Artykuł metodologiczny

Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych

DOI:

10.3791/66792

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  ,  , 
1Brain Health Imaging Centre, Centre for Addiction and Mental Health, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Neurology, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy chemiczne indukowanie dużego rozszerzenia naczyń krwionośnych u myszy jako model do badania dysfunkcji naczyń mózgowych, który może być wykorzystany do modelowania demencji naczyniowej i choroby Alzheimera. Demonstrujemy również wizualizację układu naczyniowego poprzez wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i zapewnianie jasnych wizualnych wskazówek dotyczących pomiaru zmian wielkości naczyń krwionośnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krew-mózg (BBB) jest kluczowym systemem, który reguluje selektywne krążenie mózgu z peryferiami, na przykład umożliwiając niezbędne składniki odżywcze na wejście i wydalenie nadmiaru aminokwasów lub toksyn z mózgu. Aby zamodelować, w jaki sposób bariera krew-mózg może być zagrożona w chorobach takich jak otępienie naczyniowe (VaD) czy choroba Alzheimera (AD), naukowcy opracowali nowe metody modelowania rozszerzenia naczyń. Upośledzona bariera krew-mózg w tych stanach chorobowych może być szkodliwa i powodować rozregulowanie bariery krew-mózg, co prowadzi do niepożądanych i patologicznych konsekwencji wpływających na funkcjonowanie mózgu. Byliśmy w stanie zmodyfikować istniejącą technikę, która umożliwiła nam wstrzyknięcie bezpośrednio do Cisterna magna (CM) w celu wywołania rozszerzenia naczyń krwionośnych za pomocą elastazy i przerwania połączeń ścisłych (TJ) BBB. Dzięki tej metodzie byliśmy w stanie zaobserwować różne wskaźniki sukcesu w porównaniu z poprzednimi technikami, w tym konsekwentne rozszerzanie naczyń krwionośnych, zmniejszenie śmiertelności lub poprawę powrotu do zdrowia oraz ulepszenie środka wypełniającego/zmętniającego, mieszanki kauczuku silikonowego, dostarczanej do znakowania naczyń krwionośnych do analizy rozszerzenia. Ta zmodyfikowana minimalnie inwazyjna metoda przyniosła obiecujące wyniki, z 19%-32% wzrostem trwałego rozszerzenia dużych naczyń krwionośnych u myszy od 2 tygodni do 3 miesięcy po wstrzyknięciu. Ta poprawa kontrastuje z wcześniejszymi badaniami, które wykazały zwiększone rozszerzenie dopiero po 2 tygodniach. Dodatkowe dane wskazują na utrzymującą się ekspansję nawet po 9,5 miesiącach. Wzrost ten został potwierdzony przez porównanie średnicy naczyń krwionośnych elastazy i grupy, w której wstrzyknięto nośnik. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta jest cenna w badaniu zaburzeń patologicznych, które wpływają na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) przy użyciu modeli zwierzęcych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka wyściełające naczynia włosowate mózgu są głównymi składnikami tworzącymi barierę krew-mózg (BBB)1, która odgrywa kluczową rolę w regulacji tego, co wchodzi lub wychodzi z krążenia mózgowego na peryferiach. Niezbędne składniki odżywcze potrzebne tkance nerwowej mogą dostać się do BBB, podczas gdy niektóre niezbędne aminokwasy, takie jak glutaminian, są wydalane z mózgu, ponieważ wysokie stężenia mogą powodować trwałe neuropobudzające uszkodzenie tkanki mózgowej2. W normalnych warunkach fizjologicznych bariera krew-mózg ogranicza ilość białek osocza, takich jak albumina3,4 i protrombiny, ponieważ mogą one mieć szkodliwe skutki5,6,7. Wreszcie, bariera krew-mózg chroni mózg przed neurotoksynami, które krążą na obrzeżach, takimi jak ksenobiotyki z pożywienia lub środowiska1. Ogólnie rzecz biorąc, uszkodzenie tkanek mózgowych jest nieodwracalne, a starzenie się, które koreluje z niskim poziomem neurogenezy8 podkreśla znaczenie bariery krew-mózg w ochronie i zapobieganiu wszelkim czynnikom przyspieszającym proces neurodegeneracyjny.

W dolichoektazji (lub rozszerzeniu dużych naczyń krwionośnych) obserwuje się spadek elastyczności naczyń, co powoduje, że naczynia ulegają zmianom morfologicznym, co czyni je dysfunkcyjnymi9 i prowadzi do zmniejszenia przepływu krwi w mózgu. To zmniejszenie przepływu krwi następnie zmniejsza dopływ tlenu i glukozy, ostatecznie wywołując uszkodzenie bariery krew-mózg poprzez aktywację reaktywnych astrocytów10. Gdy wewnętrzna blaszka elastyny naczyń krwionośnych jest uszkodzona przez dolichoectasia11, do angiogenezy konieczna jest wielokrotna stymulacja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Może to prowadzić do powstawania nieszczelnych naczyń krwionośnych i ostatecznie prowadzić do patologicznej angiogenezy, charakteryzującej się rozwojem wadliwych naczyń12. Podczas patologicznej angiogenezy, gdy naczynia krwionośne ulegają uszkodzeniu, pojawia się mechanizm kompensacyjny, który przywraca integralność naczyń poprzez regulację w górę białek połączeń ścisłych. Jednak proces ten może nieumyślnie zakłócić barierę krew-mózg, gdy integralność strukturalna naczynia krwionośnego zostanie utracona13. Może się to zdarzyć poprzez dalsze zakłócanie bariery krew-mózg i promowanie produkcji płytki amyloidowej14. Dodatkowo, wyciek z obwodu może powodować zapalenie nerwów15, co skutkuje degeneracją neuronów i późniejszą utratą pamięci.

Strukturalnie ochrona, którą zapewnia BBB, polega na ścisłych połączeniach, które zapobiegają przedostawaniu się krwi do mózgu przez czynniki ksenobiotyczne. Pozwalając pewnym substancjom dostać się do mózgu, BBB robi to głównie poprzez dwa główne procesy, pasywną dyfuzję lub określone kanały (takie jak kanały jonowe i transportery)1. Badania wykazały, że w chorobie Alzheimera dysfunkcyjny układ naczyniowy odgrywa znaczącą rolę w postępie choroby12,13. Powstawanie blaszek amyloidu beta (Aβ) i neurodegeneracja mogą wynikać z rozpadu BBB12,13 i zaburzeń w przepływie krwi w mózgu16. Zmniejszenie przepływu krwi w mózgu można zaobserwować u osób starszych, u których zdiagnozowano otępienie naczyniowe i AD17,18. Uszkodzenie bariery krew-mózg (BBB) wraz z dysfunkcyjnym przepływem krwi w mózgu (CBF) może przyczyniać się do zwiększonej produkcji stężenia Aβ w mózgu, czemu towarzyszy infiltracja ciał obcych z krążenia obwodowego19.

Aby zbadać patogenezę chorób neurologicznych, takich jak AD i demencja naczyniowa (VaD), opracowywane są modele replikujące chorobę. Modele in vitro są szeroko stosowane, ale brakuje im środowiska biologicznego do ekstensywnego modelowania chorób, takich jak populacja komórek mieszanych, co wymaga znaczenia modeli in vivo. Myszy są powszechnie stosowane ze względu na łatwość manipulacji genetycznej w generowaniu właściwości podobnych do ludzkich (np. patologii) w chorobie. Wraz z postępem, który został osiągnięty do tej pory, nadal istnieje zapotrzebowanie na ulepszone modele do naśladowania fenotypów chorób, takich jak rozszerzenie dużych naczyń krwionośnych i ich rola w chorobie Alzheimera. W tym celu dostrzegliśmy szansę i zmodyfikowaliśmy technikę, która polegała na wstrzyknięciu elastazy do Cisterna magna myszy20,21. Elastaza jest enzymem, który, jak wykazano, rozkłada elastynę w tkance łącznej22 i w otaczających połączeniach ścisłych23. Cisterna magna została wybrana jako punkt wstrzyknięcia, ponieważ znajduje się bezpośrednio nad okręgiem Willisa, największym naczyniem krwionośnym w mózgu. Wstrzykując elastazę do Cisterna magna, możemy naruszyć barierę krew-mózg i naczynia krwionośne, rozbijając ścisłe połączenia i wywołując rozszerzenie naczyń krwionośnych (krąg Willisa)24,25. Połączenie tej techniki z wykorzystaniem mysiego modelu patologii choroby Alzheimera, w celu lepszego zrozumienia patogenezy składnika naczyniowego choroby Alzheimera, może dostarczyć cennych informacji na temat złożonych interakcji i wpływów między tymi dwiema odrębnymi patologiami.

Poprzednie badania wykazały przypadki, w których pacjenci wykazują zarówno patologiczne cechy AD, jak i VaD, stan zwykle określany jako demencja mieszana26,27. W ten sposób zrozumienie wzajemnie powiązanych mechanizmów między oboma schorzeniami może zaoferować bardziej wszechstronną perspektywę na postęp i manifestację tych zaburzeń neurodegeneracyjnych, zwiększa nasze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw i potencjalnych strategii terapeutycznych. W tym celu demonstrujemy zastosowanie elastazy w mysim modelu patologii AD (AppNL-F) w celu identyfikacji zmian naczyniowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AppNL-Fmyszy (3 miesiące), które wykazują ekspresję ludzkiej płytki amyloidowej na poziomie fizjologicznym, zostały użyte do tego badania, chociaż ten system może być używany z dowolnym modelem gryzoni. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CAMH (Protokół #843) i były zgodne ze standardami etycznymi wytycznych Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Myszy były hodowane w domu i utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność z dostępem ad libitum do jedzenia i wody.

1. Procedura wstrzyknięcia Cisterna magna (CM)

  1. Zabiegu chirurgicznego
    1. Umieść mysz (APPNL-F, obie płcie, 3 miesiące) w komorze indukcyjnej znieczulenia na 1 min.
      UWAGA: Przepłukać komorę 5% izofluranem zmieszanym z 1% tlenem przez co najmniej 1 minutę.
    2. Po znieczuleniu myszy wyjmij zwierzę z komory i umieść je na świeżej serwety chirurgicznej i utrzymuj znieczulenie (izofluran, 2,5%-3%), umieszczając stożek nosowy nad nosem.
      UWAGA: Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palec u nogi, aby upewnić się, że nie ma odruchów.
    3. Nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie wstrzyknąć podskórnie 0,1 ml bupiwakainy (znieczulenie miejscowe; 1-2 mg/kg 0,125%, w stosunku rozcieńczenia 1:2) w miejsce nacięcia i Metacam (środek przeciwbólowy; 5 mg/kg, w stosunku rozcieńczenia 1:10). Utrzymuj zwierzę nawodnione, wstrzykując podskórnie 0,5 ml soli fizjologicznej przed wykonaniem zabiegu, aby zrekompensować potencjalną utratę krwi podczas operacji.
    4. Aby uzyskać wyraźne miejsce nacięcia, ogol szyję u podstawy kości potylicznej, przetrzyj powierzchnię sterylnym PBS i przenieś badanego do ramy stereotaktycznej w pozycji leżącej.
      UWAGA: Upewnij się, że znieczulenie jest utrzymywane przez stereotaktyczny stożek nosowy.
    5. Umieść pasek na nos z ramki stereotaktycznej na górze myszy, aby zapewnić stabilność i upewnić się, że górne zęby są zamocowane.
    6. Ustaw głowę zwierzęcia pod kątem 120° od ciała, aby unieść i rozciągnąć kark, aby odsłonić obszar zainteresowania chirurgicznego.
    7. Oczyść miejsce operowane peelingiem Betadine 3x, 70% etanolem 3x i roztworem betadyny 1x ze sterylną gazą 2 cale x 2 cale.
      UWAGA: Rękawiczki i narzędzia przed zabiegiem powinny być sterylne. Na miejscu nacięcia należy również umieścić sterylną serwetę.
    8. Wykonaj małe nacięcie (1 cm) za pomocą skalpela.
      UWAGA: Powinno to odsłonić linię środkową karku.
    9. Ostrożnie przesuń skalpel wzdłuż linii środkowej, aby przeciąć mięśnie. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie rozdziel mięśnie, rozsuwając je w lewo i w prawo.
      UWAGA: Powinno to ujawnić Cisterna magna (odwrócony trójkąt), który znajduje się pod podstawą czaszki (Rysunek 1).
  2. Przygotowanie elastazy
    UWAGA: Zamówione opakowanie elastazy (w postaci proszku) zawierało 250 jednostek (U). Ilość elastazy do wstrzyknięcia każdemu zwierzęciu wynosi 2,5 μl. Ilość elastazy, która powinna znajdować się w 2,5 μl, powinna wynosić 15 milijednostek mU.
    1. Najpierw oblicz stężenie roztworu, który ma zostać wstrzyknięty.
      Stężenie = masa/ objętość
      = 15 mU/2,5 μL
      = 6 mU/μL
      Dlatego wymagane stężenie wynosi 6 mU/μL.
    2. Ilość elastazy wynosi 250 U, a badanie działa z milijednostkami, więc przelicz jednostki na milijednostki, co daje 250000 mU.
    3. Po uzyskaniu masy 250000 mU i stężeniu 6 mU/uL, oblicz objętość (PBS), która wymagałaby rozcieńczenia elastazy i utrzymania stężenia 6 mU/uL.
    4. Korzystając z tej samej formuły powyżej, przeporządkuj, aby rozwiązać objętość:
      Objętość = masa/Stężenie
      = 250000 mU/ 6 mU/μL
      = 41666,67 μL
    5. Ponieważ trudno jest pipetować 41666.67 μL, po prostu przelicz to na mililitry, dzieląc przez 1000, aby uzyskać 41.66667 ml, aby uzyskać 1x roztwór.
      1. Aby roztwór był bardziej skoncentrowany, zwiększ go 10x lub 100x.
      2. Stwórz rozwiązanie 10x, ponieważ jest prostsze w obsłudze (patrz poniżej).
        10x roztwór ---------- 4,166667 ml (stężenie)
    6. Umieścić 250 j. w podwielokrotnej probówce o pojemności 5 ml i dodać 4,167 ml sterylnego PBS do podwielokrotnej probówki, aby uzyskać 10-krotny roztwór podstawowy.
      UWAGA: Przygotuj elastazę w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
    7. Pobrać pipetą 10 μl roztworu podstawowego i umieścić w 100 podwielokrotnych probówkach dających 1000 μl roztworu podstawowego o stężeniu 4,167 ml. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.
    8. Pozostałą część roztworu podstawowego przechowywać w podwielokrotnych probówkach po 100 μl na probówkę i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Roztwory są stabilne w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy bez znaczącej utraty aktywności. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że nadmierne zamrażanie i rozmrażanie elastazy może zmniejszyć stabilność. Dlatego, aby temu zapobiec, roztwór podstawowy można podzielić przed zamrożeniem w taki sposób, że tylko jedna próbka musi być rozmrożona na raz do wstrzyknięcia.
    9. Po rozmrożeniu jednej z podwielokrotnych probówek, która zawiera 10 μl 10x roztworu, dodaj 90 μl sterylnego PBS, aby uzyskać 100 μl 1x roztworu.
    10. Jeśli podwielokrotna probówka zawierająca 100 μl 10x roztworu została rozmrożona, po prostu dodaj 900 μl PBS, aby uzyskać 1000 μl, co jest roztworem 1x. Przechowywać oba roztwory w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
  3. Wstrzykiwanie do Cisterna magna
    UWAGA: Wyczyść strzykawkę Hamilton przed załadowaniem elastazą, ładując i odsysając wodą destylowaną 5x, następnie etanolem 5x, a na końcu wodą destylowaną 5x.
    1. Załadować do strzykawki Hamilton 2,5 μl elastazy (stężenie 15 mU) i upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Powoli włożyć strzykawkę skosem skierowanym do góry w środek Cisterna magna.
      UWAGA: Unikaj nakłuwania naczyń krwionośnych biegnących w poprzek Cisterna magna.
    3. Po nakłuciu usuń skos. Ułatwi to uwalnianie niewielkiej ilości płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wchłonąć nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego.
    4. Ponownie włożyć skos w miejsce nakłucia, powoli wstrzykiwać elastazę lub nośnik przez 1 minutę do Cisterna magna i pozostawić igłę na miejscu na 1 minutę, aby zapobiec wyciekowi elastazy.
    5. Po usunięciu skosu zamknij miejsce nacięcia niewchłanialnym szwem chirurgicznym (#4-0 z igłą 3/8") i wyłącz znieczulenie.
    6. Wyjmij zwierzę z ramki stereotaktycznej i umieść je na ciepłej poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aż obiekt wyzdrowieje.
      UWAGA: Kolejna dawka leku Metacam jest zalecana po zabiegu chirurgicznym, aby pomóc w łagodzeniu bólu podczas rekonwalescencji pooperacyjnej.

2. Wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i pobieranie tkanek

  1. Znieczulić zwierzę przedawkowaniem awertyny (1 ml, 125-250 mg/kg).
    UWAGA: Ściśnij palec u nogi, aby upewnić się, że ustaną odruchy.
  2. Umieść zwierzę na pieluszce i zabezpiecz wszystkie kończyny taśmą chirurgiczną z klatką piersiową skierowaną do góry
  3. Otwórz klatkę piersiową za pomocą kleszczy i nożyczek, aby odsłonić serce.
  4. Włóż igłę o sile 23 G do lewej komory serca i wykonuj fuzję z PBS w infuzji heparyny (100 U/ml) przez 4 minuty, aby oczyścić naczynia krwionośne za pomocą pompy mikroperfuzyjnej.
  5. Zastąp butelkę buforową butelką zawierającą 4% paraformaldehydu (PFA) (uzupełnionego w PBS) i perfuzuj przez kolejne 4 minuty.
  6. Przygotować roztwór mieszanki kauczuku silikonowego (żółty), łącząc 5 ml związku z 5 ml rozcieńczalnika w probówce o pojemności 50 ml. Dokładnie wymieszaj przed użyciem.
  7. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml 10 ml kompozytu z gumy silikonowej i . Podłączyć strzykawkę do węża podłączonego do igły o sile 23 G i ostrożnie wstrzyknąć roztwór ręcznie do serca.
    UWAGA: Ze względu na wysoką lepkość mieszanki kauczuku silikonowego ważne jest, aby użyć strzykawki z większą lufą, w przeciwnym razie ciśnienie będzie zbyt duże, aby popchnąć tłok.
  8. Po wstrzyknięciu należy zdjąć głowę myszy i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, aby mieszanina gumy silikonowej utwardziła się w naczyniach.
  9. Następnego dnia delikatnie usuń czaszkę myszy (najlepiej za pomocą cienkich kleszczy), wyekstrahuj mózg i inkubuj w 4% PFA przez noc w temperaturze pokojowej (RT).
  10. Po 24 godzinnej inkubacji w PFA umyć mózg w PBS 3x, umieścić w 30% sacharozie i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Analiza ilościowa

  1. Aby uchwycić wysokiej jakości obrazy Koła Willisa w całym mózgu (Rysunek 3):
    1. Usuń mózg z roztworu sacharozy. Dokładnie osusz mózg za pomocą ręcznika papierowego, aby odprowadzić wilgoć z powierzchni.
    2. Umieść mózg w maszynce do łamania mózgu. Umieść krajalnicę mózgu pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę.
    3. Ustaw ostrość mikroskopu na wyraźną rozdzielczość Koła Willisa o wysokiej rozdzielczości.
  2. Użyj oprogramowania do analizy obrazu z odniesieniem do linijki 10 cm, aby zmierzyć około 1 cm i zanotować liczbę pikseli. Ustaw skalę 1 cm na podstawie tego pomiaru, a następnie zmierz grubość tętnicy podstawnej poziomo, aby znaleźć jej średnicę.
  3. Użyj standardowego oprogramowania do densytometrii pikseli, aby przeanalizować obraz. Zmierz (w centymetrach) pięć oddzielnych odczytów tętnicy podstawnej za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i oblicz średnią, aby uzyskać dokładne odwzorowanie średnicy tętnicy podstawnej.
  4. Użyj 2-kierunkowej analizy wariancji (ANOVA), aby porównać średnią zmianę średnicy między elastazą a grupą kontrolną.
    1. Oblicz procentową zmianę średnicy, korzystając z poniższego wzoru 21:
      figure-protocol-1
      C = zmiana względna
      X1 = Wartość początkowa (pojazd)
      X2 = Wartość końcowa (elastaza)
      Uznajmy, że wartości P mniejsze niż 0,05 są statystycznie istotne. Wykonuj wszystkie analizy statystyczne za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej.

4. Usuwanie mieszanki kauczuku silikonowego za pomocą dehydratacji alkoholowej

UWAGA: Ważne jest, aby odwodnić mózg, aby pomóc usunąć nadmiar mieszanki kauczuku silikonowego z naczynia krwionośnego, co może potencjalnie poprawić jakość barwienia immunologicznego.

  1. Umyj mózgi 3x PBS, aby usunąć sacharozę.
  2. Umieść mózg w 25%, 50%, 75%, 95% i absolutnym etanolu na 24 godziny w każdym stężeniu, przez łączny czas 5 dni.
  3. Po odwodnieniu tkanki należy umieścić ją w salicylanie metylu (stężenie ≤100%) na 12-24 godziny. Etanol i salicylan metylu pozwolą na usunięcie nadmiaru silikonu z tkanki.
  4. Umyj mózg w PBS 3x, aby usunąć pozostałości chemikaliów i pozostaw na noc na bujaku w temperaturze 4 °C w świeżym PBS.
  5. Umieścić mózg w sacharozie i przechowywać w temperaturze 4 °C przed sekcją i barwieniem immunologicznym.

5. Barwienie immunohistochemiczne

  1. Sekcje mózgów
    1. Przed immunosekcją pozwól mózgowi osiąść na dnie rurki wypełnionej sacharozą.
    2. Zamroź mózg na platformie mikrotomu za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) otoczonego suchym lodem. Pokrój mózg na sekcje 40 μm za pomocą ostrza mikrotomu.
    3. Przenieś każdą sekcję do 96-dołkowej płytki zawierającej krioprotektant, aby zapobiec zamarzaniu, za pomocą pędzla z cienką końcówką.
    4. Szczelnie zamknąć płytkę 96-dołkową folią spożywczą. Szczelnie zamknięty talerz należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne (na przykładzie NeuN)
    1. Umieść skrawki w 24-dołkowej płytce. Wykonaj trzy płukania PBS, aby wyeliminować krioprotektant.
    2. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy użyciu roztworu blokującego zawierającego 2% surowicy koziej, 0,1% Triton-X 100 i 1% BSA.
    3. Przygotuj wszystkie składniki w PBS.
      UWAGA: Podstawowym zastosowanym przeciwciałem był monoklonalny mysi anty-NeuN o rozcieńczeniu 1: 500. Użyte przeciwciało drugorzędowe obejmowało poliklonalną kozę anty-mysią 568 o rozcieńczeniu 1:200.
    4. Rozcieńczyć monoklonalny mysi anty-NeuN w roztworze blokującym, o którym mowa powyżej.
    5. Dodaj rozcieńczone przeciwciało do każdej studzienki. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, osłonięte folią przed światłem.
    6. Po wstępnej inkubacji przemyć skrawki 3x PBS. Rozcieńczyć poliklonalną kozę anty-mysią 568 w tym samym roztworze blokującym.
    7. Dodaj rozcieńczone przeciwciało do każdej studzienki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, osłonięte folią przed światłem.
    8. Przemyć skrawki 3x PBS po wtórnej inkubacji.
    9. Przygotuj się do montażu, powoli przenosząc sekcje na szkiełka za pomocą cienkich pędzli. Pozostaw wszystkie sekcje do wyschnięcia.
    10. Po wysuszeniu sekcji nałóż 125-150 μl środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Delikatnie ułóż szkiełka nakrywkowe.
    11. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 24 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, uszczelniając krawędzie lakierem do paznokci. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się zlokalizować Cisterna magna pod potyliczną częścią czaszki po dokładnym ustawieniu myszy na stereotaktycznym kadrze i przeprowadzeniu sekcji mięśni. Ta struktura anatomiczna, przypominająca odwrócony trójkąt i podświetlona na żółto, znajduje się poniżej podstawy czaszki (Ryc. 1). Aby zapewnić precyzję i zapobiec uszkodzeniom tkanki mózgowej, 1-2 mm skosu strzykawki Hamiltona został delikatnie włożony do Cisterna magna.

Po wstrzyknięciu elastazy, zwierzęta były poddawane perfuzji PBS i 4% PFA w trzech różnych odstępach czasu: 2 tygodnie, 1 miesiąc i 3 miesiące. Następnie ich naczynia krwionośne zostały unieruchomione za pomocą mieszanki kauczuku silikonowego, aby poprawić wizualizację naczyń krwionośnych, jak pokazano na Rysunek 2. Jakościowo, rozszerzenie wywołane elastazą ujawnia zwiększoną widoczność małych naczyń krwionośnych wokół koła Willisa oraz powiększonej i krętej tętnicy podstawnej, w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymała wstrzyknięcie nośnika (Ryc. 3).

Analiza ilościowa wykazała istotną różnicę między grupą elastazową a grupą kontrolną, z powiększeniem naczyń krwionośnych w grupie elastazy obserwowanym po 2 tygodniach (wzrost o 32%; wartość p= 0,019), 1 miesiącu (wzrost o 19%; wartość p= 0,020) i 3 miesiącach (wzrost o 20%; wartość p= 0,020) po wstrzyknięciu (Rysunek 4). Późniejsze odwodnienie mózgu poprzez stopniowy wzrost stężenia etanolu, a następnie zanurzenie w salicylanie metylu, ułatwiło usunięcie nadmiaru mieszanki kauczuku silikonowego i przyczyniło się do poprawy jakości barwienia histologicznego (Ryc. 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Lokalizacja Cisterna magna. Ulepszona wizualizacja ukazuje Cisterna magna odizolowaną od sąsiednich mięśni szyi, ukazując jej położenie w stosunku do mózgu i struktury czaszki, w szczególności kości potylicznej. Podkreślona żółtym trójkątem, Cisterna magna przypomina odwrócony trójkąt, oferując przejrzystość w przedstawieniu anatomicznym. Podziałka liniowa: 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wstrzyknięcie żółtego barwnika. Perfuzję przezsercową wykorzystano do przygotowania tkanki do barwienia histologicznego. (A) Konfiguracja perfuzji u myszy obejmowała pompowanie PBS do organizmu przez 4 minuty w celu usunięcia krwi, a następnie PFA przez kolejne 4 minuty w celu utrwalenia białka. (B) Wstrzyknięcie barwnika do lewej komory myszy po perfuzji poprawia widoczność naczyń krwionośnych w mózgu, ułatwiając łatwą obserwację gołym okiem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Piktogram mózgu, któremu wstrzyknięto elastazę i PBS. Wizualizacja ilustruje powiększenie BA i zwiększoną krętość wokół CW po wstrzyknięciu elastazy, w porównaniu z grupą kontrolną (PBS). CW, krąg willisa; BA, tętnica podstawna. Podziałka liniowa: 3 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wywołane elastazą i utrzymujące się rozszerzenie naczyń krwionośnych przez 3 miesiące. W porównaniu z grupą kontrolną leczoną PBS zaobserwowaliśmy znaczne rozszerzenie naczyń krwionośnych po pojedynczym wstrzyknięciu elastazy do Cisterna magna 3-miesięcznych myszy, które utrzymywało się przez 3 miesiące. Tętnicę podstawną mierzono po 2 tygodniach, 1 miesiącu i 3 miesiącach od wstrzyknięcia elastazy. Dane są średnie ± SD; 2-drożny Anova, Sidak (testy post hoc); *p < 0,019 (2 tygodnie), *p < 0,020 (1 miesiąc) i *p < 0,020 (3 miesiące). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Barwienie NeuN odwodnionego mózgu po usunięciu nadmiaru żółtego barwnika. Po umieszczeniu mózgu w rosnących stężeniach etanolu i salicylanu metylu przez 24 godziny każdy, mózg został podzielony na sekcje za pomocą mikrotomu i wybarwiony pod kątem markera neuronalnego NeuN. Na diagramie widać, że (A) nieodwodniony mózg wykazuje więcej widocznych naczyń krwionośnych w porównaniu z (B) odwodnionym mózgiem, jak wskazuje biała strzałka. Ułatwia to dokładniejszą analizę tych odcinków, ponieważ zmniejsza zakłócenia tła związane z naczyniami krwionośnymi. Podziałka skali: 3 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono ulepszony protokół rozszerzania naczyń mózgowych, zapewniając precyzyjne i proste podejście do wstrzykiwania elastazy do Cisterna magna myszy. Ten anatomiczny punkt służy jako bezpośrednia brama do płynu mózgowo-rdzeniowego, oferując cenną drogę do badania różnych chorób neurologicznych. Jedną z głównych zalet tej zmodyfikowanej techniki jest to, że wstrzyknięcie pojedynczej dawki elastazy do Cisterna magna myszy było w stanie spowodować i utrzymać rozszerzenie dużych naczyń krwionośnych przez co najmniej 3 miesiące bez konieczności powtarzalnego wstrzykiwania lub wszczepiania kaniuli. Podejście polegające na podawaniu elastazy do mysiego modelu AD jest kolejną godną uwagi zaletą, szczególnie w przypadku przyspieszania odkładania się blaszek amyloidowych w mózgu. Zazwyczaj modele AD, takie jak myszy AppNL-F (wykorzystane w tym badaniu) wykazywały tworzenie się płytki nazębnej w wieku 6 miesięcyw wieku 28 lat. Model ten został wybrany, ponieważ myszy te naturalnie wykazują odkładanie się amyloidu podobne do ludzkiego w normalnych warunkach starzenia. Wstrzyknięcie elastazy do Cisterna magna w wieku 3 miesięcy może zaostrzyć patologię AD poprzez zmniejszenie przepływu krwi wmózgu16 i zwiększenie zaburzeń bariery krew-mózg 12,13.

Ważne jest, aby pamiętać, że wstrzykiwanie substancji do Cisterna magna może być utrudnione przez ciśnienie płynu mózgowo-rdzeniowego. Zajęliśmy się tym ograniczeniem, opracowując metodę mającą na celu zminimalizowanie jego wpływu, uznając, że nie możemy wyeliminować potencjalnej interferencji płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) na dostarczanie elastazy do mózgu. Zdolność elastazy do trawienia elastyny powoduje zmniejszenie sztywności tętnic, osłabiając w ten sposób tętnice i powodując wydłużenie naczyń krwionośnych i ich krętość29,30, co czyni ją odpowiednią interwencją w wywoływaniu dolichoektazji.

Zazwyczaj wykonanie chirurgicznego wstrzyknięcia do Cisterna magna na mysz zajmuje około 20 minut. Podczas tego procesu myszy są znieczulane 1,5%-2% izofluranem stosowanym jako znieczulenie ogólne. Zaleca się stosowanie ramy stereotaktycznej z listwą zębatą i nausznikami, aby zapewnić stabilność i twardość główki myszy podczas operacji, co jest delikatnym i kluczowym krokiem. Nieprawidłowe ułożenie na ramie stereotaktycznej może skutkować pochyloną głową i nieprecyzyjnym podawaniem, a także możliwością uderzenia w naczynie krwionośne. Delikatnie przeciąć skórę, przesuwając skalpel poniżej podstawy kości potylicznej, aby odsłonić linię środkową karku. Skalpel następnie przesuwał się wzdłuż linii środkowej, aby wykonać zgrabne cięcie, a do rozdzielenia mięśni używano cienkich kleszczy. Ogólnie rzecz biorąc, minimalizuje to krwawienie, co pomaga myszy znacznie szybciej się regenerować.

Zdecydowaliśmy się na dawkę elastazy 15 mU w oparciu o wyniki poprzednich prac20, które wykazały, że nie ma różnicy między dawkami 15 mU i 25 mU. Ponadto zauważyli, że wyższe stężenia prowadziły do zwiększonej śmiertelności. Podczas gdy śmiertelność na poziomie 28% odnotowano przy dawce 15 mU20, metoda zastosowana w tym badaniu nie przyniosła żadnych zgonów w kohorcie. Mieliśmy zerową śmiertelność podczas całego procesu chirurgicznego wszystkich myszy i 5-10% śmiertelność po operacji do 3 miesięcy po niej. Jednak głównym celem tego badania jest zrozumienie dolichoektazji, rozszerzenia dużych naczyń krwionośnych. Ten nacisk skłonił nas do skoncentrowania się na tętnicy podstawnej jako podstawowym punkcie odniesienia do pomiaru poszerzenia. Dodatkowo wstrzyknięcie elastazy do Cisterna magna myszy wywołuje szeroki efekt, rozszerzając zarówno duże, jak i małe naczynia krwionośne.

Podczas wstrzykiwania do cysterny magna jakiegokolwiek zwierzęcia ważne jest, aby wziąć pod uwagę odległość między tkanką mózgową a przestrzenią Cisterna magna, aby uniknąć uszkodzenia mózgu igłą. Ze względu na to, że myszy mają stosunkowo niewielką odległość, do Cisterna magna wkładamy tylko skos strzykawki. Aby zminimalizować ryzyko infekcji, zabieg musi być wykonany przy użyciu sterylnego sprzętu chirurgicznego, przy znieczuleniu myszy. Podanie bupiwakainy i leku Metacam przed zabiegiem może pomóc w zmniejszeniu dyskomfortu pooperacyjnego i przyspieszyć powrót zwierząt do zdrowia. Cisterna magna, znajdująca się u podstawy czaszki, jest uwidoczniona poprzez dokładne osuszenie pola operacyjnego sterylnym wacikiem. W obecnym badaniu obszar chirurgiczny ma rozmiar około 1 cm, co jest maksymalnym obszarem, który można wykorzystać do uzyskania wyraźnego widoku Cisterna magna. Dodatkowo małe miejsce nacięcia pomaga zwierzęciu szybciej się goić.

Kluczowe znaczenie ma maksymalizacja retencji narkotyków w przestrzeni Cisterna magna. Wcześniejsze badania miały na celu zapobieganie wyciekom leku poprzez umieszczenie bawełnianego wacika w miejscu wstrzyknięcia po podaniu elastazy21. Mamy jednak obawy co do skuteczności tej metody, ponieważ chłonny charakter bawełny w miejscu wstrzyknięcia może potencjalnie zagrozić skuteczności elastazy poprzez jej ponowne wchłanianie po wstrzyknięciu. Podobnie, w innym badaniu20, igła została szybko usunięta po wstrzyknięciu elastazy do Cisterna magna, co stanowi kolejne potencjalne wyzwanie w zapewnieniu, że optymalny lek dostanie się do przestrzeni Cisterna magna, potencjalnie prowadząc do wycieku elastazy do płynu mózgowo-rdzeniowego. Dlatego proponowana metoda rozpoczyna się od nakłucia Cisterna magna w celu uwolnienia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), a następnie umieszczenia sterylnego bawełnianego wacika w miejscu nakłucia, aby wchłonąć nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego i złagodzić ciśnienie w przestrzeni. Następnie wacik jest usuwany, a igła jest ponownie wkładana w to samo miejsce w celu wstrzyknięcia elastazy do przestrzeni cysterny bez ponownego nakładania wacika. Co więcej, zdecydowaliśmy się trzymać igłę na miejscu przez 1-2 minuty po wstrzyknięciu, pozwalając elastazie odpowiednio dyfuzjować się po całym Cisterna magna przed delikatnym wycofaniem. Należy jednak zauważyć, że technika ta wymaga wykonywania ręki bez iniekcji i stabilnego zakotwiczenia igły podczas nakłuwania Cisterna magna i powolnego wstrzykiwania elastazy. Ponadto ważne jest, aby unikać uszkodzenia dużych naczyń krwionośnych w poprzek Cisterna magna podczas wstrzykiwania, ponieważ może to spowodować powikłania, takie jak krążenie po operacji, co jest punktem końcowym i wymaga eutanazji. Ogólnie rzecz biorąc, metoda wykazuje dylatację trwającą do 3 miesięcy od pojedynczego wstrzyknięcia elastazy do Cisterna magna, przewyższając 2-tygodniową dylatację obserwowaną w poprzednich metodach 20,21. Podsumowując, takie podejście wydłuża czas trwania dylatacji, ale także konsekwentnie dostarcza substancje, takie jak elastaza, bezpośrednio do mózgu. Metoda ta jest preferowana ze względu na minimalnie inwazyjne podejście do transportu substancji przez barierę krew-mózg, co stanowi dodatkową zaletę, ponieważ można ją dodatkowo rozszerzyć w celu dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było możliwe dzięki nieocenionemu wkładowi Stephanie Tam, która udzieliła wsparcia w asystowaniu przy operacjach. Wyrażamy jej szczerą wdzięczność za pomoc. National Institutes of Health (AG066162) za wsparcie tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik 23 GUniversity Medstore2546-CABD305145Potrzebny do perfuzji  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Etanol absolutnyUniversity Medstorehttps://www.uoftmedstore.com/index.szDo usuwania mikrofilu
Peeling betadynowy#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubSterylizacja
Roztwór betadynyAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWSterylizacja
BupiwakainaDostarczone przez zakład dla zwierzątN/Ado strzyżenia przeciwbólowego
BrainTree Scientific IncCLP-41590Futro do golenia
Bawełniana końcówka Q-tipUniversity Medstore1962Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastazaSigma-aldrich  E7885Używany do rozszerzania naczyń krwionośnych
EtanolUniversity Medstore39752-P016-EAANSterylizacja (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Koza anty-mysz 568InvitrogenA11004Do barwienia dojrzałych neuronów
Pryzmat Graphpad 10 PryzmatGraphpad 10https://www.graphpad.com/Oprogramowanie do analizy statystycznej
Strzykawka HamiltonSigma-aldrich28614-UElastaza iniekcyjna
Poduszka grzewczaAmazonhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZUtrzymuj temperaturę ciała
Oprogramowanie ImageJFidżi Oprogramowanie Imagejimagej.net (USA)Oprogramowanie do analizy obrazu
Komora indukcyjnaDostarczone przez zakład dla zwierzątNie dotyczyAnestezja indukcja
MetacamDostarczone przez zakład dla zwierzątNie dotyczyPrzeciwbólowy
salicylan metyluSigma-aldrichM6752Do usuwania mikrofilu
MicrofilFlow Tech, Carver, Massachusettshttps://www.flowtech-inc.com/order/  Barwnik (żółty)
Mysz monoklonalny anty-NeuNMillipore SigmaMAB377Do barwienia dojrzałych neuronów,
skanera slajdów Olympus VS200 i oprogramowania VSI.Olympus Life Sciencehttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[pliki do pobrania][id]=847254104Oprogramowanie do obrazowania
ParaformaldehydUniversity MedstorePAR070.1Do utrwalania białek  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Pompa perfuzyjnaVWR Internationalhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsPotrzebna do perfuzji
SkalpelUniversity Medstore2580-M90-10Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
StereotaktycznyDostarczony przez zakład dla zwierzątNie dotyczyWięc zabezpiecz zwierzę do operacji
NożyczkichirurgiczneUniversity Medstore22751-A9-240Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Taśma chirurgicznaUniversity Medstorehttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2Zabezpiecz zwierzę na pieluszce
SzwyUniversity Medstore2297-VS881Do operacji (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Pęseta X2University Medstore7731-A10-612Do zabiegów chirurgicznych (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Maszynki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  2. Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I. Recent advances in drug delivery and targeting to the brain. J Control Release. 350, 668-687 (2022).
  3. Vagnucci, A. H. Jr, Li, W. W. Alzheimer's disease and angiogenesis. Lancet. 361 (9357), 605-608 (2003).
  4. Banks, W. A., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. J Neuroinflamm. 12, 223(2015).
  5. Archie, S. R., Shoyaib, A. A., Cucullo, L. Blood-brain barrier dysfunction in CNS disorders and putative therapeutic targets: an overview. Pharmaceutics. 13 (11), 1779(2021).
  6. Jefferies, W. A., Price, K. A., Biron, K. E., Fenninger, F., Pfeifer, C. G., Dickstein, D. L. Adjusting the compass: new insights into the role of angiogenesis in Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 5 (6), 64(2013).
  7. Kook, S. Y., Seok-Hong, H., Moon, M., Mook-Jung, I. Disruption of blood-brain barrier in Alzheimer disease pathogenesis. Tissue Barriers. 1 (2), e23993(2013).
  8. Kempermann, G. Activity dependency and aging in the regulation of adult neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a018929(2015).
  9. Del Brutto, V. J., Ortiz, J. G., Biller, J. Intracranial arterial dolichoectasia. Front Neurol. 8, 344(2017).
  10. de la Torre, J. C., Mussivand, T. Can disturbed brain microcirculation cause Alzheimer's disease. Neurol Res. 15 (3), 146-153 (1993).
  11. Gutierrez, J., Sacco, R. L., Wright, C. B. Dolichoectasia-an evolving arterial disease. Nat Rev Neurol. 7 (1), 41-50 (2011).
  12. Desai, B. S., Schneider, J. A., Li, J. L., Carvey, P. M., Hendey, B. Evidence of angiogenic vessels in Alzheimer's disease. J Neural Transm. 116 (5), 587-597 (2009).
  13. Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789(2011).
  14. Zenaro, E., Piacentino, G., Constantin, G. The blood-brain barrier in Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 107, 41-56 (2017).
  15. Brandl, S., Reindl, M. Blood-Brain barrier breakdown in neuroinflammation: current in vitro models. Int J Mol Sci. 24 (16), 12699(2023).
  16. Austin, B. P., et al. Effects of hypoperfusion in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 26, Suppl 3 123-133 (2011).
  17. Jagust, W. J., Budinger, T. F., Reed, B. R. The diagnosis of dementia with single photon emission computed tomography. Arch Neurol. 44 (3), 258-262 (1987).
  18. Schuff, N., et al. Cerebral blood flow in ischemic vascular dementia and Alzheimer's disease, measured by arterial spin-labeling magnetic resonance imaging. Alzheimers Dement. 5 (6), 454-462 (2009).
  19. Singh, C., Pfeifer, C. G., Jefferies, W. A. Pathogenic Angiogenic Mechanisms in Alzheimer's Disease. Physiologic and Pathologic Angiogenesis - Signaling Mechanisms and Targeted Therapy. , InTech (2017).
  20. Dai, D., Kadirvel, R., Rezek, I., Ding, Y. H., Lingineni, R., Kallmes, D. Elastase-induced intracranial dolichoectasia model in mice. Neurosurgery. 76 (3), 337-343 (2015).
  21. Liu, F. X., et al. Modified protocol for establishment of intracranial arterial Dolichoectasia model by injection of elastase into cerebellomedullary cistern in mice. Front Neurol. 13, 860541(2022).
  22. Lee, A. Y., Han, B., Lamm, S. D., Fierro, C. A., Han, H. Effects of elastin degradation and surrounding matrix support on artery stability. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (4), H873-H884 (2012).
  23. Li, Y., et al. The role of elastase in corneal epithelial barrier dysfunction caused by Pseudomonas aeruginosa exoproteins. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (9), 7(2021).
  24. Temesvári, P., Ábrahám, C. S., Gellén, J., Speer, C. P., Kovács, J., Megyeri, P. Elastase given intracisternally opens blood-brain barrier in newborn piglets. Biol Neonatol. 67 (1), 59-63 (1995).
  25. Takata, F., et al. Elevated permeability of the blood-brain barrier in mice intratracheally administered porcine pancreatic elastase. J Pharmacol Sci. 129 (1), 78-81 (2015).
  26. Hanyu, H. Diagnosis and treatment of mixed dementia. Brain Nerve. 64 (9), 1047-1055 (2012).
  27. Chui, H. C., Ramirez-Gomez, L. Clinical and imaging features of mixed alzheimer and vascular pathologies. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 21(2015).
  28. Saito, T., et al. Single app knock-in mouse models of alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
  29. Dobrin, P. B., Canfield, T. R. Elastase, collagenase, and the biaxial elastic properties of dog carotid artery. Am J Physiol. 247, 1 Pt 2 H124-H131 (1984).
  30. Wagenseil, J. E., Ciliberto, C. H., Knutsen, R. H., Levy, M. A., Kovacs, A., Mecham, R. P. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model dolichoektazjibariera krew m zgrozszerzenie du ych naczyiniekcja do cysterny wielkiejiniekcja elastazytransgeniczny model mysiot pienie naczyniowechoroba Alzheimeraznakowanie naczy

Powiązane artykuły