Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66792

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  ,  , 
1Brain Health Imaging Centre, Centre for Addiction and Mental Health, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Neurology, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazujemy chemiczne indukowanie dużego rozszerzenia naczyń krwionośnych u myszy jako model do badania dysfunkcji naczyń mózgowych, który może być wykorzystany do modelowania demencji naczyniowej i choroby Alzheimera. Demonstrujemy również wizualizację układu naczyniowego poprzez wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i zapewnianie jasnych wizualnych wskazówek dotyczących pomiaru zmian wielkości naczyń krwionośnych.

Streszczenie

Krew-mózg (BBB) jest kluczowym systemem, który reguluje selektywne krążenie mózgu z peryferiami, na przykład umożliwiając niezbędne składniki odżywcze na wejście i wydalenie nadmiaru aminokwasów lub toksyn z mózgu. Aby zamodelować, w jaki sposób bariera krew-mózg może być zagrożona w chorobach takich jak otępienie naczyniowe (VaD) czy choroba Alzheimera (AD), naukowcy opracowali nowe metody modelowania rozszerzenia naczyń. Upośledzona bariera krew-mózg w tych stanach chorobowych może być szkodliwa i powodować rozregulowanie bariery krew-mózg, co prowadzi do niepożądanych i patologicznych konsekwencji wpływających na funkcjonowanie mózgu. Byliśmy w stanie zmodyfikować istniejącą technikę, która umożliwiła nam wstrzyknięcie bezpośrednio do Cisterna magna (CM) w celu wywołania rozszerzenia naczyń krwionośnych za pomocą elastazy i przerwania połączeń ścisłych (TJ) BBB. Dzięki tej metodzie byliśmy w stanie zaobserwować różne wskaźniki sukcesu w porównaniu z poprzednimi technikami, w tym konsekwentne rozszerzanie naczyń krwionośnych, zmniejszenie śmiertelności lub poprawę powrotu do zdrowia oraz ulepszenie środka wypełniającego/zmętniającego, mieszanki kauczuku silikonowego, dostarczanej do znakowania naczyń krwionośnych do analizy rozszerzenia. Ta zmodyfikowana minimalnie inwazyjna metoda przyniosła obiecujące wyniki, z 19%-32% wzrostem trwałego rozszerzenia dużych naczyń krwionośnych u myszy od 2 tygodni do 3 miesięcy po wstrzyknięciu. Ta poprawa kontrastuje z wcześniejszymi badaniami, które wykazały zwiększone rozszerzenie dopiero po 2 tygodniach. Dodatkowe dane wskazują na utrzymującą się ekspansję nawet po 9,5 miesiącach. Wzrost ten został potwierdzony przez porównanie średnicy naczyń krwionośnych elastazy i grupy, w której wstrzyknięto nośnik. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta jest cenna w badaniu zaburzeń patologicznych, które wpływają na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) przy użyciu modeli zwierzęcych.

Wprowadzenie

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka wyściełające naczynia włosowate mózgu są głównymi składnikami tworzącymi barierę krew-mózg (BBB)1, która odgrywa kluczową rolę w regulacji tego, co wchodzi lub wychodzi z krążenia mózgowego na peryferiach. Niezbędne składniki odżywcze potrzebne tkance nerwowej mogą dostać się do BBB, podczas gdy niektóre niezbędne aminokwasy, takie jak glutaminian, są wydalane z mózgu, ponieważ wysokie stężenia mogą powodować trwałe neuropobudzające uszkodzenie tkanki mózgowej2. W normalnych warunkach fizjologicznych bariera krew-mózg ogranicza ilość białek osocza, takich jak albumina3,4 i protrombiny, ponieważ mogą one mieć szkodliwe skutki5,6,7. Wreszcie, bariera krew-mózg chroni mózg przed neurotoksynami, które krążą na obrzeżach, takimi jak ksenobiotyki z pożywienia lub środowiska1. Ogólnie rzecz biorąc, uszkodzenie tkanek mózgowych jest nieodwracalne, a starzenie się, które koreluje z niskim poziomem neurogenezy8 podkreśla znaczenie bariery krew-mózg w ochronie i zapobieganiu wszelkim czynnikom przyspieszającym proces neurodegeneracyjny.

W dolichoektazji (lub rozszerzeniu dużych naczyń krwionośnych) obserwuje się spadek elastyczności naczyń, co powoduje, że naczynia ulegają zmianom morfologicznym, co czyni je dysfunkcyjnymi9 i prowadzi do zmniejszenia przepływu krwi w mózgu. To zmniejszenie przepływu krwi następnie zmniejsza dopływ tlenu i glukozy, ostatecznie wywołując uszkodzenie bariery krew-mózg poprzez aktywację reaktywnych astrocytów10. Gdy wewnętrzna blaszka elastyny naczyń krwionośnych jest uszkodzona przez dolichoectasia11, do angiogenezy konieczna jest wielokrotna stymulacja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Może to prowadzić do powstawania nieszczelnych naczyń krwionośnych i ostatecznie prowadzić do patologicznej angiogenezy, charakteryzującej się rozwojem wadliwych naczyń12. Podczas patologicznej angiogenezy, gdy naczynia krwionośne ulegają uszkodzeniu, pojawia się mechanizm kompensacyjny, który przywraca integralność naczyń poprzez regulację w górę białek połączeń ścisłych. Jednak proces ten może nieumyślnie zakłócić barierę krew-mózg, gdy integralność strukturalna naczynia krwionośnego zostanie utracona13. Może się to zdarzyć poprzez dalsze zakłócanie bariery krew-mózg i promowanie produkcji płytki amyloidowej14. Dodatkowo, wyciek z obwodu może powodować zapalenie nerwów15, co skutkuje degeneracją neuronów i późniejszą utratą pamięci.

Strukturalnie ochrona, którą zapewnia BBB, polega na ścisłych połączeniach, które zapobiegają przedostawaniu się krwi do mózgu przez czynniki ksenobiotyczne. Pozwalając pewnym substancjom dostać się do mózgu, BBB robi to głównie poprzez dwa główne procesy, pasywną dyfuzję lub określone kanały (takie jak kanały jonowe i transportery)1. Badania wykazały, że w chorobie Alzheimera dysfunkcyjny układ naczyniowy odgrywa znaczącą rolę w postępie choroby12,13. Powstawanie blaszek amyloidu beta (Aβ) i neurodegeneracja mogą wynikać z rozpadu BBB12,13 i zaburzeń w przepływie krwi w mózgu16. Zmniejszenie przepływu krwi w mózgu można zaobserwować u osób starszych, u których zdiagnozowano otępienie naczyniowe i AD17,18. Uszkodzenie bariery krew-mózg (BBB) wraz z dysfunkcyjnym przepływem krwi w mózgu (CBF) może przyczyniać się do zwiększonej produkcji stężenia Aβ w mózgu, czemu towarzyszy infiltracja ciał obcych z krążenia obwodowego19.

Aby zbadać patogenezę chorób neurologicznych, takich jak AD i demencja naczyniowa (VaD), opracowywane są modele replikujące chorobę. Modele in vitro są szeroko stosowane, ale brakuje im środowiska biologicznego do ekstensywnego modelowania chorób, takich jak populacja komórek mieszanych, co wymaga znaczenia modeli in vivo. Myszy są powszechnie stosowane ze względu na łatwość manipulacji genetycznej w generowaniu właściwości podobnych do ludzkich (np. patologii) w chorobie. Wraz z postępem, który został osiągnięty do tej pory, nadal istnieje zapotrzebowanie na ulepszone modele do naśladowania fenotypów chorób, takich jak rozszerzenie dużych naczyń krwionośnych i ich rola w chorobie Alzheimera. W tym celu dostrzegliśmy szansę i zmodyfikowaliśmy technikę, która polegała na wstrzyknięciu elastazy do Cisterna magna myszy20,21. Elastaza jest enzymem, który, jak wykazano, rozkłada elastynę w tkance łącznej22 i w otaczających połączeniach ścisłych23. Cisterna magna została wybrana jako punkt wstrzyknięcia, ponieważ znajduje się bezpośrednio nad okręgiem Willisa, największym naczyniem krwionośnym w mózgu. Wstrzykując elastazę do Cisterna magna, możemy naruszyć barierę krew-mózg i naczynia krwionośne, rozbijając ścisłe połączenia i wywołując rozszerzenie naczyń krwionośnych (krąg Willisa)24,25. Połączenie tej techniki z wykorzystaniem mysiego modelu patologii choroby Alzheimera, w celu lepszego zrozumienia patogenezy składnika naczyniowego choroby Alzheimera, może dostarczyć cennych informacji na temat złożonych interakcji i wpływów między tymi dwiema odrębnymi patologiami.

Poprzednie badania wykazały przypadki, w których pacjenci wykazują zarówno patologiczne cechy AD, jak i VaD, stan zwykle określany jako demencja mieszana26,27. W ten sposób zrozumienie wzajemnie powiązanych mechanizmów między oboma schorzeniami może zaoferować bardziej wszechstronną perspektywę na postęp i manifestację tych zaburzeń neurodegeneracyjnych, zwiększa nasze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw i potencjalnych strategii terapeutycznych. W tym celu demonstrujemy zastosowanie elastazy w mysim modelu patologii AD (AppNL-F) w celu identyfikacji zmian naczyniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W badaniu wykorzystano myszy AppNL-F (w wieku 3 miesięcy), które wykazują fizjologiczny poziom ludzkich blaszek amyloidowych, choć system ten można zastosować w dowolnym modelu gryzoni. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CAMH (protokół nr 843) i były zgodne ze standardami etycznymi wytycznych Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Myszy hodowano wewnątrz jednostki badawczej, utrzymując je w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności z dostępem ad libitum do paszy i wody.

1. Procedura wstrzykiwania do cysterny wielkiej (CM)

  1. Procedura chirurgiczna
    1. Umieść mysz (APPNL-F, obie płcie, 3 miesiące) w komorze indukcyjnej do znieczulenia na 1 min.
      UWAGA: Przepłucz komorę 5% izofluranem zmieszanym z 1% tlenem przez co najmniej 1 min.
    2. Po znieczuleniu myszy wyjmij zwierzę z komory, połóż na czystej podkładce chirurgicznej i utrzymuj znieczulenie (izofluran, 2,5%-3%), nakładając stożek nosowy na nos.
      UWAGA: Sprawdź głębokość znieczulenia, uciskając palec u stopy, aby upewnić się, że nie występują odruchy.
    3. Nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu oczu. Następnie wstrzyknij podskórnie w miejscu ncięcia 0,1 mL bupiwakainy (środek znieczulający miejscowo; 1-2 mg/kg 0,125%, z proporcją rozcieńczenia 1:2) oraz Metacam (środek przeciwbólowy; 5 mg/kg, z proporcją rozcieńczenia 1:10). Przed przystąpieniem do procedury wstrzyknij podskórnie 0,5 mL soli fizjologicznej, aby nawodnić zwierzę i zrekompensować potencjalną utratę krwi podczas operacji.
    4. Aby uzyskać czyste miejsce ncięcia, ogól szyję u podstawy kości potylicznej, przemyj powierzchnię sterylnym PBS i przenieś osobnika do ramy stereotaktycznej w pozycji brzusznej.
      UWAGA: Upewnij się, że znieczulenie jest utrzymywane poprzez stereotaktyczny stożek nosowy.
    5. Umieść poprzeczkę nosową z ramy stereotaktycznej na górze myszy, aby zapewnić stabilność i upewnić się, że górne zęby są unieruchomione.
    6. Ustaw głowę zwierzęcia pod kątem 120° względem ciała, aby unieść i rozciągnąć kark i odsłonić interesujący obszar chirurgiczny.
    7. Oczyść miejsce operacyjne za pomocą sterylnej gazy o wymiarach 2 cali x 2 cale: 3x Betadine scrub, 3x 70% etanol i 1x roztwór Betadinu.
      UWAGA: Rękawiczki i narzędzia powinny być sterylne przed procedurą. W miejscu ncięcia należy również umieścić sterylną podkładkę.
    8. Wykonaj niewielkie ncięcie (1 cm) za pomocą skalpela.
      UWAGA: Powinno to odsłonić linię środkową karku.
    9. Ostrożnie prowadź skalpel wzdłuż linii środkowej, aby przeciąć mięśnie. Następnie, używając pęsety, delikatnie rozdziel mięśnie, odsuwając je w lewo i w prawo.
      UWAGA: Powinno to odsłonić Cisterna magna (odwrócony trójkąt), która znajduje się pod podstawą czaszki (Rysunek 1).
  2. Przygotowanie elastazy
    UWAGA: Zamówione opakowanie elastazy (w formie proszku) zawierało 250 jednostek (U). Ilość elastazy do wstrzyknięcia każdemu zwierzęciu wynosi 2,5 µL. Ilość elastazy w 2,5 µL powinna wynosić 15 mili jednostek mU.
    1. Najpierw oblicz stężenie roztworu do wstrzyknięcia.
      Stężenie = masa/objętość
      = 15 mU/2,5 µL
      = 6 mU/µL
      Zatem wymagane stężenie wynosi 6 mU/µL.
    2. Ilość elastazy to 250 U, a w badaniu pracuje się w mili jednostkach, więc przelicz jednostki na mili jednostki, co daje 2500 mU.
    3. Mając masę 2500 mU i stężenie 6 mU/µL, określ objętość (PBS), która byłaby wymagana do rozcieńczenia elastazy i utrzymania stężenia 6 mU/µL.
    4. Korzystając z powyższego wzoru, przekształć go, aby obliczyć objętość:
      Objętość = masa/Stężenie
      = 250 mU/ 6 mU/µL
      ​= 416,67 µL
    5. Ponieważ trudno jest odpipetować 416,67 µL, po prostu przelicz to na mililitry, dzieląc przez 10, aby otrzymać 41,67 mL dla uzyskania roztworu 1x.
      1. Aby uzyskać bardziej skoncentrowany roztwór, zwiększ go 10-krotnie lub 10-krotnie.
      2. Przygotuj roztwór 10x, ponieważ jest on prostszy w obsłudze (patrz poniżej).
        ​roztwór 10x ---------- 4,167 mL (stężenie)
    6. Umieść 250 U w probówce typu aliquot o pojemności 5 mL i dodaj 4,167 mL sterylnego PBS do probówki, aby przygotować 10-krotny roztwór zapasowy.
      UWAGA: Przygotuj elastazę w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
    7. Odpipetuj 10 µL roztworu zapasowego i umieść w 100 probówkach aliquot, co daje 10 µL z 4,167 mL roztworu zapasowego. Przechowuj probówki w temperaturze -20 °C.
    8. Pozostałą część roztworu zapasowego rozdziel w probówkach aliquot po 10 µL na probówkę i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Roztwory są stabilne w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy bez znaczącej utraty aktywności. Dodatkowo należy zauważyć, że nadmierne zamrażanie i rozmrażanie elastazy może zmniejszyć jej stabilność. Dlatego, aby temu zapobiec, roztwór zapasowy można podzielić przed zamrożeniem w taki sposób, aby za każdym razem do wstrzyknięcia należało rozmrozić tylko jedną próbkę.
    9. Po rozmrożeniu jednej z probówek aliquot zawierającej 10 µL roztworu 10x, dodaj 90 µL sterylnego PBS, aby uzyskać 10 µL roztworu 1x.
    10. Jeśli zamiast tego rozmrożono probówkę aliquot zawierającą 10 µL roztworu 10x, po prostu dodaj 90 µL PBS, aby uzyskać 100 µL, czyli roztwór 1x. Przechowuj dowolny z tych roztworów w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
  3. Wtryskiwanie do Cisterna magna
    UWAGA: Oczyść strzykawkę Hamiltona przed napełnieniem elastazą, pobierając i wypuszczając wodę destylowaną 5x, następnie etanol 5x i na koniec wodę destylowaną 5x.
    1. Napełnij strzykawkę Hamiltona 2,5 µL elastazy (stężenie 15 mU) i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Powoli wprowadź strzykawkę ściętym końcem skierowanym do góry do centrum Cisterna magna.
      UWAGA: Unikaj przebijania naczyń krwionośnych przebiegających przez Cisterna magna.
    3. Po nakłuciu wyjmij igłę. Ułatwi to uwolnienie niewielkiej ilości płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR). Użyj sterylnego patyczka bawełnianego, aby wchłonąć nadmiar PMR.
    4. Ponownie wprowadź igłę w miejsce nakłucia, powoli wstrzykując elastazę lub nośnik przez 1 min do Cisterna magna i pozostaw igłę w tym miejscu przez 1 min, aby zapobiec wyciekowi elastazy.
    5. Po wyjęciu igły zamknij miejsce ncięcia niewchłanialną nicią chirurgiczną (#4-0 z igłą 3/8") i wyłącz znieczulenie.
    6. Zdejmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść na ciepłej podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C, aż osobnik odzyska przytomność.
      UWAGA: Po operacji zaleca się podanie kolejnej dawki Metakamu, aby pomóc w łagodzeniu bólu podczas rekonwalescencji pooperacyjnej.

2. Wtryskiwanie związku gumy silikonowej i pobieranie tkanek

  1. Zanurzyć zwierzę w narkozie, podając przedawkę avertinu (1 mL, 125-250 mg/kg).
    UWAGA: Ścisnąć palec u nogi, aby upewnić się, że odruchy ustąpiły.
  2. Umieścić zwierzę na pieluszce i unieruchomić wszystkie kończyny taśmą chirurgiczną, z jamą klatki piersiowej skierowaną ku górze
  3. Otworzyć jamę klatki piersiowej za pomocą pęsety i nożyczek, aby odsłonić serce.
  4. Wprowadzić tępą igłę 23 G do lewej komory serca i przeprowadzić perfuzję roztworem PBS z dodatkiem heparyny (10 U/mL) przez 4 min przy użyciu mikropompy perfuzyjnej w celu oczyszczenia naczyń krwionośnych.
  5. Zastąpić butelkę z buforem butelką zawierającą 4% paraformaldehyd (PFA) (przygotowany w PBS) i przeprowadzić perfuzję przez kolejne 4 min.
  6. Przygotować roztwór silikonowej gumy (żółtej), łącząc 5 mL związku z 5 mL rozcieńczalnika w probówce o pojemności 50 mL. Przed użyciem dokładnie wymieszać.
  7. Napełnić strzykawkę 10 mL ilością 10 mL silikonowej gumy. Podłączyć strzykawkę do wężyka zakończonego tępą igłą 23 G i ostrożnie wstrzyknąć roztwór ręcznie do serca.
    UWAGA: Ze względu na wysoką lepkość silikonowej gumy ważne jest użycie strzykawki z większym tłokiem, w przeciwnym razie nacisk potrzebny do przesunięcia tłoka będzie zbyt duży.
  8. Po wstrzyknięciu odciąć głowę myszy i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, aby pozwolić silikonowej gumie utwardzić się w naczyniach.
  9. Następnego dnia delikatnie usunąć czaszkę myszy (najlepiej za pomocą precyzyjnej pęsety), wyekstrahować mózg i inkubować w 4% PFA przez noc w temperaturze pokojowej (RT).
  10. Po 24-godzinnej inkubacji w PFA trzykrotnie przemyć mózg w PBS, umieścić w 30% sacharozie i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Analiza ilościowa

  1. Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy koła Willisa w całym mózgu (Rysunek 3):
    1. Wyjmij mózg z roztworu sacharozy. Dokładnie osusz mózg za pomocą ręcznika papierowego, aby usunąć wilgoć z powierzchni.
    2. Umieść mózg w urządzeniu do krojenia mózgu (brain slicer). Umieść urządzenie do krojenia mózgu pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę.
    3. Ustaw ostrość mikroskopu, aby uzyskać wyraźny, wysokorozdzielczy obraz kręgu Willisa.
  2. Użyj oprogramowania do analizy obrazu z referencyjną linijką o długości 10 cm, aby zmierzyć odcinek o długości około 1 cm i odnotować liczbę pikseli. Na podstawie tego pomiaru ustaw skalę 1 cm, a następnie zmierz poziomo grubość tętnicy podstawnej, aby wyznaczyć jej średnicę.
  3. Do analizy obrazu należy użyć standardowego oprogramowania do densytometrii pikselowej. Za pomocą oprogramowania do analizy obrazu należy wykonać pięć oddzielnych pomiarów (w centymetrach) tętnicy podstawnej, a następnie obliczyć średnią, aby uzyskać dokładną reprezentację średnicy tętnicy podstawnej.
  4. Aby porównać średnią zmianę średnicy pomiędzy grupą z elastazą a grupą kontrolną, należy zastosować dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA).
    1. Oblicz procentową zmianę średnicy, korzystając z poniższego wzoru 21:
      figure-protocol-1
      C = zmiana względna
      X1 = Wartość początkowa (nośnik)
      X2 = Wartość końcowa (elastaza)
      Wartości p mniejsze od 0,05 uznano za istotne statystycznie. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej.

4. Usuwanie mieszanki gumy silikonowej za pomocą odwodnienia alkoholem

UWAGA: Ważne jest odwodnienie mózgu, aby pomóc w usunięciu nadmiaru silikonowej gumy z naczyń krwionośnych, co może potencjalnie poprawić jakość immunobarwienia.

  1. Przemyć mózgi 3x w PBS, aby usunąć sacharozę.
  2. Umieścić mózg w etanolu o stężeniach 25%, 50%, 75%, 95% oraz w etanolu absolutnym, pozostawiając na 24 h przy każdym stężeniu, co łącznie zajmie 5 dni.
  3. Po odwodnieniu tkanki umieścić ją w salicylanie metylu (stęż. ≤100%) na 12-24 h. Etanol i salicylan metylu pozwolą na usunięcie nadmiaru silikonu z tkanki.
  4. Przemyć mózg 3x w PBS, aby usunąć pozostałości chemikaliów, a następnie pozostawić na noc na kołysace w temperaturze 4 °C w świeżym PBS.
  5. Umieścić mózg w sacharozie i przechowywać w temperaturze 4 °C przed wykonaniem skrawków i barwieniem immunohistochemicznym.

5. Barwienie immunohistochemiczne

  1. Przecinanie mózgu
    1. Przed immunosekcjonowaniem należy odczekać, aż mózg opadnie na dno probówki wypełnionej sacharozą.
    2. Zamrozić mózg na platformie mikrotomu, używając związku OCT (optimal cutting temperature) w otoczeniu suchego lodu. Przeciąć mózg na sekcje o grubości 40 µm za pomocą ostrza mikrotomu.
    3. Przenieść każdą sekcję za pomocą cienkiego pędzla do płytki 96-dołkowej zawierającej krioprotektant zapobiegający zamarzaniu.
    4. Szczelnie zamknąć płytkę 96-dołkową folią spożywczą. Przechowywać zamkniętą płytkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne (na przykładzie NeuN)
    1. Umieścić sekcje w płytce 24-dołkowej. Przeprowadzić trzy przemycia PBS w celu usunięcia krioprotektantu.
    2. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, inkubować przez 1 h w temperaturze RT, stosując roztwór blokujący zawierający 2% surowicy koziej, 0,1% Triton-X 10 oraz 1% BSA.
    3. Przygotować wszystkie składniki w PBS.
      UWAGA: Jako przeciwciało pierwszorzędowe zastosowano monoklonalne przeciwciało mysie anty-NeuN w rozcieńczeniu 1:50. Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano poliklonalne przeciwciało kozie anty-mysie 568 w rozcieńczeniu 1:20.
    4. Rozcieńczyć monoklonalne przeciwciało mysie anty-NeuN w wyżej wymienionym roztworze blokującym.
    5. Dodać rozcieńczone przeciwciało do każdego dołka. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
    6. Po inkubacji pierwszorzędowej przemyć sekcje 3x PBS. Rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało kozie anty-mysie 568 w tym samym roztworze blokującym.
    7. Dodać rozcieńczone przeciwciało do każdego dołka. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
    8. Przemyć sekcje 3x PBS po inkubacji drugorzędowej.
    9. Przygotować do montowania, powoli przenosząc sekcje na szkiełka za pomocą cienkich pędzli. Pozostawić wszystkie sekcje do wyschnięcia.
    10. Po wyschnięciu sekcji nanieść 125-150 µL medium montującego anty-fade. Delikatnie nałożyć szkiełka nakrywki.
    11. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia przez 24 h w temperaturze RT w ciemności, zabezpieczając krawędzie lakierem do paznokci. Wykonać obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z powodzeniem zlokalizowaliśmy cysternę wielką (Cisterna magna) pod potylicznym regionem czaszki, po dokładnym ustawieniu myszy w aparacie stereotaksycznym i rozcięciu mięśni. Ta struktura anatomiczna, przypominająca odwrócony trójkąt i zaznaczona na żółto, znajduje się pod podstawą czaszki (Rysunek 1). Aby zapewnić precyzję i zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej, 1-2 mm ściętego końca strzykawki Hamiltona delikatnie wprowadzono do cysterny wielkiej.

Po wstrzyknię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono ulepszony protokół rozszerzania naczyń mózgowych, zapewniając precyzyjne i proste podejście do wstrzykiwania elastazy do Cisterna magna myszy. Ten anatomiczny punkt służy jako bezpośrednia brama do płynu mózgowo-rdzeniowego, oferując cenną drogę do badania różnych chorób neurologicznych. Jedną z głównych zalet tej zmodyfikowanej techniki jest to, że wstrzyknięcie pojedynczej dawki elastazy do Cisterna magna myszy było w stanie spowodować i utrzymać rozszerzenie dużych naczyń krwionośnych przez co...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było możliwe dzięki nieocenionemu wkładowi Stephanie Tam, która udzieliła wsparcia w asystowaniu przy operacjach. Wyrażamy jej szczerą wdzięczność za pomoc. National Institutes of Health (AG066162) za wsparcie tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik 23 GUniversity Medstore2546-CABD305145Potrzebny do perfuzji  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Etanol absolutnyUniversity Medstorehttps://www.uoftmedstore.com/index.szDo usuwania mikrofilu
Peeling betadynowy#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubSterylizacja
Roztwór betadynyAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWSterylizacja
BupiwakainaDostarczone przez zakład dla zwierzątN/Ado strzyżenia przeciwbólowego
BrainTree Scientific IncCLP-41590Futro do golenia
Bawełniana końcówka Q-tipUniversity Medstore1962Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastazaSigma-aldrich  E7885Używany do rozszerzania naczyń krwionośnych
EtanolUniversity Medstore39752-P016-EAANSterylizacja (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Koza anty-mysz 568InvitrogenA11004Do barwienia dojrzałych neuronów
Pryzmat Graphpad 10 PryzmatGraphpad 10https://www.graphpad.com/Oprogramowanie do analizy statystycznej
Strzykawka HamiltonSigma-aldrich28614-UElastaza iniekcyjna
Poduszka grzewczaAmazonhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZUtrzymuj temperaturę ciała
Oprogramowanie ImageJFidżi Oprogramowanie Imagejimagej.net (USA)Oprogramowanie do analizy obrazu
Komora indukcyjnaDostarczone przez zakład dla zwierzątNie dotyczyAnestezja indukcja
MetacamDostarczone przez zakład dla zwierzątNie dotyczyPrzeciwbólowy
salicylan metyluSigma-aldrichM6752Do usuwania mikrofilu
MicrofilFlow Tech, Carver, Massachusettshttps://www.flowtech-inc.com/order/  Barwnik (żółty)
Mysz monoklonalny anty-NeuNMillipore SigmaMAB377Do barwienia dojrzałych neuronów,
skanera slajdów Olympus VS200 i oprogramowania VSI.Olympus Life Sciencehttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[pliki do pobrania][id]=847254104Oprogramowanie do obrazowania
ParaformaldehydUniversity MedstorePAR070.1Do utrwalania białek  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Pompa perfuzyjnaVWR Internationalhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsPotrzebna do perfuzji
SkalpelUniversity Medstore2580-M90-10Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
StereotaktycznyDostarczony przez zakład dla zwierzątNie dotyczyWięc zabezpiecz zwierzę do operacji
NożyczkichirurgiczneUniversity Medstore22751-A9-240Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Taśma chirurgicznaUniversity Medstorehttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2Zabezpiecz zwierzę na pieluszce
SzwyUniversity Medstore2297-VS881Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Pęseta X2University Medstore7731-A10-612Do zabiegów chirurgicznych (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Maszynki

Bibliografia

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  2. Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I. Recent advances in drug delivery and targeting to the brain. J Control Release. 350, 668-687 (2022).
  3. Vagnucci, A. H. Jr, Li, W. W. Alzheimer's disease and angiogenesis. Lancet. 361 (9357), 605-608 (2003).
  4. Banks, W. A., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. J Neuroinflamm. 12, 223(2015).
  5. Archie, S. R., Shoyaib, A. A., Cucullo, L. Blood-brain barrier dysfunction in CNS disorders and putative therapeutic targets: an overview. Pharmaceutics. 13 (11), 1779(2021).
  6. Jefferies, W. A., Price, K. A., Biron, K. E., Fenninger, F., Pfeifer, C. G., Dickstein, D. L. Adjusting the compass: new insights into the role of angiogenesis in Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 5 (6), 64(2013).
  7. Kook, S. Y., Seok-Hong, H., Moon, M., Mook-Jung, I. Disruption of blood-brain barrier in Alzheimer disease pathogenesis. Tissue Barriers. 1 (2), e23993(2013).
  8. Kempermann, G. Activity dependency and aging in the regulation of adult neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a018929(2015).
  9. Del Brutto, V. J., Ortiz, J. G., Biller, J. Intracranial arterial dolichoectasia. Front Neurol. 8, 344(2017).
  10. de la Torre, J. C., Mussivand, T. Can disturbed brain microcirculation cause Alzheimer's disease. Neurol Res. 15 (3), 146-153 (1993).
  11. Gutierrez, J., Sacco, R. L., Wright, C. B. Dolichoectasia-an evolving arterial disease. Nat Rev Neurol. 7 (1), 41-50 (2011).
  12. Desai, B. S., Schneider, J. A., Li, J. L., Carvey, P. M., Hendey, B. Evidence of angiogenic vessels in Alzheimer's disease. J Neural Transm. 116 (5), 587-597 (2009).
  13. Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789(2011).
  14. Zenaro, E., Piacentino, G., Constantin, G. The blood-brain barrier in Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 107, 41-56 (2017).
  15. Brandl, S., Reindl, M. Blood-Brain barrier breakdown in neuroinflammation: current in vitro models. Int J Mol Sci. 24 (16), 12699(2023).
  16. Austin, B. P., et al. Effects of hypoperfusion in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 26, Suppl 3 123-133 (2011).
  17. Jagust, W. J., Budinger, T. F., Reed, B. R. The diagnosis of dementia with single photon emission computed tomography. Arch Neurol. 44 (3), 258-262 (1987).
  18. Schuff, N., et al. Cerebral blood flow in ischemic vascular dementia and Alzheimer's disease, measured by arterial spin-labeling magnetic resonance imaging. Alzheimers Dement. 5 (6), 454-462 (2009).
  19. Singh, C., Pfeifer, C. G., Jefferies, W. A. Pathogenic Angiogenic Mechanisms in Alzheimer's Disease. Physiologic and Pathologic Angiogenesis - Signaling Mechanisms and Targeted Therapy. , InTech (2017).
  20. Dai, D., Kadirvel, R., Rezek, I., Ding, Y. H., Lingineni, R., Kallmes, D. Elastase-induced intracranial dolichoectasia model in mice. Neurosurgery. 76 (3), 337-343 (2015).
  21. Liu, F. X., et al. Modified protocol for establishment of intracranial arterial Dolichoectasia model by injection of elastase into cerebellomedullary cistern in mice. Front Neurol. 13, 860541(2022).
  22. Lee, A. Y., Han, B., Lamm, S. D., Fierro, C. A., Han, H. Effects of elastin degradation and surrounding matrix support on artery stability. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (4), H873-H884 (2012).
  23. Li, Y., et al. The role of elastase in corneal epithelial barrier dysfunction caused by Pseudomonas aeruginosa exoproteins. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (9), 7(2021).
  24. Temesvári, P., Ábrahám, C. S., Gellén, J., Speer, C. P., Kovács, J., Megyeri, P. Elastase given intracisternally opens blood-brain barrier in newborn piglets. Biol Neonatol. 67 (1), 59-63 (1995).
  25. Takata, F., et al. Elevated permeability of the blood-brain barrier in mice intratracheally administered porcine pancreatic elastase. J Pharmacol Sci. 129 (1), 78-81 (2015).
  26. Hanyu, H. Diagnosis and treatment of mixed dementia. Brain Nerve. 64 (9), 1047-1055 (2012).
  27. Chui, H. C., Ramirez-Gomez, L. Clinical and imaging features of mixed alzheimer and vascular pathologies. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 21(2015).
  28. Saito, T., et al. Single app knock-in mouse models of alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
  29. Dobrin, P. B., Canfield, T. R. Elastase, collagenase, and the biaxial elastic properties of dog carotid artery. Am J Physiol. 247, 1 Pt 2 H124-H131 (1984).
  30. Wagenseil, J. E., Ciliberto, C. H., Knutsen, R. H., Levy, M. A., Kovacs, A., Mecham, R. P. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model dolichoektazjibariera krew-mózgrozszerzenie dużych naczyńiniekcja do cysterny wielkiejiniekcja elastazytransgeniczny model mysiotępienie naczyniowechoroba Alzheimeraznakowanie naczyń
Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.