w ustawieniach: 10 obszarów zainteresowania (ROI) o rozmiarze woksela 2 x 2. Wybierz 40 ms dla każdej klatki, aby wykonać integrację Dopplera.
3. Narysuj obwód naczyń krwionośnych narządu; 10 ROI jest automatycznie ustawianych między wyraźnie widocznymi tętnicami i w razie potrzeby można je regulować ręcznie (Rysunek 4A). Zamknij ruchome okno dialogowe, gdy położenie jest zadowalające. Zapewnij stabilną akwizycję (Rysunek 4B) w celu solidnego obliczenia objętości krwi, unikając akwizycji dotkniętych silnymi artefaktami ruchu (Rysunek 4C).
4. Określ ilościowo średnią objętość krwi wątrobowej w A.U. dla całkowitych 10 ROI, automatycznie szacując średnią i odchylenie standardowe wartości cichej ramki w ciągu 30 sekund nagrania (Rysunek 4D).
   UWAGA: Tabelę danych intensywności ROI można skopiować/wkleić bezpośrednio do pliku arkusza kalkulacyjnego.
5. Powtórz analizę dla co najmniej dwóch dodatkowych płaszczyzn, -0,3 mm i -0,6 mm, w kierunku ogonowym. Określ ilościowo wszystkie dane akwizycji przed wykonaniem analizy statystycznej.
6. Sprawdź odchylenie standardowe intensywności na całym obrazie i wyznacz punkt odcięcia jako średnią ogólną (μ) z 2 odchyleniami standardowymi (2σ), aby obiektywnie wykluczyć pomiary podatne na artefakty ruchu (Rysunek 4E).
   UWAGA: Średnia i odchylenie standardowe wartości cichej ramki oszacowane dla całego obrazu są podane w pierwszym wierszu tabeli danych.
   UWAGA: Artefakty ruchu uniemożliwiają solidną kwantyfikację i powinny być obiektywnie zidentyfikowane na podstawie analizy całego obrazu czasowego.
7. Weźmy średnią wszystkich średnich objętości krwi wątrobowej oznaczoną ilościowo na 3 różnych płaszczyznach w 30 ROI na zwierzę w kroku 4.3 (Rysunek 4F). Zastosuj test ROUT 1% w oprogramowaniu do analizy statystycznej, aby zidentyfikować odstające zwroty z inwestycji przed uśrednieniem 30 ROI na zwierzę. Aby poprawić oszacowanie objętości krwi, zapisz dodatkowe samoloty na zwierzę.
8. W celu podania produktu leczniczego należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, tj. dolną prawą lub lewą ćwiartkę brzucha, przy użyciu gazy i 70% etanolu. Wstrzyknąć 20 μl soli fizjologicznej lub DMSO ip za pomocą igły 27G i jednorazowej strzykawki 1 ml lub strzykawki insulinowej 30G lub podać 100 μl (hydroksypropylometylocelulozy) przez zgłębnik za pomocą igły wielokrotnego użytku 30G z okrągłą końcówką. Wykreśl dane 3 kohort otrzymujących sól fizjologiczną lub DMSO przez ip lub doustne podawanie (po) celulozy (Rysunek 4G). Wykonuj analizę w sposób ślepy, bez ujawniania stanu i/lub otrzymanego leczenia.
   UWAGA: Podawanie pojazdu nie ma wpływu na pomiary objętości krwi.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, obrazowanie naczyń wątrobowych jest ułatwione w oparciu o standaryzację struktur anatomicznych i odpowiednią terminologię (Rysunek 1). Aby zaproponować ustandaryzowaną nomenklaturę dla badaczy korzystających z przedklinicznych modeli wątroby, schematycznie przedstawiliśmy typowe ułożenie wątroby w jamie brzusznej myszy (Figura 1A), przedstawiliśmy strukturalny układ różnych płatów wątroby (Figura 1B) i określiliśmy sieć naczyń tętniczych (Rysunek 1C). Wyposażone w wiedzę anatomiczną, obrazowanie in vivo UFUS zostało przeprowadzone przy użyciu wydrukowanego w 3D zbiornika na wodę w celu redukcji artefaktów ruchowych (Rysunek 2A). Impedancję akustyczną skorygowano poprzez wprowadzenie sondy do wody i nałożenie żelu transmisyjnego ultradźwięków bezpośrednio na ogoloną skórę zwierzęcia. Przyjmując tę konfigurację, oddychanie i inne artefakty ruchowe są zmniejszone, ponieważ sonda nie ma bezpośredniego kontaktu z poruszającą się klatką piersiową i brzuchem zwierzęcia. W ten sposób zobrazowaliśmy strukturę naczyniową prawego i lewego płata, które są łatwo dostępne dla UFUS ze względu na ich powierzchowne położenie (Rysunek 2B). Inne płaty wątroby, takie jak płat ogoniasty i czworokątny, znajdują się głębiej w ciele, co utrudnia anatomiczną identyfikację prawidłowego unaczynienia wątroby za pomocą UFUS.

Wykazawszy znaczenie standaryzowanych i powszechnie akceptowanych wskazań anatomicznych oraz interpretacji struktur naczyniowych, przeprowadziliśmy wiele skanów Dopplera w różnych płaszczyznach, aby zapewnić kompleksowy przegląd unaczynienia wątroby zobrazowanego przez UFUS ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy (Rysunek 3). Wytyczyliśmy sieć tętniczą wątroby poszczególnych płatów wątroby, tj. Płaty boczne lewy boczny (LL), lewy przyśrodkowy (LM), prawy boczny (RL) i prawy przyśrodkowy (RM). Ponadto oznaczone są główne tętnice, takie jak aorta brzuszna (AA), tętnica wątrobowa (HA), lewa boczna tętnica wątrobowa (LLHA) i prawa przyśrodkowa tętnica wątrobowa (RMHA). Należy zauważyć, że płaty wątroby mogą być nieco inaczej ustawione w zależności od umiejscowienia i ruchu perystaltycznego jelita cienkiego (SM), a także stanu wypełnienia żołądka (S). Ten wzmocniony kontrastem przegląd całego unaczynienia wątroby myszy zapewnia kompleksowy atlas naczyń krwionośnych do obrazowania wątroby in vivo za pomocą UFUS.

Dokładny wybór płaszczyzn anatomicznych jest kluczowy dla uzyskania ilościowego odczytu pochodzącego z jednego płata wątroby. Rzetelne pomiary objętości krwi można uzyskać, ręcznie wybierając 10 obszarów zainteresowania (ROI) na płaszczyznę (Rysunek 4A). Aby uzyskać wiarygodną ocenę ilościową objętości krwi w mikrokrążeniu, potrzebna jest stabilna akwizycja przy niewielkich wahaniach średniej intensywności obrazu. Jest to określane na podstawie średniej wartości obrazu (MIV) całego obrazu w czasie (Rysunek 4B), w przeciwieństwie do nagrania, które jest podatne na znaczne artefakty ruchu (Rysunek 4C). Aby poradzić sobie z artefaktami ruchu, automatyczny wybór niskiego MIV został wykorzystany do wiarygodnego ilościowego określenia pomiarów objętości krwi wątrobowej (Rysunek 4D) poprzez wykreślenie odchylenia standardowego wszystkich czasowych niskich MIV całego obrazu (Rysunek 4E). Skany dopplerowskie wielu płaszczyzn na zwierzę wykazują akceptowalną zmienność wewnątrz- i międzyzmienną w obrębie i między myszami z 3 różnych kohort po leczeniu odstającym na 30 ROI na zwierzę z testem ROUT 1% (Rysunek 4F). Aby poprawić oszacowanie objętości krwi na zwierzę, zaleca się rejestrowanie dodatkowych płaszczyzn lub zwiększenie liczby wybranych ROI na samolot. Ponadto odczyty objętości krwi mogą być wykorzystywane do monitorowania leczenia farmakologicznego, w szczególności ukierunkowanego na mikrokrążenie. Podając nośnik dwiema drogami podawania, wykazaliśmy, że nie ma wpływu na pomiary objętości krwi w wątrobie (Ryc. 4G). Wyniki te wskazują, że podawanie nośnika nie ma wpływu na delecję genu ani na dostarczanie leczenia, co zapewnia solidny projekt eksperymentalny. Ogólnie rzecz biorąc, zapewniono obiektywny i powtarzalny protokół ilościowy dla przyszłych badań mających na celu zbadanie wad naczyniowych wątroby w różnych modelach mysich.

Rysunek 1: Anatomia mysiej wątroby. (A) Schematyczny przegląd ułożenia wątroby w jamie brzusznej pod przeponą myszy. (B) Schematyczny opis mysiej wątroby z czterema płatami wątroby, tj. lewym, czworokątnym, ogoniastym i prawym płatem oraz triadą wrotną składającą się z żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego. (C) Schematyczna ilustracja sieci tętniczej haptycznego układu naczyniowego. Identyfikacja tętnic wątrobowych (HA) i gałęzi (ramus) z podaniem nomenklatury łacińskiej. Skrót: HA = Tętnica wątrobowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ultraszybkie obrazowanie ultrasonograficzne metodą dopplerowską (UFUS) naczyń wątrobowych u myszy. (A) Schematyczny przegląd zestawu eksperymentalnego do nieinwazyjnego obrazowania in vivo. (B) Schematyczne ilustracje kierunku obrazowania i związanych z nim przedstawicieli prawego i lewego płata przyśrodkowego, a także lewego płata bocznego, zobrazowane przez UFUS. Skrót: AA = Aorta brzuszna, LLL = Lewy płat boczny, love my life = Lewy płat przyśrodkowy, RML = Prawy płat przyśrodkowy. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne ultraszybkie badanie dopplerowskie (UFUS) mysiego układu krwionośnego z kontrastem. Przegląd całego unaczynienia wątroby dorosłej myszy zobrazowanej w 3 pozycjach, tj. bocznej prawej, przyśrodkowej i bocznej lewej, w 4 płaszczyznach od czaszki w kierunku ogona. Odniesienie znajduje się bezpośrednio pod membraną zobrazowaną przyśrodkowo i 1 cm bocznie po prawej i lewej stronie, z tymi samymi płaszczyznami w kierunku ogonowym. Skrót: AA = Aorta brzuszna, HA = Tętnica wątrobowa, LLL = Lewy płat boczny, LLHA = Lewa boczna tętnica wątrobowa, love my life = Lewy płat przyśrodkowy, RLL = Prawy płat boczny, RMHA = Prawa przyśrodkowa tętnica wątrobowa, RML = Prawy płat przyśrodkowy, SI = Jelito cienkie, S = Żołądek. Podziałka 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ultraszybki ultrasonograficzny ultrasonograf dopplerowski (UFUS) ilościowy pomiar objętości krwi w wątrobie. (A) Przedstawiciele płata przyśrodkowego (ML) dorosłych myszy kontrolnych typu dzikiego C57BL/6 w płaszczyźnie 1 wybranej pod membraną, odpowiadającej 0 mm, płaszczyźnie 2 na -0,3 mm i płaszczyźnie 3 na -0,6 mm z wyborem 10 obszarów zainteresowania (ROI). Podziałka liniowa 1 mm. Ilustracja Power Dopplera z lat 30-tych z (B) stabilną akwizycją (szary) i (C) ruchem tkanek (czerwony) na podstawie średnich wartości obrazu w dowolnych jednostkach (A.U.) całego obrazu do oceny ilościowej. (D) Automatyczne rozpoznawanie niskich intensywności (A.U.) do ilościowego pomiaru objętości krwi w czasie. (E) Odchylenie standardowe (odchylenie St.) o niskiej intensywności wykreślone w celu identyfikacji niestabilnych akwizycji (czerwonych) spowodowanych artefaktami ruchu wskazanymi przez odcięcie ogólnej średniej (μ) od liczby (N) zwierząt z 3 kohort z 2 SD (2σ) ocena odchylenia standardowego (SD) o niskiej intensywności (AU) w stanie fizjologicznym (szary) u dorosłych myszy kontrolnych C57BL / 6 typu dzikiego. (F) Kwantyfikacja zmian objętości krwi mierzonych in vivo w czasie, uśredniająca na 3 płaszczyznach, tj. łącznie 30 ROI na zwierzę, jest reprezentowana jako intensywność pikseli (A.U.). Wykrywanie wartości odstających za pomocą testu ROUT 1%. (G) Nie ma różnicy między typem pojazdu dostawczego a drogą podania. Kohorta 1 (n = 6) otrzymała dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie soli fizjologicznej, kohorta 2 (n = 3) ip wstrzyknięcie DMSO, a kohorta 3 (n = 6) doustne podanie (po) celulozy. Jednoczynnikowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunnetta, ns P > 0,05. Skrót: A.U. = Jednostki dowolne, DMSO = Dimetylosulfotlenek, ip = Dootrzewnowy, po = Podanie doustne, ROI = Region zainteresowania, St. Deviation = Odchylenie standardowe, UFUS = Ultraszybkie USG Dopplera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Ultraszybki ultrasonograf dopplerowski (UFUS) ilościowy skrypt do pomiaru objętości krwi w wątrobie. Script gui_analysis.m zapewnia graficzny interfejs do automatycznego pozycjonowania obszaru zainteresowania (ROI) do pomiarów objętości krwi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym protokole pokazujemy, jak wykonać nieinwazyjne obrazowanie UFUS naczyń krwionośnych wątroby myszy. Przedstawiamy szczegółowy opis procedury obrazowania, obejmujący postępowanie ze zwierzętami, obsługę skanera ultrasonograficznego oraz analizę danych do obliczania zmian objętości krwi in vivo. Aby ułatwić interpretację danych ultrasonograficznych, zapewniamy kompleksowy przegląd struktur anatomicznych, które mogą być przejrzyście zobrazowane przez UFUS. Ponadto opisujemy ustandaryzowaną procedurę kwantyfikacji w celu uzyskania solidnych pomiarów parametrów naczyniowych. Osiągnięcie odpowiedniej rozdzielczości jest możliwe bez użycia środka kontrastowego, co umożliwia bezpieczną i prostą ilościową ocenę objętości krwi w wątrobie w mikrokrążeniu. Kładziemy nacisk na stosowanie znormalizowanej nomenklatury anatomicznej, aby zapobiec nieporozumieniom i błędnej interpretacji, szczególnie podczas oceny ilościowych pomiarów mikrokrążenia.

Obrazowanie mysiego układu krwionośnego metodą UFUS było już wcześniej opisywane, głównie w dziedzinie neurobiologii⁷. Artefakty ruchowe nie mają negatywnego wpływu na obrazowanie mózgu, w przeciwieństwie do wątroby, która jest bardzo podatna na ruchy oddechowe. Ze względu na anatomiczne położenie pod przeponą, depilacja w okolicy brzucha musi być wykonywana bardzo delikatnie, aby uniknąć wprowadzenia nieregularnego oddechu poprzez zminimalizowanie sił fizycznych działających na klatkę piersiową i okolicę brzucha. Co więcej, osiągnięcie odpowiedniego stopnia znieczulenia jest niezbędne, aby zapewnić regularne oddychanie oscylacyjne, czynnik, który można stosunkowo łatwo skorygować na etapach obróbki końcowej. Czułość UFUS została tutaj zwiększona poprzez zastosowanie filtra dekompozycji wartości osobliwych (SVD) w celu usunięcia artefaktów ruchu⁶ i dalszej cenzury klatek o dużym ruchu. Filmy Power Doppler o wysokiej liczbie klatek na sekundę są tutaj rejestrowane w czasie 10 ms, aby dodatkowo umożliwić nam wizualizację i pomiar wpływu ruchu oddechowego na klatki, które generowały szczyty o wysokiej wartości z powodu artefaktów ruchu. Częstość oddechów można następnie zidentyfikować na podstawie piku w szybkiej transformacji Fouriera średniego sygnału obrazu, a odpowiadające im klatki pików odpowiadające wysokiemu ruchowi narządu można odrzucić.

Powtarzalne ultrasonograficzne obrazowanie dopplerowskie u jednego zwierzęcia w czasie, a także między zwierzętami o różnej masie ciała, może nadal napotykać kilka ograniczeń. Po pierwsze, na ułożenie wątroby mogą mieć wpływ takie czynniki, jak mocno wypełniony żołądek i perystaltyczne ruchy jelit. Wpływ ten jest szczególnie wyraźny przy wyborze lewego bocznego płata wątroby jako punktu odniesienia. Dlatego zalecamy wybór lewego płata bocznego tylko u większych zwierząt i preferowanie prawego lub lewego płata przyśrodkowego u mniejszych zwierząt. Po drugie, u zwierząt w trudnej sytuacji mogą wystąpić ciężkie, nieoscylacyjne ruchy oddechowe, co skutkuje artefaktami ruchowymi, które są trudne do skorygowania, a w konsekwencji nie mogą być wykorzystane do obliczenia objętości krwi. Dlatego tak ważny jest odpowiedni dobór znieczulenia, wraz z dawką dostosowaną do masy ciała. Wreszcie, limit rozdzielczości ogranicza wizualizację mikrokrążenia wątrobowego, tj. można uwidocznić naczynia krwionośne o średnicach do 100 mm³.

Niedawno zaproponowano zastosowanie środków kontrastowych w celu uzyskania szczegółowego obrazu układu naczyniowego myszy poprzez śledzenie mikropęcherzyków. Takie podejście pozwala osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną i zapewnić ilościowe pomiary prędkości krwi¹⁷. Jednak śledzenie mikropęcherzyków pozostaje dużym wyzwaniem dla poruszających się narządów wewnętrznych, zwłaszcza gdy są one pozyskiwane w 2D.

Tutaj wykazaliśmy, że stabilne pomiary objętości krwi wątrobowej uzyskane za pomocą ultraszybkiego Dopplera można uzyskać u myszy kontrolnych z trzech kohort otrzymujących różne nośniki podawane w zastrzykach ip lub zgłębniku doustnym. Ostatnio takie pomiary objętości krwi zostały z powodzeniem wykorzystane w mysim modelu¹⁶ z chorobą wątroby. Rozszerzając tę kwestię, ekspansję naczyniową wykryto na poziomie mikroskopii elektronowej i potwierdzono pomiarami ilościowymi za pomocą UFUS. W badaniu tym podkreślono wrażliwość oceny in vivo na badanie wad naczyniowych na poziomie funkcjonalnym i ilościowym, nawet przy zachowanej angioarchitekturze wątroby, co jest obiecujące dla diagnostyki klinicznej i monitorowania.

Podsumowując, protokół ten służy jako przewodnik dla nieinwazyjnych badań jakościowych i ilościowych naczyń wątrobowych u myszy. Może być również stosowany do obserwacji podłużnej ze względu na nieinwazyjną i prostą procedurę. Dodatkowo posiada potencjał do zapewnienia oceny funkcjonalnej naczyń krwionośnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(Hydroksypropylo)metyloceluloza HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0,5% HPMC
Wirówka ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Probówki wirówkowe 50 ml stożkowe sterylne probówki polipropylenowe	CELLSTAR	227 261
Bawełniane końcówki	Meditip Clean	G80215
Woda dejonizowana	w domu
Krem do depilacji	w pobliżu drogerii
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	sterylny
absolut etanolu	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Igła do karmienia, wielokrotnego użytku	FST Fine Science Tools	18064-20
Kleszcze z cienką końcówką Kleszcze Dumont #5	FST Fine Science Tools	11252-00
Gaziki 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Wersja 9
Skrypt analizy GUI	Inserm	gui_analysis.m	potrzebuje skanu dopplerowskiego 10 ms
Poduszka grzewcza 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
Strzykawka insulinowa 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 ml i 0,5 ml	BD Microfine + Demi	25636
Ketamina Anesketin	Dechra	REG NL 111764	100 mg/ml
Kimwipes Wycieraczka niskokłaczkowa KIMTECH	ULINE	S-8115
Taśma laboratoryjna 19 mm x 50 m x 0,125 mm	Oprogramowanie Stokvis	M451
MATLAB		MathWorks Wersja R2022b
Krem nawilżający	w pobliżu drogerii
Igła żółta 30G 0,3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Maść okulistyczna Oculentum Simplex	Dodano Pharma	220201
Chusteczki papierowe	we własnym zakresie
Trwały marker laboratoryjny	VWR	52877-310
Fizjologiczny roztwór soli (NaCl 0,9%)	FRESENIUS KABI	B102986	sterylny
jednorazowy pojemnik na ostre przedmioty Medical Dispo 2,5 L	APmedical	UN3291
Sterylne probówki z blokadą 1,5 ml	Eppendorf	0030 120.086
Strzykawka 1 ml	BD Plastipak	303172
Strzykawka 20 ml Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Timer	West Bend	40053
Trymer	Exacta Aesculap	GT416
Ultraszybki platforma ultrasonograficzna	Iconeus &   INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus Jeden prototyp	z sekwencją 10ms
Żel transmisyjny do ultradźwięków Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Zbiornik na wodę wydrukowany w 3D 10 x 10 x 1,5 cm polimetylopentenu (PMP) 0,125 mm	Plik CAD GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	na żądanie
Ksylazyna Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg / ml